Summary
Kardiyak progenitör hücrelerin 3D + zaman görüntülemesini sağlayan fare embriyo kültürü ve görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu video araç seti, başarılı canlı görüntüleme için gereken temel becerileri ele alır, aksi takdirde yalnızca metin yayınlarından elde edilmesi zordur.
Abstract
Kalp gelişiminin ilk adımları, hücre davranışında ve farklılaşmasında ciddi değişiklikler anlamına gelir. Sabit embriyoların analizi, hareketsiz bir anlık görüntüde spesifik gelişim aşamalarının ayrıntılı olarak incelenmesine izin verirken, canlı görüntüleme, embriyoyu geliştikçe görüntüleyerek hücre göçü, şekil değişiklikleri ve farklılaşma gibi dinamik morfogenetik olayları yakalar. Bu, sabit analizi tamamlar ve embriyogenez sırasında organların nasıl geliştiğinin anlaşılmasını genişletir. Avantajlarına rağmen, canlı görüntüleme, teknik zorlukları nedeniyle fare modellerinde nadiren kullanılır. Erken fare embriyoları kültüre alındığında ex vivo hassastır ve verimli kullanım gerektirir. Fare gelişimsel araştırmalarında canlı görüntülemenin daha geniş bir kullanımını kolaylaştırmak için, bu makale fare embriyolarında uzun süreli edinime izin veren iki fotonlu canlı mikroskopi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Protokole ek olarak, embriyo işleme ve kültür optimizasyonu hakkında ipuçları verilmektedir. Bu, erken fare organogenezindeki önemli olayların anlaşılmasına yardımcı olacak ve kardiyovasküler progenitör biyolojisinin anlaşılmasını artıracaktır.
Introduction
Kalp, embriyogenez sırasında tüm embriyoya besin pompalamaya başlamak için erken oluşurken, gelişmeye devam eder1. Fare embriyolarında, gastrülasyonun başlamasından bir buçuk gün sonra, ön kutup 2,3'te ilkel bir kalp organı toplanır. Erken Çizgi (ES) evresinde, epiblasttaki kardiyak progenitörler ilkel çizgiden yeni ortaya çıkan mezodermal tabaka 4,5,6'ya girer ve ilkel kalp tüpünü oluşturmak için farklılaştıkları ön kutba göç etmeye başlarlar. Bu süreç boyunca, erken kalp progenitörleri, göç7'ye ek olarak hücre yeniden düzenlemelerine, şekil dönüşümlerine ve farklılaşmaya maruz kalırlar (Şekil 1).
Erken kardiyak progenitörler, aynı anda fonksiyonel bir organı ayırt etme ve inşa etme konusundaki olağanüstü yetenekleri nedeniyle yaklaşık bir yüzyıl boyunca araştırmacıları cezbetmiştir. Son yirmi yılda, klonal analiz ve koşullu nakavt modelleri, erken kalp gelişiminin oldukça dinamik bir süreçte farklı hücre kaynaklarını içerdiğini göstermiştir 8,9,10. Bununla birlikte, ilkel kalp tüpünün 3B yapısı ve morfogenezinin dinamik doğası çalışmayı zorlaştırır (Şekil 1) vetam karmaşıklığını anlamaktan çok uzağız.
Bu dinamik hücresel süreçleri incelemek için, canlı görüntüleme yöntemleri şimdi benzeri görülmemiş bir ayrıntı sunuyor 7,12,13,14. Fare modelinde, canlı yaklaşımlar, statik analizile ele alınması zor olan gelişimsel konuları sorgulamanın anahtarı olmuştur 7,13,15. Uzun süreli ex vivo kültür ve sağlam mikroskop kurulumları16,17 hızlı ilerlerken, az sayıda araştırmacı canlı embriyoları başarılı bir şekilde görüntüleme uzmanlığına sahiptir. Kağıt tabanlı yayınlar canlı görüntüleme deneylerini yeniden üretmek için yeterli teknik ayrıntı sağlasa da, bazı beceri ve püf noktalarının görsel örnekler veya eşler arası yardım olmadan kavranması zordur. Bu öğrenme sürecini hızlandırmak ve laboratuvarlar arasında canlı görüntüleme kullanımını yaygınlaştırmak için, gastrulating fare embriyoları üzerinde canlı görüntüleme yapmak için gerekli becerileri toplayan bir video protokolü (Şekil 2) oluşturduk.
