Summary
Här presenteras metoder för beredning av aktiv nematik från mikrotubuli och kinesinmotorer, inklusive proteinberedning och konstruktion och användning av brunnar för aktiv nematisk inneslutning.
Abstract
Bildandet av biopolymerbaserade aktiva faser har blivit en viktig teknik för forskare som är intresserade av att utforska det framväxande fältet aktiva flytande kristaller och deras möjliga roller i cellbiologi. Dessa nya system består av självdrivna underenheter som förbrukar energi lokalt och producerar en dynamisk vätska utanför jämvikt. För att bilda den aktiva flytande kristallfasen som beskrivs i denna rapport kombineras renade proteinkomponenter inklusive biopolymerer och molekylära motorer, och den aktiva nematiska fasen bildas spontant i närvaro av adenosintrifosfat (ATP). För att observera det nematiska tillståndet måste materialet begränsas i en lämplig geometri för mikroskopi med tillräckligt hög densitet. Denna artikel beskriver två olika metoder för bildandet av en aktiv nematisk fas med användning av mikrotubuli och kinesinmotorer: montering av ett tvådimensionellt aktivt skikt vid ett olje- och vattengränssnitt och montering under ett oljeskikt med användning av en elastomerbrunn. Tekniker för att sätta in det aktiva materialet i små brunnar av olika former beskrivs också.
Introduction
Aktiva vätskor består av energidrivna partiklar eller element som drar bränsle från sin lokala miljö. Under rätt förhållanden kan dessa rörliga aktiva element agera kollektivt för att producera framväxande vätskedynamik över långa längdskalor. Det finns en mängd olika exempel på sådant beteende utanför jämviktsfasen i litteraturen och aktiva faser finns över hela spektrumet av levande system. Några anmärkningsvärda exempel är kolonier av bakterier1, cellark2,3 och flockning eller svärmning av organismer 4,5. Aktiva faser har också studerats i stor utsträckning i kondenserade faser av cytoskelettfilament, antingen som en del av cell6 eller i syntetiska system utformade för att använda biologiskt extraherade komponenter 7,8,9. Flytande kristallin ordning och bildandet av topologiska defekter i både naturligt förekommande och syntetiska system sammansatta av biologiska extrakt är av särskilt intresse för forskarsamhället. Under de senaste åren har forskargrupper undersökt sådana system, deras grundläggande fysikaliska egenskaper och deras relevans för biologi 2,3,10,11.
Detta papper fokuserar på bildandet av det aktiva nematiska tillståndet från en kombination av mikrotubuli och kinesinmotorproteiner. Den traditionella nematiska flytande kristallen är en jämviktsfas av materia där de ingående molekylerna uppvisar orienteringsordning. Till exempel kan en vätska bestående av relativt styva stavliknande molekyler uppvisa både den nematiska fasen och, vid högre temperaturer, en oorienterad isotrop vätskefas12. Det första experimentella exemplet på en aktiv nematisk fas utvecklades av Sanchez et al.13 och anpassade ett tidigare in vitro-experiment 14 där kluster av motorproteiner användes för att producera en skjuvningsrörelse mellan angränsande mikrotubulibuntar. När detta mikrotubulisystem var begränsat till ett tunt skikt uppstod spontan nematisk ordning. Under de senaste åren har det aktiva nematiska tillståndet studerats intensivt av flera experimentella15,16 och teoretiska 17,18 forskargrupper, med fokus på fenomen som aktiv turbulens - ett tillstånd där vätskan producerar självdrivna kaotiska flöden 19 - och mobila topologiska defekter. Detta dokument beskriver metoder för att förbereda och bilda det aktiva nematiska tillståndet från mikrotubuli och kinesinmotorer i olika experimentella geometrier. Först beskrivs beredningsmetoder för de olika komponentlösningarna, följt av metoder för att bilda den aktiva nematiken med användning av två olika flödeskammargeometrier. Typiska bildresultat visas. Slutligen beskrivs metoder för att begränsa den aktiva nematiska i brunnar och kanaler.
Protocol
1. Förbereda det aktiva materialet
OBS: Den 2D-aktiva nematiken monteras i en trestegsprocess. Först framställs två separata lösningar: a) polymeriserade, stabiliserade mikrotubuli och b) MIX (en lösning innehållande kinesinmotorer). Dessa kombineras och aktivitet initieras vid tillsats av adenosintrifosfat (ATP). Materialet begränsas sedan i en lämplig geometri, så att dess densitet är tillräckligt hög för att nematisk ordning ska kunna uppstå. Protokoll ingår för beredning av alla nödvändiga komponenter och hur man monterar den aktiva fasen.
