Summary
यहां, हम पोस्ट-मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) माउस दिल से उच्च व्यवहार्यता के साथ पर्याप्त मात्रा में एकल गैर-कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसका उपयोग बाद में एकल-कोशिका अनुक्रमण, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए किया जा सकता है।
Abstract
मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) दुनिया भर में बढ़ती मृत्यु दर के साथ सबसे आम हृदय रोगों में से एक है। गैर-कार्डियोमायोसाइट्स कुल कार्डियक सेल आबादी के आधे से अधिक के लिए जिम्मेदार हैं, और वे मायोकार्डियल चोट पर अनुकूली मुआवजे में योगदान करते हैं, जिसमें भड़काऊ प्रतिक्रियाएं, ऊतक की मरम्मत और निशान गठन शामिल हैं। पोस्ट-एमआई कार्डियक माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन करने के लिए, एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) का व्यापक रूप से विभिन्न कार्डियक सेल प्रकारों और अंतरकोशिकीय संचार की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। एससीआरएनए-सेक नमूना तैयारी की प्रक्रियाओं में, सेल निलंबन तैयार करना सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, क्योंकि सेल व्यवहार्यता एससीआरएनए-सेक परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है। इसलिए, हमने हल्के पाचन एंजाइमों को चुनने, पाचन समय को नियंत्रित करने और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) लागू करके सेल व्यवहार्यता में सुधार करने पर अतिरिक्त ध्यान देने के साथ पोस्ट-एमआई माउस दिलों से एक गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल तैयार किया। अंत में, हमने इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन से सीडी 45+ कोशिकाओं को अलग किया, और फिर हमने एससीआरएनए-सेक का प्रदर्शन किया।
Introduction
मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) सबसे आम कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों में से एक है, और इसकी मृत्युदर दुनिया भर में बढ़ रही है। एमआई आसपास के मायोकार्डियम में अपर्याप्त रक्त की आपूर्ति के कारण होता है, जो एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका टूटने के साथ होने वाली कोरोनरी धमनी रुकावट का परिणाम हो सकता है। हालांकि पर्क्यूटेनियस कोरोनरी इंटरवेंशन (पीसीआई) ने तीव्र एमआई रोगियों की मृत्यु दर को कम कर दिया है, लेकिन एमआई के बाद दिल की विफलता का उच्च प्रसार एक समस्याबनी हुई है। एमआई दिल की विफलता के बाद अंतर्निहित प्रमुख पैथोफिज़ियोलॉजी हृदय की चोटों के लिए शरीर की प्रतिपूरक प्रतिक्रिया है, जिसमें मृत हृदय की मांसपेशियों को गैर-सिकुड़ा हुआ फाइब्रोटिक निशान के साथ बदलना शामिल है। ये अनुकूली प्रतिक्रियाएं कई सेल प्रकारों और हृदय ऊतक कोशिकाओं के बीच बातचीत द्वारा मध्यस्थता की गई स्थानीय सूजन पर काफी निर्भर करती हैं, और इस सूजन को अब फाइब्रोटिक निशान गठन को कम करने के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य माना जाता है और इस प्रकार, पोस्ट-एमआई दिल की विफलता 3,4 से बचाता है। दिलचस्प बात यह है कि रोधगलन स्थल पर माइक्रोएन्वायरमेंट एमआई 1,5 के विभिन्न चरणों में घुसपैठ करने वाले सेल प्रकारों और कार्यों में समय-निर्भर संक्रमण का अनुभव करता है। कई अध्ययनों से पता चला है कि गैर-कार्डियोमायोसाइट्स (जैसे, प्रतिरक्षा कोशिकाएं, फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाएं) पोस्ट-एमआई सूजन और ऊतक की मरम्मतमें केंद्रीय भूमिका निभाती हैं। हाल के वर्षों में, एकल-कोशिका अनुक्रमण का व्यापक रूप से पोस्ट-एमआई माइक्रोएनवायरमेंट 7,8 में गैर-कार्डियोमायोसाइट्स की भागीदारी और कार्यों को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उपयोग किया गया है। यह पोस्ट-एमआई चोट और मरम्मत के पैथोफिज़ियोलॉजी और पोस्ट-एमआई दिल की विफलता के खिलाफ संभावित उपचारों के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
