Summary
Hier worden methoden gepresenteerd voor het bereiden van actieve nematica uit microtubuli en kinesinemotoren, inclusief eiwitvoorbereiding en -constructie en het gebruik van putten voor actieve nematische opsluiting.
Abstract
De vorming van op biopolymeer gebaseerde actieve fasen is een belangrijke techniek geworden voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het verkennen van het opkomende veld van actieve vloeibare kristallen en hun mogelijke rol in de celbiologie. Deze nieuwe systemen bestaan uit zelfgestuurde subeenheden die lokaal energie verbruiken en een dynamische vloeistof uit evenwicht produceren. Om de actieve vloeibare kristalfase te vormen die in dit rapport wordt beschreven, worden gezuiverde eiwitcomponenten, waaronder biopolymeren en moleculaire motoren, gecombineerd en vormt de actieve nematische fase zich spontaan in aanwezigheid van adenosinetrifosfaat (ATP). Om de nematische toestand waar te nemen, moet het materiaal worden opgesloten in een geschikte geometrie voor microscopie bij een voldoende hoge dichtheid. Dit artikel beschrijft twee verschillende methoden voor de vorming van een actieve nematische fase met behulp van microtubuli en kinesinemotoren: assemblage van een tweedimensionale actieve laag op een olie- en waterinterface en assemblage onder een olielaag met behulp van een elastomeerbron. Technieken om het actieve materiaal in kleine putjes van verschillende vormen te steken worden ook beschreven.
Introduction
Actieve vloeistoffen zijn samengesteld uit energiegedreven deeltjes of elementen die brandstof uit hun lokale omgeving halen. Onder de juiste omstandigheden kunnen deze beweeglijke actieve elementen collectief werken om emergente vloeistofdynamica over lange lengteschalen te produceren. Er zijn verschillende voorbeelden van dergelijk gedrag uit evenwichtsfasen in de literatuur en actieve fasen zijn te vinden in het hele spectrum van levende systemen. Enkele opmerkelijke voorbeelden zijn kolonies van bacteriën1, celbladen 2,3 en het zwermen of zwermen van organismen 4,5. Actieve fasen zijn ook uitgebreid bestudeerd in gecondenseerde fasen van cytoskeletale filamenten, hetzij als onderdeel van de cel6 of in synthetische systemen die zijn ontworpen om gebruik te maken van biologisch geëxtraheerde componenten 7,8,9. Vloeibare kristallijne ordening en de vorming van topologische defecten in zowel natuurlijk voorkomende als synthetische systemen samengesteld uit biologische extracten zijn van bijzonder belang voor de onderzoeksgemeenschap. In de afgelopen jaren hebben onderzoeksgroepen dergelijke systemen, hun fundamentele fysische eigenschappen en hun relevantie voor de biologie onderzocht 2,3,10,11.
Dit artikel richt zich op de vorming van de actieve nematische toestand uit een combinatie van microtubuli en kinesinemotoreiwitten. Het traditionele nematische vloeibare kristal is een evenwichtsfase van materie waarin de samenstellende moleculen een oriëntatievolgorde vertonen. Een vloeistof bestaande uit relatief stijve staafachtige moleculen kan bijvoorbeeld zowel de nematische fase als, bij hogere temperaturen, een onortiriënteerde isotrope vloeistof fase12 vertonen. Het eerste experimentele voorbeeld van een actieve nematische fase werd ontwikkeld door Sanchez et al.13, waarbij een eerder in vitro experiment14 werd aangepast waarin clusters van motoreiwitten werden gebruikt om een schuifbeweging tussen naburige microtubulibundels te produceren. Toen dit microtubulisysteem beperkt was tot een dunne laag, ontstond er spontane nematische ordening. In de afgelopen jaren is de actieve nematische toestand intensief bestudeerd door verschillende experimentele15,16 en theoretische17,18 onderzoeksgroepen, met de nadruk op fenomenen zoals actieve turbulentie - een toestand waarin de vloeistof zelfgestuurde chaotische stromen produceert19 - en mobiele topologische defecten. Dit artikel beschrijft methoden om de actieve nematische toestand van microtubuli en kinesinemotoren in verschillende experimentele geometrieën te bereiden en te vormen. Eerst worden bereidingsmethoden voor de verschillende componentoplossingen beschreven, gevolgd door methoden voor het vormen van de actieve nematic met behulp van twee verschillende stromingskamergeometrieën. Typische beeldvormingsresultaten worden getoond. Ten slotte worden methoden beschreven voor het beperken van de actieve nematic in putten en kanalen.
