Summary
心臓前駆細胞の3D +時間イメージングを可能にするマウス胚培養およびイメージングのための詳細なプロトコルを提示します。このビデオツールキットは、テキストのみの出版物では習得が困難なライブイメージングを成功させるために必要な主要なスキルに対応しています。
Abstract
心臓発達の最初のステップは、細胞の挙動と分化の劇的な変化を意味します。固定胚の解析では、静止画のスナップショットで特定の発生段階を詳細に研究することができますが、ライブイメージングでは、胚の発達を画像化することで、細胞の移動、形状変化、分化などの動的な形態形成イベントをキャプチャします。これは固定分析を補完し、胚形成中に臓器がどのように発達するかについての理解を広げます。その利点にもかかわらず、ライブイメージングは、その技術的な課題のためにマウスモデルで使用されることはめったにありません。初期のマウス胚は、 ex vivo で培養すると敏感であり、効率的な取り扱いが必要です。マウス発生研究におけるライブイメージングの幅広い使用を促進するために、この論文は、マウス胚での長期取得を可能にする2光子ライブ顕微鏡の詳細なプロトコルを提示します。プロトコルに加えて、胚の取り扱いと培養の最適化に関するヒントが提供されます。これは、初期のマウス器官形成における重要なイベントを理解するのに役立ち、心血管前駆細胞生物学の理解を深めます。
Introduction
心臓は胚形成の初期に形成され、胚全体に栄養素を送り込み始めますが、発達を続けます1。マウス胚では、原腸形成の開始から1日半後、初歩的な心臓器官が前極2,3に集合する。初期ストリーク(ES)段階までに、エピブラストの心臓前駆細胞は原始ストリークを通って新生中胚葉層4,5,6に侵入し、前極に移動し始め、そこで分化して原始心臓管を形成します。このプロセスを通して、初期の心臓前駆細胞は、遊走に加えて、細胞の再編成、形状転換、および分化を経験します7(図1)。
初期の心臓前駆細胞は、機能的な器官を同時に分化および構築する驚くべき能力により、ほぼ1世紀にわたって研究者を魅了してきました。過去20年間、クローン解析と条件付きノックアウトモデルは、初期の心臓発達が非常に動的なプロセスに異なる細胞源を関与させることを示しました8,9,10。しかし、原始的な心臓管の3D構造とその形態形成の動的な性質は、研究を困難にし(図1)、その完全な複雑さを理解するにはほど遠い11。
これらの動的な細胞プロセスを研究するために、ライブイメージング法は現在、前例のない詳細を提供します7、12、13、14。マウスモデルでは、静的解析では対処が困難な発達トピックを調査するためのライブアプローチが鍵となっています7,13,15。長期間の生体外培養と堅牢な顕微鏡セットアップは急速に進歩していますが16,17、生きた胚のイメージングを成功させる専門知識を持っている研究者はほとんどいません。紙ベースの出版物は、ライブイメージング実験を再現するのに十分な技術的詳細を提供しますが、視覚的な例やピアツーピアの支援がなければ、一部のスキルやトリックを把握することは困難です。この学習プロセスを加速し、ラボ間でライブイメージングの使用を広めるために、原腸マウス胚でライブイメージングを実行するために必要なスキルを収集するビデオプロトコル(図2)を組み立てました。
図1:原腸形成の開始から原始的な心臓管形成前の段階までのマウス胚における心臓前駆細胞の早期分化。 心臓前駆細胞は原腸形成の開始直後に中胚葉に侵入し、胚の反対側に移動する。形態学的および胚の日(E)段階は、図の上に書かれています。破線の矢印は、原腸形成中の原始心臓管前駆細胞の移行軌跡を示しています。この図は11から適応されました。略語:ES =初期のストリーク。MS =ミドルストリーク;EHF = 初期のヘッドフォールド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:初期心臓前駆細胞のライブイメージングのワークフロー図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物手順は、CNIC動物実験倫理委員会、マドリッド共同体(参照PROEX 220/15)によって承認され、Real Decreto 1201/2005に基づいてスペインの法律で施行された、実験およびその他の科学的目的で使用される動物の保護に関するEU指令2010/63EUおよび勧告2007/526/ECに準拠しています。
