Summary
Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa Cladonema. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero con un marcatore di cellule staminali consente il rilevamento di cellule staminali e la marcatura con 5-etinil-2'-deossiuridina consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Insieme, possono essere rilevate cellule staminali che proliferano attivamente.
Abstract
Gli cnidiari, tra cui anemoni di mare, coralli e meduse, mostrano morfologie e stili di vita diversi che si manifestano in polipi sessili e meduse che nuotano liberamente. Come esemplificato in modelli consolidati come Hydra e Nematostella, le cellule staminali e/o le cellule proliferative contribuiscono allo sviluppo e alla rigenerazione dei polipi cnidariani. Tuttavia, i meccanismi cellulari sottostanti nella maggior parte delle meduse, in particolare allo stadio di medusa, sono in gran parte poco chiari e, quindi, lo sviluppo di un metodo robusto per identificare specifici tipi di cellule è fondamentale. Questo articolo descrive un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum. Cladonema medusae possiede tentacoli ramificati che crescono continuamente e mantengono la capacità rigenerativa durante la loro fase adulta, fornendo una piattaforma unica con cui studiare i meccanismi cellulari orchestrati da cellule proliferanti e / o staminali. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero (FISH) che utilizza un marcatore di cellule staminali consente la rilevazione di cellule staminali, mentre la marcatura a impulsi con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), un marcatore di fase S, consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Combinando sia l'etichettatura FISH che EdU, possiamo rilevare cellule staminali che proliferano attivamente su animali fissi e questa tecnica può essere ampiamente applicata ad altri animali, comprese le specie di meduse non modello.
Introduction
Cnidaria è considerato un phylum metazoico basalmente ramificato contenente animali con nervi e muscoli, ponendoli in una posizione unica per comprendere l'evoluzione dello sviluppo animale e della fisiologia 1,2. Gli Cnidari sono classificati in due gruppi principali: gli antozoi (ad esempio, anemoni di mare e coralli) possiedono solo larve di planula e stadi di polipo sessili, mentre i Medusozoi (membri di Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa e Cubozoa) assumono tipicamente la forma di meduse che nuotano liberamente, o meduse, così come larve di planula e polipi. Gli Cnidari mostrano comunemente un'elevata capacità rigenerativa e i loro meccanismi cellulari sottostanti, in particolare il possesso di cellule staminali adulte e cellule proliferative, hanno attirato molta attenzione 3,4. Inizialmente identificate in Hydra, le cellule staminali idrozoiche si trovano negli spazi interstiziali tra le cellule epiteliali ectodermiche e sono comunemente indicate come cellule interstiziali o cellulei-3.
Le cellule i-idrozoiche condividono caratteristiche comuni che includono la multipotenza, l'espressione di marcatori di cellule staminali ampiamente conservati (ad esempio, Nanos, Piwi, Vasa) e il potenziale di migrazione 3,5,6,7,8. Come cellule staminali funzionali, le cellule i-sono ampiamente coinvolte nello sviluppo, nella fisiologia e nelle risposte ambientali degli animali idrozoi, il che attesta la loro elevata capacità rigenerativa e plasticità3. Mentre le cellule staminali, simili alle cellule i, non sono state identificate al di fuori degli idrozoi, anche nella specie modello stabilita Nematostella, le cellule proliferative sono ancora coinvolte nel mantenimento e nella rigenerazione del tessuto somatico, così come la linea germinale9. Poiché gli studi sullo sviluppo e la rigenerazione cnidariana sono stati condotti prevalentemente su animali di tipo polipo come Hydra, Hydractinia e Nematostella, la dinamica cellulare e le funzioni delle cellule staminali nelle specie di meduse rimangono in gran parte non affrontate.
La medusa idrozoica Clytia hemisphaerica , una specie di medusa cosmopolita con diversi habitat in tutto il mondo, tra cui il Mar Mediterraneo e il Nord America, è stata utilizzata come animale modello sperimentale in diversi studi evolutivi e sullo sviluppo10. Con le sue piccole dimensioni, la facilità d'uso e le uova di grandi dimensioni, Clytia è adatto per la manutenzione in laboratorio, nonché per l'introduzione di strumenti genetici come i metodi di transgenesi e knockout recentemente stabiliti11, aprendo l'opportunità di un'analisi dettagliata dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della biologia delle meduse. Nel tentacolo di Clytia medusa, le cellule I sono localizzate nella regione prossimale, chiamata bulbo, e i progenitori come i nematoblasti migrano verso la punta distale differenziandosi in tipi cellulari distinti, compresi i nematociti12.
Durante la rigenerazione del Clytia manubrium, l'organo orale delle meduse, le cellule Nanos1+ i-che sono presenti nelle gonadi migrano nella regione in cui il manubrio viene perso in risposta al danno e partecipano alla rigenerazione del manubrio7. Questi risultati supportano l'idea che le cellule i-in Clytia si comportano anche come cellule staminali funzionali coinvolte nella morfogenesi e nella rigenerazione. Tuttavia, dato che le proprietà delle cellule i-differiscono tra animali rappresentativi di tipo polipo come Hydra e Hydractinia3, è possibile che le caratteristiche e le funzioni delle cellule staminali siano diversificate tra le specie di meduse. Inoltre, con l'eccezione di Clytia, le tecniche sperimentali sono state limitate per altre meduse, e la dinamica dettagliata delle cellule proliferative e delle cellule staminali è sconosciuta13.