Protocol
1. Voorbereiding van het actieve materiaal
OPMERKING: De 2D actieve nematic wordt geassembleerd in een proces van drie stappen. Eerst worden twee afzonderlijke oplossingen bereid: a) gepolymeriseerde, gestabiliseerde microtubuli en b) MIX (een oplossing die kinesinemotoren bevat). Deze worden gecombineerd en de activiteit wordt gestart bij het toevoegen van adenosinetrifosfaat (ATP). Het materiaal wordt dan opgesloten in een geschikte geometrie, zodat de dichtheid hoog genoeg is om een nematische orde te laten ontstaan. Protocollen zijn opgenomen voor de voorbereiding van alle benodigde componenten en hoe de actieve fase te assembleren.
- Kinesine motoreiwit clustervoorbereiding
- Expresseer en zuiver recombinante K401-BIO motoreiwitten (K401 motoren) uit Escherichia coli volgens het protocol van Edgar C. Young20.
OPMERKING: K401-BIO motoreiwitten zijn dimeerachtig en bestaan uit twee koppen verbonden met een spiraalvormige stengel. De motoren werden geleverd door de Brandeis Biomaterials Facility en gebruikt zoals eerder gemeld16. Met het oog op het vormen van een actieve nematic worden de kinesinemoleculen gebiotinyleerd en vervolgens verbonden via een streptavidin-koppeling om kinesineclusters van maximaal vier motoren 13,15,21,22 te vormen. Het is nuttig om de kinesine uit te drukken met een groene fluorescerende eiwit (GFP) tag. - Na zuivering en incubatie van streptavidin en motoren op ijs gedurende 40 minuten, flash-freeze de K401 motoren in vloeibare stikstof in 5 μL aliquots bij een eindconcentratie van 0,7 mg/ml, en bewaren bij -80 °C.
OPMERKING: Het experiment kan hier worden onderbroken. Ontdooi de kinesine voorzichtig wanneer dat nodig is en vries niet opnieuw in. - Bereid clusters van biotine-gelabelde kinesine (KSA) door 24 vol% van 0,7 mg / ml K401-motoren, 27 vol% 0,325 mg / ml streptavidin en 3 vol% 5 mM dithiothreitol (DTT) te mengen (om aggregatie te voorkomen) bij 4 ° C in 46 vol% M2B-buffer (80 mM PIPES [1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, pH 6,8], 2 mM MgCl2 en 1 mM EGTA [ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, N,N′,N′-tetraazijnzuur]). Laat de KSA 40 min op ijs incuberen.
- Expresseer en zuiver recombinante K401-BIO motoreiwitten (K401 motoren) uit Escherichia coli volgens het protocol van Edgar C. Young20.
- Bereiding van microtubuli-oplossingen
OPMERKING: Guanosine-5'-[(α,β)-methyleno]trifosfaat, natriumzout (GMPCPP) is een langzaam hydrolyseerbaar analoog van Guanosinetrifosfaat (GTP), en microtubuli gevormd in aanwezigheid van GMPCPP zijn drie keer stijver dan GTP-microtubuli23 en korter. Het gebruik van korte, stijve microtubuli is gunstig voor de vorming van de actieve nematische fase, omdat deze factoren samen de vloeibare kristallijne ordening bevorderen.- Polymeriseer ongelabelde gefietste tubuline (99%, zie Tabel van materialen) met behulp van 0,6 mM GMPCPP bij een tubulineconcentratie van 6 mg / ml.
OPMERKING: Tubuline van hoge kwaliteit kan ook worden gezuiverd uit runder- of varkenshersenen volgens vastgestelde protocollen of worden verkregen uit een andere betrouwbare bron zoals de Brandeis Biomaterials Facility, waar materialen bevroren kunnen worden verzonden om schade te voorkomen. Voor tubulinezuivering uit runderhersenen verwijzen wij u naar het gepubliceerde protocol van Bate et al.24. Voor tubulinezuivering uit varkenshersenen verwijzen we naar de gepubliceerde protocollen van Castoldi et al.25 en Tayar et al.26. - Bereid ter voorbereiding op polymerisatie een warmtebad bij 37 °C voor en koel de centrifuge voor tot 4 °C. Combineer de ongelabelde tubuline-oplossing in M2B-buffer (stap 1.1.3) in een ultracentrifugebuis van 500 μL met 4 mol% rhodamine-gelabelde tubuline (zie materiaaltabel) om 4% gelabelde microtubuli te produceren na polymerisatie.
- Controleer de tubulineconcentratie met behulp van een Bradford-test27. De totale tubulineconcentratie in de centrifugebuis moet 6,5-6,9 mg/ml zijn.
- Incubeer het tubulinemengsel op ijs gedurende 10 minuten en ultracentrifugeer gedurende 10 minuten bij 352.700 x g bij 4 °C. Deze stap verwijdert disfunctionele tubuline, die in de pellet zal zitten.
- Gebruik een pipet om het supernatant met functionele tubuline voorzichtig in een microcentrifugebuis te extraheren. Voeg GMPCPP toe aan een eindconcentratie van 0,6 mM om tubulinepolymerisatie te induceren en DTT tot een eindconcentratie van 1 mM om eiwitaggregatie te voorkomen.