- Kinesinmotoriskt proteinklusterberedning
- Expressera och rena rekombinanta K401-BIO-motorproteiner (K401-motorer) från Escherichia coli enligt protokollet av Edgar C. Young20.
OBS: K401-BIO motorproteiner är dimeriska och består av två huvuden kopplade till en spiralformad stjälk. Motorerna levererades av Brandeis Biomaterials Facility och användes som tidigare rapporterats16. För att bilda en aktiv nematisk biotinyleras kinesinmolekylerna och ansluts sedan via en streptavidinlänkning för att bilda kinesinkluster med upp till fyra motorer 13,15,21,22. Det är bra att uttrycka kinesinet med en grön fluorescerande protein (GFP) tagg. - Efter rening och inkubation av streptavidin och motorer på is i 40 minuter blixtfryser K401-motorerna i flytande kväve i 5 μL alikvoter i en slutlig koncentration av 0,7 mg/ml och förvaras vid -80 °C.
OBS: Experimentet kan pausas här. Tina försiktigt kinesinet vid behov och frys inte in igen. - Bered kluster av biotinmärkt kinesin (KSA) genom att blanda 24 vol% av 0,7 mg / ml K401-motorer, 27 vol% av 0,325 mg / ml streptavidin och 3 vol% 5 mM ditiotreitol (DTT) (för att förhindra aggregering) vid 4 ° C i 46 vol% M2B-buffert (80 mM RÖR [1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, pH 6,8], 2 mM MgCl2 och 1 mM EGTA [etylenglykol-bis (β-aminoetyleter)-N, N,N′,N′-tetraättiksyra]). Låt KSA inkubera på is i 40 min.
- Expressera och rena rekombinanta K401-BIO-motorproteiner (K401-motorer) från Escherichia coli enligt protokollet av Edgar C. Young20.
- Beredning av mikrotubuli lösning
OBS: Guanosin-5'-[(α,β)-metyleno]trifosfat, natriumsalt (GMPCPP) är en långsamt hydrolyserbar analog av guanosintrifosfat (GTP), och mikrotubuli som bildas i närvaro av GMPCPP är tre gånger styvare än GTP-mikrotubuli23 och kortare. Användningen av korta, styva mikrotubuli är gynnsam för bildandet av den aktiva nematiska fasen eftersom dessa faktorer kombineras för att främja flytande kristallin ordning.- Polymerisera omärkt cyklat tubulin (99%, se materialtabell) med användning av 0,6 mM GMPCPP vid en tubulinkoncentration på 6 mg / ml.
OBS: Högkvalitativt tubulin kan också renas från nötkreatur eller svinhjärna enligt etablerade protokoll eller erhållas från en annan pålitlig källa som Brandeis Biomaterials Facility där material kan skickas frysta för att förhindra skador. För tubulinrening från nötkreaturshjärna, se det publicerade protokollet från Bate et al.24. För tubulinrening från svinhjärna, se de publicerade protokollen från Castoldi et al.25 och Tayar et al.26. - Som förberedelse för polymerisation, förbered ett värmebad vid 37 °C och förkyl centrifugen till 4 °C. Kombinera den omärkta tubulinlösningen i M2B-buffert (steg 1.1.3) i ett 500 μL ultracentrifugrör med 4 mol% rhodaminmärkt tubulin (se materialtabell) för att producera 4% märkta mikrotubuli efter polymerisation.
- Verifiera tubulinkoncentrationen med hjälp av en Bradford-analys27. Den totala tubulinkoncentrationen i centrifugröret bör vara 6,5-6,9 mg / ml.
- Inkubera rörblandningen på is i 10 minuter och ultracentrifugera i 10 min vid 352 700 x g vid 4 °C. Detta steg tar bort dysfunktionellt tubulin, som kommer att finnas i pelleten.
- Använd en pipett och extrahera försiktigt supernatanten som innehåller funktionellt tubulin i ett mikrocentrifugrör. Tillsätt GMPCPP till en slutlig koncentration på 0,6 mM för att inducera tubulinpolymerisation och DTT till en slutlig koncentration på 1 mM för att förhindra proteinaggregering.