उच्च-थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) एक तकनीक है जिसका उपयोग अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) 7,8,9 का उपयोग करके पूरे ट्रांसक्रिपटम्स का बहुत विस्तार से अध्ययन करने के लिए किया जाता है। हाल ही में, एससीआरएनए-सेक के विकास ने जैव चिकित्सा अनुसंधान क्षेत्र में क्रांति ला दी है। पारंपरिक थोक अनुक्रमण की तुलना में, एससीआरएनए-सेक एकल-कोशिका स्तर 7,8 पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और ट्रांसक्रिप्शनल विषमता का विश्लेषण करता है। यह तकनीक पोस्ट-एमआई माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न परिसंचारी सेल प्रकारों की पहचान करके और कार्डियोमायोसाइट्स और गैर-कार्डियोमायोसाइट्स के बीच बातचीत को उजागर करके एमआई 9,10 के सेलुलर पैथोफिज़ियोलॉजी के अनुसंधान को काफी बढ़ावा देती है। ये निष्कर्ष पोस्ट-एमआई दिल की विफलता के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों को उजागर करने में योगदान करते हैं। सामान्य तौर पर, एससीआरएनए-सेक-आधारित पोस्ट-एमआई प्रयोग में तीन मुख्य खंड शामिल हैं: (1) पोस्ट-एमआई पशु मॉडल की स्थापना; (2) सेल निलंबन की तैयारी; और (3) नमूना अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण। उल्लेखनीय रूप से, सेल निलंबन तैयार करना एससीआरएनए-सेक प्रयोग की तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि सेल निलंबन की गुणवत्ता परिणामों की सटीकता निर्धारित करती है।
यह प्रोटोकॉल पोस्ट-एमआई कार्डियक ऊतक से एक गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल निलंबन निकालने के लिए डिज़ाइन किया गया है; गौरतलब है कि सेल व्यवहार्यता और संकल्प को बनाए रखने के लिए विशिष्ट विवरण शामिल हैं। इस बीच, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरण, जैसे चूहों के लिए सर्जिकल किट, कृंतक वेंटिलेटर और सेंट्रीफ्यूज, अधिकांश पशु प्रयोग केंद्रों और जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में पाए जा सकते हैं, और इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल की प्रयोग लागत अपेक्षाकृत कम है। इसके अलावा, यदि समय बिंदुओं और रोधगलन की साइटों को चर के रूप में माना जाता है, तो इस प्रोटोकॉल को नैदानिक परिदृश्यों की एक विस्तृत श्रृंखला का अनुकरण करने के लिए लागू किया जा सकता है, खासकर पोस्ट-एमआई जटिलताओं के लिए।
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Protocol
सभी प्रयोग झेजियांग विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे और झेजियांग विश्वविद्यालय में पशु सलाहकार समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।
1. बाएं पूर्ववर्ती अवरोही कोरोनरी धमनी बंधाव (एलएडी बंधाव) सर्जरी।
नोट: आठ सप्ताह के पुरुष C57BL / 6J चूहों को मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया था। बाएं पूर्ववर्ती अवरोही कोरोनरी धमनी बंधाव सर्जरी पहले वर्णित और प्रदर्शित11 के रूप में की गई थी।
- सर्जरी से पहले 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल उपकरणों को कीटाणुरहित करें।
- माउस का वजन करें, और फिर माउस को 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम (50 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली-चुटकी रिफ्लेक्स का निरीक्षण करें, और प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन करने के लिए श्वसन दर को मापें।
- माउस को ऑपरेटिंग टेबल पर 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड के साथ रखें। आंखों के निर्जलीकरण को रोकने के लिए नेत्र मरहम का उपयोग करें।