La medusa idrozoica Cladonema pacificum è un organismo modello emergente che può essere conservato in un ambiente di laboratorio senza pompa dell'acqua o sistema di filtrazione. Il Cladonema medusa ha tentacoli ramificati, una caratteristica comune nella famiglia Cladonematidae, e un organo fotorecettore chiamato ocello sullo strato ectodermico vicino al bulbo14. Il processo di ramificazione dei tentacoli si verifica in un nuovo sito di ramificazione che appare lungo il lato adassiale del tentacolo. Nel corso del tempo, i tentacoli continuano ad allungarsi e ramificarsi, con i rami più vecchi spinti verso la punta15. Inoltre, i tentacoli Cladonema possono rigenerarsi entro pochi giorni dall'amputazione. Studi recenti hanno suggerito il ruolo delle cellule proliferanti e delle cellule staminali nella ramificazione e rigenerazione dei tentacoli in Cladonema16,17. Tuttavia, mentre l'ibridazione convenzionale in situ (ISH) è stata utilizzata per visualizzare l'espressione genica in Cladonema, a causa della sua bassa risoluzione, è attualmente difficile osservare in dettaglio la dinamica delle cellule staminali a livello cellulare.
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare cellule staminali simili a Cladonema mediante FISH e co-colorazione con EdU, un marker di proliferazione cellulare18. Visualizziamo il pattern di espressione di Nanos1, un marcatore di cellule staminali 5,17, di FISH, che consente l'identificazione della distribuzione delle cellule staminali a livello di singola cellula. Inoltre, la co-colorazione dell'espressione di Nanos1 con l'etichettatura EdU consente di distinguere le cellule staminali che proliferano attivamente. Questo metodo per monitorare sia le cellule staminali che le cellule proliferative può essere applicato a una vasta gamma di aree di indagine, tra cui la ramificazione dei tentacoli, l'omeostasi dei tessuti e la rigenerazione degli organi in Cladonema, e un approccio simile può essere applicato ad altre specie di meduse.
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Protocol
NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo.
1. Sintesi della sonda
- Estrazione dell'RNA
- Posizionare tre meduse di Cladonema vive coltivate in acqua di mare artificiale (ASW) in una provetta da 1,5 ml utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 ml con la punta tagliata e rimuovere quanto più ASW possibile.
NOTA: ASW si prepara sciogliendo una miscela di sali minerali in acqua di rubinetto con neutralizzatore di cloro; il peso specifico finale (S.G.) è 1,018 o le parti per mille (ppt) sono ~27. - Congelare i tubi da 1,5 mL in azoto liquido per inibire l'attività della RNasi. Aggiungere 30 μL di tampone di lisi dal kit di isolamento dell'RNA totale in cui è stato aggiunto 2-mercaptoetanolo (1 μL/100 μL di tampone di lisi) e omogeneizzare i campioni nel tampone di lisi usando un omogeneizzatore.
NOTA: Per evitare il trabocco del tampone e del campione dalle provette, si raccomanda l'omogeneizzazione con una piccola quantità di tampone di lisi. - Aggiungere 570 μL di tampone di lisi ed estrarre l'RNA totale seguendo il protocollo del kit di isolamento dell'RNA totale (Figura 1).
- Misurare la concentrazione dell'RNA estratto utilizzando uno spettrofotometro e conservare a -80 °C fino all'uso.
- Posizionare tre meduse di Cladonema vive coltivate in acqua di mare artificiale (ASW) in una provetta da 1,5 ml utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 ml con la punta tagliata e rimuovere quanto più ASW possibile.
- Sintesi del cDNA
- Utilizzando un kit, sintetizzare il cDNA usando l'RNA totale estratto dalle meduse come modello (Figura 1 e Tabella 1).
- Incubare a 65 °C per 5 min.
- Raffreddare rapidamente sul ghiaccio.
- Eseguire la sintesi del cDNA con la miscela del punto 1.2.1 (Tabella 1). Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare a 42 °C per 60 minuti.
- Incubare a 95 °C per 5 min.
- Raffreddare rapidamente sul ghiaccio.
- Misurare la concentrazione del cDNA sintetizzato utilizzando uno spettrofotometro e conservare a -20 °C o al di sotto di -20 °C fino all'uso.
- Sintesi del prodotto PCR
- Per creare un modello PCR, progettare il primer specifico utilizzando Primer-BLAST. Ricavare la sequenza di riferimento dai dati NCBI o dai dati RNA-seq.
