Summary
여기에는 단백질 준비 및 구성과 활성 네마틱 감금을위한 우물 사용을 포함하여 미세 소관 및 키네신 모터에서 활성 네마틱스를 준비하는 방법이 제시됩니다.
Abstract
생체 고분자 기반 활성상의 형성은 활성 액정의 새로운 분야와 세포 생물학에서의 가능한 역할을 탐구하는 데 관심이있는 연구자에게 중요한 기술이되었습니다. 이 새로운 시스템은 국부적으로 에너지를 소비하는 자체 구동 하위 단위로 구성되어 평형을 벗어난 동적 유체를 생성합니다. 이 보고서에 설명된 활성 액정상을 형성하기 위해 바이오폴리머 및 분자 모터를 포함한 정제된 단백질 성분이 결합되고 활성 네마틱 상이 아데노신 삼인산(ATP)의 존재 하에 자발적으로 형성됩니다. 네마틱 상태를 관찰하려면 재료가 충분히 높은 밀도로 현미경 검사에 적합한 형상으로 제한되어야 합니다. 이 기사에서는 미세 소관과 키네신 모터를 사용하여 활성 네마틱 상을 형성하는 두 가지 방법, 즉 오일과 물 계면에서 2 차원 활성층을 조립하고 엘라스토머 웰을 사용하여 오일 층 아래에서 조립하는 방법에 대해 설명합니다. 활성 물질을 상이한 형상의 작은 우물에 삽입하는 기술이 또한 기재된다.
Introduction
활성 유체는 에너지 구동 입자 또는 지역 환경에서 연료를 끌어오는 요소로 구성됩니다. 적절한 조건 하에서, 이러한 운동성 활성 요소는 집합 적으로 작용하여 긴 길이 스케일에 걸쳐 창발적 유체 역학을 생성 할 수 있습니다. 문헌에서 이러한 평형 외 위상 거동의 다양한 예가 있으며 활성 위상은 살아있는 시스템의 스펙트럼 전반에 걸쳐 찾을 수 있습니다. 몇 가지 주목할만한 예는 박테리아1의 식민지, 세포 시트2,3 및 유기체 4,5의 무리 또는 떼입니다. 활성기는 또한 세포6의 일부로서 또는 생물학적으로 추출된 성분7,8,9를 사용하도록 설계된 합성 시스템에서, 세포골격 필라멘트의 응축된 단계에서 광범위하게 연구되었다. 생물학적 추출물로부터 조립 된 자연 발생 및 합성 시스템 모두에서 액정 순서 및 토폴로지 결함의 형성은 연구 커뮤니티에 특히 중요합니다. 최근 몇 년 동안 연구 그룹은 그러한 시스템, 기본 물리적 특성 및 생물학 2,3,10,11과의 관련성을 조사했습니다.
이 논문은 미세 소관과 키네신 운동 단백질의 조합으로부터 활성 네마틱 상태의 형성에 초점을 맞추고 있습니다. 전통적인 네마틱 액정은 구성 분자가 방향 순서를 나타내는 물질의 평형 단계입니다. 예를 들어, 비교적 단단한 막대 형 분자로 구성된 유체는 네마틱 상 및 더 높은 온도에서 방향성이없는 등방성 유체 상(12)을 모두 나타낼 수 있습니다. 활성 네마틱 단계의 첫 번째 실험 예는 Sanchez et al.13에 의해 개발되었으며, 운동 단백질 클러스터를 사용하여 인접한 미세 소관 다발 사이의 전단 운동을 생성하는 초기 시험관 내 실험 14를 적용했습니다. 이 미세 소관 시스템이 얇은 층에 국한되었을 때, 자발적인 네마틱 순서가 나타났습니다. 최근 몇 년 동안, 활성 네마틱 상태는 여러 실험 15,16 및 이론적 17,18 연구 그룹에 의해 집중적으로 연구되었으며, 활성 난류 (유체가 자체 구동 혼돈 흐름 19를 생성하는 상태) 및 이동성 토폴로지 결함과 같은 현상에 중점을 둡니다. 이 논문은 다양한 실험 기하학의 미세소관 및 키네신 모터로부터 활성 네마틱 상태를 준비하고 형성하는 방법을 설명합니다. 먼저, 상이한 성분 용액에 대한 제조 방법이 설명되고, 이어서 2개의 상이한 유동 챔버 형상을 사용하여 활성 네마틱을 형성하는 방법이 뒤따른다. 일반적인 이미징 결과가 표시됩니다. 마지막으로, 활성 네마틱을 우물과 채널에 가두는 방법이 설명됩니다.