- Incubeer het mengsel in het warmtebad bij 37 °C gedurende 30 minuten en centrifugeer het vervolgens opnieuw gedurende 10 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en verdun de pellet vervolgens met M2B-buffer om een uiteindelijke microtubuliconcentratie van 6 mg / ml te bereiken.
OPMERKING: Deze oplossing kan voor gebruik ten minste 4 uur bij kamertemperatuur worden bewaard. - Om te controleren of de microtubuli met succes zijn gepolymeriseerd, verdunt u 1 μL van de microtubulioplossing 100:1 met M2B-buffer en pipet op een microscoopglaasje. Bedek met een afdekslip voor beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel) met een 40x objectieflens.
OPMERKING: Excitatie- en emissiegolflengten worden gekozen op basis van de fluorescentielabels die op de microtubuli worden gebruikt. In dit protocol wordt rhodamine-etikettering gebruikt (zie stap 1.2.2), dus beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een excitatieband van 515-560 nm en een 590 nm langdoorlaatfilter. Figuur 1 toont een representatief voorbeeld. - Nadat de polymerisatie is voltooid, bevriest u de microtubuli als 2 μL-aliquots in vloeibare stikstof en bewaart u deze bij -80 °C (indien nodig).
- Polymeriseer ongelabelde gefietste tubuline (99%, zie Tabel van materialen) met behulp van 0,6 mM GMPCPP bij een tubulineconcentratie van 6 mg / ml.
- Bereiding van MIX
OPMERKING: MIX is een waterige oplossing die de kinesine-streptavidin clusters (KSA) omvat. Bereide MIX moet voorafgaand aan het experiment bij -80 °C in aliquots van 4 μL worden bewaard. Wanneer MIX wordt gecombineerd met ATP en de in stap 1.2 beschreven microtubule-oplossing bij kamertemperatuur, wordt de activiteit gestart. MIX wordt als volgt bereid 13,19.- Bereid een oplossing voor om fluorescentievervaging (ANTIFADE) te voorkomen door twee antioxiderende oplossingen te mengen. Combineer AO1 (250 mM DTT, 65 mM catalase) en AO2 (750 μM catalase, 3 mM glucoseoxidase) in een volumeverhouding van 1:1. Inclusief 20 mM Trolox, een andere antioxidant die wordt gebruikt om schade veroorzaakt door fluorescentiemicroscopie te verminderen.
- Bereid MIX voor door een oplossing van KSA te maken (beschreven in stap 1.1.3) die 6 wt% 20 kDa polyethyleenglycol (PEG) bevat om bundeling van de microtubuli, 3 vol% ANTIFADE en 5 vol% pyruvaatkinase/melkzuurdehydrogenase (PKLDH) bij 70 mg/ml voor ATP-regeneratie te induceren.
2. Het creëren van de actieve nematic
OPMERKING: Activiteit in het materiaal wordt geïnitieerd door ATP-toevoeging. Het actieve netwerk wordt voor elk experiment vers bereid door ATP toe te voegen in een concentratie die hoog genoeg is om motorische activiteit te induceren. Om een uniforme, volledig ontwikkelde actieve nematische fase te vormen, moeten de microtubuli een voldoende hoge dichtheid hebben. Dit kan worden bereikt door de microtubuli tussen twee onmengbare vloeistoffen te beperken om een tweedimensionale (2D) actieve nematische laag te vormen. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld aan de Brandeis University13 en blijft een populaire techniek voor het produceren van een homogene, hoogwaardige, actieve nematische fase.
- Flowcelmethode voor actieve nematische vorming
- Bereid hydrofiele coverslips voor met een acrylamidecoating.
- Reinig de coverslips grondig met zeepsop, ethanol en 0,1 M NaOH met afwisselende spoelingen met nanopoerwater. Na het spoelen, bedekt u de coverslips met een silaanoplossing bestaande uit 100 ml ethanol, 1 ml azijnzuur en 500 μL 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat gedurende 15 minuten en spoel vervolgens af met nanopoerwater.
- Bereid een acrylamide-oplossing uit 95 ml nanopure water en 5 ml 40 wt% acrylamide en ontgas de oplossing gedurende 30 minuten in een vacuümoven.
- Voeg 35 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe voor een eindconcentratie van 2,3 mM en vervolgens 0,07 g ammoniumpersulfaat. Giet de acrylamide-oplossing over de deklapjes terwijl je naar boven kijkt en incubeer een nacht bij kamertemperatuur.
- Bereid hydrofobe microscoopglaasjes voor. Pipetteer 100 μL van een waterafstotende oplossing (zie Materiaaltabel) op een schoon glazen microscoopglaasje en plaats er vervolgens nog een schone glasplaat op. Dit zorgt voor een gelijkmatige coating van de waterafstotende oplossing op het oppervlak waar het 2 minuten zit. Verwijder na 2 minuten de tweede glasglaas en spoel de eerste dia grondig af met nanozuiver water en droog vervolgens met stikstofgas. Reinig het gebied waar de tape zal worden geplaatst (rond het patroon) voorzichtig met aceton om ervoor te zorgen dat de waterafstotende oplossing hechting aan het glas niet voorkomt.