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i primer utilizzati in questo protocollo. - Per amplificare la sequenza target, eseguire la clonazione TA, che non richiede l'uso di enzimi di restrizione. Per ottenere un prodotto PCR in cui viene aggiunta un'adenina all'estremità 3', utilizzare le seguenti impostazioni: 98 °C per 2 min; 35 cicli di 98 °C per 10 s, 55-60 °C per 30 s, 72 °C per 1 min. Utilizzare Taq DNA polimerasi per le reazioni (Tabella 1).
NOTA: Per determinare le condizioni della PCR, seguire il protocollo che accompagna la DNA polimerasi da utilizzare, che generalmente fornisce una temperatura di ricottura raccomandata e un tempo di estensione. - Eseguire il prodotto PCR attraverso un gel di agarosio all'1% e tagliare la banda di interesse. Estrarre i prodotti PCR dai gel tagliati utilizzando un kit di estrazione del gel.
- Per creare un modello PCR, progettare il primer specifico utilizzando Primer-BLAST. Ricavare la sequenza di riferimento dai dati NCBI o dai dati RNA-seq.
- Legatura
- Legare il prodotto PCR al vettore con sporgenze di timina 3' mescolando i reagenti (Tabella 1) e incubando a 37 °C per 30 minuti (Figura 1).
NOTA: Il rapporto molecolare di vector:PCR dovrebbe essere 1:>3. La dimensione del vettore pTA2 è di circa 3 kb. Se il prodotto PCR (inserto) è A (kb) e B (ng/μL), il volume dell'inserto (X nella tabella 1) da prelevare può essere calcolato da ([50 ng di vettore × A kb di inserto])/(3 kb di × vettoriale [ 1/3]) = 50· Un ng di inserto. Se la concentrazione dell'inserto è B ng/μL, il volume prelevato è 50· A/B μL dell'inserto.
- Legare il prodotto PCR al vettore con sporgenze di timina 3' mescolando i reagenti (Tabella 1) e incubando a 37 °C per 30 minuti (Figura 1).
- Trasformazione e placcatura
- Per la trasformazione, scongelare le cellule competenti sul ghiaccio e distribuirle in aliquote da 20 μL ciascuna. Aggiungere 1 μL dei plasmidi contenenti il prodotto PCR (meno del 5% del volume cellulare competente) e vortice per 1 s. Incubare su ghiaccio per 5 minuti, quindi incubare a 42 °C per 45 s e vortice per 1 s.
- Aggiungere 180 μL di brodo Super Optimal con terreno di repressione dei cataboliti (SOC) (un terreno di coltura batterica ricco di nutrizione) alle cellule competenti e incubare a 37 °C per 30 minuti. Dopo 30 minuti, distribuire le cellule competenti su una piastra di agar contenente ampicillina, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galatto-piranoside (X-gal) e isopropil-β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare a 37 °C per 12-16 ore (Figura 1).
NOTA: X-gal e IPTG vengono utilizzati per selezionare colonie blu e bianche.
- Coltura liquida
- Scegli una colonia bianca tra le colonie bianche e blu sul piatto. Aggiungere a 3-5 ml di terreno LB con ampicillina e incubare su un agitatore per 12-16 ore a 37 °C (Figura 1).
- Miniprep
- Estrarre il plasmide dal mezzo LB utilizzando un miniprep plasmidico (Figura 1).
- Quantificare la concentrazione del plasmide utilizzando uno spettrofotometro.
- Leggi la sequenza.
- Per leggere la sequenza di DNA del plasmide, inviare il plasmide per il sequenziamento Sanger e quindi utilizzare un software per allinearlo con la sequenza genoma / trascrittoma per confermare se la sequenza target è sintetizzata correttamente e valutare in quale direzione la sequenza target è inserita nel plasmide (da 5' a 3' o da 3' a 5').
NOTA: Se la sequenza bersaglio viene inserita nel plasmide nella direzione da 5' a 3' dal sito di legame della RNA polimerasi vicino all'estremità 3', una sonda antisenso può essere generata mediante trascrizione in vitro . Se la sequenza target viene inserita nella direzione inversa da 3' a 5', è possibile generare una sonda di rilevamento (controllo negativo). Se si utilizzano vettori come pTA2, è possibile utilizzare due siti di legame di trascrizione a seconda dello scopo.
- Per leggere la sequenza di DNA del plasmide, inviare il plasmide per il sequenziamento Sanger e quindi utilizzare un software per allinearlo con la sequenza genoma / trascrittoma per confermare se la sequenza target è sintetizzata correttamente e valutare in quale direzione la sequenza target è inserita nel plasmide (da 5' a 3' o da 3' a 5').
- Trascrizione in vitro
- Preparare il modello di DNA dal plasmide creato eseguendo la PCR utilizzando primer al di fuori del sito di legame della RNA polimerasi (ad esempio, siti di legame T7 / T3) nel plasmide (Figura 1).
NOTA: I primer universali come il primer forward M13-20 e il primer inverso M13 possono essere utilizzati per preparare un modello di DNA che include siti di legame della RNA polimerasi. - Purificare la dima dopo l'amplificazione PCR utilizzando un kit di estrazione gel/PCR.
- Mescolare i reagenti mostrati di seguito ed eseguire la reazione di trascrizione a 37 °C per 3 ore (Figura 1 e Tabella 1).