Protocol
1. 활물질 준비
알림: 2D 활성 네마틱은 3단계 공정으로 조립됩니다. 먼저, a) 중합되고 안정화 된 미세 소관과 b) MIX (키네신 모터를 포함하는 용액)의 두 가지 개별 용액을 준비합니다. 이들은 결합되고 활성은 아데노신 삼인산 (ATP)을 첨가 할 때 시작됩니다. 그런 다음 재료는 적절한 기하학으로 제한되어 밀도가 네마틱 질서가 나타날 수있을만큼 충분히 높습니다. 필요한 모든 구성 요소의 준비 및 활성 단계를 조립하는 방법에 대한 프로토콜이 포함되어 있습니다.
- 키네신 운동 단백질 클러스터 준비
- Edgar C. Young20의 프로토콜에 따라 대장균에서 재조합 K401-BIO 모터 단백질(K401 모터)을 발현하고 정제합니다.
참고: K401-BIO 모터 단백질은 이량체이며 나선형 줄기로 연결된 두 개의 헤드로 구성됩니다. 모터는 Brandeis Biomaterials Facility에서 공급했으며 이전에보고 된대로 사용되었습니다16. 활성 네마틱을 형성하기 위한 목적으로, 키네신 분자는 비오티닐화되고, 이어서 스트렙타비딘 결합을 통해 연결되어 최대 4개의 모터(13,15,21,22)의 키네신 클러스터를 형성한다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그로 키네신을 발현하는 것이 도움이 됩니다. - 얼음에서 스트렙타비딘과 모터를 40분 동안 정제 및 배양한 후 K401 모터를 최종 농도 0.7mg/mL의 분취량 5μL의 액체 질소에서 급속 동결하고 -80°C에서 보관합니다.
참고: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다. 필요할 때 키네신을 부드럽게 해동하고 다시 얼리지 마십시오. - 46 부피% M2B 완충액(80 mM 파이프[1,4-피페라진디에탄술폰산, pH 6.8], 2mMMgCl2 및 1mM EGTA[에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸에테르)-N]에서 4°C에서 0.7mg/mL K401 모터 24부피%, 0.325mg/mL 스트렙타비딘 27부피%, 5mM 디티오트레이톨(DTT)의 3부피%(응집 방지)를 혼합하여 비오틴 표지 키네신(KSA) 클러스터를 준비합니다. N, N', N'- 테트라 아세트산]). KSA를 얼음 위에서 40분 동안 배양합니다.
- Edgar C. Young20의 프로토콜에 따라 대장균에서 재조합 K401-BIO 모터 단백질(K401 모터)을 발현하고 정제합니다.
- 미세소관 용액 준비
참고 : 구아노 신 -5'- [(α, β)- 메틸 에노] 트리 포스페이트, 나트륨 염 (GMPCPP)은 구아노 신 트리 포스페이트 (GTP)의 천천히 가수 분해 가능한 유사체이며, GMPCPP의 존재하에 형성된 미세 소관은 GTP 미세 소관23 보다 3 배 더 단단합니다. 짧고 뻣뻣한 미세 소관의 사용은 이러한 요소가 결합하여 액정 순서를 촉진하기 때문에 활성 네마틱 상의 형성에 유리합니다.- 6 mg/mL의 튜불린 농도에서 0.6 mM GMPCPP를 사용하여 표지되지 않은 순환 튜불린(99%, 재료 표 참조)을 중합합니다.
알림: 고품질 튜불린은 확립된 프로토콜에 따라 소 또는 돼지 뇌에서 정제하거나 손상을 방지하기 위해 재료를 냉동 배송할 수 있는 Brandeis 생체 재료 시설과 같은 다른 신뢰할 수 있는 출처에서 얻을 수도 있습니다. 소 뇌로부터의 튜불린 정제에 대해서는 Bate et al.24의 공개된 프로토콜을 참조하십시오. 돼지 뇌로부터의 튜불린 정제에 대해서는 Castoldi et al.25 및 Tayar et al.26에서 발표 된 프로토콜을 참조하십시오. - 중합을 준비하기 위해, 37°C에서 열욕을 준비하고, 원심분리기를 4°C로 예냉시킨다. 500μL 초원심분리 튜브의 M2B 완충액(단계 1.1.3)에 표지되지 않은 튜불린 용액을 4몰% 로다민 표지 튜불린( 재료 표 참조)과 결합하여 중합 후 4% 표지된 미세소관을 생성합니다.
