Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour isoler une quantité suffisante de non-cardiomyocytes uniques avec une viabilité élevée d’un cœur de souris post-infarctus du myocarde (IM). Cela peut être utilisé pour le séquençage ultérieur d’une seule cellule, l’analyse de cytométrie en flux et la culture cellulaire primaire.
Abstract
L’infarctus du myocarde (IM) est l’une des maladies cardiovasculaires les plus courantes, avec une mortalité croissante dans le monde entier. Les non-cardiomyocytes représentent plus de la moitié de la population totale de cellules cardiaques et contribuent aux compensations adaptatives en cas de lésion myocardique, y compris les réponses inflammatoires, la réparation des tissus et la formation de cicatrices. Pour étudier le microenvironnement cardiaque post-MI, le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) est largement utilisé pour identifier différents types de cellules cardiaques et les communications intercellulaires. Parmi les procédures de préparation de l’échantillon scRNA-seq, la préparation de la suspension cellulaire est l’une des étapes les plus critiques, car la viabilité cellulaire peut affecter la qualité des résultats scRNA-seq. Par conséquent, nous avons conçu un protocole expérimental pour la préparation d’une suspension cellulaire non cardiomyocytaire à partir de cœurs de souris post-MI avec un accent supplémentaire sur l’amélioration de la viabilité cellulaire en choisissant des enzymes digestives douces, en contrôlant le temps de digestion et en appliquant un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Enfin, nous avons isolé des cellules CD45+ à partir de la suspension cellulaire non cardiomyocytaire obtenue grâce à ce protocole, puis nous avons effectué scRNA-seq.
Introduction
L’infarctus du myocarde (IM) est l’une des maladies cardiovasculaires les plus courantes, et sa mortalité augmente dans le mondeentier 1. L’IM est causée par un apport sanguin insuffisant au myocarde environnant, qui peut être le résultat d’un blocage de l’artère coronaire qui se produit avec la rupture de la plaque d’athérosclérose. Bien que l’intervention coronarienne percutanée (ICP) ait réduit les taux de mortalité des patients atteints d’IM aigu, la prévalence élevée de l’insuffisance cardiaque après l’IM reste un problème2. La physiopathologie clé sous-jacente à l’insuffisance cardiaque post-IM est la réponse compensatoire du corps aux lésions cardiaques, qui consiste à remplacer le muscle cardiaque mort par des cicatrices fibrotiques non contractiles. Ces réponses adaptatives reposent de manière significative sur l’inflammation locale médiée par les interactions entre plusieurs types de cellules et les cellules du tissu cardiaque, et cette inflammation est maintenant considérée comme une cible thérapeutique potentielle pour réduire la formation de cicatrices fibrotiques et, ainsi, protéger contre l’insuffisance cardiaque post-IM 3,4. Fait intéressant, le microenvironnement au site de l’infarctus connaît une transition dépendante du temps dans les types de cellules infiltrantes et fonctionne à différents stades de MI 1,5. De nombreuses études ont montré que les non-cardiomyocytes (p. ex. cellules immunitaires, fibroblastes et cellules endothéliales) jouent un rôle central dans l’inflammation post-IM et la réparation des tissus 5,6. Ces dernières années, le séquençage unicellulaire a été largement utilisé comme un outil puissant pour élucider les implications et les fonctions des non-cardiomyocytes dans le microenvironnement post-MI 7,8. Cela donne un aperçu de la physiopathologie des blessures et des réparations post-IM et du développement de thérapies potentielles contre l’insuffisance cardiaque post-IM.