- Aggiungere 1,5 μL di DNasi e incubare a 37 °C per 30 min.
- Aggiungere 10 μL di acqua priva di RNasi e purificare la sonda dalla soluzione della reazione di trascrizione utilizzando una colonna di pulizia.
- Controllare la dimensione dell'RNA sintetizzato caricando 1 μL su un gel di agarosio all'1% e determinare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro.
NOTA: Le sonde di RNA sintetizzato devono avere una concentrazione di almeno 100 ng/μL. - Aggiungere 30 μL di formammide per conservarla a una temperatura pari o inferiore a -20 °C.
- Preparare il modello di DNA dal plasmide creato eseguendo la PCR utilizzando primer al di fuori del sito di legame della RNA polimerasi (ad esempio, siti di legame T7 / T3) nel plasmide (Figura 1).
2. Incorporazione e fissazione di EdU
- Introdurre Cladonema medusae (5-10 animali per tubo) in provette da 1,5 mL utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,5 mL e aggiungere ASW fino ad un volume totale di 500 μL. Aggiungere 7,5 μL di soluzione madre EdU da 10 mM e incubare i campioni per 1 ora a 22 °C (Figura 2). La concentrazione finale di EdU è di 150 μM.
NOTA: Utilizzare meduse di 5-7 giorni per monitorare la formazione del terzo ramo (Figura 3A). Il giorno in cui le meduse si staccano dal polipo viene conteggiato come giorno 1, e il giorno 5, le meduse iniziano tipicamente a mostrare un terzo ramo sui loro tentacoli principali. - Dopo 1 ora, rimuovere il più possibile ASW contenente EdU.
- Per anestetizzare le meduse, aggiungere il 7% di MgCl 2 in H2 O e incubare per 5 minuti.
- Rimuovere il 7% di MgCl 2 in H 2 Oe fissare le meduse durante la notte (O.N.) a 4 °C con paraformaldeide (PFA) al 4% in ASW (Figura 2).
NOTA: Quando si esegue FISH senza incorporazione di EdU, i campioni possono essere fissati in modo simile a quelli trattati con EdU dopo l'anestetizzazione (fasi 2.3-2.4).
3. Ibridazione fluorescente in situ
- Trattamento con proteinasi e post fissazione
- Rimuovere il PFA e lavare i campioni con PBS contenente lo 0,1% di Tween-20 (PBST) per 3 x 10 minuti. Utilizzare 300-500 μL di PBST per lavaggio.
NOTA: Da questa fase alla fine dell'ibridazione, l'esperimento deve essere eseguito in un ambiente privo di RNasi, indossando guanti e una maschera. Il PBS 1x in questa fase deve essere realizzato con acqua trattata con DEPC. Dopo l'ibridazione, è possibile utilizzare 1x PBS realizzato con acqua senza trattamento DEPC. Alcuni protocolli ISH e FISH disidratano i campioni utilizzando passaggi di metanolo, il che consente di salvare i campioni fissi a -20 °C fino all'uso. Per evitare lavori superflui, il processo di disidratazione viene omesso da questo protocollo, in particolare perché i campioni possono essere conservati in PBST per un massimo di alcuni giorni. - Dopo la fissazione, porre il campione in provette da 1,5 mL su uno shaker, ad eccezione della fase di incubazione dell'anticorpo O.N. anti-DIG-POD (fase 3.4.2). Dopo il lavaggio, aggiungere 10 mg/mL di soluzione madre di proteinasi K in PBST e incubare le meduse con proteinasi K (concentrazione finale: 10 μg/ml) a 37 °C per 10 minuti.
- Rimuovere la soluzione di proteinasi K e lavare i campioni per 2 x 1 minuto con PBST.
- Per postfissare le meduse, aggiungere il 4% di PFA in 1x PBS e incubare a 37 °C per 15 minuti.
- Rimuovere la soluzione di PFA e lavare i campioni per 2 x 10 minuti con PBST.
NOTA: Se il gene bersaglio è altamente espresso con un segnale di fondo basso, i passaggi 3.1.2-3.1.5 possono essere saltati.
- Rimuovere il PFA e lavare i campioni con PBS contenente lo 0,1% di Tween-20 (PBST) per 3 x 10 minuti. Utilizzare 300-500 μL di PBST per lavaggio.
- Ibridazione
- Rimuovere il PBST e aggiungere il buffer di ibridazione (buffer HB, tabella 1). Incubare i campioni in HB Buffer per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Utilizzare 300-400 μL di tampone HB, che fornisce un volume sufficiente per un'ibridazione di successo.
NOTA: HB Buffer, Wash Buffer 1 e Wash Buffer 2 sono preparati con 20x SSC stock. HB Buffer è conservato a una temperatura pari o inferiore a -20 °C e deve essere portato a RT prima dell'uso. - Rimuovere il buffer HB e aggiungere un nuovo buffer HB. Preibridare a 55 °C per almeno 2 ore in un incubatore di ibridazione.