- Bereid een mengsel van gemanipuleerde olie met 1,8% (v/v) 008-FluoroSurfactant (zie Materiaaltabel).
- Monteer de glasschuif en afdekplaat met de hydrofobe glasschuif op de bodem van de stroomcel en de hydrofiele afdekplaat als het bovenoppervlak in een sandwichgeometrie met behulp van dubbelzijdige zelfklevende afstandhouders van 40 μm. Plaats de afstandhouders 1,5 mm uit elkaar op de hydrofobe microscoopglaasjes. Plaats vervolgens de met acrylamide gecoate coverslip bovenop de afstandhouders met de behandelde kant naar beneden om te hechten. Zorg ervoor dat de hechting compleet is met druk van een stomp voorwerp.
OPMERKING: Het doel is om een stroomcel samen te stellen met een platte olie/water-interface erin (figuur 2A, B). Dit is waar de actieve laag zich zal vormen. Alternatieve spacer tapes en films kunnen ook worden gebruikt om een vergelijkbare celdikte te produceren. - Nadat de stroomcel is geconstrueerd, pipetteert u het oliemengsel onmiddellijk in de stroomcel en vult u de afgesloten ruimte.
- Gebruik een pipet om in een afzonderlijke injectieflacon voorzichtig 6 μL actief materiaal te mengen met 3,73 μL MIX, 1 μL microtubulioplossing, 0,6 μL ATP-oplossing (de concentratie kan worden gevarieerd om de microtubulisnelheid te variëren) en 0,67 μL M2B-buffer.
- Pipetteer vers gemengd actief materiaal in één open uiteinde van de stroomcel, volumes zullen variëren maar moeten het volume van de stroomcel overschrijden (ongeveer 3-6 μL). Sommige olie zal worden verplaatst door de waterige oplossing als deze in het kanaal wordt geïnjecteerd; dit kan aan de andere kant van het stroomkanaal worden afgebroken met behulp van een klein stukje tissuepapier.
- Sluit na het vullen beide zijden van de stromingscel af met een epoxylijm (zie Materiaaltabel) die uithardt bij blootstelling aan UV-licht gedurende 20 s.
OPMERKING: Op dit punt vormt het actieve materiaal een 3D-netwerk dat in de waterlaag blijft hangen. - Om de actieve laag tussen de twee onmengbare vloeistoffen in een quasi-2D-laag te beperken, plaatst u de stroomcel in een zwaaiende emmercentrifuge (zie Materiaaltabel) met de waterige fase bovenop en de dichtere olielaag eronder. Centrifugeer bij 212 x g gedurende 10 min. Nadat deze stap is voltooid, kan de stroomcel naar een epifluorescentiemicroscoop worden gebracht voor beeldvorming met een vergrotingsobjectief van 10x of 20x. Figuur 2C,D toont typische beelden voor en na deze stap.
- Bereid hydrofiele coverslips voor met een acrylamidecoating.
- Omgekeerde methode voor actieve nematische vorming
OPMERKING: Een alternatieve methode dan beschreven in stap 2.1 is om de actieve nematische laag samen te voegen onder een dikke olielaag die beperkt is tot een diepe PDMS-put28. Deze methode levert vergelijkbare resultaten op en is iets gemakkelijker te beheersen; de beeldkwaliteit met deze methode is echter meestal niet zo goed als de stroomcelmethode.- Bereid het polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van een elastomeeruithardingsmiddel en een elastomeerbasis (zie Materiaaltabel). Meng de twee componenten in een verhouding van 1:10 met behulp van een metalen spatel. Tijdens het mengen verschijnen kleine belletjes die moeilijk te verwijderen zijn en het mengsel lijkt melkachtig. Om deze belletjes te verwijderen, plaatst u het mengsel onder een vacuüm om gedurende 1 uur te ontgassen, waarna het niet-uitgeharde PDMS transparant moet lijken.
OPMERKING: Het PDMS is nu klaar om elke vorm te vormen met behulp van een mal, of het kan uitharden in de container en vervolgens worden gesneden of geponst in het gewenste patroon. - Giet het PDMS in een geschikte mal en laat een nacht uitharden bij 60 °C.
OPMERKING: Onbehandeld is het oppervlak van uitgehard PDMS hydrofoob, maar met oppervlaktebehandeling kan het hydrofiel worden gemaakt. - Om een hydrofiel PDMS-oppervlak te bereiden, bedekt u het PDMS met een acrylamidepolymeerborstel29. Deze stap voorkomt ook dat eiwitten aan het oppervlak blijven plakken.