- इसकी बाईं छाती और गर्दन को डिपिलेटरी क्रीम के साथ मिलाएं, और बालों को हटाने के लिए कपास के फाहे का उपयोग करें। आयोडोफोर के साथ अपनी त्वचा को कीटाणुरहित करें, इसके बाद 70% अल्कोहल तीन बार क्षेत्र को साफ करें।
- माइक्रोस्कोप के नीचे एक मध्य रेखा ग्रीवा चीरा (0.8-1.0 सेमी) करें। श्वासनली के आसपास की त्वचा, मांसपेशियों और ऊतक को अलग करें, और फिर श्वासनली में 20 ग्राम प्रवेशनी डालें।
नोट: सूक्ष्म दृश्य के तहत श्वासनली में कैनुला डालते समय निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ट्यूब अन्नप्रणाली में नहीं डाली गई है। - माउस को प्रति मिनट 150 स्ट्रोक के साथ 0.2 एमएल ज्वारीय मात्रा पर सेट कृंतक वेंटिलेटर से कनेक्ट करें।
- एक बाँझ कैंची के साथ माउस छाती को मिडक्लेवकुलर लाइन के साथ तिरछा रूप से इंजेक्ट करें। पसलियों को उजागर करने के लिए चमड़े के नीचे के ऊतक को विच्छेदित करें।
- बाईं मध्य-क्लेवुलर लाइन (0.8-1.0 सेमी) के साथ त्वचा को तिरछा रूप से काटने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करें। दिल को उजागर करने के लिए तीसरी और चौथी पसलियों को अलग करने के लिए बाएं थोराकोटॉमी करें। स्पष्ट दृश्य के लिए रिब रिकॉलर का उपयोग करें।
- घुमावदार बल के साथ पेरिकार्डियम खोलें, और फिर 7-0 रेशम सीवन का उपयोग करके बाएं पूर्ववर्ती अवरोही धमनी (बाएं आलिंद उपांग के नीचे) को अलग करें। बाएं वेंट्रिकल की एक पीली पूर्ववर्ती दीवार इंगित करती है कि मायोकार्डियल छिड़काव सफलतापूर्वक बाधित है।
- रिब रिप्रत्यावर्ती को छोड़ दें, और छाती से हवा को बाहर निकालते हुए 5-0 रेशम सीवन के साथ परतों में वक्ष चीरा सिल लें। गर्दन के चीरे को 5-0 सीवन सिल्क सीवन से सिलें।
- माउस से श्वासनली ट्यूब को हटा दें जब इसकी सहज श्वास बहाल हो जाए। इंट्रापरिटोनियल रूप से 0.5 एमएल प्री-वार्म्ड बाँझ खारा इंजेक्ट करें। दर्द को कम करने के लिए हर 12 घंटे में बुप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें।
- अंत में, पुनर्जीवन की प्रतीक्षा करने के लिए हीटिंग पैड पर माउस रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए माउस की निगरानी करें कि यह दृश्य अवलोकन के माध्यम से अत्यधिक डिस्पेनिया या रक्तस्राव से पीड़ित नहीं है।
- उठने के बाद माउस को उसके पिंजरे में वापस कर दें। पहले सप्ताह के लिए, यह सत्यापित करने के लिए कि इसकी गतिशीलता, सौंदर्य और खाने की आदतें पर्याप्त हैं, माउस की दैनिक निगरानी करें। प्रयोग की जरूरतों के अनुसार, एमआई के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर दिल की कटाई करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, एमआई के 2 सप्ताह बाद दिल के साथ सिंगल-सेल सस्पेंशन तैयार किया गया था।
2. कार्डियक सिंगल-सेल सस्पेंशन की तैयारी
- समाधान और मीडिया की तैयारी
- कार्डियक ऊतक पृथक्करण बफर: आरपीएमआई 1640 के 5 एमएल में 10 मिलीग्राम कोलेजनेस IV (600 यू / एमएल), 5 मिलीग्राम डिस्पेस II (0.5 यू / एमएल), और 50 μL DNase I (100 μg / mL) मिलाएं। उपयोग करने से पहले पानी के स्नान में इस माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें।
- सेल वॉश बफर: फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस, पीएच 7.4) में 1% बीएसए या 10% एफबीएस तैयार करें, और 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखें।
- छिड़काव समाधान: छिड़काव समाधान के रूप में प्री-कूल पीबीएस (पीएच 7.4)।
- लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लाइसिस बफर: निर्माता द्वारा उल्लिखित आरबीसी लाइसिस बफर का उपयोग करें।
नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों और उपकरणों की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।
- एक इंट्रापरिटोनियल पेंटोबार्बिटल सोडियम (150 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्शन द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें।
- दिल का विच्छेदन।