Şekil 1: Fare embriyosundaki kardiyak progenitör hücrelerin gastrulasyonun başlangıcından ilkel kalp tüpü oluşumundan önceki aşamaya kadar erken farklılaşması. Kardiyak progenitör hücreler, gastrulasyonun başlamasından kısa bir süre sonra mezoderme girerek embriyonun karşı tarafına göç eder. Diyagramların üzerine morfolojik ve embriyonik gün (E) evresi yazılmıştır. Kesikli oklar, gastrulasyon sırasında ilkel kalp tüpü progenitörlerinin göç yörüngesini tasvir eder. Bu rakam11'den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: ES = Early Streak; MS = Orta Çizgi; EHF = Erken Baş Katımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Erken kalp progenitörlerinin canlı görüntülenmesi için iş akışı diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, CNIC Hayvan Deneyleri Etik Komitesi, Madrid Topluluğu (Referans PROEX 220/15) tarafından onaylanmış ve Real Decreto 1201/2005 uyarınca İspanyol yasalarında uygulanan, deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63EU sayılı AB Direktifi ve 2007/526/EC sayılı Tavsiye Kararı'na uygun hale getirilmiştir.
Bu protokol, NOTCH aktivitesini bildiren floresan transgenik fare hattından iki erkeğin kullanımını içerir Tg (CBF: H2BVenus,+)18. Bu protokolde kullanılan malzemeler, hayvanlar ve ekipmanlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Araçlar ve tutucu özelleştirme
- 1 cm uzunluğundaki tungsten tel parçalarını kesin ve mevcut basit yöntemlerden herhangi birini kullanarak 0.02-0.05 mm çapa kadar keskinleştirin, örneğin, telin ucunu doymuş bir sodyum nitrit çözeltisine batırın19.
- Dirsekli cam kılcal damarlar hazırlayın.
- Standart 1,0 mm'lik cam kılcal damarın orta noktasını 3-6 sn boyunca bir Bunsen çakmağının üzerine yerleştirin ve kılcal damar ince ve esnek hale gelene kadar her iki uçtan yavaşça çekin. Bu noktada, kılcal damarı ikiye bölün ve uçtan 2 cm uzakta 90 ° 'lik bir bükülme üretmek için kısaca ısıtın.
- Yaklaşık 7 mm uzunluğunda, 4 mm genişliğinde ve 2 mm kalınlığında bir polimetil metakrilat parçası gördüm (Şekil 3D).
NOT: Polimetil metakrilat levhalar geri dönüştürülmüş laboratuvar ekipmanlarından elde edilebilir veya yeni sipariş edilebilir. - Metakrilat parçasını bir tezgah mengene kullanarak tutun. Ardından, özel boyutlu delikleri tüm parça boyunca enine delin (Şekil 3D).
NOT: Tipik olarak, E6,5 ila E7,5 fare embriyoları için 0,2-0,5 mm çapında matkaplar kullanılması gerekir.- Düşük fakat sabit basınç uygularken matkabı yavaşça döndürün. Tutucunun içinde bir matkap kırılırsa, metal çıkarılamayacağından parçayı atın.
- Tutucunun kenarlarını yumuşatmak ve boyutunu ayarlamak için ince bir dosya kullanın. Ek olarak, embriyo konumlandırmasını kolaylaştırmak için tutucunun kenarlarında hafif bir eğim oluşturun (Şekil 3D).
- Bitmiş tutucuyu durulamak için damıtılmış su içeren bir kaba yerleştirin.
- Deliklerin delme tozu içerip içermediğini görmek için stereomikroskop altındaki tutucuyu kontrol edin. Toz varsa, çıkarmak için tungsten iğneleri kullanın.
- Tutucuyu sterilize etmek için, damıtılmış suyla dolu konik bir tüpe yerleştirin ve minimum 20 W güç çıkışıyla 20 dakika boyunca sonikleştirin.
2. Medya hazırlama
- Kompleman sistemini ısıl olarak inaktive etmek için, 30 dakika boyunca 56 ° C'de iki adet500 μL ticari veya ev yapımı 20 sıçan serumu alikotu bırakın.
NOT: Sıçan serumunun nasıl hazırlanacağına ilişkin ayrıntılı bir protokol için, bkz.21. - Bir hücre kültürü başlığında, embriyoları mikroskopta kültürlemek için ortamın iki alikotunu hazırlayın. Her biri için, canlı hücreli görüntüleme için 490 μL DMEM, 500 μL inaktive sıçan serumu ve 10 μL penisilin-streptomisin karışımı ile 50 μg / mL penisilin ve 50 μg / mL streptomisin22'lik nihai bir konsantrasyon elde edin.