- Begin met het reinigen van de PDMS gedurende 10 minuten met zowel ethanol als isopropanol, spoel vervolgens grondig af met gedeïoniseerd water 3x en droog. Gebruik een plasmareiniger gedurende 5 minuten om het droge, uitgeharde PDMS schoon te maken. Deze stap maakt het oppervlak meer hydrofiel.
- Bereid vervolgens een silaanoplossing (98,5 wt% ethanol, 1 wt% azijnzuur en 0,5 wt% Trimethoxysilylpropylmethacrylaat) en dompel het substraat gedurende 15 minuten in die oplossing om zich voor te bereiden op de acrylamidecoating. Spoel het substraat grondig af met gedeïoniseerd water en dompel onder in acrylamide-oplossing (2 wt% acrylamide/bis-oplossing, 2,3 mM TEMED en 3 mM ammoniumpersulfaat).
OPMERKING: Deze substraten kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur bedekt met acrylamide-oplossing in een glazen petrischaal en moeten binnen 2 weken worden gebruikt.
- Wanneer klaar voor gebruik, spoel het oppervlak met gedeïoniseerd water en droog met stikstof voor onmiddellijk gebruik. Voeg het actieve mengsel (beschreven in stap 2.1.6) toe aan de putjes en voeg onmiddellijk siliconenolie toe tot een dikte van ongeveer 2 mm.
OPMERKING: In dit stadium zal het actieve mengsel worden ingeklemd tussen de olie en de hydrofiele coating op het PDMS, maar het zal nog steeds enigszins driedimensionaal zijn. - Om het materiaal verder in een 2D-laag te duwen, lijmt u het PDMS-apparaat op een glazen glijbaan, plaatst u het in een zwaaiende emmercentrifuge en draait u gedurende 12 minuten bij 212 x g. Het apparaat moet zo worden geplaatst dat de siliconenolie zich op de bovenkant van de waterige laag bevindt. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 3.
- Bereid het polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van een elastomeeruithardingsmiddel en een elastomeerbasis (zie Materiaaltabel). Meng de twee componenten in een verhouding van 1:10 met behulp van een metalen spatel. Tijdens het mengen verschijnen kleine belletjes die moeilijk te verwijderen zijn en het mengsel lijkt melkachtig. Om deze belletjes te verwijderen, plaatst u het mengsel onder een vacuüm om gedurende 1 uur te ontgassen, waarna het niet-uitgeharde PDMS transparant moet lijken.
3. Voorbereiding van actieve nematica in besloten geometrieën
OPMERKING: Actieve nematica zoals dit quasi-tweedimensionale systeem kunnen een uitdaging zijn om te beperken tot kleine microfluïdische geometrieën zoals putten of kanalen. Hier wordt een betrouwbare methode beschreven om het materiaal in verschillend gevormde PDMS-putten te beperken.
- Ontwerp eerst een hoofdmal voor het PDMS. Dit kan worden bereikt door pilaren op een substraat te 3D-printen. Na het 3D-printen van de harsmastermal, reinigt u met isopropanol en hardt u de mal vervolgens uit onder een UV-lamp gedurende 45 minuten en in de oven bij 120 °C gedurende 2 uur (figuur 4).
OPMERKING: Uitharden onder UV en thermische uitharding verbetert de kwaliteit van de replicatie in PDMS door monomeren en fotoremmerresiduen uit de harste verwijderen 30. - Gebruik de hoofdmal om putten te maken van PDMS. Bereid het PDMS voor zoals beschreven in stap 2.2.1. Dompel de hoofdmal onder in ongehard PDMS en laat een nacht uitharden in een oven op 60 °C.
- Nadat het uitharden van PDMS is voltooid, verwijdert u voorzichtig de hoofdmal en snijdt u het PDMS naar wens om met de putten te werken (figuur 4). Behandel het PDMS-oppervlak zoals beschreven in stap 2.2.3. Vóór het experiment kan het oppervlak worden bevestigd aan een glasplaat met epoxylijm om beeldvorming gemakkelijker te maken.
- Pipetteer 1 μL van het actieve mengsel beschreven in stap 2.1.6 op het PDMS-substraat en voeg onmiddellijk siliconenolie met 100-1000 cSt viscositeit28 toe bovenop de actieve netwerkdruppel. Het actieve netwerk zal zich in de put verplaatsen; dit proces duurt maximaal 60 minuten (figuur 4). Zoals beschreven in stap 2.2.5 kan het 2D-netwerk worden verbeterd door de PDMS-put in de zwenkbakcentrifuge gedurende 12 minuten bij 212 x g naar beneden te draaien.