- Rimuovere il tampone HB e incubare con il tampone HB contenente le sonde memorizzate nella fase 1.9.7 (concentrazione finale della sonda: 0,5-1 ng/μL nel tampone HB). Ibridare a 55 °C per 18-24 ore (Figura 2) in un incubatore di ibridazione.
NOTA: L'intensità e la specificità del segnale FISH possono variare a causa dell'espressione genica bersaglio, nonché della lunghezza e della specificità della sonda. Per aumentare l'intensità, è possibile regolare parametri come la durata dell'ibridazione (18-72 h) e la temperatura (50-65 °C) e testare diverse sonde. Per evitare segnali non specifici, il trattamento con proteinasi K (concentrazione e durata) può essere modificato19.
- Rimuovere il PBST e aggiungere il buffer di ibridazione (buffer HB, tabella 1). Incubare i campioni in HB Buffer per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Utilizzare 300-400 μL di tampone HB, che fornisce un volume sufficiente per un'ibridazione di successo.
- Rimozione della sonda
- Rimuovere il buffer HB contenente le sonde, quindi aggiungere il buffer di lavaggio 1 (tabella 1). Lavare i campioni con Wash Buffer 1 per 2 x 15 minuti a 55 °C. Utilizzare 300-400 μL di tampone di lavaggio.
NOTA: HB Buffer contenente sonde può essere utilizzato ripetutamente, fino a circa dieci volte. Invece di scartare, conservare il buffer HB usato contenente sonde a una temperatura pari o inferiore a -20 °C. Preriscaldare il tampone di lavaggio 1, il tampone di lavaggio 2, 2x SSC e PBST a 55 °C prima dell'uso. - Rimuovere il buffer di lavaggio 1, quindi aggiungere il buffer di lavaggio 2 (tabella 1). Lavare i campioni con Wash Buffer 2 per 2 x 15 minuti a 55 °C.
- Rimuovere Wash Buffer 2, quindi aggiungere 2x SSC. Lavare i campioni con 2x SSC per 2 x 15 minuti a 55 °C.
- Rimuovere 2x SSC, quindi aggiungere PBST preriscaldato. Lavare i campioni per 1 x 15 minuti con PBST a RT.
- Rimuovere il buffer HB contenente le sonde, quindi aggiungere il buffer di lavaggio 1 (tabella 1). Lavare i campioni con Wash Buffer 1 per 2 x 15 minuti a 55 °C. Utilizzare 300-400 μL di tampone di lavaggio.
- Incubazione di anticorpi anti-DIG
- Rimuovere PBST e quindi aggiungere il buffer di blocco all'1%. Incubare i campioni per almeno 1 ora a RT agitando lentamente su un rocker.
NOTA: preparare un tampone bloccante all'1% diluendo il 5% di tampone bloccante (Tabella 1). Controllare i campioni prima della successiva reazione anticorpale perché il campione tende ad attaccarsi alla parte posteriore del coperchio o alla parete a causa dell'agitazione. - Dopo il blocco, rimuovere il buffer bloccante all'1%, aggiungere la soluzione anti-DIG-POD (1:500, in tampone bloccante all'1%) e incubare i campioni O.N. a 4 °C (Figura 2).
NOTA: Fare attenzione a mantenere il tempo di incubazione entro 12-16 h per evitare il rilevamento di segnali non specifici.
- Rimuovere PBST e quindi aggiungere il buffer di blocco all'1%. Incubare i campioni per almeno 1 ora a RT agitando lentamente su un rocker.
- Rilevamento di sonda marcata DIG
- Rimuovere la soluzione anti-DIG-POD, quindi aggiungere Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, Tabella 1). Lavare i campioni con TNT per 3 x 10 minuti a RT.
NOTA: L'uso della tecnica di amplificazione del segnale del tiramido (TSA) fornisce un'immagine a migliore risoluzione contro i reagenti marcati con perossidasi di rafano (ad esempio, anti-DIG-POD). - Soluzione madre diluita di tiramide fluorescente coniugata con colorante (Cy5-tiramide) (1:50) nel tampone diluente di amplificazione per ottenere la soluzione attiva di Cy5-tyramide (Figura 2).
- Rimuovere quanto più TNT possibile, quindi aggiungere la soluzione attiva di Cy5-tyramide. Incubare i campioni per 10 minuti al buio.
- Lavare i campioni con PBST per 3 x 10 minuti al buio.
- Rimuovere la soluzione anti-DIG-POD, quindi aggiungere Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, Tabella 1). Lavare i campioni con TNT per 3 x 10 minuti a RT.
- Rilevamento di EdU
NOTA: Il kit EdU rileva EdU incorporati come segnali fluorescenti (Figura 2).- Per preparare il cocktail di rilevamento EdU, mescolare i componenti come mostrato nella Tabella 1. Utilizzare 100 μL di cocktail di rilevazione EdU per ogni campione.
NOTA: Preparare 1x additivo tampone di reazione diluendo l'additivo tampone di reazione 10x con acqua ultrapura. - Rimuovere PBST, quindi aggiungere il cocktail di rilevamento EdU. Incubare al buio per 30 min.