Le séquençage d’ARN à haut débit (RNA-Seq) est une technique utilisée pour étudier en détail des transcriptomes entiers à l’aide du séquençage de nouvelle génération (NGS)7,8,9. Récemment, le développement de scRNA-Seq a révolutionné le domaine de la recherche biomédicale. Par rapport au séquençage en vrac conventionnel, scRNA-Seq analyse les profils d’expression génique et l’hétérogénéité transcriptionnelle au niveau de la cellule unique 7,8. Cette technique favorise de manière significative la recherche sur la physiopathologie cellulaire de l’IM 9,10 en identifiant différents types de cellules circulantes dans le microenvironnement post-MI et en découvrant l’interaction entre les cardiomyocytes et les non-cardiomyocytes. Ces résultats contribuent également à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’insuffisance cardiaque post-IM. En général, l’expérience post-MI basée sur scRNA-seq comprend trois sections principales: (1) l’établissement d’un modèle animal post-MI; 2° la préparation de la suspension cellulaire; et (3) le séquençage des échantillons et l’analyse des données. Il est à noter que la préparation de la suspension cellulaire est l’étape la plus critique dans la préparation de l’expérience scRNA-Seq, car la qualité de la suspension cellulaire détermine la précision des résultats.
Ce protocole est conçu pour extraire une suspension cellulaire non cardiomyocytaire du tissu cardiaque post-IM; De manière significative, les détails spécifiques pour maintenir la viabilité et la résolution de la cellule sont inclus. Pendant ce temps, les équipements utilisés dans ce protocole, tels que les kits chirurgicaux pour souris, les ventilateurs pour rongeurs et les centrifugeuses, peuvent être trouvés dans la plupart des centres d’expérimentation animale et des laboratoires biomédicaux, et, par conséquent, le coût de l’expérience de ce protocole est relativement faible. De plus, si l’on considère les points temporels et les sites d’infarctus comme variables, ce protocole peut être appliqué pour simuler un large éventail de scénarios cliniques, en particulier pour les complications post-IM.
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Protocol
Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire à l’Université du Zhejiang et ont été approuvées par le Comité consultatif des animaux de l’Université du Zhejiang.
1. Chirurgie de ligature de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (ligature LAD)
NOTE: Des souris C57BL / 6J mâles âgées de huit semaines ont été utilisées comme modèles. Les cœurs ont été récoltés 2 semaines après l’IM. La chirurgie de ligature de l’artère coronaire antérieure descendante gauche a été effectuée comme décrit précédemment et démontré11.
- Désinfectez les instruments chirurgicaux avec de l’éthanol à 70% avant la chirurgie.
- Pesez la souris, puis anesthésiez la souris avec des injections intrapéritonéales de pentobarbital sodique à 1% (50 mg / kg). Observez le réflexe de pincement des orteils et mesurez la fréquence respiratoire pour évaluer la profondeur de l’anesthésie pendant la procédure.
- Placez la souris sur la table d’opération à l’aide d’un coussin chauffant à 37 °C. Utilisez une pommade ophtalmique pour prévenir la déshydratation oculaire.
- Épilez sa poitrine et son cou précortiaux gauches avec de la crème dépilatoire et utilisez des cotons-tiges pour enlever les poils. Désinfecter sa peau avec de l’iodophor, suivi d’alcool à 70% pour nettoyer la zone trois fois.
- Effectuer une incision cervicale médiane (0,8-1,0 cm) au microscope. Séparez la peau, les muscles et les tissus entourant la trachée, puis insérez une canule de 20 G dans la trachée.
REMARQUE: Observez lors de l’insertion de la canule dans la trachée sous vue microscopique pour vous assurer que le tube n’est pas inséré dans l’œsophage. - Connectez la souris à un ventilateur pour rongeurs réglé à 0,2 mL de volume courant avec 150 coups par minute.
- Inciser la poitrine de la souris obliquement le long de la ligne mi-claviculaire avec un ciseau stérile. Disséquez le tissu sous-cutané pour exposer les côtes.
- Utilisez des ciseaux stériles pour couper la peau obliquement le long de la ligne mi-claviculaire gauche (0,8-1,0 cm). Effectuer une thoracotomie gauche pour séparer les troisième et quatrième côtes afin d’exposer le cœur. Utilisez un rétracteur de côtes pour une vue dégagée.
- Ouvrez le péricarde avec une pince incurvée, puis ligaturez l’artère descendante antérieure gauche (sous l’appendice de l’oreillette gauche) à l’aide d’une suture en soie 7-0. Une paroi antérieure pâle du ventricule gauche indique que la perfusion myocardique est interrompue avec succès.