Representative Results
Figuur 1 toont een representatief beeld van enkele microtubuli bereid uit GMPCPP-tubuline. De afbeelding toont korte microtubuli van vergelijkbare lengtes (met enige dispersie aanwezig). Voldoende verdunning van de microtubule-oplossing moet een beeld van goed gescheiden microtubuli opleveren voor lengteverificatie. De individuele microtubuli kunnen een uitdaging zijn om in beeld te brengen vanwege hun kleine formaat. Het gebruik van een camera met hoge gevoeligheid die is ontworpen voor fluorescentiemicroscopie is het beste voor deze toepassing. Figuur 2 en figuur 3 tonen voorbeeldfluorescentiemicroscopiebeelden van succesvolle experimenten die zijn uitgevoerd met respectievelijk de flowcelmethode (punt 2.1) en de omgekeerde methode (punt 2.2). Een goed gevormde actieve nematische laag is homogeen van textuur, zonder significante holtegebieden en mobiele topologische defecten aanwezig. Houd er echter rekening mee dat er enkele acceptabele kleine holtes in de defecte kernen kunnen zijn. Naast de voorbeelden in figuur 2 en figuur 3 zijn drie aanvullende films (film 1, film 2 en film 3) opgenomen om aan te tonen hoe de actieve nematic in een succesvol experiment moet verschijnen. Alle films tonen de vloeiende continue beweging van de actieve nematische fase. Er zijn geen variaties in de microtubuliconcentratie zichtbaar nadat het materiaal zijn steady state heeft bereikt. Zolang er voldoende ATP in het systeem aanwezig is, zal het materiaal gelijkmatig blijven bewegen.
Figuur 1: Fluorescentiemicroscoopbeeld van GMPCPP-microtubuli. De GMPCPP-microtubuli werden gelabeld op 4% met rhodamine tubuline en gepolymeriseerd gedurende 20 minuten bij 37 °C. Beeldvorming werd uitgevoerd bij kamertemperatuur. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microtubule nematica in een flowcel. (A) Cross sectioneel schema van de flowcel, 1 mm x 18 mm geometrie. (B) Bovenaanzicht schema van de stroomcel. (C) Fluorescentiemicroscopiebeeld dat het typische uiterlijk van de actieve oplossing aantoont voordat het op het olie/water-grensvlak wordt gemonteerd. (D) Fluorescentiemicroscopiebeeld van de actieve nematische fase geassembleerd op het olie/water-raakvlak in de stroomcel. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Fluorescentiemicroscoopafbeelding met een actieve nematic die is bereid met behulp van de omgekeerde methode. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Stromingsdiagram ter illustratie van de methode voor actieve nematische opsluiting in een PDMS-put, inclusief matrijsfabricage en oppervlaktebehandeling. Schaalbalk op de rechter afbeelding (beperkt actief materiaal) = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: Representatief resultaat voor actieve nematic bereid met behulp van de flow cell methode. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 2: Representatief resultaat voor actieve nematic bereid met behulp van de omgekeerde methode. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 3: Representatief resultaat voor actieve nematic bereid met behulp van de omgekeerde methode beperkt tot een elliptische put. Klik hier om deze film te downloaden.
Discussion
Er zijn een paar punten in de protocollen waarop de experimentator enkele belangrijke controles kan uitvoeren. Alvorens een van de apparaten met actief materiaal te vullen, moet fluorescentiemicroscopie (zie figuur 1) worden gebruikt om te controleren of de microtubuli gepolymeriseerd zijn en idealiter ~ 2-3 μm lang. Als microtubuli niet zichtbaar zijn onder de microscoop, kunnen ze zijn gedepolymeriseerd en zal de actieve nematic zich niet vormen. Omdat individuele microtubuli erg klein zijn, kan het een uitdaging zijn om ze rechtstreeks door de microscoop te observeren. In deze studie werd een hoogwaardige fluorescentiecamera gebruikt die is ontworpen voor uitdagende toepassingen bij weinig licht met de bijbehorende software om de groei van filamenten te verifiëren. Significante fluorescerende aggregaten mogen in dit stadium niet aanwezig zijn, omdat dit kan wijzen op depolymerisatie of de aanwezigheid van gedenatureerd eiwit. Het is ook een goed idee om een eenvoudige microscooptest te maken door microtubuli, MIX en ATP te combineren in dezelfde verhoudingen als beschreven in de protocollen. De activiteit moet beginnen bij het combineren van de componenten en het materiaal moet vergelijkbaar zijn met het materiaal in figuur 2C met bundels aanwezig en merkbare filamentbewegingen die overal zichtbaar zijn.
Bij gebruik van de flowcelmethode zijn de centrifugetijd en oriëntatie van de flowcel belangrijk voor de vorming van een uniforme actieve laag. Deze stap kan enige fijnafstelling vereisen, afhankelijk van het gebruikte centrifugetype. Het centrifugeren van de stroomcel met het actieve vlak loodrecht op het rotatievlak georiënteerd geeft de beste resultaten omdat materiaal uniform op de vloeistofinterface kan worden geduwd. Controleer nogmaals of de stroomcel zorgvuldig is afgesloten voordat deze wordt gecentrifugeerd.