- Lavare con PBST per 3 x 10 minuti al buio.
- Per preparare il cocktail di rilevamento EdU, mescolare i componenti come mostrato nella Tabella 1. Utilizzare 100 μL di cocktail di rilevazione EdU per ogni campione.
- Colorazione del DNA
- Diluire Hoechst 33342 (1:500) in PBST per preparare la soluzione di Hoechst. Rimuovere la PBST e quindi aggiungere la soluzione di Hoechst. Incubare i campioni per 30 minuti al buio (Figura 2).
- Lavare i campioni con PBST per 3-4 x 10 minuti al buio.
- Montante
- Fare una banca sul vetrino per evitare che il campione venga schiacciato. Applicare del nastro adesivo sul vetrino e svuotare il centro.
- Trasferire le meduse sulla banca sul vetro vetrino utilizzando una pipetta di trasferimento da 3,1 mL con la punta tagliata.
NOTA: Fare attenzione a non lasciare che i tentacoli si sovrappongano. - Rimuovere qualsiasi PBST con una pipetta P200, quindi aggiungere lentamente il 70% di glicerolo come mezzo di montaggio (Figura 2).
NOTA: invece del 70% di glicerolo, è possibile utilizzare un mezzo di montaggio anti-sbiadimento per evitare che la fluorescenza si affievolisca. - Posizionare delicatamente una copertina sulle meduse con una pinza e sigillare il lato della copertina con smalto trasparente.
- Mantenere i vetrini a 4 °C al buio se non si esegue immediatamente l'osservazione al microscopio.
- Imaging
- Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser per acquisire immagini. Per una risoluzione a cella singola, utilizzare una lente dell'olio 40x o una lente per un ingrandimento maggiore.
- Dopo l'acquisizione delle immagini, aprire le immagini utilizzando il software ImageJ/FIJI e contare le celle positive per EdU+ e/o Nanos1+ dallo strumento multipunto20.
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Representative Results
I tentacoli Cladonema sono stati usati come modello per studiare i processi cellulari di morfogenesi e rigenerazione15,16,17. La struttura del tentacolo è composta da un tubo epiteliale in cui le cellule staminali, o i-cellule, si trovano nella regione prossimale, chiamata bulbo tentacolare, e nuovi rami vengono aggiunti sequenzialmente alla parte posteriore della regione distale del bulbo lungo il lato assiale (Figura 3A) 15. Rapporti precedenti hanno indicato che la proliferazione cellulare è attiva sia nel bulbo tentacolare che nei nuovi siti di ramificazione utilizzando l'etichettatura EdU o BrdU16,17. Tuttavia, a causa della risoluzione dell'ibridazione in situ, non è chiaro se le cellule staminali siano veramente proliferative o meno. Per visualizzare contemporaneamente cellule staminali e proliferative a livello cellulare, abbiamo eseguito FISH per marcatori di cellule staminali (Nanos1 o Piwi) e marcatura EdU per cellule di fase S negli stessi campioni.
Alla risoluzione cellulare di FISH, l'espressione di Nanos1 è stata localizzata nel bulbo tentacolare e nel nuovo sito di ramificazione (Figura 3B). Piwi è stato espresso anche nel bulbo tentacolare e nel nuovo sito di ramificazione in uno schema simile a quello di Nanos1 (Figura 3C). Questi risultati erano coerenti con le osservazioni dell'ibridazione in situ a montaggio intero in un precedente rapporto17, in cui il ramo in erba di una medusa di 7 giorni era quasi uniformemente etichettato da Nanos1 e Piwi. Per visualizzare l'inizio dell'accumulo di cellule staminali, abbiamo monitorato il nuovo sito di ramificazione di una medusa di 5 giorni. La co-etichettatura dell'espressione di Nanos1 e delle cellule EdU-positive ha rivelato il modello spaziale delle cellule staminali e delle cellule proliferative nel tentacolo (Figura 4A). Sebbene le distribuzioni lorde delle cellule EdU+ e Nanos1+ fossero coerenti con i precedenti rapporti16,17, le cellule EdU+ erano più ampiamente distribuite in tutto il bulbo tentacolare, almeno all'inizio della ramificazione, mentre le cellule Nanos1+ si accumulavano più localmente al bulbo tentacolare e al nuovo sito di ramificazione (Figura 4A e Figura 4E ). Queste osservazioni suggeriscono che vengono rilevate distribuzioni distinte di cellule staminali e cellule proliferanti a seconda dei tempi di sviluppo e delle diverse fasi.