- Bradford 분석27을 사용하여 튜불린 농도를 확인합니다. 원심분리기 튜브의 총 튜불린 농도는 6.5-6.9mg/mL여야 합니다.
- 튜불린 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양하고 4°C에서 352,700 x g 에서 10분 동안 초원심분리합니다. 이 단계는 펠릿에있을 기능 장애 튜 불린을 제거합니다.
- 피펫을 사용하여 기능성 튜 불린이 함유 된 상청액을 미세 원심 분리 튜브로 조심스럽게 추출합니다. GMPCPP를 최종 농도 0.6mM에 추가하여 튜불린 중합을 유도하고 DTT를 최종 농도 1mM에 추가하여 단백질 응집을 방지합니다.
- 혼합물을 37°C의 열조에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 실온에서 14,000 x g 에서 10분 동안 다시 원심분리한다. 상청액을 제거한 다음 M2B 완충액으로 펠릿을 희석하여 최종 미세소관 농도 6mg/mL에 도달합니다.
알림: 이 용액은 사용하기 전에 최소 4시간 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. - 미세소관이 성공적으로 중합되었는지 확인하려면 현미경 슬라이드에서 M2B 버퍼와 피펫으로 미세소관 용액 100:1 1μL를 희석합니다. 40x 대물 렌즈가 있는 형광 현미경( 재료 표 참조)을 사용하여 이미징하기 위한 커버 슬립으로 덮습니다.
참고: 여기 및 방출 파장은 미세소관에 사용된 형광 라벨링에 따라 선택됩니다. 이 프로토콜에서는 로다민 표지가 사용되므로(단계 1.2.2 참조), 이미징은 515-560nm의 여기 밴드 및 590nm 장통과 필터를 사용하여 수행됩니다. 그림 1 에 대표적인 예가 나와 있습니다. - 중합이 완료된 후 미세소관을 액체 질소에서 2μL 분취액으로 드롭동결하고 -80°C에서 보관합니다(필요한 경우).
- 6 mg/mL의 튜불린 농도에서 0.6 mM GMPCPP를 사용하여 표지되지 않은 순환 튜불린(99%, 재료 표 참조)을 중합합니다.
- MIX의 제조
참고: MIX는 키네신-스트렙타비딘 클러스터(KSA)를 포함하는 수용액입니다. 준비된 MIX는 실험 전에 4μL 분취량으로 -80°C에서 보관해야 합니다. MIX가 실온에서 단계 1.2에 기재된 ATP 및 미세소관 용액과 결합될 때, 활성이 개시된다. MIX는13,19와 같이 제조된다.- 두 개의 항산화 용액을 혼합하여 형광 퇴색 방지(ANTIFADE)용 용액을 준비합니다. AO1 (250 mM DTT, 65 mM 카탈라아제)과 AO2 (750 μM 카탈라아제, 3 mM 포도당 산화 효소)를 1 : 1 부피비로 결합하십시오. 형광 현미경으로 인한 손상을 줄이기 위해 사용되는 또 다른 항산화제인 20mM Trolox를 포함합니다.
- ATP 재생을 위해 70mg/mL에서 미세소관의 번들링을 유도하기 위해 6중량% 20kDa 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 3부피% 안티페이드 및 5부피% 피루브산 키나아제/락트탈수소효소(PKLDH)를 포함하는 KSA(단계 1.1.3에 설명됨) 용액을 만들어 MIX를 준비합니다.
2. 활성 네마틱 만들기
참고: 재질의 활동은 ATP 추가에 의해 시작됩니다. 활성 네트워크는 운동 활동을 유도하기에 충분히 높은 농도에서 ATP를 추가하여 각 실험에 대해 신선하게 준비됩니다. 균일하고 완전히 발달 된 활성 네마 틱 상을 형성하려면 미세 소관이 충분히 높은 밀도에 있어야합니다. 이는 미세소관을 두 개의 비혼화성 유체 사이에 가두어 2차원(2D) 활성 네마틱 층을 형성함으로써 달성할 수 있습니다. 이 방법은 원래 Brandeis University13 에서 개발되었으며 균질하고 고품질의 활성 네마틱 상을 생성하는 데 널리 사용되는 기술로 남아 있습니다.
- 활성 네마틱 형성을 위한 플로우 셀 방법
- 아크릴 아미드 코팅으로 친수성 커버 슬립을 준비하십시오.