Bij het gebruik van de omgekeerde methode om beperkte actieve nematica te produceren, zijn er verschillende stappen om te optimaliseren. Ten eerste is het belangrijk om een 3D-printmethode te gebruiken die structuren met een hoge resolutie produceert. Ongelijke zijwanden kunnen ervoor zorgen dat de microtubuli vangen, wat de stromen zal verstoren. De putten mogen niet te diep zijn (in dit onderzoek is gebruik gemaakt van 150-200 μm diepe putten met een 2 mm dikke bovenliggende olielaag). Experimentatoren moeten deze parameters mogelijk enigszins aanpassen met vallen en opstaan om het beste resultaat te krijgen.
De flowcelmethode en de omgekeerde methode zijn door verschillende auteurs gebruikt om te kijken naar een verscheidenheid aan effecten die van invloed zijn op de actieve stromen, waaronder verschillende oliën12 en ondergedompelde structuren13. De keuze van de methode hangt af van het experimentele doel. Met behulp van de flow cell-methode is optische beeldvorming van boven de actieve laag duidelijker dan voor de omgekeerde methode vanwege de verschillende bovenliggende vloeistoffen. In de flow cell-methode wordt beeldvorming uitgevoerd door middel van een glazen afdekslip en een dunne laag water, terwijl de omgekeerde methode is ontworpen om de olielaag bovenop te hebben. Dit betekent dat er een lange werkafstandsdoelstelling nodig is voor de omgekeerde methode en dat de beeldkwaliteit wordt verminderd. Verschillen in beeldkwaliteit kunnen worden gezien door figuur 2D (stroomcelmethode) en figuur 3 (omgekeerde methode) en respectievelijk film 1 en film 2 te vergelijken. Voor figuur 3 was een lens met een lagere vergroting met een langere werkafstand vereist dan voor figuur 2. Deze beeldvormende nadelen voor de omgekeerde methode kunnen worden vermeden als er een geschikte omgekeerde microscoop beschikbaar is, gecombineerd met objectieven met een passende werkafstand voor de microscoopglaassubstraten. Dunner glas kan worden gebruikt als substraat om het gebruik van standaard werkafstandsdoelen mogelijk te maken.
Als voordeel is dat de omgekeerde geometrie het gebruik van een breder scala aan olieviscositeiten mogelijk maakt, niet noodzakelijkerwijs zwenkende emmercentrifugatie vereist (als dit niet beschikbaar is) en de voorbereiding van het systeem is relatief eenvoudiger zodra de mal is voorbereid. Voor opsluiting in putten met behulp van de omgekeerde methode kan enige centrifugatie echter belangrijk zijn om het materiaal in een goed gedefinieerde 2D-laag te krijgen.
De flow cell methode is recent zeer succesvol toegepast in experimenten waarbij een continue actieve laag nodig is. Ons recente werk heeft gekeken naar de dynamiek van topologische defecten in de actieve laag, waar hoogwaardige beeldvorming en textuuranalyse belangrijk is19. Daarnaast is de flow cell methode gebruikt om de effecten van olie-ondergedompelde microstructuren op actieve stromen16 en pijlers te onderzoeken om defecten in de actieve stromen op te vangen31. Deze methode werkt heel goed voor de vorming van een continue actieve laag en de beeldkwaliteit is uitstekend. De centrifugatiestap die wordt gebruikt om de laatste actieve 2D-laag te produceren, kan echter moeilijk uit te voeren zijn en de stroomcellen zijn gevoelig voor lekken en luchtbellen. De omgekeerde methode is een zeer nuttig alternatief met een hoog slagingspercentage, is gemakkelijk te construeren en kan worden gebruikt voor elk substraatpatroon of geometrie, op voorwaarde dat een 3D-geprinte hoofdmal met hoge resolutie kan worden gemaakt. Deze methode is ook nuttig om te kijken naar de effecten van geometrische opsluiting op actieve nematische dynamica, omdat het het vullen van putten relatief eenvoudig maakt.
In dit artikel worden twee manieren beschreven om een actieve nematic te vormen uit microtubuli en kinesinemotoren, plus een techniek om de materialen in putten op te sluiten. Het gepresenteerde systeem is het schoonste voorbeeld van een actieve nematische fase die momenteel in de literatuur is en is gereproduceerd door verschillende groepen over de hele wereld. De betekenis van dit materiaal ligt niet alleen in de biologische oorsprong van zijn componenten, maar ook omdat het een geheel nieuwe richting opent in actieve geordende vloeistoffen. Door met dit systeem te werken en de fundamentele eigenschappen ervan op te helderen, kunnen wetenschappers evolueren naar het ontwerp van volledig synthetische actieve fasen.