NOT: Kültür ortamının hacmi, kültürlenecek embriyoların zamanına ve sayısına bağlıdır. Genel bir kural olarak, optimal büyüme, E7.0 embriyolarında embriyo başına günde en az 200 μL gerektirir. - 2 mL'lik bir şırınga kullanarak, ortamı 0.22 μm gözenek boyutunda bir membran filtreden yeni bir tüpe süzün ve embriyo kültürü 23'ten önce 1 saat boyunca 37 ° C'de ve% 7 CO2'de bir hücre kültürü inkübatörüne kapağını açık olarak yerleştirin.
- L-glutamin şişesi ile desteklenmiş 500 mL'lik bir DMEM'e aşağıdakileri ekleyerek diseksiyon ortamını hazırlayın: 50 mL fetal sığır serumu, 10 mL 25 mM HEPES-NaOH (pH 7.2) ve 10 mL penisilin ve streptomisin (50 mg / mL).
- Daha sonra, 50 mL alikotlara ayırın, 37 ° C'lik bir banyoya üç alikot yerleştirin ve geri kalanını 3 aya kadar 4 ° C'de saklayın.
3. Embriyo diseksiyonu
- E6.75-E7.5 hamile bir fareyi ötenazileştirin.
- Uterusu çıkarın ve kuru ve temiz bir kağıt mendil üzerine yerleştirin. Daha sonra, uterusu kesin, ince makasın ucunu mezometriyal taraftan yerleştirin ve deciduae'yi ortaya çıkarmak ve diseksiyon ortamına aktarmak için bıçağı kaydırın. Ayrıntılı bir protokol için bkz:24.
- Embriyoları disseke ederek ektoplasental koniyi sağlam tutun (Şekil 3A,B). Ayrıntılı bir diseksiyon yöntemi için25'e bakınız.
- Daha sonra, Reichert'in zarını soyun ve bir kısmını ekstraembriyonik bölgede bırakın (Şekil 3B).
NOT: İnce forsepsler bu adım için gereklidir. Deneyimsiz kullanıcılar, forsepslerin uçlarının çanak yüzeyine doğru bükülmesini önlemek için% 2 agaroz jel kaplı tabaklardaki embriyoları diseke edebilir (Şekil 3C). - Diseksiyonu orta sıcak tutmak için, her 10 dakikada bir değiştirin. Ayrıca, diseksiyon 3-4'lü gruplar halinde karar verirken, geri kalanını 37 °C'lik bir banyoya yerleştirilmiş diseksiyon ortamında tutun. Disseke edilmiş embriyoları hemen kültür ortamına yerleştirin.
- İstenilen floresan özelliklerine sahip embriyoları floresan stereomikroskop kullanarak seçin ve hücre kültürü inkübatöründe kültür ortamını içeren tüpe yerleştirin.
- Embriyolar E6.5 ila E7.0 aşamalarındaysa, kapağı kapatın ve görüntülemeden önce embriyoları 2 saat iyileşmeye bırakın.
NOT: E6.5 ila E7.0 embriyoları hassastır. Ayrıca doğrudan mikroskop altına da yerleştirilebilirler, ancak ön kültürleme, diseksiyondan en iyi iyileşenlerin seçilmesine izin vererek başarı şansını arttırır.
4. Mikroskop hazırlama
- Lazerler, bilgisayar ve yazılım dahil olmak üzere tüm mikroskop bileşenlerini açın. Sıcaklık kontrol cihazlarını açın ve dengeyi sağlamak için 3 saat önceden 37 ° C'ye ayarlayın.
- Daldırma algılama hedefi kullanıyorsanız, kalıntı bırakmayan tek kullanımlık bir mendil kullanarak temizleyin. Hedefin ucunu 60 mm'lik bir tabak kullanarak çift damıtılmış suya batırın ve edinme başlayana kadar bırakın.
- CO2 denetleyicisini açın ve %7 olarak ayarlayın.
- Cam kapaklı (14 mm çaplı) 35 mm'lik bir kaba bir damla yüksek vakumlu silikon gres yerleştirin, tutucuyu damlanın üzerine yerleştirin ve hareketsiz hale getirmek için hafifçe bastırın.
- Bir stereomikroskop altında, yemeğin cam alt kısmını doldurmak için kültür ortamı ekleyin. Bunu yaparken, içlerinde hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için akışı tutucunun deliklerine hedefleyin.
- Kabarcıklar kalırsa, kabarcıkları nazikçe emmek için adım 1.2'de hazırlanan, ağızlıklı bir silikon tüpe bağlanmış cam kılcal damarı kullanın.
NOT: Kılcal damarın dirsek ucu deliklerden erişimi kolaylaştıracaktır.