- 비눗물, 에탄올 및 0.1M NaOH로 커버 슬립을 철저히 청소하고 나노 순수를 사용하여 대체 헹굼하십시오. 헹구면 커버 슬립을 에탄올 100mL, 아세트산 1mL, 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트 500μL로 구성된 실란 용액으로 15분 동안 코팅한 다음 나노 순수로 헹굽니다.
- 나노 순수 95mL와 40 중량 % 아크릴 아미드 5mL로부터 아크릴 아미드 용액을 제조 한 다음, 진공 오븐에서 30 분 동안 용액을 탈기한다.
- 2.3 mM 최종 농도에 대해 35 μL의 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 첨가한 다음 0.07 g의 과황산암모늄을 첨가한다. 아크릴아미드 용액을 커버슬립 위에 붓고 앞면이 위로 향하게 하고 실온에서 밤새 배양합니다.
- 소수성 현미경 슬라이드를 준비하십시오. 발수 용액 100μL( 재료 표 참조)를 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 피펫팅한 다음 다른 깨끗한 유리 슬라이드를 그 위에 놓습니다. 이렇게 하면 2분 동안 그대로 있는 표면에 발수 용액이 균일하게 코팅됩니다. 2 분 후 두 번째 유리 슬라이드를 제거하고 첫 번째 슬라이드를 나노 순수로 완전히 헹구고 질소 가스로 건조시킵니다. 테이프를 놓을 영역 (패턴 주위)을 아세톤으로 부드럽게 청소하여 발수 용액이 유리에 부착되는 것을 방해하지 않도록하십시오.
- 1.8 % (v / v) 008- 플루오로 계면 활성제를 포함하는 엔지니어링 오일의 혼합물을 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
- 유리 슬라이드와 커버슬립을 플로우 셀 하단에 소수성 유리 슬라이드로 조립하고 친수성 커버 슬립을 40μm 양면 접착 스페이서를 사용하여 샌드위치 형상의 윗면으로 조립합니다. 스페이서를 소수성 현미경 슬라이드에 1.5mm 간격으로 놓습니다. 그런 다음 아크릴아미드 코팅 커버슬립을 스페이서 위에 놓고 처리된 면이 아래를 향하도록 하여 접착합니다. 무딘 물체의 압력으로 접착이 완료되었는지 확인하십시오.
참고: 목표는 내부에 평평한 오일/물 인터페이스가 있는 플로우 셀을 조립하는 것입니다(그림 2A, B). 이것은 활성 레이어가 형성되는 곳입니다. 대체 스페이서 테이프 및 필름을 사용하여 유사한 셀 두께를 생성 할 수도 있습니다. - 플로우 셀이 구성된 후 즉시 오일 혼합물을 플로우 셀에 피펫팅하여 밀폐된 공간을 채웁니다.
- 피펫을 사용하여 별도의 바이알에 6μL의 활성 물질을 3.73μL의 MIX, 1μL의 미세소관 용액, 0.6μL의 ATP 용액(농도는 미세소관 속도에 따라 달라질 수 있음) 및 0.67μL의 M2B 완충액과 부드럽게 혼합합니다.
- 피펫은 유동 셀의 한쪽 열린 끝에 활성 물질을 새로 혼합하면 부피는 다양하지만 유동 셀의 부피(약 3-6 μL)를 초과해야 합니다. 일부 오일은 채널에 주입될 때 수용액에 의해 대체됩니다. 이것은 작은 티슈 페이퍼 조각을 사용하여 유동 채널의 반대쪽 끝에서 사악해질 수 있습니다.
- 충전 후 20초 동안 자외선에 노출되면 경화되는 에폭시 접착제( 재료 표 참조)로 플로우 셀의 양쪽을 밀봉합니다.
참고: 이 시점에서 활성 물질은 수층에 부유된 상태로 남아 있는 3D 네트워크를 형성합니다. - 준 2D 층에서 두 개의 비혼화성 유체 사이에 활성층을 가두려면 플로우 셀을 스윙 버킷 원심분리기( 재료 표 참조)에 놓고 수성상이 맨 위에 있고 밀도가 높은 오일 층이 아래에 있습니다. 212 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 이 단계가 완료되면 플로우 셀을 에피 형광 현미경으로 가져가 10x 또는 20x 배율 대물렌즈로 이미징할 수 있습니다. 그림 2C, D 는 이 단계 전후의 일반적인 이미지를 보여줍니다.
- 아크릴 아미드 코팅으로 친수성 커버 슬립을 준비하십시오.