De experimenten gericht op de effecten van opsluiting op actieve nematica hebben het potentieel om fundamentele vragen te beantwoorden met betrekking tot het gedrag van actieve stromen en topologische defectdynamica onder topologische opsluiting. De hier gepresenteerde methode zal helpen bij het uitvoeren van een verscheidenheid aan op geometrie gerichte experimenten en hun analyse, waaronder microfluïdica en actief mengen.
Disclosures
Sommige materialen die in dit werk werden gebruikt, werden gratis verstrekt door Cytoskeleton Inc. (Denver, VS).
Acknowledgments
De auteurs willen graag de National Science Foundation (NSF) erkennen die DMR-1808926 toekent voor genereuze financiering. Het project werd ook ondersteund door de NSF via het Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines aan de University of California Merced (HRD-1547848) en het Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). We willen Dr. Bin Liu van de University of California Merced bedanken voor hulp bij het 3D-printen van de mal, en Dr. Jordi Ignes voor wetenschappelijk advies tijdens de ontwikkeling van de omgekeerde experimentele methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
| 3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin | |
| 40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
| Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
| Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
| Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
| ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
| Beakers | VWR | ||
| Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
| Desiccator | Bel-art | ||
| Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA - Flash4.0 LT+ | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
| EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
| Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
| Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
| GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
| HFE7500 Oil | 3M | ||
| Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | ||
| KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
| Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf - Thermo Fisher | 1.5 mL | |
| Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
| Petri Dishes | VWR | ||
| PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
| Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
| PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
| Pipettes (0.2 - 1000 µl) | VWR | ||
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
| RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
| Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
| Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
| Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
| Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
| Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
| UV Light | RapidFix | ||
| UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
| Water Bath | Thelco | ||
| Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |
References
- Sokolov, A., Aranson, I. S., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Concentration dependence of the collective dynamics of swimming bacteria. Physics Review Letters. 98 (15), 158102 (2007).
- Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
- Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (97654), 327-331 (2017).
- Toner, J., Tu, Y. Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: how birds fly together. Physics Review Letters. 75 (23), 4326-4329 (1995).
- Katz, Y., Tunstrøm, K., Ioannou, C. C., Huepe, C., Couzin, I. D. Inferring the structure and dynamics of interactions in schooling fish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (46), 18720-18725 (2011).
- Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048 (2017).
- Weirich, K., Dasbiswas, K., Witten, T. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (23), 11125-11130 (2019).
- Memarian, F. L., et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), (2021).
- Bausch, A., Sciortino, A. R. Pattern formation and polarity sorting of driven actin filaments on lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (6), (2021).
- Maroudas-Sacks, Y., et al. Topological defects in the nematic order of actin fibres as organization centres of Hydra morphogenesis. Nature Physics. 17 (2), 251-259 (2021).
- Liu, J., et al. Topological braiding and virtual particles on the cell membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (34), (2021).
- Hirst, L. S. Fundamentals of Soft Matter Science 2nd ed. , CRC Press. (2019).
- Sanchez, T., Chen, D., DeCamp, S., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S.
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8, 564 (2017).
- Thijssen, K., et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), (2021).
- Shendruk, T. N., Doostmohammadi, A., Thijssen, K., Yeomans, J. M. Dancing disclinations in confined active nematics. Soft Matter. 13 (21), 3853-3862 (2017).
- Giomi, L. Geometry and topology of turbulence in active nematics. Physical Review X. 5 (3), 031003 (2015).
- Tan, A. J., et al.
- Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit interactions in dimeric kinesin heavy chain derivatives that lack the kinesin rod. The Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
- Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Expression, purification, and characterization of the Drosophila kinesin motor domain produced in Escherichia coli. Biochemistry. 32 (17), 4677-4684 (1993).
- Kuznetsov, S. A., Gelfand, V. I. Kinesin Protocol. Vernos, I. 164, Humana Press. NJ. (2001).
- Hawkins, T. L., Sept, D., Mogessie, B., Straube, A., Ross, J. L. Mechanical properties of doubly stabilized microtubule filaments. Biophysics Journal. 104 (7), 1517-1528 (2013).
- Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling flow speeds of microtubule-based 3D active fluids using temperature. Journal of Visualized Experiments. (153), e60484 (2019).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Tayar, A. M., Lemma, L. M., Dogic, Z. Assembling microtubule-based active matter.. Microtubules. , Humana. New York, NY. 151-183 (2022).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Shankar, S., Marchetti, M. C., Sagués, F. Probing the shear viscosity of an active nematic film. Physical Review E. 94 (6), 060602 (2016).
- Rudy, A., et al. Lubricous hydrogel surface coatings on polydimethylsiloxane (PDMS). Tribology Letters. 65, 3 (2017).
- Venzac, B., et al. PDMS curing inhibition on 3D-printed molds: Why? Also, how to avoid it. Analytical Chemistry. 93 (19), 7180-7187 (2021).
- Khaladj, D. A., Hirst, L. S. Using curved fluid boundaries to confine active nematic flows. Frontiers of Physics. 10, 880941 (2022).