- Inkubera blandningen i värmebadet vid 37 °C i 30 minuter och centrifugera sedan igen i 10 minuter vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och späd sedan pelleten med M2B-buffert för att nå en slutlig mikrotubulikoncentration på 6 mg/ml.
OBS: Denna lösning kan förvaras vid rumstemperatur i minst 4 timmar före användning. - För att kontrollera att mikrotubulierna har polymeriserats framgångsrikt, späd 1 μL av mikrotubulilösningen 100: 1 med M2B-buffert och pipett på ett mikroskopglas. Täck med en täckglidning för avbildning med hjälp av ett fluorescensmikroskop (se materialförteckning) med en 40x objektivlins.
OBS: Excitations- och emissionsvåglängder väljs enligt fluorescensmärkningen som används på mikrotubuli. I detta protokoll används rhodaminmärkning (se steg 1.2.2), så avbildning utförs med hjälp av ett excitationsband på 515-560 nm och ett 590 nm långt passfilter. Figur 1 visar ett representativt exempel. - När polymerisationen är klar, droppfrys mikrotubulien som 2 μL alikvoter i flytande kväve och förvara vid -80 °C (om så krävs).
- Polymerisera omärkt cyklat tubulin (99%, se materialtabell) med användning av 0,6 mM GMPCPP vid en tubulinkoncentration på 6 mg / ml.
- Beredning av MIX
OBS: MIX är en vattenlösning som inkluderar kinesin-streptavidinkluster (KSA). Beredd MIX ska förvaras vid -80 °C i 4 μl alikvoter före experimentet. När MIX kombineras med ATP och den mikrotubulilösning som beskrivs i steg 1.2 vid rumstemperatur initieras aktivitet. MIX framställs enligtföljande 13,19.- Förbered en lösning för att förhindra fluorescensblekning (ANTIFADE) genom att blanda två antioxidantlösningar. Kombinera AO1 (250 mM DTT, 65 mM katalas) och AO2 (750 μM katalas, 3 mM glukosoxidas) i ett volymförhållande på 1:1. Inkludera 20 mM Trolox, en annan antioxidant som används för att minska skador orsakade av fluorescensmikroskopi.
- Bered MIX genom att göra en lösning av KSA (beskrivs i steg 1.1.3) som innehåller 6 vikt% 20 kDa polyetylenglykol (PEG) för att inducera buntning av mikrotubuli, 3 vol% ANTIFADE och 5 vol% pyruvatkinas/mjölkdehydrogenas (PKLDH) vid 70 mg/ml för ATP-regenerering.
2. Skapa den aktiva nematiska
OBS: Aktivitet i materialet initieras av ATP-tillägg. Det aktiva nätverket förbereds färskt för varje experiment genom att tillsätta ATP i en koncentration som är tillräckligt hög för att inducera motorisk aktivitet. För att bilda en enhetlig, fullt utvecklad aktiv nematisk fas måste mikrotubuli ha en tillräckligt hög densitet. Detta kan uppnås genom att begränsa mikrotubuli mellan två oblandbara vätskor för att bilda ett tvådimensionellt (2D) aktivt nematiskt skikt. Denna metod utvecklades ursprungligen vid Brandeis University13 och är fortfarande en populär teknik för att producera en homogen, högkvalitativ, aktiv nematisk fas.
- Flödescellmetod för aktiv nematisk bildning
- Förbered hydrofila täckglas med akrylamidbeläggning.
- Rengör täckglasen noggrant med tvålvatten, etanol och 0,1 M NaOH med alternativa sköljningar med nanorent vatten. När de har sköljts, täck täckglasen med en silanlösning bestående av 100 ml etanol, 1 ml ättiksyra och 500 μl 3-(trimetoxisilyl) propylmetakrylat i 15 minuter och skölj sedan med nanorent vatten.
- Bered en akrylamidlösning från 95 ml nanorent vatten och 5 ml 40 vikt% akrylamid och avgasa sedan lösningen i 30 minuter i en vakuumugn.
- Tillsätt 35 μl tetrametyletylendiamin (TEMED) för en slutlig koncentration på 2,3 mM och sedan 0,07 g ammoniumpersulfat. Häll akrylamidlösningen över täckglasen med framsidan uppåt och inkubera över natten vid rumstemperatur.