このプロトコルには、NOTCH活性Tg(CBF:H2BVenus,+)を報告する蛍光トランスジェニックマウス系統の2人の雄の使用が含まれます18。このプロトコルで使用される材料、動物、および機器の詳細については、 材料の表 を参照してください。
1.ツールとホルダーのカスタマイズ
- 長さ1cmのタングステン線片を切り取り、例えばワイヤーの先端を飽和亜硝酸ナトリウム溶液19に浸すなど、利用可能な簡単な方法のいずれかを使用して直径0.02〜0.05mmに研ぎます。
- 肘付きガラス毛細管を準備します。
- 標準の1.0 mmガラスキャピラリーの中点をブンゼンライターの上に3〜6秒間置き、キャピラリーが薄く柔軟になるまで両端からゆっくりと引っ張ります。その時点で、キャピラリーを半分に壊し、短時間加熱して、先端から2cmの90°の曲げを生成します。
- 長さ約7 mm、幅4 mm、厚さ2 mmのポリメチルメタクリレートを見ました(図3D)。
注意: ポリメチルメタクリレートシートは、リサイクルされた実験装置から入手するか、新しいものを注文することができます。 - ベンチバイスを使用してメタクリレートピースを保持します。次に、ピース全体を横方向にカスタムサイズの穴を開けます(図3D)。
注:通常、E6.5〜E7.5マウス胚は直径0.2〜0.5mmのドリルを使用する必要があります。- ドリルをゆっくりと回転させながら、低いながらも一定の圧力をかけます。ホルダー内でドリルが破損した場合は、金属を取り出すことができないため、部品を廃棄してください。
- 細かいファイルを使用して、ホルダーのエッジを滑らかにし、サイズを調整します。さらに、胚の位置決めを容易にするために、ホルダーの端に緩やかな傾斜を作成します(図3D)。
- 完成したホルダーを蒸留水の入った皿に入れてすすぎます。
- 実体顕微鏡の下のホルダーをチェックして、穴にドリルダストが含まれているかどうかを確認します。ほこりがある場合は、タングステン針を使用して取り除きます。
- ホルダーを滅菌するには、蒸留水でいっぱいの円錐形のチューブに入れ、最低20Wの電力出力で20分間超音波処理します。
2. メディアの準備
- 補体系を熱不活性化するには、市販または自家製の20ラット血清の500 μLアリコート2個を56°Cで30 分間放置します。
注:ラット血清の調製方法の詳細なプロトコルについては、21を参照してください。 - 細胞培養フード内で、顕微鏡で胚を培養するための培地の2つのアリコートを調製する。それぞれについて、生細胞イメージング用のDMEM490 μL、不活化ラット血清500 μL、およびペニシリン-ストレプトマイシン10 μLを混合して、最終濃度50 μg/mLのペニシリンおよび50 μg/mLのストレプトマイシン22を得ます。
注:培地の量は、培養する胚の時間と数によって異なります。経験則として、最適な成長には、E7.0胚で1日あたり最低200μLが必要です。 - 2 mLシリンジを使用して、0.22 μmの孔径メンブレンフィルターを通して培地を新しいチューブにろ過し、胚培養23の前に37°Cおよび7%CO2の細胞培養インキュベーターに蓋を開けて1時間置きます。
- L-グルタミンボトルを添加した500 mLのDMEMに、ウシ胎児血清50 mL、25 mM HEPES-NaOH(pH 7.2)10 mL、ペニシリンとストレプトマイシン10 mL(50 mg/mL)を加えて解剖培地を調製します。
- 次に、それを50 mLアリコートに分け、3つのアリコートを37°Cの槽に入れ、残りを4°Cで最大3か月間保存します。
3.胚解剖
- E6.75-E7.5妊娠中のマウスを安楽死させます。
- 子宮を抽出し、乾いた清潔な紙のワイプの上に置きます。次に、子宮を切断し、メソメトリー側から細かいハサミの先端を挿入し、ブレードに沿ってスライドさせて脱落膜を露出させ、解剖培地に移します。詳細なプロトコルについては、24を参照してください。
- 胚を解剖し、外胎盤円錐を無傷に保ちます(図3A、B)。詳細な解剖方法については、25を参照してください。
- 次に、ライヒェルト膜を剥がし、その一部を胚外領域に残します(図3B)。
注:このステップには細かい鉗子が不可欠です。経験の浅いユーザーは、鉗子の先端が皿の表面に対して曲がらないように、2%アガロースゲルコーティングされた皿で胚を解剖することができます(図3C)。 - 解剖培地を暖かく保つために、10分ごとに交換してください。また、37°Cの槽に入れた解剖培地に残りを保ったまま落葉膜を3〜4の群に分けて解剖する。解剖した胚を直ちに培養液に入れる。