- Relâchez l’écarteur de côtes et cousez l’incision thoracique en couches avec une suture en soie 5-0 tout en expulsant l’air de la poitrine. Coudre l’incision du cou avec une suture en soie 5-0.
- Retirez le tube trachéal de la souris une fois que sa respiration spontanée est rétablie. Injecter par voie intrapéritonéale 0,5 mL de solution saline stérile préchauffée. Injectez de la buprénorphine (0,1 mg/kg) toutes les 12 heures par voie sous-cutanée pour minimiser la douleur.
- Enfin, placez la souris sur le coussin chauffant pour attendre la réanimation. Surveillez la souris pour vous assurer qu’elle ne souffre pas de dyspnée excessive ou d’hémorragie via l’observation visuelle.
- Remettez la souris dans sa cage après son réveil. Pendant la première semaine, surveillez quotidiennement la souris pour vérifier que sa mobilité, son toilettage et ses habitudes alimentaires sont adéquats. Selon les besoins de l’expérience, récoltez le cœur à différents moments après l’IM.
NOTE: Dans ce protocole, la suspension unicellulaire a été préparée avec le cœur 2 semaines après l’IM.
2. Préparation de la suspension monocellulaire cardiaque
- Préparation des solutions et des supports
- Tampon de dissociation des tissus cardiaques : Mélanger 10 mg de collagénase IV (600 U/mL), 5 mg de dispase II (0,5 U/mL) et 50 μL de DNase I (100 μg/mL) dans 5 mL de RPMI 1640. Préchauffer ce milieu à 37 °C au bain-marie avant utilisation.
- Tampon de lavage cellulaire : Préparer 1 % de BSA ou 10 % de FBS dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, PH 7.4) et conserver à 4 °C ou sur de la glace.
- Solution de perfusion : Pré-refroidir le PBS (PH 7.4) comme solution de perfusion.
- Tampon de lyse des globules rouges (GR) : Utilisez le tampon de lyse des globules rouges mentionné par le fabricant.
REMARQUE : Veuillez consulter le tableau des matériaux pour obtenir la liste des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude.
- Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (150 mg/kg).
- Dissection cardiaque
- Placez la souris en décubitus dorsal en fixant ses membres postérieurs en place avec du ruban adhésif.
- Vaporisez le corps avec de l’éthanol à 70%, puis coupez verticalement à travers la peau abdominale et les muscles tout en évitant de percer le foie. Ouvrez soigneusement le thorax tout en évitant de percer le cœur.
- Utilisez le PBS prérefroidi (PH 7,4) pour perfuser le ventricule gauche jusqu’à ce que le liquide de perfusion incolore soit observé (environ 15 mL de PBS [pH 7,4] sont nécessaires).
- Soulevez doucement le cœur du thorax avec une pince et coupez l’excès de tissu attaché à l’extérieur du cœur avec des ciseaux ophtalmiques. Placer le cœur dans 1 mL de PBS prérefroidi (PH 7,4) dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
- Dissociation enzymatique du tissu cardiaque
- Transférer le cœur de souris dans un puits d’une plaque de 24 puits avec 150 μL de tampon de dissociation du tissu cardiaque placé sur de la glace, et le couper en petits morceaux (~ 1 mm) avec un ciseau.
- Transférer le tissu cardiaque haché dans un tube à centrifuger de 15 mL avec 5 mL de tampon de dissociation tissulaire.
REMARQUE : Le volume recommandé du tampon de dissociation des tissus cardiaques est de 5 mL/cœur. - Placer le tube centrifuge dans l’agitateur alternatif thermostatique électrique à 125 tr/min pendant 1 h à 37 °C. Pipeter la suspension tissulaire de haut en bas 10 fois toutes les 20 minutes.
- Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μm pour éliminer les tissus non digérés et les touffes. Ajouter 25 ml du tampon de lavage cellulaire pour rincer le tube d’origine, puis transférez-le pour rincer la passoire cellulaire. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 μm pour éliminer davantage les amas de cellules.