5. Embriyo montajı
- Kuluçka makinesinde iyileşmek için bırakılan 2-3 embriyoyu tutucu ile yemeğe aktarın. Geri kalanını inkübatörde yedek olarak bırakın.
- Bir çift forseps ve konik bir tungsten iğnesi kullanarak embriyoları deliklere yerleştirin. Embriyoyu ektoplasental koni ile bağlamak için iğneyi kullanın ve boyut eşleştirme deliğine yerleştirin. Embriyoyu hareketsiz hale getirmek için, koniyi 90-120 ° döndürün, böylece Reichter'ın zarı delik duvarlarına yapışır (Şekil 3C). Alternatif bir açıklama için bkz:26.
- Embriyoları ve tutucuyu içeren kabı dikkatlice mikroskop plakasına taşıyın (Şekil 3F,G).
NOT: Sabit bir şekilde hareket ettirilmezse, embriyo tutucudan dışarı doğru hareket edebilir. - Orta-objektif arayüzde sıvı bir menisküs oluşana kadar hedefi düşürün.
- Mikroskop dürbünü altında iletilen ışığı kullanarak embriyoyu bulun ve embriyoyu odaklayın.
- Kuluçka odasını monte edin ve bant kullanarak hedefin etrafına kapatın (Şekil 3F).
- Mikroskop kontrol yazılımında Canlı Yakalama kullanarak, Lazer Çıkışı ve Kazanç seviyelerini ayarlayın.
NOT: Yeşil floresan proteinin (GFP) ve Tddomates muhabirlerinin iki foton alımı için, bu protokolde 980 nm'de lazer gücü çıkışının% 30'u ve taranmamış dedektörlerde% 70 kazanç kullanılmıştır (Şekil 3G). - Buharlaşmayı önlemek için, ortamı hedefe yavaşça damlatarak parafin yağı ile örtün.
NOT: Bu, tutucuya ek embriyoların monte edilebileceği son noktadır. Parafin yağı ile kaplandıktan sonra, tutucuyu temizlemek ve bunu yapmak için ortamı değiştirmek gerekir. Alternatif montaj yöntemleri için bkz.27.
6. Görüntü toplama
- Hızlandırılmış kaydı ayarlayın. Yığınlar arasında 3-5 μm z-boşluk olacak şekilde 5-10 dakikalık bir zaman aralığı ayarlayın. Embriyo büyümesini tahmin etmek için z-yığınının üstünde boş bir alan bırakın, minimum 50 μm, edinimin denetlenmeyeceği her saat için 30 μm ekleyin.
- Varsa, gerekirse z-yığını boyutunun odak alanındaki ilgi alanına uyacak şekilde ayarlanmasına izin vermek üzere kişisel bilgisayardan edinimin denetlenmesine izin vermek için Otomatik Kaydet seçeneğini etkinleştirin.
Şekil 3: Canlı görüntüleme araçları ve kurulumu . (A) Fare embriyolarının stereomikroskop altında agaroz kaplı bir çanak ile diseksiyonu. (B) Canlı görüntüleme için fare embriyolarını disseke etme adımlarının diyagramı. (C) Tutucuda embriyo pozisyonu. (D) Embriyo tutucu tasarımı ve özellikleri. (F) Daldırma hedefinin etrafındaki inkübatör odası. (G) Hızlandırılmış edinim için son kurulumun diyagramı. Ölçek çubuğu = 500 μm (A). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlkel kalp tüpü morfogenezi sırasında endotel hücrelerine farklılaşmak üzere olan erken kardiyak progenitörlerde NOTCH sinyal aktivasyonunu görselleştirmek için protokolü kullandık. Bunun için, sarı floresan proteini Venüs aracılığıyla NOTCH aktivitesini bildiren embriyolar elde etmek için vahşi tip C57BL / 6-N fareleri Tg (CBF: H2BVenus, +) farelerle18 ile geçtik. E7.5'te, Venüs floresansı nöral ektoderm boyunca bulunur, splanknik ve ekstraembriyonik mezodermde birkaç pozitif çekirdek bulunur. 4 saat sonra, endotel progenitörleri Venüs'ü aktive eder ve 7 saat sonra kapalı yapılar haline gelen endokardiyal tüp ve altta yatan aortları oluşturmak için bir araya gelir (Şekil 4).