- चिपकने वाले टेप के साथ अपने पिछले अंगों को ठीक करके माउस को लापरवाह स्थिति में रखें।
- 70% इथेनॉल के साथ शरीर को स्प्रे करें, और फिर यकृत को छेदने से बचते हुए पेट की त्वचा और मांसपेशियों के माध्यम से लंबवत रूप से काट लें। दिल को घुमाने से बचने के दौरान वक्ष को ध्यान से खोलें।
- बाएं वेंट्रिकल को तब तक गर्म करने के लिए प्री-कूल्ड पीबीएस (पीएच 7.4) का उपयोग करें जब तक कि रंगहीन छिड़काव द्रव नहीं देखा जाता है (लगभग 15 एमएल पीबीएस [पीएच 7.4] की आवश्यकता होती है)।
- धीरे से हृदय को छाती से बल के साथ उठाएं, और नेत्र कैंची के साथ हृदय के बाहर से जुड़े अतिरिक्त ऊतक को काट दें। दिल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्री-कूल्ड पीबीएस (पीएच 7.4) के 1 एमएल में रखें।
- हृदय ऊतक का एंजाइमेटिक पृथक्करण
- माउस के दिल को बर्फ पर रखे कार्डियक ऊतक पृथक्करण बफर के 150 μL के साथ 24-वेल प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें, और इसे कैंची के साथ छोटे टुकड़ों (~ 1 मिमी) में काट लें।
- कीमा वाले हृदय ऊतक को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिसमें ऊतक पृथक्करण बफर के 5 मिलीलीटर हों।
नोट: अनुशंसित कार्डियक ऊतक पृथक्करण बफर वॉल्यूम 5 एमएल / - सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को विद्युत थर्मोस्टेटिक पारस्परिक शेकर में 125 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। ऊतक निलंबन को हर 20 मिनट में 10 बार ऊपर और नीचे करें।
- बिना पचे हुए ऊतक और झुरमुट को हटाने के लिए 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें। मूल ट्यूब को कुल्ला करने के लिए सेल वॉश बफर के 25 एमएल जोड़ें, और फिर इसे सेल छन्नी को कुल्ला करने के लिए स्थानांतरित करें। इसके बाद, सेल क्लंप को हटाने के लिए 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।
- फ़िल्टर किए गए सेल सस्पेंशन को 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और फिर कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 1x आरबीसी लाइसिस बफर में सेल के नमूने को फिर से निलंबित करें।
- सेल वॉश बफर की चार गुना अधिक मात्रा जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और सेल वॉश बफर के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और सेल वॉश बफर के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- सेल सस्पेंशन के 18 μL को 2 μL acridine नारंगी (AO)/प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) धुंधला घोल (9: 1) के साथ मिलाएं, और मिश्रण के 10 μL को एक गिनती कक्ष स्लाइड में जोड़ें। एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल संख्या और व्यवहार्यता का मूल्यांकन करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल की धारा 2 को लागू करके उच्च जीवन शक्ति के साथ एक एकल-सेल निलंबन प्राप्त किया गया था। हालांकि, सेल के टुकड़े अभी भी देखे जा सकते हैं (चित्रा 1 ए); इसलिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) गुणवत्ता16 में और सुधार करने के लिए किया गया था। एफएसीएस के बाद, औसत सेल आकार 9.6 μm से 9.1 μm (तालिका 1) तक कम हो जाता है, जो बताता है कि FACS (चित्रा 1B) द्वारा सेल निलंबन में सेल टुकड़ों के अनुपात को प्रभावी ढंग से कम किया जा सकता है। एफएसीएस के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति चित्रा 1 सी में दिखाई गई है।
चित्रा 1 में छवियों के अलावा, सेल एकाग्रता, औसत सेल आकार और सेल व्यवहार्यता को सेल काउंटर (तालिका 1) द्वारा मापा गया था। सेल सांद्रता में अंतर सेल निलंबन की मात्रा के कारण थे। उल्लेखनीय रूप से, एफएसीएस (तालिका 1) के बाद औसत सेल आकार कम हो गया, जिससे पता चलता है कि एफएसीएस प्रभावी रूप से सेल क्लंपिंग को कम कर सकता है और सेल के टुकड़ों को हटा सकता है।
इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त सेल निलंबन गुणवत्ता को सत्यापित करते हुए कार्डियक इम्यूनोलॉजिकल माइक्रोएन्वायरमेंट का अध्ययन करने के लिए एससीआरएनए-सेक का प्रदर्शन किया गया था। एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के बाद, हमने सबसे पहले उन कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया जो सतह प्रोटीन सीडी 45 व्यक्त करते हैं, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक सामान्य मार्कर है। इसके बाद, हमने 10एक्स जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म17 का उपयोग करके सीडी 45+ कोशिकाओं पर एससीआरएनए-सेक का प्रदर्शन किया। इस तरह, हमने तीन स्वस्थ हृदय नमूनों से 14,217 व्यक्तिगत कोशिकाओं को गुणवत्ता नियंत्रण (तालिका 2) के बाद एक विलय किए गए डेटा सेट में एकत्र किया। असुरक्षित क्लस्टरिंग और टी-वितरित स्टोकेस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग (टी-एसएनई) आयामीता में कमी ने सात प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिकाओं (चित्रा 2) का स्पष्ट पृथक्करण दिखाया। इसके अलावा, प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार ने क्लासिक मार्करों की एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाई। निर्णायक रूप से, इन परिणामों से पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार किए गए एकल-सेल निलंबन में एकल-सेल अनुक्रमण के लिए उच्च शक्ति है।
चित्रा 1: कार्डियक सिंगल-सेल सस्पेंशन में सेल व्यवहार्यता। (ए) एफएसीएस के बिना सेल व्यवहार्यता। काले तीर के निशान सेल के टुकड़े (कोई प्रतिदीप्ति नहीं) का संकेत देते हैं। (बी) एफएसीएस के साथ सेल व्यवहार्यता। पीला तीर जीवित कोशिकाओं (हरे रंग की प्रतिदीप्ति) को इंगित करता है, और लाल तीर मृत कोशिकाओं (लाल प्रतिदीप्ति) को इंगित करता है। (सी) गेटिंग रणनीति। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: तीन माउस दिल के नमूनों से कार्डियक सीडी 45+ कोशिकाओं का एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण। (ए) सीडी 45+ कोशिकाओं का टीएसएनई प्लॉट कैननिकल मार्कर जीन के आधार पर पहचाने गए प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को दर्शाता है। (बी) प्रत्येक उप-जनसंख्या में शीर्ष पांच अलग-अलग व्यक्त जीनों का हीटमैप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| FACS से पहले | FACS के बाद | |
| कुल सेल एकाग्रता (कोशिकाओं / एमएल) | 1.51 x 106 | 3.40 x 105 |
| लाइव सेल एकाग्रता (कोशिकाओं / एमएल) | 1.40 x 106 | 3.15 x 105 |
| मृत कोशिका एकाग्रता (कोशिकाओं / एमएल) | 1.09 x 105 | 2.48 x 104 |
| व्यवहार्यता (%) | 92.8 | 92.7 |
| औसत सेल आकार (μm) | 9.6 | 9.1 |
तालिका 1: एफएसीएस से पहले और बाद में कार्डियक सिंगल-सेल सस्पेंशन। एफएसीएस से पहले और बाद में प्राप्त कार्डियक सिंगल-सेल सस्पेंशन की सेल घनत्व की तुलना स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके की जाती है।
| अनुमान | |
| कोशिकाओं की अनुमानित संख्या | 14,217 |
| प्रति सेल औसत पढ़ता है। | 81,017 |
| प्रति कोशिका औसत जीन | 1,374 |
| कुल जीन का पता लगाया गया | 18,424 |
| औसत यूएमआई गणना प्रति सेल | 4,021 |
| मान्य बारकोड | 98.4% |
| जीनोम में मैप किया गया | 95.1% |
तालिका 2: गुणवत्ता नियंत्रण आँकड़े। तालिका स्वस्थ माउस दिलों के एकल-सेल डेटा के विभिन्न अनुमानों को सूचीबद्ध करती है।
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Discussion
