Summary
Apresentamos um protocolo detalhado para cultura e imagem de embriões de camundongos que permite imagens 3D + tempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de ferramentas de vídeo aborda as principais habilidades necessárias para o sucesso da geração de imagens ao vivo, de outra forma difíceis de adquirir de publicações somente de texto.
Abstract
Os primeiros passos do desenvolvimento cardíaco implicam mudanças drásticas no comportamento e diferenciação celular. Enquanto a análise de embriões fixos permite estudar em detalhes estágios específicos de desenvolvimento em um instantâneo estático, a imagem ao vivo captura eventos morfogenéticos dinâmicos, como migração celular, mudanças de forma e diferenciação, por meio de imagens do embrião à medida que ele se desenvolve. Isso complementa a análise fixa e expande a compreensão de como os órgãos se desenvolvem durante a embriogênese. Apesar de suas vantagens, a imagem ao vivo raramente é usada em modelos de mouse por causa de seus desafios técnicos. Os embriões precoces de camundongos são sensíveis quando cultivados ex vivo e requerem manuseio eficiente. Para facilitar um uso mais amplo de imagens vivas em pesquisas de desenvolvimento de camundongos, este artigo apresenta um protocolo detalhado para microscopia viva de dois fótons que permite a aquisição a longo prazo em embriões de camundongos. Além do protocolo, são fornecidas dicas sobre manuseio de embriões e otimização da cultura. Isso ajudará a entender os principais eventos na organogênese precoce do camundongo, melhorando a compreensão da biologia do progenitor cardiovascular.
Introduction
O coração se forma cedo durante a embriogênese para começar a bombear nutrientes para todo o embrião, enquanto ele continua se desenvolvendo1. Em embriões de camundongos, um dia e meio após o início da gastrulação, um órgão cardíaco rudimentar se reúne no polo anterior 2,3. No estágio Early Streak (ES), os progenitores cardíacos no epiblasto ingressam através da estria primitiva para a camada mesodérmica nascente 4,5,6 e começam a migrar para o polo anterior, onde se diferenciam para formar o tubo cardíaco primitivo. Ao longo desse processo, os progenitores cardíacos precoces passam por rearranjos celulares, transformações de forma e diferenciação, além da migração7 (Figura 1).
Os primeiros progenitores cardíacos atraíram pesquisadores por quase um século devido à sua notável capacidade de diferenciar e construir um órgão funcional simultaneamente. Nas últimas duas décadas, a análise clonal e os modelos de knockout condicional mostraram que o desenvolvimento cardíaco precoce implica fontes celulares distintas em um processo altamente dinâmico 8,9,10. No entanto, a estrutura 3D do tubo cardíaco primitivo e a natureza dinâmica de sua morfogênese o tornam difícil de estudar (Figura 1), e estamos longe de compreender toda a sua complexidade11.
Para estudar esses processos celulares dinâmicos, os métodos de imagem ao vivo agora oferecem um detalhe sem precedentes 7,12,13,14. No modelo de camundongos, as abordagens ao vivo têm sido fundamentais para interrogar tópicos de desenvolvimento que são difíceis de abordar pela análise estática 7,13,15. Embora a cultura ex vivo de longo prazo e as configurações robustas de microscópio estejam avançando rapidamente16,17, poucos pesquisadores têm a experiência para obter imagens bem-sucedidas de embriões vivos. Embora as publicações baseadas em papel forneçam detalhes técnicos suficientes para reproduzir experimentos de imagem ao vivo, algumas habilidades e truques são difíceis de entender sem exemplos visuais ou assistência peer-to-peer. Para acelerar esse processo de aprendizagem e difundir o uso de imagens ao vivo entre os laboratórios, montamos um protocolo de vídeo (Figura 2) que reúne as habilidades necessárias para realizar imagens ao vivo em embriões de camundongos gastrulantes.
Figura 1: Diferenciação precoce das células progenitoras cardíacas no embrião de camundongo desde o início da gastrulação até o estágio que precede a formação primitiva do tubo cardíaco. As células progenitoras cardíacas entram no mesoderma logo após o início da gastrulação, migrando para o lado oposto do embrião. O estágio morfológico e embrionário do dia (E) é escrito em cima dos diagramas. As setas tracejadas retratam a trajetória de migração de progenitores primitivos do tubo cardíaco durante a gastrulação. Este número foi adaptado de11. Abreviaturas: ES = Early Streak; MS = Estria Média; EHF = Early Head Fold. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama de fluxo de trabalho para imagens ao vivo dos primeiros progenitores cardíacos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comité de Ética em Experimentação Animal da CNIC, pela Comunidade de Madrid (Referência PROEX 220/15) e em conformidade com a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos, aplicados na legislação espanhola ao abrigo do Real Decreto 1201/2005.