- 활성 네마틱 형성을 위한 거꾸로 된 방법
참고: 단계 2.1에 설명된 것에 대한 대안적인 방법은 깊은 PDMS 웰(28)에 국한된 두꺼운 오일층 아래에 활성 네마틱 층을 조립하는 것이다. 이 방법은 비슷한 결과를 생성하며 마스터하기가 다소 쉽습니다. 그러나 이 방법을 사용하는 이미지 품질은 일반적으로 플로우 셀 방법만큼 좋지 않습니다.- 엘라스토머 경화제 및 엘라스토머 베이스를 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS)을 제조한다( 재료 표 참조). 금속 주걱을 사용하여 두 성분을 1:10 비율로 혼합합니다. 혼합하는 동안 제거하기 어려운 작은 기포가 나타나고 혼합물이 유백색으로 보입니다. 이러한 기포를 제거하려면 혼합물을 진공 상태에서 1시간 동안 탈기한 후 경화되지 않은 PDMS가 투명하게 나타나야 합니다.
참고: PDMS는 이제 금형을 사용하여 모든 모양을 형성할 준비가 되었거나 용기에서 경화된 다음 원하는 패턴으로 절단 또는 펀칭할 수 있습니다. - PDMS를 적절한 몰드에 붓고 60°C에서 경화시키기 위해 밤새 방치한다.
참고: 처리되지 않은 경화된 PDMS의 표면은 소수성이지만 표면 처리를 통해 친수성으로 만들 수 있습니다. - 친수성 PDMS 표면을 제조하기 위해, PDMS를 아크릴아미드 폴리머 브러시(29)로 코팅한다. 이 단계는 또한 단백질이 표면에 달라 붙는 것을 방지합니다.
- 에탄올과 이소프로판올로 PDMS를 10분 동안 세척한 다음 탈이온수 3회로 완전히 헹구고 건조시킵니다. 플라즈마 클리너를 5분 동안 사용하여 건조하고 경화된 PDMS를 청소합니다. 이 단계는 표면을보다 친수성으로 만듭니다.
- 다음으로, 실란 용액 (98.5 중량 % 에탄올, 1 중량 % 아세트산, 및 0.5 중량 % 트리 메 톡시 실릴 프로필 메타 크릴 레이트)을 제조하고 그 용액에 15 분 동안 기재를 침지시켜 아크릴 아미드 코팅을 준비한다. 탈이온수로 기질을 완전히 헹구고 아크릴아미드 용액(2wt% 아크릴아미드/비스 용액, 2.3mM TEMED 및 3mM 과황산암모늄)에 담그십시오.
알림: 이 기판은 유리 페트리 접시에 아크릴아미드 용액으로 덮인 실온에서 보관할 수 있으며 2주 이내에 사용해야 합니다.
- 사용할 준비가 되면 표면을 탈이온수로 헹구고 즉시 사용할 수 있도록 질소로 건조시킵니다. 활성 혼합물 (2.1.6 단계에서 설명)을 웰에 첨가하고 즉시 실리콘 오일을 약 2mm의 두께로 첨가하십시오.
참고: 이 단계에서 활성 혼합물은 오일과 PDMS의 친수성 코팅 사이에 끼워지지만 여전히 다소 입체적입니다. - 재료를 2D 레이어로 더 밀어 넣으려면 PDMS 장치를 유리 슬라이드에 붙이고 스윙 버킷 원심 분리기에 넣고 212 x g에서 12 분 동안 회전시킵니다. 장치는 실리콘 오일이 수성 층의 상단에 오도록 배치해야합니다. 대표적인 결과를 도 3에 나타내었다.
- 엘라스토머 경화제 및 엘라스토머 베이스를 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS)을 제조한다( 재료 표 참조). 금속 주걱을 사용하여 두 성분을 1:10 비율로 혼합합니다. 혼합하는 동안 제거하기 어려운 작은 기포가 나타나고 혼합물이 유백색으로 보입니다. 이러한 기포를 제거하려면 혼합물을 진공 상태에서 1시간 동안 탈기한 후 경화되지 않은 PDMS가 투명하게 나타나야 합니다.
3. 제한된 기하학에서 활성 네마틱 준비
참고: 이 준 2차원 시스템과 같은 활성 네마틱스는 우물이나 채널과 같은 작은 미세 유체 형상으로 제한하기 어려울 수 있습니다. 여기서, 재료를 상이한 형상의 PDMS 웰로 제한하는 신뢰성 있는 방법이 설명된다.