Una visione più dettagliata del bulbo e del nuovo sito di ramificazione ha rivelato che i segnali EdU si fondono con la colorazione nucleare, mentre l'espressione di Nanos1 è vincolata al citoplasma che circonda il nucleo, coerentemente con un precedente rapporto5 (Figura 4B, C). Una frazione (19,79%) delle cellule ha mostrato co-etichettatura di EdU e Nanos1 (EdU+ Nanos1+; Figura 4B, C, punte di freccia gialle e Figura 4D), suggerendo che queste cellule sono una popolazione di cellule staminali attivamente proliferanti. Curiosamente, il 14,46% delle cellule è risultato essere EdU+ Nanos1− nel mezzo del bulbo e nel nuovo sito di ramificazione, suggerendo la presenza di cellule proliferative non staminali (Figura 4B, C, frecce bianche e Figura 4D). Al contrario, il 26,32% delle cellule è stato osservato essere EdU− Nanos1+ alla base del bulbo e nel nuovo sito di ramificazione, indicando la presenza di una popolazione di cellule staminali che è a ciclo lento o quiescente, nessuna delle quali viene rilevata dall'etichettatura degli impulsi EdU (Figura 4B, C, frecce gialle e Figura 4D).
Figura 1: Schema della sintesi della sonda per l'ibridazione in situ . Estrazione dell'RNA totale dalle meduse e sintesi del cDNA dall'RNA totale. I prodotti PCR specifici per Nanos1 sono stati sintetizzati dal cDNA. I prodotti PCR sono stati legati nei vettori e i vettori amplificati sono stati raccolti attraverso colture cellulari competenti. I prodotti PCR con siti di legame della RNA polimerasi sono stati sintetizzati utilizzando i plasmidi come modelli. Le sonde di RNA marcate con DIG sono state sintetizzate mediante trascrizione in vitro . Abbreviazioni: DIG = digoxigenina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Schema di co-colorazione di EdU e ibridazione fluorescente in situ. Le meduse sono state incubate con 150 μM di EdU per 1 ora. Successivamente, le meduse sono state anestetizzate, per rilassare il tessuto, con il 7% di MgCl 2 in H2 O e fissatecon il 4% di PFA O.N. a 4 °C. Dopo la fissazione, i campioni sono stati ibridati con HB Buffer con una sonda per 20-24 ore a 55 °C. Dopo la reazione di ibridazione, i campioni sono stati lavati e incubati con soluzione anti-DIG-POD O.N. a 4 °C. Le meduse sono state colorate con soluzione di Cy5-tyramide per 10 minuti, seguite dalla rilevazione di EdU per 30 minuti e dalla colorazione con Hoechst 33342 per 30 minuti. Dopo aver completato tutti i processi di colorazione, le meduse sono state montate sul vetrino e le immagini sono state ottenute con un microscopio confocale. Abbreviazioni: EdU = 5-etinil-2'-deossiuridina; FISH = ibridazione fluorescente in situ; PFA = paraformaldeide; O.N. = pernottamento; HB = ibridazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Pattern di espressione di Nanos1 e Piwi sul lato adassiale prossimale del tentacolo Cladonema medusa. (A) Schema di un Cladonema medusa e tentacolo. Il lato adassiale del tentacolo: il bulbo tentacolare (la regione più prossimale) con nuovi rami formati sequenzialmente sul nuovo sito di ramificazione. L'inserto (quadrato tratteggiato) indica l'area catturata dall'immagine confocale. (B) Immagini FISH dell'espressione genica Nanos1 dal lato prossimale e adassiale del tentacolo di una medusa Cladonema di 7 giorni. (C) Immagini FISH dell'espressione genica Piwi dal lato prossimale e adassiale del tentacolo di una medusa Cladonema di 7 giorni. DNA: verde, Nanos1: magenta. B'-C' per le immagini solo Nanos1 FISH. Barre di scala = 100 μm (B,C). Abbreviazione: FISH = ibridazione fluorescente in situ. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Modelli di espressione di EdU e Nanos1 sul lato prossimale e assiale del tentacolo di Cladonema medusa. (A-C) Immagini del lato adassiale prossimale del tentacolo Cladonema medusa co-marcato con l'espressione di Nanos1 e EdU; Sono state utilizzate meduse di 5 giorni. (A) Una panoramica del tentacolo. I quadrati tratteggiati gialli indicano le aree di B e C. (B) Ingrandimento del bulbo tentacolare. (C) Ingrandimento di un nuovo sito di ramificazione. Le punte di freccia gialle indicano le celle positive sia per EdU che per Nanos1. Le frecce gialle indicano le celle che sono positive solo per Nanos1. Le frecce bianche indicano che le celle sono positive solo per EdU. I pannelli A-C sono immagini unite per DNA (blu), EdU (verde) e Nanos1 (magenta). A'-C' sono pannelli per immagini solo EdU; A''-C'' sono solo per le immagini Nanos1 FISH. Barre della scala = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) La quantificazione di cellule EdU- e/o Nanos1-positive nel lato basale del tentacolo (area di quantificazione = 30,10 μm2 quadrati, n = 6, per un totale di 249 cellule). Cellule EdU+ Nanos1−, 14,46%; Celle EdU+ Nanos1+, 19,79%; Cellule EdU− Nanos1+, 26,32%; Cellule EdU− Nanos1−, 39,44%. (E) Schema di un tentacolo Cladonema medusa dal lato adassiale. La distribuzione complessiva delle celle EdU+ e delle celle Nanos1+ è mostrata rispettivamente in E ed E'. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Composizione di diverse reazioni PCR e tamponi in questo protocollo. Per calcolare il volume del prodotto PCR (X μL) nella reazione di legatura, vedere la nota dopo il passaggio 1.4 del protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Le cellule proliferanti e le cellule staminali sono importanti fonti cellulari in vari processi come la morfogenesi, la crescita e la rigenerazione21,22. Questo articolo descrive un metodo per co-colorare il marcatore di cellule staminali Nanos1 mediante marcatura FISH e EdU in Cladonema medusae. Lavori precedenti che utilizzano l'etichettatura EdU o BrdU hanno suggerito che le cellule proliferative si localizzano nei bulbi tentacolari16,17, ma le loro caratteristiche molecolari non erano chiare. Il presente studio mostra la determinazione simultanea della distribuzione delle cellule proliferative e la localizzazione delle cellule staminali Nanos1+ (Figura 4). I risultati hanno mostrato che alcune cellule proliferative esprimevano Nanos1, ma altre cellule erano marcate solo con EdU e non esprimevano Nanos1, suggerendo l'esistenza di eterogeneità delle cellule staminali o, potenzialmente, di altre cellule proliferative. Sarà interessante analizzare la distribuzione dettagliata delle cellule staminali durante diversi processi in Cladonema, tra cui la ramificazione dei tentacoli, l'omeostasi dei tessuti, la rigenerazione degli organi e il mantenimento delle cellule germinali.