Esse protocolo inclui o uso de dois machos da linhagem de camundongos transgênicos fluorescentes relatando atividade NOTCH Tg(CBF:H2BVenus,+)18. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre materiais, animais e equipamentos usados neste protocolo.
1. Ferramentas e personalização do suporte
- Corte pedaços de fio de tungstênio de 1 cm de comprimento e afie-os para 0,02-0,05 mm de diâmetro usando qualquer um dos métodos simples disponíveis, por exemplo, submergindo a ponta do fio em uma solução saturada de nitrito de sódio19.
- Prepare capilares de vidro cotovelados.
- Coloque o ponto médio de um capilar de vidro padrão de 1,0 mm sobre um isqueiro Bunsen por 3-6 s, puxando lentamente de ambas as extremidades até que o capilar fique fino e flexível. Nesse ponto, quebre o capilar ao meio e aqueça-o brevemente para produzir uma flexão de 90° a 2 cm da ponta.
- Viu um pedaço de polimetilmetacrilato medindo aproximadamente 7 mm de comprimento, 4 mm de largura e 2 mm de espessura (Figura 3D).
NOTA: As folhas de polimetilmetacrilato podem ser obtidas a partir de equipamento de laboratório reciclado ou encomendadas novas. - Segure a peça de metacrilato usando uma viseira de banco. Em seguida, faça furos de tamanho personalizado transversalmente em toda a peça (Figura 3D).
NOTA: Normalmente, embriões de camundongos E6.5 a E7.5 requerem o uso de brocas de 0,2-0,5 mm de diâmetro.- Gire a broca lentamente enquanto aplica pressão baixa, mas constante. Se uma broca quebrar dentro do suporte, descarte a peça, pois o metal não pode ser retirado.
- Use um arquivo fino para suavizar as bordas do suporte e ajustar seu tamanho. Além disso, crie uma inclinação suave nas bordas do suporte para facilitar o posicionamento do embrião (Figura 3D).
- Coloque o suporte acabado em um prato com água destilada para enxaguar.
- Verifique o suporte sob o estereomicroscópio para ver se os furos contêm poeira de perfuração. Se a poeira estiver presente, use agulhas de tungstênio para removê-la.
- Para esterilizar o suporte, coloque-o em um tubo cônico cheio de água destilada e sonice-o por 20 minutos com uma potência mínima de 20 W.
2. Preparação para a mídia
- Para inactivar o sistema complemento térmico, deixe duas alíquotas de 500 μL de soro comercial ou caseiro de20 ratos a 56 °C durante 30 minutos.
NOTA: Para obter um protocolo detalhado sobre como preparar o soro de rato, ver21. - Em um exaustor de cultura celular, prepare duas alíquotas do meio para a cultura dos embriões no microscópio. Para cada um, misture 490 μL de DMEM para imagens de células vivas, 500 μL de soro de rato inativado e 10 μL de penicilina-estreptomicina para obter uma concentração final de 50 μg/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina22.
NOTA: O volume do meio de cultura depende do tempo e do número de embriões a serem cultivados. Como regra geral, o crescimento ideal requer um mínimo de 200 μL por embrião por dia em embriões E7.0. - Usando uma seringa de 2 mL, filtre o meio através de um filtro de membrana de tamanho de poro de 0,22 μm em um novo tubo e coloque-o aberto em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 7% de CO2 por 1 h antes da cultura embrionária23.
- Preparar o meio de dissecção adicionando a um frasco de 500 mL de DMEM suplementado com frasco de L-glutamina o seguinte: 50 mL de soro fetal bovino, 10 mL de HEPES-NaOH de 25 mM (pH 7,2) e 10 mL de penicilina e estreptomicina (50 mg/mL).
- Em seguida, separe-o em alíquotas de 50 mL, coloque três alíquotas em um banho de 37 °C e armazene o restante a 4 °C por até 3 meses.
3. Dissecção embrionária
- Eutanasiar uma rata grávida E6.75-E7.5.
- Extraia o útero e coloque-o em um lenço de papel seco e limpo. Em seguida, corte o útero, inserindo a ponta da tesoura fina do lado do mesoteste e deslizando a lâmina para expor as decíduas e transferi-las para o meio de dissecção. Para obter um protocolo detalhado, consulte24.
- Dissecar os embriões, mantendo o cone ectoplacentário intacto (Figura 3A,B). Para obter um método de dissecação detalhado, consulte25.
- Em seguida, descasque a membrana de Reichert, deixando parte dela na região extraembrionária (Figura 3B).
NOTA: Fórceps finos são essenciais para esta etapa. Usuários inexperientes podem dissecar embriões em pratos revestidos com gel de agarose a 2% para evitar dobrar as pontas da pinça contra a superfície do prato (Figura 3C). - Para manter o meio de dissecação quente, substitua-o a cada 10 minutos. Além disso, dissecar as decíduas em grupos de 3-4, mantendo o restante em meio de dissecação colocado em um banho de 37 °C. Coloque imediatamente os embriões dissecados em meio de cultura.