- 蛍光実体顕微鏡を使用して目的の蛍光特徴を持つ胚を選択し、細胞培養インキュベーター内の培養液を含むチューブに入れます。
- 胚がE6.5からE7.0の段階にある場合は、蓋を閉め、胚を2時間放置して回復させてからイメージングします。
注:E6.5からE7.0の胚は敏感です。顕微鏡の直下に置くこともできますが、前培養により解剖から最もよく回復するものを選択できるため、成功の可能性が高まります。
4. 顕微鏡の準備
- レーザー、コンピューター、ソフトウェアを含むすべての顕微鏡コンポーネントの電源を入れます。温度コントローラーの電源を入れ、平衡を確保するために37°C3時間前に設定します。
- 液浸検出対物レンズを使用する場合は、残留物のない使い捨てワイプを使用して清掃してください。60 mmの皿を使用して対物レンズの先端を二重蒸留水に浸し、取得が開始されるまでそのままにします。
- CO2コントローラーの電源を入れ、7%に設定します。
- ガラスカバーガラス底部(直径14 mm)のある35 mm皿に高真空シリコングリースを一滴置き、ホルダーをドロップの上に置き、軽く押して固定します。
- 実体顕微鏡下で、培養液を加えて皿のガラス底部分を満たします。その際、流れをホルダーの穴に向け、気泡の形成を防ぎます。
- 気泡が残っている場合は、ステップ1.2で調製したガラスキャピラリーを使用し、マウスピース付きのシリコンチューブに接続し、気泡を静かに吸い出します。
注意: キャピラリーの肘の端は、穴からのアクセスを容易にします。
5.胚のマウント
- インキュベーター内で回復するために残された2〜3個の胚をホルダー付きの皿に移します。残りはバックアップとしてインキュベーターに残してください。
- 一対の鉗子と先細のタングステン針を使用して穴に胚をセットします。針を使用して、外胎盤円錐によって胚を引っ掛け、サイズに一致する穴に挿入します。胚を固定するには、ライヒターの膜が穴の壁に付着するように円錐を90〜120°回転させます(図3C)。別の説明については、26を参照してください。
- 胚とホルダーが入った皿を顕微鏡プレートに慎重に移動します(図3F、G)。
注:着実に動かさない場合、胚はホルダーから移動する可能性があります。 - 中対物レンズ界面に液体メニスカスが形成されるまで対物レンズを下げます。
- 顕微鏡双眼鏡の下で透過光を使用して胚を見つけ、胚に焦点を合わせます。
- インキュベーションチャンバーを取り付け、テープを使用して対物レンズの周囲を密閉します(図3F)。
- 顕微鏡制御ソフトウェアでライブキャプチャを使用して、レーザー出力とゲインレベルを調整します。
注:緑色蛍光タンパク質(GFP)およびTdtomatorレポーターの2光子取得では、このプロトコルでは、980 nmで30%の出力レーザー出力と、非スキャン検出器で70%のゲインが使用されました(図3G)。 - 蒸発を防ぐために、媒体を対物レンズにゆっくりと滴下してパラフィンオイルで覆います。
注:これは、追加の胚をホルダーに取り付けることができる最後のポイントです。パラフィンオイルで覆われたら、ホルダーを清掃し、培地を交換する必要があります。その他の取り付け方法については、27を参照してください。
6. 画像取得
- タイムラプス録画を設定します。スタック間に3〜5μmのzスペースで5〜10分の時間間隔を設定します。zスタックの上に空白スペースを残して、胚の成長を予測し、最低50μm、取得が監視されない時間ごとに30μmを追加します。
- 利用可能な場合は、[自動保存]オプションを有効にして、パーソナルコンピュータからの取り込みを監視できるようにし、必要に応じて、焦点内の関心領域に合うようにZスタックサイズを調整できるようにします。
図3:ライブイメージングツールとセットアップ 。 (A)実体顕微鏡下でアガロースコーティングされたディッシュでマウス胚を解剖する。(B)ライブイメージングのためにマウス胚を解剖するステップの図。(C)ホルダー内の胚の位置。(D)胚ホルダーの設計と機能。(F)インキュベーターチャンバー周囲の浸漬対物レンズ。(G)タイムラプス取得の最終セットアップの図。スケールバー= 500μm(A)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルを使用して、原始心臓管形態形成中に内皮細胞に分化しようとしている初期の心臓前駆細胞におけるNOTCHシグナル伝達活性化を視覚化しました。そのために、野生型C57BL/6-NマウスとTg(CBF:H2BVenus,+)マウス18 を交配し、黄色蛍光タンパク質Venusを介してNOTCH活性を報告する胚を取得しました。E7.5では、金星蛍光は神経外胚葉全体に存在し、内臓および胚外中胚葉にいくつかの正の核があります。4時間後、内皮前駆細胞は金星を活性化して集合し、心内膜チューブとその下にある大動脈を形成し、7時間後には密閉構造になります(図4)。