- 먼저 PDMS용 마스터 금형을 설계합니다. 이것은 기판에 3D 프린팅 기둥으로 달성 할 수 있습니다. 수지 마스터 몰드를 3D 프린팅한 후 이소프로판올로 세척한 다음 UV 램프 아래에서 45분 동안 그리고 120°C의 오븐에서 2시간 동안 경화시킵니다(그림 4).
참고: UV 및 열 후경화 하에서 경화하면 수지(30)에서 단량체 및 광억제제 잔류물을 제거하여 PDMS에서 복제 품질이 향상됩니다. - 마스터 몰드를 사용하여 PDMS에서 웰을 생성합니다. 단계 2.2.1에 설명된 대로 PDMS를 준비합니다. 마스터 몰드를 경화되지 않은 PDMS에 담그고 60°C의 오븐에서 밤새 경화합니다.
- PDMS 경화가 완료되면 마스터 몰드를 조심스럽게 제거하고 원하는 대로 PDMS를 절단하여 웰로 작업합니다(그림 4). 단계 2.2.3에 설명된 대로 PDMS 표면을 처리하십시오. 실험 전에 표면을 에폭시 접착제로 유리 슬라이드에 부착하여 이미징을 더 쉽게 할 수 있습니다.
- 단계 2.1.6에 기재된 활성 혼합물 1 μL를 PDMS 기판 상에 피펫팅하고, 즉시 활성 네트워크 액적의 상부에 100-1000 cSt 점도28 의 실리콘 오일을 첨가한다. 활성 네트워크는 우물로 이동합니다. 이 프로세스는 최대 60분이 걸립니다(그림 4). 단계 2.2.5에서 설명한 바와 같이, 2D 네트워크는 스윙 버킷 원심분리기에서 PDMS 웰을 212 x g에서 12분 동안 스핀다운함으로써 향상될 수 있다.
Representative Results
도 1은 GMPCPP 튜불린으로부터 제조된 단일 미세소관의 대표 이미지를 나타낸다. 이미지는 비슷한 길이의 짧은 미세 소관을 묘사합니다 (약간의 분산이 있음). 미세소관 용액의 충분한 희석은 길이 검증을 위해 잘 분리된 미세소관의 이미지를 생성해야 합니다. 개별 미세소관은 크기가 작기 때문에 이미징하기 어려울 수 있습니다. 형광 현미경용으로 설계된 고감도 카메라를 사용하는 것이 이 응용 분야에 가장 적합합니다. 그림 2와 그림 3은 각각 플로우 셀 방법(섹션 2.1) 및 반전 방법(섹션 2.2)을 사용하여 수행된 성공적인 실험의 형광 현미경 이미지 예를 보여줍니다. 잘 형성된 활성 네마틱 층은 질감이 균질하며 상당한 공극 영역과 이동성 토폴로지 결함이 존재하지 않습니다. 그러나 결함 코어에 허용 가능한 작은 공극이있을 수 있습니다. 그림 2와 그림 3에 표시된 예제 외에도 성공적인 실험에서 활성 네마틱이 어떻게 나타나야 하는지 보여주기 위해 세 개의 보조 동영상(영화 1, 영화 2 및 영화 3)이 포함되었습니다. 모든 영화는 활성 네마틱 단계의 부드러운 연속 운동을 보여줍니다. 미세소관 농도의 변화는 물질이 정상 상태에 도달한 후에도 나타나지 않습니다. 시스템에 충분한 ATP가 존재하는 한 재료는 계속 균일하게 움직입니다.