- Selecione os embriões com as características de fluorescência desejadas usando um estereomicroscópio de fluorescência e coloque-os no tubo contendo meio de cultura na incubadora de cultura celular.
- Se os embriões estiverem nos estágios E6.5 a E7.0, feche a tampa e deixe os embriões se recuperarem por 2 h antes da imagem.
NOTA: Os embriões E6.5 a E7.0 são sensíveis. Eles também podem ser colocados diretamente sob o microscópio, mas a precultura permite a seleção dos que melhor se recuperam da dissecção, aumentando a chance de sucesso.
4. Preparação do microscópio
- Ligue todos os componentes do microscópio, incluindo lasers, computador e software. Ligue os controladores de temperatura e ajuste para 37 °C com 3 h de antecedência para garantir o equilíbrio.
- Se estiver usando um objetivo de detecção de imersão, limpe-o usando um lenço descartável sem resíduos. Mergulhe a ponta da objetiva em água destilada duplamente usando um prato de 60 mm e deixe-a até o início da aquisição.
- Ligue o controlador CO2 e defina-o como 7%.
- Coloque uma gota de graxa de silício de alto vácuo em um prato de 35 mm com fundo de tampa de vidro (14 mm de diâmetro), coloque o suporte em cima da gota e pressione suavemente para imobilizá-lo.
- Sob um estereomicroscópio, adicione o meio de cultura para preencher a parte de fundo de vidro do prato. Ao fazer isso, aponte o fluxo para os orifícios do suporte para evitar a formação de bolhas de ar neles.
- Se as bolhas permanecerem, use o capilar de vidro preparado na etapa 1.2, conectado a um tubo de silicone com um bocal, para sugar as bolhas suavemente.
NOTA: A extremidade cotovelada do capilar facilitará o acesso através dos orifícios.
5. Montagem do embrião
- Transfira 2-3 embriões que foram deixados para recuperar na incubadora para o prato com o titular. Deixe o resto na incubadora como um backup.
- Coloque os embriões nos orifícios usando um par de pinças e uma agulha de tungstênio cônica. Use a agulha para prender o embrião pelo cone ectoplacentário e insira-o em um orifício de correspondência de tamanho. Para imobilizar o embrião, gire o cone em 90-120° para que a membrana do Reichter adera às paredes do orifício (Figura 3C). Para uma descrição alternativa, ver26.
- Mover cuidadosamente o prato que contém os embriões e o suporte para a placa do microscópio (Figura 3F,G).
NOTA: Se não for movido de forma constante, o embrião pode sair do suporte. - Abaixe a objetiva até que um menisco líquido seja formado na interface médio-objetivo.
- Localize o embrião usando a luz transmitida sob o binóculo do microscópio e coloque o embrião em foco.
- Monte a câmara de incubação e sele em torno da objetiva usando fita adesiva (Figura 3F).
- Usando uma captura ao vivo no software de controle do microscópio, ajuste os níveis de saída e ganho do laser.
NOTA: Para a aquisição de dois fótons de proteína verde fluorescente (GFP) e repórteres de Tdtomato, foram utilizados neste protocolo 30% de potência do laser de saída a 980 nm e 70% de ganho em detectores não desdecantados (Figura 3G). - Para evitar a evaporação, cubra o meio com óleo de parafina, pingando-o lentamente na objetiva.
NOTA: Este é o último ponto em que embriões adicionais podem ser montados no suporte. Uma vez coberto com óleo de parafina, seria necessário limpar o suporte e substituir o meio para fazê-lo. Para métodos de montagem alternativos, ver27.
6. Aquisição de imagens
- Configure a gravação de lapso de tempo. Defina um intervalo de tempo de 5-10 min com 3-5 μm de z-space entre as pilhas. Deixe um espaço em branco no topo da pilha z para antecipar o crescimento embrionário, um mínimo de 50 μm, adicionando 30 μm para cada hora que a aquisição não será supervisionada.
- Se disponível, habilite a opção Auto-Save para permitir a supervisão da aquisição de um computador pessoal para permitir o ajuste do tamanho da pilha z, se necessário, para se adequar à área de interesse dentro do foco.