- Centrifuger la suspension de cellules filtrées à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant, puis remettre en suspension l’échantillon de cellule dans 1x tampon de lyse RBC pendant 5 minutes à température ambiante (RT).
- Ajouter quatre fois plus de volume du tampon de lavage cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 ml du tampon de lavage des cellules. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL du tampon de lavage des cellules.
- Mélanger 18 μL de la suspension cellulaire avec 2 μL de solution de coloration orange acridine (AO)/iodure de propidium (PI) (9:1) et ajouter 10 μL du mélange dans une lame de chambre de comptage. Évaluez le nombre de cellules et leur viabilité à l’aide d’un compteur automatique de cellules.
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Representative Results
Une suspension unicellulaire à haute vitalité a été obtenue en mettant en œuvre la section 2 de ce protocole. Cependant, des fragments cellulaires ont encore pu être observés (Figure 1A); par conséquent, un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été effectué pour améliorer encore la qualité16. Après FACS, la taille moyenne des cellules passe de 9,6 μm à 9,1 μm ( tableau 1), ce qui suggère que la proportion de fragments cellulaires peut être efficacement réduite dans la suspension cellulaire par FACS (Figure 1B). La stratégie d’établissement de points de contrôle utilisée pour le FACS est illustrée à la figure 1C.
En plus des images de la figure 1, la concentration cellulaire, la taille moyenne des cellules et la viabilité cellulaire ont été mesurées par un compteur de cellules (tableau 1). Les différences de concentrations cellulaires étaient dues au volume de la suspension cellulaire. Remarquablement, la taille moyenne des cellules a diminué après FACS (tableau 1), ce qui montre que FACS peut réduire efficacement l’agglutination cellulaire et éliminer les fragments de cellule.
ScRNA-seq a été réalisé pour étudier le microenvironnement immunologique cardiaque tout en vérifiant la qualité de la suspension cellulaire obtenue grâce à ce protocole. Après avoir préparé la suspension unicellulaire, nous avons d’abord trié les cellules qui exprimaient la protéine de surface CD45, qui est un marqueur commun pour un large éventail de cellules immunitaires. Ensuite, nous avons effectué scRNA-seq sur des cellules CD45+ à l’aide de la plateforme 10X Genomics17. De cette façon, nous avons regroupé 14 217 cellules individuelles provenant de trois échantillons de cœur sain dans un ensemble de données fusionnées après contrôle de la qualité (tableau 2). Le regroupement non supervisé et la réduction de la dimensionnalité d’incorporation stochastique des voisins distribués t (t-SNE) ont montré une séparation évidente de sept types de cellules immunitaires (Figure 2). De plus, chaque type de cellule immunitaire a montré une expression élevée de marqueurs classiques. De manière concluante, ces résultats montrent que la suspension monocellulaire préparée par ce protocole a une puissance élevée pour le séquençage unicellulaire.
Figure 1 : Viabilité cellulaire dans la suspension monocellulaire cardiaque. (A) Viabilité cellulaire sans FACS. Les pointes de flèches noires indiquent des fragments de cellules (pas de fluorescence). (B) Viabilité cellulaire avec FACS. La flèche jaune indique les cellules vivantes (fluorescence verte) et la flèche rouge indique les cellules mortes (fluorescence rouge). C) Stratégie d’établissement de points de contrôle. Barre d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Séquençage de l’ARN unicellulaire de cellules CD45+ cardiaques provenant de trois échantillons de cœur de souris. (A) Tracé tSNE de cellules CD45+ montrant les populations de cellules immunitaires identifiées à partir de gènes marqueurs canoniques. (B) Carte thermique des cinq principaux gènes exprimés différentiellement dans chaque sous-population. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Avant FACS | Après FACS | |
| Concentration cellulaire totale (cellules/mL) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Concentration de cellules vivantes (cellules/mL) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Concentration de cellules mortes (cellules/mL) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Viabilité (%) | 92.8 | 92.7 |
| Taille moyenne des cellules (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tableau 1 : Suspension monocellulaire cardiaque avant et après FACS. Les densités cellulaires de la suspension monocellulaire cardiaque obtenue avant et après FACS sont comparées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
| Estimations | |
| Nombre estimé de cellules | 14,217 |
| Lectures moyennes par cellule | 81,017 |
| Gènes médians par cellule | 1,374 |
| Nombre total de gènes détectés | 18,424 |
| Nombre médian d’UMI par cellule | 4,021 |
| Codes-barres valides | 98.4% |
| Lectures mappées au génome | 95.1% |
Tableau 2 : Statistiques sur le contrôle de la qualité. Le tableau répertorie les différentes estimations des données unicellulaires de cœurs de souris en bonne santé.