그림 1: GMPCPP 미세소관의 형광 현미경 이미지. GMPCPP 미세소관을 로다민 튜불린으로 4%로 표지하고 37°C에서 20분 동안 중합시켰다. 영상화는 실온에서 수행하였다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유동 세포의 미세소관 네마틱스 . (A) 플로우 셀의 단면 개략도, 1mm x 18mm 형상. (B) 플로우 셀의 평면도 개략도. (C) 오일/물 계면에서 조립하기 전에 활성 용액의 일반적인 모양을 보여주는 형광 현미경 이미지. (D) 유동 세포 내부의 오일/물 계면에 조립된 활성 네마틱 상의 형광 현미경 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 도립 방법을 사용하여 제조된 활성 네마틱을 보여주는 형광 현미경 이미지. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 금형 제작 및 표면 처리를 포함하여 PDMS 웰에서 활성 네마틱 감금 방법을 보여주는 흐름도. 오른쪽 이미지의 스케일 바(제한된 활성 물질) = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 플로우 셀 방법을 이용하여 제조된 활성 네마틱에 대한 대표적인 결과. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 2: 반전법을 사용하여 제조된 활성 네마틱에 대한 대표적인 결과. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 3: 타원형 웰에 국한된 반전법을 사용하여 제조된 활성 네마틱에 대한 대표적인 결과. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
프로토콜 전반에 걸쳐 실험자가 몇 가지 중요한 검사를 할 수 있는 몇 가지 사항이 있습니다. 두 장치 중 하나에 활성 물질을 채우기 전에 형광 현미경( 그림 1 참조)을 사용하여 미세소관이 중합되고 이상적으로는 길이가 ~2-3μm인지 확인해야 합니다. 현미경으로 미세소관이 보이지 않으면 해중합되었을 수 있으며 활성 네마틱이 형성되지 않습니다. 개별 미세소관은 매우 작기 때문에 현미경을 통해 직접 관찰하는 것이 어려울 수 있습니다. 이 연구에서는 까다로운 저조도 응용 분야를 위해 설계된 고품질 형광 카메라를 관련 소프트웨어와 함께 사용하여 필라멘트 성장을 확인했습니다. 이 단계에서 중요한 형광 응집체가 존재해서는 안되며, 이는 해중합 또는 변성 단백질의 존재를 나타낼 수 있습니다. 프로토콜에 설명된 것과 동일한 비율로 미세소관, MIX 및 ATP를 결합하여 간단한 현미경 테스트 슬라이드를 만드는 것도 좋은 생각입니다. 활동은 구성 요소를 결합하는 것으로 시작되어야하며 재료는 그림 2C 에 표시된 것과 유사하게 나타나야하며 번들이 존재하고 전체적으로 눈에 띄는 필라멘트 움직임이 보입니다.
플로우 셀 방법을 사용할 때, 플로우 셀의 원심 분리 시간 및 방향은 균일 한 활성층의 형성에 중요합니다. 이 단계는 사용되는 원심분리기 유형에 따라 약간의 미세 조정이 필요할 수 있습니다. 회전면에 수직으로 배향된 활성 평면으로 플로우 셀을 원심분리하면 재료가 유체 계면에 균일하게 푸시될 수 있으므로 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 원심분리하기 전에 플로우 셀이 조심스럽게 밀봉되었는지 다시 확인하십시오.
반전 방법을 사용하여 제한된 활성 네마틱을 생성할 때 최적화해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 고해상도 구조를 생성하는 3D 프린팅 방법을 사용하는 것이 중요합니다. 측벽이 고르지 않으면 미세 소관이 걸려 흐름을 방해 할 수 있습니다. 우물은 너무 깊지 않아야합니다 (이 연구에서는 2mm 두께의 위에 놓인 오일 층이있는 150-200 μm 깊이의 우물이 사용되었습니다). 실험자는 최상의 결과를 얻기 위해 시행 착오를 통해 이러한 매개 변수를 약간 조정해야 할 수도 있습니다.
유동 셀 방법 및 반전 방법은 상이한 오일(12) 및 침수 구조(13)를 포함하여 활성 유동에 영향을 미치는 다양한 효과를 살펴보기 위해 상이한 저자에 의해 사용되어 왔다. 방법의 선택은 실험 목표에 달려 있습니다. 플로우 셀 방법을 사용하면 활성층 위로부터의 광학 이미징이 서로 다른 위에 놓인 유체로 인해 반전 된 방법보다 선명합니다. 플로우 셀 방법에서 이미징은 유리 커버 슬립과 얇은 물 층을 통해 수행되는 반면 반전 방법은 오일 층이 위에 있도록 설계되었습니다. 즉, 반전 방법에 긴 작동 거리 대물렌즈가 필요하며 이미지 품질이 저하됩니다. 이미지 품질 차이는 그림 2D(플로우 셀 방법)와 그림 3(반전 방법), 동영상 1과 동영상 2를 각각 비교하여 확인할 수 있습니다. 그림 2에 사용된 것보다 그림 3에는 작동 거리가 더 긴 더 낮은 배율 렌즈가 필요했습니다. 도립 방법에 대한 이러한 이미징 단점은 현미경 슬라이드 기판에 적절한 작동 거리를 가진 대물렌즈와 결합된 적절한 도립 현미경을 사용할 수 있는 경우 피할 수 있습니다. 더 얇은 유리는 표준 작동 거리 대물렌즈를 사용할 수 있도록 기판으로 사용할 수 있습니다.