Figura 3: Ferramentas de imagem ao vivo e configuração . (A) Dissecando embriões de camundongos com um prato revestido de agarose sob o estereomicroscópio. (B) Diagrama das etapas para dissecar embriões de camundongos para imagens vivas. (C) Posicionamento do embrião no titular. (D) Concepção e características do portador de embriões. (F) Câmara da incubadora em torno do objetivo de imersão. (G) Diagrama da configuração final para aquisição de lapso de tempo. Barra de escala = 500 μm (A). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Utilizamos o protocolo para visualizar a ativação da sinalização NOTCH em progenitores cardíacos precoces prestes a se diferenciar para células endoteliais durante a morfogênese primitiva do tubo cardíaco. Para isso, cruzamos camundongos do tipo selvagem C57BL/6-N com camundongos Tg (CBF:H2BVenus,+)18 para obter embriões relatando atividade NOTCH através da proteína fluorescente amarela Vênus. Em E7.5, a fluorescência de Vênus está presente em todo o ectoderma neural, com alguns núcleos positivos no mesoderma esplâncnico e extraembrionário. Após 4 h, os progenitores endoteliais ativam Vênus e se reúnem para formar o tubo endocárdico e as aortas subjacentes, que se tornam estruturas fechadas após 7 h (Figura 4).
Figura 4: Desenvolvimento do coração embrionário inteiro vivo por imagem multifóton. Pontos de tempo selecionados de um vídeo de lapso de tempo de um embrião de camundongo CBF:H2BVenus+/- no estágio inicial do broto (E7.5). (A) Seções ópticas de campo brilhante. (B) Banda detectora de 480-510 nm mostrando expressão de proteínas fluorescentes de Vênus. Barras de escala = 100 μm. As pontas de seta amarelas apontam para o lúmen endocárdico em desenvolvimento e aortas. A hora é indicada em h:min no canto superior direito de cada imagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os primeiros progenitores cardíacos se organizam em um tubo cardíaco primitivo que começa a bater enquanto ainda está se formando. Entender como esse processo ocorre é fundamental para identificar o amplo espectro de defeitos cardíacos congênitos para eventos morfogenéticos específicos. Para isso, a imagem ao vivo oferece uma oportunidade de estudar o desenvolvimento embrionário normal e defeituoso com maior resolução temporal. Isso é especialmente útil para estudar as células progenitoras cardíacas precoces à medida que elas transitam rapidamente através de múltiplos comportamentos de diferenciação e migração7.
Como podemos estudar diferentes estágios embrionários em um único espécime, o protocolo de imagem ao vivo aqui apresentado pode ser utilizado para corroborar a interpolação de eventos morfogenéticos estudados em análise estática. Isso ajudará a entender a sequência de eventos de desenvolvimento de maneira contínua. Além disso, a análise ao vivo produz dados multidimensionais, o que permite a classificação de tipos celulares com precisão sem precedentes, medindo comportamentos celulares28.
Apesar de suas vantagens, o método aqui proposto apresenta algumas limitações. Embora os embriões possam se desenvolver bem até 48 h dentro do microscópio, a região de interesse tende a sair do quadro em longas aquisições. Para evitar que isso aconteça, o usuário deve verificar regularmente a deriva do embrião durante o processo de aquisição. Embora existam sistemas automáticos para corrigir o foco da amostra12, estes não podem ser implementados na maioria dos microscópios comercialmente disponíveis. Alternativamente, dois ou mais usuários podem se revezar para supervisionar e ajustar a estrutura e a pilha do embrião, de modo que as aquisições longas não sejam tão desafiadoras. No entanto, deve-se ter em mente que aquisições longas têm uma chance considerável de fracasso, especialmente para usuários não treinados. Pequenos danos embrionários durante a dissecção e mau posicionamento no suporte são duas das principais causas. Para melhorar essas habilidades, pode-se começar cultivando embriões montados na incubadora antes de tentar experimentos de imagem ao vivo. Dessa forma, pode-se testar se os embriões se desenvolvem adequadamente antes de gastar recursos de microscopia.
Em resumo, os métodos de imagem ao vivo estão abrindo novos caminhos para estudar o desenvolvimento embrionário. O protocolo aqui apresentado permite analisar detalhadamente a origem dos fenótipos em embriões mutantes ou testar a função de vias moleculares específicas através da manipulação farmacológica. Com este kit de ferramentas de vídeo, pretendemos facilitar seu amplo uso para entender a complexidade dos progenitores cardíacos precoces.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o Dr. Kenzo Ivanovitch pelo trabalho anterior sobre este método e o grupo do Dr. Shigenori Nonaka (Institutos Nacionais de Ciências Naturais, Japão) por fornecer a experiência inicial na montagem de embriões. Este estudo foi apoiado pelo Grant PGC2018-096486-B-I00 do Ministério da Ciência e Inovação espanhol e Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 do programa EU Horizon 2020 para MT e Grant 1380918 do FEDER Andalucía 2014-2020 Programa Operacional para JND. O MS foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação La Caixa (LCF/BQ/DE18/11670014) e pela bolsa itinerante da The Company of Biologists (DEVTF181145). O CNIC é apoiado pelo Ministério da Ciência espanhol e pela Fundação ProCNIC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
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