- Förbered hydrofoba mikroskopglas. Pipettera 100 μl av en vattenavvisande lösning (se materialtabell) på ett rent glasmikroskopglas och placera sedan en annan ren glasskiva ovanpå. Detta säkerställer en jämn beläggning av den vattenavvisande lösningen på ytan där den sitter i 2 min. Efter 2 min, ta bort den andra glasskivan och skölj den första bilden noggrant med nanorent vatten och torka sedan med kvävgas. Rengör försiktigt regionen där tejpen ska placeras (runt mönstret) med aceton för att säkerställa att den vattenavvisande lösningen inte förhindrar vidhäftning till glaset.
- Bered en blandning av konstruerad olja som innehåller 1,8% (v/v) 008-fluortensid (se materialtabell).
- Montera glasskivan och täckglaset med den hydrofoba glasskivan på botten av flödescellen och det hydrofila locket glider som den övre ytan i en sandwichgeometri med 40 μm dubbelsidiga limdistanser. Placera distanserna 1,5 mm från varandra på det hydrofoba mikroskopglaset. Placera sedan den akrylamidbelagda täckglaset ovanpå distanserna med den behandlade sidan nedåt för att fästa. Se till att vidhäftningen är komplett med tryck från ett trubbigt föremål.
OBS: Målet är att montera en flödescell med ett platt olje-/vattengränssnitt inuti (figur 2A,B). Det är här det aktiva lagret kommer att bildas. Alternativa distansband och filmer kan också användas för att producera en liknande celltjocklek. - Efter att flödescellen har konstruerats, pipettera omedelbart oljeblandningen i flödescellen och fyll det slutna utrymmet.
- Blanda försiktigt 6 μl aktivt material med en pipett i en separat injektionsflaska med 3,73 μL MIX, 1 μl mikrotubulilösning, 0,6 μl ATP-lösning (koncentrationen kan varieras för att variera mikrotubulihastigheten) och 0,67 μl M2B-buffert.
- Pipettera nyblandat aktivt material i en öppen ände av flödescellen, volymerna kommer att variera men bör överstiga flödescellens volym (ungefär 3-6 μl). En del olja kommer att förskjutas av vattenlösningen när den injiceras i kanalen; Detta kan ondas upp i motsatt ände av flödeskanalen med hjälp av en liten bit silkespapper.
- Efter fyllning, försegla båda sidor av flödescellen med ett epoxilim (se materialtabell) som härdar när det utsätts för UV-ljus i 20 s.
OBS: Vid denna tidpunkt bildar det aktiva materialet ett 3D-nätverk som förblir upphängt i vattenskiktet. - För att begränsa det aktiva skiktet mellan de två oblandbara vätskorna i ett kvasi-2D-skikt, placera flödescellen i en svängande hinkcentrifug (se materialtabell) med vattenfasen ovanpå och det tätare oljeskiktet under. Centrifugera vid 212 x g i 10 min. När detta steg är klart kan flödescellen tas till ett epifluorescensmikroskop för avbildning med ett 10x eller 20x förstoringsmål. Figur 2C,D visar typiska bilder före och efter detta steg.
- Förbered hydrofila täckglas med akrylamidbeläggning.
- Inverterad metod för aktiv nematisk bildning
OBS: En alternativ metod till den som beskrivs i steg 2.1 är att montera det aktiva nematiska skiktet under ett tjockt oljelager begränsat till en djup PDMS-brunn28. Denna metod ger liknande resultat och är något lättare att behärska; Bildkvaliteten med den här metoden är dock vanligtvis inte lika bra som flödescellmetoden.- Bered polydimetylsiloxan (PDMS) med hjälp av ett elastomerhärdningsmedel och en elastomerbas (se materialförteckning). Blanda de två komponenterna i ett förhållande 1:10 med en metallspatel. Små bubblor uppträder under blandning som är svåra att ta bort, och blandningen verkar mjölkaktig. För att avlägsna dessa bubblor, placera blandningen under vakuum för att avgasa i 1 h, varefter det ohärdade PDMS ska vara transparent.
OBS: PDMS är nu redo att bilda vilken form som helst med hjälp av en form, eller så kan den härda i behållaren och sedan skäras eller stansas i önskat mönster. - Häll PDMS i en lämplig form och låt stå över natten för att härda vid 60 °C.
OBS: Obehandlad är ytan på härdad PDMS hydrofob, men med ytbehandling kan den göras hydrofil. - För att förbereda en hydrofil PDMS-yta, täck PDMS med en akrylamidpolymerborste29. Detta steg förhindrar också att proteiner fastnar på ytan.