図4:多光子イメージングによる全胚心臓の生きた発達。 初期芽段階(E7.5)のCBF:H2BVenus+/- マウス胚のタイムラプスビデオから選択された時点。(A)明視野光学セクション。(b)金星蛍光タンパク質発現を示す480-510 nm検出器バンド。スケールバー= 100μm。黄色の矢印は、発達中の心内腔と大動脈を指しています。時間は、各画像の右上にh:minで示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
初期の心臓前駆細胞は、それがまだ形成されている間に鼓動を開始する原始的な心臓管で組織化します。このプロセスがどのように行われるかを理解することは、特定の形態形成イベントに対する先天性心疾患の広い範囲を特定するための鍵です。そのために、ライブイメージングは、時間分解能を高めて正常および欠陥のある胚発生を研究する機会を提供します。これは、初期の心臓前駆細胞が多重分化および遊走行動を通じて迅速に移行するため、初期の心臓前駆細胞を研究するのに特に有用です7。
単一の標本で異なる胚期を研究できるため、ここで提示されたライブイメージングプロトコルを使用して、静的分析で研究された形態形成イベントの補間を裏付けることができます。これは、発達イベントのシーケンスを継続的に理解するのに役立ちます。さらに、ライブ解析は多次元データを生成し、細胞の挙動を測定することにより、前例のない精度で細胞タイプの分類を可能にします28。
その利点にもかかわらず、ここで提案する方法にはいくつかの制限があります。胚は顕微鏡内で最大48時間まで発達することができますが、長い取得では関心領域がフレームから外れる傾向があります。それが起こらないようにするために、ユーザーは取得プロセス中に胚のドリフトを定期的にチェックする必要があります。サンプルの焦点を補正する自動システムが存在しますが12、これらはほとんどの市販の顕微鏡では実装できません。あるいは、2人以上のユーザーが交代で胚のフレームとスタックを監督および調整できるため、長時間の取得はそれほど難しくありません。ただし、特にトレーニングを受けていないユーザーにとって、長期の買収は失敗する可能性がかなりあることに注意する必要があります。解剖中の軽度の胚損傷とホルダー内の位置不良が主な原因の2つです。これらのスキルを向上させるために、ライブイメージング実験を試す前に、インキュベーターでマウントされた胚を培養することから始めることができます。そうすれば、顕微鏡検査のリソースを費やす前に、胚が適切に発達するかどうかをテストできます。
要約すると、ライブイメージング法は、胚発生を研究するための新しい道を開いています。ここで提示されたプロトコルは、突然変異胚における表現型の起源を詳細に分析するか、または薬理学的操作を通じて特定の分子経路の機能をテストすることを可能にする。このビデオツールキットを使用して、初期の心臓前駆細胞の複雑さを理解するための幅広い使用を促進することを目指しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、この方法に関する以前の研究についてKenzo Ivanovitch博士と、胚マウントに関する初期の専門知識を提供した野中茂徳博士(自然科学研究機構)のグループを認めています。この研究は、スペイン科学大臣のGrant PGC2018-096486-B-I00と、EU Horizon 2020プログラムからMTへのGrant H2020-MSCA-ITN-2016-722427、およびFEDERアンダルシア2014-2020オペレーティングプログラムからJNDへの助成金1380918によってサポートされました。MSは、ラカイシャ財団博士フェローシップ(LCF / BQ / DE18 / 11670014)および生物学者旅行フェローシップ(DEVTF181145)によってサポートされました。CNICは、スペイン科学省とProCNIC財団によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A.
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al.