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Discussion
Cet article visait à décrire un protocole pour isoler des non-cardiomyocytes uniques de cœurs de souris après l’IM. Le protocole peut être appliqué pour isoler différents types de cellules dans le microenvironnement post-MI avec une haute qualité, y compris les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Trois facteurs essentiels sont cruciaux pour obtenir une suspension cellulaire de haute qualité pour le séquençage unicellulaire. Le premier est le réglage de la digestion enzymatique. Il est important de contrôler le temps de digestion ainsi que le volume et la concentration des enzymes digestives pour assurer à la fois la viabilité cellulaire et l’efficacité de l’isolement. Dans ce cas, nous avons augmenté de manière appropriée la concentration de l’enzyme et prolongé le temps de digestion. Ici, nous recommandons une durée de digestion de 45 min à 1 h. Une durée plus courte peut augmenter la viabilité cellulaire, mais peut entraîner une digestion insuffisante des tissus cardiaques et peut augmenter la quantité d’amas cellulaires. De plus, nous avons utilisé la DNase I pour empêcher l’agrégation cellulaire parce que les cellules lytiques peuvent libérer de l’ADN libre pour envelopper les cellules environnantes et former des amas cellulaires13. Le deuxième facteur essentiel est l’utilisation d’une solution de lavage cellulaire contenant du BSA ou du FBS. BSA ou FBS peut non seulement protéger l’activité des enzymes, mais aussi améliorer la viabilité des cellules. Le dernier facteur essentiel est de faciliter l’élimination des fragments cellulaires et des cellules mortes par le FACS. Les fragments de cellules peuvent entraîner un nombre de cellules et une viabilité inexacts. Ensemble, ces facteurs améliorent la viabilité et la pureté de la suspension cellulaire, la rendant plus compatible avec le séquençage unicellulaire.
Ce protocole décrit d’abord la préparation de la suspension cellulaire pour le séquençage monocellulaire, et il comprend également des procédures supplémentaires pour améliorer la qualité de la suspension cellulaire à un coût relativement faible. En comparaison avec d’autres protocoles utilisés par des études précédentes, nous évitons d’utiliser des enzymes digestives qui peuvent provoquer l’agrégation de cellules induites par l’ADN libre, comme la trypsine14. L’élimination des débris cellulaires est l’un des principaux défis pour les études unicellulaires, et certaines études utilisent des kits d’élimination des cellules mortes pour améliorer la viabilité cellulaire avant d’exécuter les échantillons14,15. Cependant, ici, nous suggérons d’utiliser FACS pour améliorer la pureté de l’échantillon en raison de sa grande efficacité dans la réduction des cellules mortes et des débris.
La suspension unicellulaire obtenue par ce protocole peut être analysée plus avant par analyse en flux ou culture cellulaire primaire (procédures aseptiques standard)18. Comme les enzymes digestives sont relativement douces, il convient de digérer le tissu cardiaque prélevé à différents stades de l’IM, ainsi que celui des cœurs sains. Cependant, ce protocole a certaines limites. Par exemple, une digestion prolongée à 37 °C favorise inévitablement l’expression des gènes de stress 19,20. Cette limitation peut être résolue en utilisant de la protéase active à basse température ou en réduisant le temps de digestion suivi de FACS. En outre, ce protocole n’inclut pas l’isolement des cardiomyocytes et, par conséquent, il ne convient pas aux études sur les réponses tissulaires locales.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Fonds des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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