- Börja med att rengöra PDMS i 10 min med både etanol och isopropanol, skölj sedan noggrant med avjoniserat vatten 3x och torka. Använd en plasmarengörare i 5 minuter för att rengöra det torra, härdade PDMS. Detta steg gör ytan mer hydrofil.
- Bered sedan en silanlösning (98,5 vikt% etanol, 1 vikt% ättiksyra och 0,5 vikt% trimetoxisilylpropylmetakrylat) och sänk ned substratet i den lösningen i 15 minuter för att förbereda för akrylamidbeläggningen. Skölj substratet noggrant med avjoniserat vatten och sänk ned i akrylamidlösning (2 viktprocent akrylamid/bis-lösning, 2,3 mM TEMED och 3 mM ammoniumpersulfat).
OBS: Dessa substrat kan förvaras vid rumstemperatur täckt av akrylamidlösning i en petriskål i glas och bör användas inom 2 veckor.
- När du är klar för användning, skölj ytan med avjoniserat vatten och torka med kväve för omedelbar användning. Tillsätt den aktiva blandningen (beskrivs i steg 2.1.6) i brunnarna och tillsätt omedelbart silikonolja ovanpå till en tjocklek av ca 2 mm.
OBS: I detta skede kommer den aktiva blandningen att klämmas in mellan oljan och den hydrofila beläggningen på PDMS, men den kommer fortfarande att vara något tredimensionell. - För att skjuta materialet längre in i ett 2D-lager, limma PDMS-enheten på en glasskiva, placera den i en svängande hinkcentrifug och snurra i 12 minuter vid 212 x g. Enheten måste placeras så att silikonoljan ligger på toppen av det vattenhaltiga skiktet. Representativa resultat visas i figur 3.
- Bered polydimetylsiloxan (PDMS) med hjälp av ett elastomerhärdningsmedel och en elastomerbas (se materialförteckning). Blanda de två komponenterna i ett förhållande 1:10 med en metallspatel. Små bubblor uppträder under blandning som är svåra att ta bort, och blandningen verkar mjölkaktig. För att avlägsna dessa bubblor, placera blandningen under vakuum för att avgasa i 1 h, varefter det ohärdade PDMS ska vara transparent.
3. Förbereda aktiv nematik i begränsade geometrier
OBS: Aktiv nematik som detta kvasi-tvådimensionella system kan vara utmanande att begränsa till små mikrofluidiska geometrier som brunnar eller kanaler. Här beskrivs en pålitlig metod för att begränsa materialet till olika formade PDMS-brunnar.
- Designa först en huvudform för PDMS. Detta kan uppnås genom 3D-utskriftspelare på ett substrat. Efter 3D-utskrift av hartsformen, rengör med isopropanol och härda sedan formen under en UV-lampa i 45 minuter och i ugnen vid 120 °C i 2 timmar (figur 4).
OBS: Härdning under UV och termisk efterhärdning förbättrar kvaliteten på replikationen i PDMS genom att ta bort monomerer och fotoinhibitorrester från hartset30. - Använd huvudformen för att skapa brunnar från PDMS. Förbered PDMS enligt beskrivningen i steg 2.2.1. Sänk ner huvudformen i ohärdat PDMS och härda över natten i en ugn vid 60 °C.
- När PDMS-härdningen är klar, ta försiktigt bort huvudformen och skär PDMS efter önskemål för att arbeta med brunnarna (figur 4). Behandla PDMS-ytan enligt beskrivningen i steg 2.2.3. Innan experimentet kan ytan fästas på en glasskiva med epoxilim för att underlätta avbildningen.
- Pipettera 1 μl av den aktiva blandning som beskrivs i steg 2.1.6 på PDMS-substratet och tillsätt omedelbart silikonolja med 100-1000 cSt viskositet28 ovanpå den aktiva nätverksdroppen. Det aktiva nätverket kommer att flytta in i brunnen; Denna process tar upp till 60 minuter (figur 4). Som beskrivs i steg 2.2.5 kan 2D-nätverket förbättras genom att snurra ner PDMS-brunnen i den svängande skopcentrifugen i 12 minuter vid 212 x g.