장점으로, 반전 된 형상은 더 넓은 범위의 오일 점도를 사용할 수 있고, 반드시 스윙 버킷 원심 분리가 필요하지 않으며 (사용할 수없는 경우) 금형이 준비되면 시스템 준비가 상대적으로 쉽습니다. 그러나 반전 된 방법을 사용하여 웰을 가두는 경우 재료를 잘 정의 된 2D 층으로 가져 오기 위해 일부 원심 분리가 중요 할 수 있습니다.
플로우 셀 방법은 최근 연속 활성층이 필요한 실험에서 매우 성공적으로 사용되었습니다. 우리의 최근 연구는 고품질 이미징 및 텍스처 분석이 중요한 활성층에서 토폴로지 결함의 역학을 살펴보았습니다19. 또한, 유동 세포 방법은 활성 유동(16 ) 및 활성 유동(31)의 결함을 포착하기 위한 기둥에 대한 오일 침수 미세구조의 효과를 조사하기 위해 사용되어 왔다. 이 방법은 연속 활성층의 형성에 매우 효과적이며 이미지 품질이 우수합니다. 그러나 최종 2D 활성층을 생성하는 데 사용되는 원심 분리 단계는 수행하기 어려울 수 있으며 플로우 셀은 누출 및 기포가 발생하기 쉽습니다. 반전 방법은 성공률이 높고 시공이 쉬우며 고해상도 3D 프린팅 마스터 몰드를 만들 수 있는 모든 기판 패턴 또는 형상에 사용할 수 있는 매우 유용한 대안입니다. 이 방법은 또한 우물을 채우는 것을 비교적 간단하게 만들기 때문에 활성 네마틱 역학에 대한 기하학적 감금의 효과를 보는 데 유용합니다.
이 논문에서는 미세소관과 키네신 모터에서 활성 네마틱을 형성하는 두 가지 방법과 재료를 웰에 가두는 기술에 대해 설명합니다. 제시된 시스템은 현재 문헌에서 활성 네마틱 단계의 가장 깨끗한 예를 나타내며 전 세계의 여러 그룹에 의해 재현되었습니다. 이 물질의 중요성은 구성 요소의 생물학적 기원뿐만 아니라 활성 주문 유체에서 완전히 새로운 방향을 열어주기 때문입니다. 이 시스템으로 작업하고 기본 특성을 설명함으로써 과학자들은 완전 합성 활성상의 설계로 이동할 수 있습니다.
능동 네마틱에 대한 감금의 영향에 초점을 맞춘 실험은 위상학적 감금 하에서 능동 흐름의 거동과 위상학적 결함 역학에 관한 근본적인 질문에 답할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에 제시된 방법은 미세 유체 공학 및 활성 혼합을 포함한 다양한 기하학적 중심 실험 및 분석의 수행에 도움이 될 것입니다.
Disclosures
이 작업에 사용 된 일부 자료는 Cytoskeleton Inc. (미국 덴버)에서 무료로 제공했습니다.
Acknowledgments
저자는 관대 한 자금에 대해 국립 과학 재단 (NSF) 상 DMR-1808926을 인정하고자합니다. 이 프로젝트는 또한 NSF의 지원을 받아 과학 기술 연구 우수 센터: 캘리포니아 대학교 머시드의 세포 및 생체 분자 기계 센터(HRD-1547848)와 브랜다이스 생체 재료 시설 재료 연구 과학 및 엔지니어링 센터(DMR-2011486)를 통해 지원되었습니다. 주형을 3D 프린팅하는 데 도움을 주신 캘리포니아 대학교 머시드의 Bin Liu 박사와 거꾸로 된 실험 방법을 개발하는 동안 과학적 조언을 해주신 Jordi Ignes 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
| 3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin | |
| 40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
| Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
| Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
| Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
| ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
| Beakers | VWR | ||
| Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
| Desiccator | Bel-art | ||
| Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA - Flash4.0 LT+ | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
| EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
| Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
| Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
| GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
| HFE7500 Oil | 3M | ||
| Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | ||
| KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
| Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf - Thermo Fisher | 1.5 mL | |
| Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
| Petri Dishes | VWR | ||
| PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
| Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
| PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
| Pipettes (0.2 - 1000 µl) | VWR | ||
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
| RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
| Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
| Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
| Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
| Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
| Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
| UV Light | RapidFix | ||
| UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
| Water Bath | Thelco | ||
| Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |
References
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