इस लेख का उद्देश्य एमआई के बाद माउस दिल से एकल गैर-कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करना था। प्रोटोकॉल को प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट सहित उच्च गुणवत्ता के साथ पोस्ट-एमआई माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए लागू किया जा सकता है। एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए तीन आवश्यक कारक महत्वपूर्ण हैं। पहला एक एंजाइमेटिक पाचन की सेटिंग है। सेल व्यवहार्यता और अलगाव दक्षता दोनों को सुनिश्चित करने के लिए पाचन के समय और पाचन एंजाइमों की मात्रा और एकाग्रता को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। इस मामले में, हमने उचित रूप से एंजाइम की एकाग्रता में वृद्धि की और पाचन समय को लंबा किया। यहां, हम 45 मिनट से 1 घंटे की पाचन अवधि की सलाह देते हैं। एक छोटी अवधि सेल व्यवहार्यता को बढ़ा सकती है लेकिन अपर्याप्त हृदय ऊतक पाचन का कारण बन सकती है और सेल क्लंप की मात्रा में वृद्धि कर सकती है। इसके अलावा, हमने सेल एकत्रीकरण को रोकने के लिए DNase I का उपयोग किया क्योंकि लिटिक कोशिकाएं सेल क्लंप13 बनाने के लिए आसपास की कोशिकाओं को लपेटने के लिए मुक्त डीएनए जारी कर सकती हैं। दूसरा आवश्यक कारक बीएसए या एफबीएस युक्त सेल वॉशिंग समाधान का उपयोग कर रहा है। बीएसए या एफबीएस न केवल एंजाइमों की गतिविधि की रक्षा कर सकते हैं बल्कि कोशिकाओं की व्यवहार्यता में भी सुधार कर सकते हैं। अंतिम आवश्यक कारक सेल के टुकड़ों और मृत कोशिकाओं को खत्म करने के लिए एफएसीएस की सुविधा प्रदान कर रहा है। सेल टुकड़े के परिणामस्वरूप एक गलत सेल गिनती और व्यवहार्यता हो सकती है। ये कारक एक साथ सेल निलंबन की व्यवहार्यता और शुद्धता को बढ़ाते हैं, जिससे यह एकल-सेल अनुक्रमण के साथ अधिक संगत हो जाता है।
यह प्रोटोकॉल सबसे पहले एकल-सेल अनुक्रमण के लिए सेल निलंबन तैयारी का वर्णन करता है, और इसमें अपेक्षाकृत कम लागत पर सेल निलंबन की गुणवत्ता को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त प्रक्रियाएं भी शामिल हैं। पिछले अध्ययनों द्वारा उपयोग किए जाने वाले अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में, हम पाचन एंजाइमों का उपयोग करने से बचते हैं जो मुक्त डीएनए द्वारा प्रेरित कोशिकाओं के एकत्रीकरण का कारण बन सकते हैं, जैसे कि ट्रिप्सिन14। सेल मलबे को हटाना एकल-कोशिका अध्ययन के लिए प्रमुख चुनौतियों में से एक है, और कुछ अध्ययन नमूने14,15 चलाने से पहले सेल व्यवहार्यता में सुधार के लिए मृत सेल हटाने किट का उपयोग करते हैं। हालांकि, यहां, हम मृत कोशिकाओं और मलबे को कम करने में इसकी उच्च प्रभावशीलता के कारण नमूना शुद्धता को बढ़ाने के लिए एफएसीएस का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।
इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त एकल-सेल निलंबन को प्रवाह विश्लेषण या प्राथमिक सेल संस्कृति (मानक सड़न रोकनेवाला प्रक्रियाओं) द्वारा आगे विश्लेषण किया जा सकता है। चूंकि पाचन एंजाइम अपेक्षाकृत हल्के होते हैं, इसलिए यह एमआई के विभिन्न चरणों में लिए गए हृदय के ऊतकों को पचाने के लिए उपयुक्त है, साथ ही स्वस्थ दिल से भी। हालाँकि, इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएँ हैं। उदाहरण के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक पाचन अनिवार्य रूप से तनाव जीन19,20 की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है। इस सीमा को कम तापमान वाले सक्रिय प्रोटीज का उपयोग करके या एफएसीएस के बाद पाचन समय को कम करके हल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना शामिल नहीं है, और इस प्रकार, यह स्थानीय ऊतक प्रतिक्रियाओं पर अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है।
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Disclosures
लेखक ों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।
Acknowledgments
इस काम को झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान कोष (एलक्यू 22 एच 020010) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
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