Representative Results
Figur 1 visar en representativ bild av enstaka mikrotubuli framställda från GMPCPP-tubulin. Bilden visar korta mikrotubuli av liknande längder (med viss spridning närvarande). Tillräcklig utspädning av mikrotubulilösningen bör ge en bild av väl separerade mikrotubuli för längdverifiering. De enskilda mikrotubuli kan vara utmanande att avbilda på grund av sin lilla storlek. Användning av en högkänslig kamera avsedd för fluorescensmikroskopi är bäst för denna applikation. Figur 2 och figur 3 visar exempel på fluorescensmikroskopibilder av framgångsrika experiment utförda med flödescellsmetoden (avsnitt 2.1) respektive den inverterade metoden (avsnitt 2.2). Ett välformat aktivt nematiskt skikt är homogent i textur, utan några signifikanta tomrumsområden och mobila topologiska defekter närvarande. Observera dock att det kan finnas några acceptabla små hålrum i defektkärnorna. Förutom exemplen som visas i figur 2 och figur 3 har tre kompletterande filmer (film 1, film 2 och film 3) inkluderats för att visa hur den aktiva nematiken ska se ut i ett framgångsrikt experiment. Alla filmer visar den smidiga kontinuerliga rörelsen hos den aktiva nematiska fasen. Inga variationer i mikrotubulikoncentrationen är uppenbara efter att materialet har nått sitt stabila tillstånd. Så länge det finns tillräckligt med ATP i systemet kommer materialet att fortsätta att röra sig enhetligt.
Figur 1: Fluorescensmikroskopbild av GMPCPP-mikrotubuli. GMPCPP-mikrotubuli märktes vid 4% med rhodamintubulin och polymeriserades i 20 minuter vid 37 ° C. Avbildning utfördes vid rumstemperatur. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mikrotubulinematik i en flödescell . (A) Tvärsnittsschema för flödescellen, 1 mm x 18 mm geometri. (B) Övre vyschema för flödescellen. C) Bild av fluorescensmikroskopi som visar den aktiva lösningens typiska utseende före montering vid gränssnittet mellan olja och vatten. D) Fluorescensmikroskopibild av den aktiva nematiska fasen som monterats vid gränssnittet mellan olja och vatten inuti flödescellen. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fluorescensmikroskopbild som visar en aktiv nematisk framställd med inverterad metod. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Flödesschema som illustrerar metoden för aktiv nematisk inneslutning i en PDMS-brunn, inklusive formtillverkning och ytbehandling. Skalstreck på höger bild (begränsat aktivt material) = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Film 1: Representativt resultat för aktiv nematisk beredning med hjälp av flödescellsmetoden. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 2: Representativt resultat för aktiv nematik framställd med inverterad metod. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 3: Representativt resultat för aktiv nematisk beredning med inverterad metod begränsad till en elliptisk brunn. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Discussion
Det finns några punkter i protokollen där experimenten kan göra några viktiga kontroller. Innan någon av enheterna fylls med aktivt material bör fluorescensmikroskopi (se figur 1) användas för att kontrollera att mikrotubuli är polymeriserade och helst ~ 2-3 μm långa. Om mikrotubuli inte är synliga under mikroskopet kan de ha depolymeriserats och den aktiva nematiska kommer inte att bildas. Eftersom enskilda mikrotubuli är mycket små kan det vara utmanande att observera dem direkt genom mikroskopet. I denna studie användes en högkvalitativ fluorescenskamera utformad för utmanande applikationer i svagt ljus med tillhörande programvara för att verifiera filamenttillväxt. Betydande fluorescerande aggregat bör inte vara närvarande vid detta tillfälle, eftersom detta kan indikera depolymerisation eller närvaron av denaturerat protein. Det är också en bra idé att göra ett enkelt mikroskoptestglas genom att kombinera mikrotubuli, MIX och ATP i samma förhållanden som beskrivs i protokollen. Aktiviteten bör börja med att kombinera komponenterna och materialet bör se ut som det som visas i figur 2C med buntar närvarande och märkbara glödtrådsrörelser synliga hela tiden.
Vid användning av flödescellmetoden är flödescellens centrifugtid och orientering viktiga för bildandet av ett enhetligt aktivt skikt. Detta steg kan kräva viss finjustering beroende på vilken centrifugtyp som används. Centrifugering av flödescellen med det aktiva planet orienterat vinkelrätt mot rotationsplanet ger de bästa resultaten eftersom material kan skjutas på vätskegränssnittet enhetligt. Dubbelkolla att flödescellen är försiktigt förseglad innan centrifugering.