Il principale collo di bottiglia per la visualizzazione delle cellule staminali negli animali è l'identificazione iniziale dei marcatori delle cellule staminali. Negli cnidari, i marcatori delle cellule staminali non sono stati identificati nei non-idrozoi3, e quindi, in questa fase, l'applicazione diretta della FISH per i marcatori delle cellule staminali rimane limitata agli idrozoi. Tuttavia, la FISH consente di rilevare l'espressione genica specifica a livello cellulare e, quindi, cambiando le sonde, questo metodo può essere esteso per osservare in dettaglio i modelli di espressione spaziale di qualsiasi gene di interesse. Ad esempio, utilizzando marcatori di cellule progenitrici e cellule differenziate, possiamo verificare la distribuzione di specifici tipi cellulari nei tentacoli Cladonema. Come avvertimento, il presente protocollo potrebbe dover essere modificato a seconda dei geni di interesse a causa delle differenze nei livelli di espressione e nella stabilità dell'mRNA. In particolare, i segnali non specifici e i segnali deboli sono problemi comuni associati alla FISH. La modifica del tempo e della temperatura di ibridazione, l'uso di reagenti sbiancanti (formammide o metanolo) e la regolazione di altri parametri (tempo di reazione TSA, trattamento con proteinasi K, lavaggio dopo ibridazione) possono produrre segnali più chiari e meno segnali non specifici23,24. È anche importante selezionare un protocollo FISH appropriato al modello animale utilizzato, poiché un protocollo FISH potrebbe non essere applicabile ad altre specie, anche all'interno dello stesso taxon 7,25,26.
L'etichettatura EdU viene generalmente utilizzata per rilevare cellule proliferative, ma potrebbe essere utilizzata per diversi scopi sperimentali variando la concentrazione e il tempo di incubazione27. Per rilevare le cellule proliferanti, è fondamentale determinare una durata e una concentrazione di successo per l'incorporazione di EdU. Nella marcatura a impulsi utilizzata in questo lavoro, sono state marcate solo le cellule proliferative che sono passate attraverso la fase S per un breve periodo di tempo, e simili metodi di incubazione breve sono stati utilizzati per rilevare cellule proliferanti in altri cnidari 6,28,29. Al contrario, la combinazione di incorporazione prolungata di EdU e Nanos1 FISH può rivelare la presenza di cellule staminali a ciclo lento o quiescenti27. È anche possibile marcare non solo le cellule proliferative ma anche le cellule endocicliche che hanno subito la sintesi del DNA senza divisione. Inoltre, tracciando le cellule marcate con EdU per una durata più lunga, possiamo determinare la capacità cellulare di migrazione e differenziazione associata alle cellule proliferative e al loro lignaggio cellulare 6,30.
Mentre la combinazione di colorazione FISH e EdU o BrdU è stata utilizzata 7,31, il metodo qui stabilito può essere facilmente applicato ad altri invertebrati marini e animali non modello, comprese diverse specie di meduse. La colorazione EdU è più semplice e più sensibile della colorazione BrdU18 e, con la sua incubazione a breve termine, consente il rilevamento di cellule proliferanti, a differenza dello studio precedente che utilizzava EdU per l'etichettatura cellulare a lungo termine7. Negli ultimi anni, con il progresso delle tecnologie di sequenziamento di prossima generazione, le informazioni sul genoma e sull'espressione genica sono diventate disponibili per molte specie. L'identificazione delle cellule staminali e delle cellule proliferative continuerà ad essere un approccio efficace per comprendere l'eterogeneità e la diversità delle cellule staminali e fornire informazioni sulle dinamiche cellulari alla base dei diversi fenomeni biologici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da AMED con il numero di sovvenzione JP22gm6110025 (a Y.N.) e dal JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (a Y.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
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