Şekil 4: Multifoton görüntüleme ile embriyo kalp gelişiminin tamamını yaşayın. Erken tomurcuk aşamasında (E7.5) bir CBF: H2BVenus + / - fare embriyosunun hızlandırılmış bir videosundan seçilen zaman noktaları. (A) Parlak alan optik bölümleri. (B) Venüs floresan protein ekspresyonunu gösteren 480-510 nm dedektör bandı. Ölçek çubukları = 100 μm. Sarı ok uçları gelişmekte olan endokardiyal lümen ve aortlara işaret eder. Süre, her görüntünün sağ üst köşesinde s:min olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erken kalp ataları, hala oluşurken atmaya başlayan ilkel bir kalp tüpünde organize olurlar. Bu sürecin nasıl gerçekleştiğini anlamak, konjenital kalp kusurlarının geniş spektrumunu spesifik morfogenetik olaylara belirlemenin anahtarıdır. Bunun için canlı görüntüleme, normal ve kusurlu embriyonik gelişimi artmış zamansal çözünürlükle incelemek için bir fırsat sunar. Bu, özellikle erken kardiyak progenitör hücreleri, çoklu farklılaşma ve göç davranışlarından hızla geçerken incelemek için yararlıdır7.
Tek bir örnekte farklı embriyonik aşamaları inceleyebildiğimiz için, burada sunulan canlı görüntüleme protokolü, statik analizde incelenen morfogenetik olayların interpolasyonunu doğrulamak için kullanılabilir. Bu, gelişimsel olayların sırasını sürekli bir şekilde anlamaya yardımcı olacaktır. Dahası, canlı analiz, hücresel davranışları ölçerek hücre tiplerinin benzeri görülmemiş bir hassasiyetle sınıflandırılmasını sağlayan çok boyutlu veriler verir28.
Avantajlarına rağmen, burada önerilen yöntemin bazı sınırlamaları vardır. Embriyolar mikroskop içinde 48 saate kadar iyi gelişebilse de, ilgilenilen bölge uzun kazanımlarda çerçevenin dışına çıkma eğilimindedir. Bunun olmasını önlemek için, kullanıcı edinme işlemi sırasında embriyonun sürüklenmesini düzenli olarak kontrol etmelidir. Numune odağını düzeltmek için otomatik sistemler mevcut olmasına rağmen12, bunlar ticari olarak temin edilebilen mikroskopların çoğunda uygulanamaz. Alternatif olarak, iki veya daha fazla kullanıcı embriyo çerçevesini ve yığınını denetlemek ve ayarlamak için sırayla alabilir, böylece uzun kazanımlar zor olmaz. Bununla birlikte, uzun satın almaların, özellikle eğitimsiz kullanıcılar için önemli bir başarısızlık şansına sahip olduğu unutulmamalıdır. Diseksiyon sırasında minör embriyo hasarı ve tutucudaki zayıf pozisyon başlıca nedenlerden ikisidir. Bu becerileri geliştirmek için, canlı görüntüleme deneylerini denemeden önce inkübatörde monte edilmiş embriyoları kültürleyerek başlayabilirsiniz. Bu şekilde, mikroskopi kaynaklarını harcamadan önce embriyoların düzgün gelişip gelişmediği test edilebilir.
Özetle, canlı görüntüleme yöntemleri embriyonik gelişimi incelemek için yeni yollar açıyor. Burada sunulan protokol, mutant embriyolardaki fenotiplerin kökenini ayrıntılı olarak analiz etmeyi veya farmakolojik manipülasyon yoluyla spesifik moleküler yolakların işlevini test etmeyi sağlar. Bu video araç seti ile, erken kardiyak progenitörlerin karmaşıklığını anlamaya yönelik geniş kullanımını kolaylaştırmayı amaçlıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, bu yöntem üzerindeki önceki çalışmaları için Dr. Kenzo İvanoviç'e ve embriyo montajı konusundaki ilk uzmanlığı sağladığı için Dr. Shigenori Nonaka'nın (Ulusal Doğa Bilimleri Enstitüleri, Japonya) grubuna teşekkür etmektedir. Bu çalışma, İspanya Ministerio de Ciencia e Innovación'dan Grant PGC2018-096486-B-I00 ve AB Horizon 2020 programından MT'ye Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 ve FEDER Endülüs 2014-2020 Çalışma Programı'ndan JND'ye Hibe 1380918 tarafından desteklenmiştir. MS, La Caixa Vakfı doktora bursu (LCF / BQ / DE18 / 11670014) ve Biyologlar Seyahat Bursu Şirketi (DEVTF181145) tarafından desteklenmiştir. CNIC, İspanya Bilim Bakanlığı ve ProCNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
References
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L.
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), Cambridge, England. 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A.
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- González Hinojosa, F. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental. , Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , Cold Harbor Laboratory Press. 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al.