När du använder den inverterade metoden för att producera begränsad aktiv nematik finns det flera steg att optimera. För det första är det viktigt att använda en 3D-utskriftsmetod som producerar högupplösta strukturer. Ojämna sidoväggar kan få mikrotubuli att fånga, vilket kommer att störa flödena. Brunnarna bör inte vara för djupa (150-200 μm djupa brunnar med ett 2 mm tjockt överliggande oljelager användes i denna studie). Experimenterare kan behöva justera dessa parametrar något genom försök och fel för att få bästa resultat.
Flödescellsmetoden och den inverterade metoden har använts av olika författare för att titta på en mängd olika effekter som påverkar de aktiva flödena, inklusive olika oljor12 och nedsänkta strukturer13. Valet av metod beror på det experimentella målet. Med hjälp av flödescellsmetoden är optisk avbildning ovanifrån det aktiva skiktet tydligare än för den inverterade metoden på grund av de olika överliggande vätskorna. I flödescellsmetoden utförs avbildning genom ett glasskydd och ett tunt lager vatten, medan den inverterade metoden är utformad för att ha oljeskiktet ovanpå. Detta innebär att ett långt arbetsdistansmål behövs för den inverterade metoden och bildkvaliteten minskar. Bildkvalitetsskillnader kan ses genom att jämföra figur 2D (flödescellsmetod) och figur 3 (inverterad metod) respektive film 1 och film 2. För figur 3 krävdes en objektiv med lägre förstoringsglas med längre arbetsavstånd än för figur 2. Dessa avbildningsnackdelar för den inverterade metoden kan undvikas om ett lämpligt inverterat mikroskop finns tillgängligt, kombinerat med mål med ett lämpligt arbetsavstånd för mikroskopets glidsubstrat. Tunnare glas kan användas som substrat för att möjliggöra användning av standardmål för arbetsavstånd.
Som en fördel möjliggör den inverterade geometrin användning av ett bredare spektrum av oljeviskositeter, kräver inte nödvändigtvis svängande skopcentrifugering (om detta inte är tillgängligt), och beredningen av systemet är relativt lättare när formen är beredd. För inneslutning i brunnar med den inverterade metoden kan dock viss centrifugering vara viktig för att få materialet i ett väldefinierat 2D-lager.
Flödescellsmetoden har nyligen använts mycket framgångsrikt i experiment där ett kontinuerligt aktivt skikt krävs. Vårt senaste arbete har tittat på dynamiken i topologiska defekter i det aktiva lagret, där högkvalitativ avbildning och texturanalys är viktig19. Dessutom har flödescellsmetoden använts för att undersöka effekterna av oljedränkta mikrostrukturer på aktiva flöden16 och pelare för att fånga defekter i de aktiva flödena31. Denna metod fungerar mycket bra för bildandet av ett kontinuerligt aktivt lager, och bildkvaliteten är utmärkt. Centrifugeringssteget som används för att producera det slutliga 2D-aktiva skiktet kan dock vara svårt att utföra, och flödescellerna är benägna att läcka och luftbubblor. Den inverterade metoden är ett mycket användbart alternativ med hög framgångsgrad, är lätt att konstruera och kan användas för alla substratmönster eller geometrier förutsatt att en högupplöst 3D-tryckt huvudform kan skapas. Denna metod är också användbar för att titta på effekterna av geometrisk inneslutning på aktiv nematisk dynamik eftersom det gör fyllningsbrunnar relativt enkla.
I detta papper beskrivs två sätt att bilda en aktiv nematik från mikrotubuli och kinesinmotorer, plus en teknik för att begränsa materialen i brunnar. Systemet som presenteras representerar det renaste exemplet på en aktiv nematisk fas som för närvarande finns i litteraturen och har reproducerats av flera grupper runt om i världen. Betydelsen av detta material ligger inte bara i det biologiska ursprunget till dess komponenter, utan också för att det öppnar en helt ny riktning i aktiva ordnade vätskor. Genom att arbeta med detta system och belysa dess grundläggande egenskaper kan forskare gå mot utformningen av helt syntetiska aktiva faser.
Experimenten fokuserade på effekterna av inneslutning på aktiv nematik har potential att svara på grundläggande frågor om beteendet hos aktiva flöden och topologisk defektdynamik under topologisk inneslutning. Metoden som presenteras här kommer att hjälpa till att utföra en mängd olika geometrifokuserade experiment och deras analys, inklusive mikrofluidik och aktiv blandning.
Disclosures
Vissa material som användes i detta arbete tillhandahölls gratis av Cytoskeleton Inc.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma National Science Foundation (NSF) utmärkelse DMR-1808926 för generös finansiering. Projektet stöddes också av NSF genom Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines vid University of California Merced (HRD-1547848) och Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Vi vill tacka Dr. Bin Liu vid University of California Merced för hjälp med 3D-utskrift av formen, och Dr. Jordi Ignes för vetenskaplig rådgivning under utvecklingen av den inverterade experimentella metoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
| 3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin | |
| 40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
| Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
| Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
| Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
| ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
| Beakers | VWR | ||
| Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
| Desiccator | Bel-art | ||
| Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA - Flash4.0 LT+ | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
| EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
| Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
| Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
| GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
| HFE7500 Oil | 3M | ||
| Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | ||
| KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
| Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf - Thermo Fisher | 1.5 mL | |
| Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
| Petri Dishes | VWR | ||
| PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
| Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
| PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
| Pipettes (0.2 - 1000 µl) | VWR | ||
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
| RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
| Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
| Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
| Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
| Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
| Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
| UV Light | RapidFix | ||
| UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
| Water Bath | Thelco | ||
| Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |
References
- Sokolov, A., Aranson, I. S., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Concentration dependence of the collective dynamics of swimming bacteria. Physics Review Letters. 98 (15), 158102 (2007).
- Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
- Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (97654), 327-331 (2017).
- Toner, J., Tu, Y. Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: how birds fly together. Physics Review Letters. 75 (23), 4326-4329 (1995).
- Katz, Y., Tunstrøm, K., Ioannou, C. C., Huepe, C., Couzin, I. D. Inferring the structure and dynamics of interactions in schooling fish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (46), 18720-18725 (2011).
- Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048 (2017).
- Weirich, K., Dasbiswas, K., Witten, T. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (23), 11125-11130 (2019).
- Memarian, F. L., et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), (2021).
- Bausch, A., Sciortino, A. R. Pattern formation and polarity sorting of driven actin filaments on lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (6), (2021).
- Maroudas-Sacks, Y., et al. Topological defects in the nematic order of actin fibres as organization centres of Hydra morphogenesis. Nature Physics. 17 (2), 251-259 (2021).
- Liu, J., et al. Topological braiding and virtual particles on the cell membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (34), (2021).
- Hirst, L. S. Fundamentals of Soft Matter Science 2nd ed. , CRC Press. (2019).
- Sanchez, T., Chen, D., DeCamp, S., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S.
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8, 564 (2017).
- Thijssen, K., et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), (2021).
- Shendruk, T. N., Doostmohammadi, A., Thijssen, K., Yeomans, J. M. Dancing disclinations in confined active nematics. Soft Matter. 13 (21), 3853-3862 (2017).
- Giomi, L. Geometry and topology of turbulence in active nematics. Physical Review X. 5 (3), 031003 (2015).
- Tan, A. J., et al.
- Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit interactions in dimeric kinesin heavy chain derivatives that lack the kinesin rod. The Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
- Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Expression, purification, and characterization of the Drosophila kinesin motor domain produced in Escherichia coli. Biochemistry. 32 (17), 4677-4684 (1993).
- Kuznetsov, S. A., Gelfand, V. I. Kinesin Protocol. Vernos, I. 164, Humana Press. NJ. (2001).
- Hawkins, T. L., Sept, D., Mogessie, B., Straube, A., Ross, J. L. Mechanical properties of doubly stabilized microtubule filaments. Biophysics Journal. 104 (7), 1517-1528 (2013).
- Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling flow speeds of microtubule-based 3D active fluids using temperature. Journal of Visualized Experiments. (153), e60484 (2019).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Tayar, A. M., Lemma, L. M., Dogic, Z. Assembling microtubule-based active matter.. Microtubules. , Humana. New York, NY. 151-183 (2022).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Shankar, S., Marchetti, M. C., Sagués, F. Probing the shear viscosity of an active nematic film. Physical Review E. 94 (6), 060602 (2016).
- Rudy, A., et al. Lubricous hydrogel surface coatings on polydimethylsiloxane (PDMS). Tribology Letters. 65, 3 (2017).
- Venzac, B., et al. PDMS curing inhibition on 3D-printed molds: Why? Also, how to avoid it. Analytical Chemistry. 93 (19), 7180-7187 (2021).
- Khaladj, D. A., Hirst, L. S. Using curved fluid boundaries to confine active nematic flows. Frontiers of Physics. 10, 880941 (2022).
