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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Abstract

Die angeborene Immunität stellt die entscheidende erste Verteidigungslinie als Reaktion auf Krankheitserreger und sterile Beleidigungen dar. Eine wichtige mechanistische Komponente dieser Reaktion ist die Einleitung des angeborenen immunprogrammierten Zelltods (PCD), um infizierte oder beschädigte Zellen zu eliminieren und Immunantworten zu verbreiten. Eine übermäßige PCD ist jedoch mit Entzündungen und Pathologien verbunden. Daher ist das Verständnis der Aktivierung und Regulation von PCD ein zentraler Aspekt bei der Charakterisierung der angeborenen Immunantwort und der Identifizierung neuer therapeutischer Ziele im gesamten Krankheitsspektrum.

Dieses Protokoll bietet Methoden zur Charakterisierung der PCD-Aktivierung des angeborenen Immunsystems durch Überwachung von Caspasen, einer Familie von Cystein-abhängigen Proteasen, die häufig mit verschiedenen PCD-Signalwegen assoziiert sind, einschließlich Apoptose, Pyroptose, Nekroptose und PANoptose. Erste Berichte charakterisierten Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10 als Initiator-Caspasen und Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 als Effektor-Caspasen bei Apoptose, während spätere Studien die entzündlichen Caspasen Caspase-1, Caspase-4, Caspase-5 und Caspase-11 fanden, die Pyroptose auslösen. Es ist nun bekannt, dass es eine umfangreiche Wechselwirkung zwischen den Caspasen und anderen angeborenen Immun- und Zelltodmolekülen über die zuvor definierten PCD-Signalwege gibt, was eine wichtige Wissenslücke im mechanistischen Verständnis der angeborenen Immunität und der PCD identifiziert und zur Charakterisierung der PANoptose führt. PANoptose ist ein einzigartiger angeborener immuninflammatorischer PCD-Signalweg, der durch PANoptosom-Komplexe reguliert wird, die Komponenten, einschließlich Caspasen, aus anderen Zelltodwegen integrieren.

Hier werden Methoden zur Beurteilung der Aktivierung von Caspasen als Reaktion auf verschiedene Reize bereitgestellt. Diese Methoden ermöglichen die Charakterisierung von PCD-Signalwegen sowohl in vitro als auch in vivo, da aktivierte Caspasen eine proteolytische Spaltung durchlaufen, die durch Western Blot unter Verwendung optimaler Antikörper und Blotting-Bedingungen sichtbar gemacht werden kann. Es wurden ein Protokoll und ein Western-Blotting-Workflow etabliert, die es ermöglichen, die Aktivierung mehrerer Caspasen aus derselben Zellpopulation zu bewerten und eine umfassende Charakterisierung der PCD-Prozesse zu ermöglichen. Diese Methode kann in allen Forschungsbereichen in den Bereichen Entwicklung, Homöostase, Infektion, Entzündung und Krebs angewendet werden, um PCD-Signalwege in zellulären Prozessen in Gesundheit und Krankheit zu bewerten.

Introduction

Das angeborene Immunsystem fungiert als erste Verteidigungslinie während einer Infektion und als Reaktion auf sterile Reize wie Gewebeverletzungen und Veränderungen der Homöostase. Angeborene Immunsensoren auf der Zelloberfläche und im Zytoplasma reagieren auf pathogen- oder schädigungsassoziierte molekulare Muster (PAMPs bzw. DAMPs), um entzündliche Signalwege und zelluläre Reaktionen auszulösen. Einer der Schlüsselprozesse der angeborenen Immunantwort ist die Induktion des Zelltods, um infizierte oder beschädigte Zellen zu entfernen und weitere angeborene und adaptive Immunantworten voranzutreiben. Der programmierte Zelltod (PCD) ist ein hochkonservierter Prozess über Spezies hinweg, was seine evolutionäre Bedeutung als angeborener Immunmechanismus unterstreicht.

Es gibt mehrere angeborene Immun-PCD-Signalwege, die in allen Zelltypen aktiviert werden können. Caspasen sind eine Schlüsselfamilie hochkonservierter, intrazellulärer, Cystein-abhängiger Proteasen, die für viele PCD-Signalwege, einschließlich des traditionell nicht-inflammatorischen Apoptosewegs sowie entzündlicher PCD-Signalwege wie Pyroptose, Nekroptose und PANoptosekritisch sind 1,2,3,4,5 . Es gibt 11 humane und 10 murine Caspasen, die gut definiert sind, sowie Pseudo-Caspasen, die funktionell sein können, und die meisten werden konstitutiv als inaktive monomere oder dimere Pro-Caspasen exprimiert, die eine Spaltung zur Aktivierung erfordern 6,7. Caspasen enthalten auch wichtige Domänen für die Rekrutierung und Bildung von Multiproteinkomplexen. Dazu gehören die Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (CARD), die in Caspase-1, Caspase-2, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-9 und Caspase-11 zu finden ist, oder die Todeseffektordomäne (DED), die in Caspase-8 und Caspase-10 zu finden ist. Sowohl durch ihre proteolytische Aktivität als auch durch ihre Fähigkeit, Multiproteinkomplexe zu bilden, sind Caspasen entscheidende Treiber der angeborenen Immun-PCD.

Die Rolle von Caspasen bei der angeborenen Immun-PCD wurde erstmals in der Apoptose identifiziert, wo die Initiator-Caspasen Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10 die Henker-Caspasen Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 aktivieren, um den Zelltodzu beschleunigen 8,9,10,11,12. Initiator-Caspasen können durch verschiedene Signalkaskaden aktiviert werden; Der extrinsische Signalweg aktiviert Caspase-8 durch extrazelluläre Liganden-induzierte Todesrezeptor-Signalgebung, und der intrinsische Signalweg aktiviert Caspase-9 durch die Störung der mitochondrialen Integrität13. Aktivierte Initiator-Caspasen spalten den Linker und trennen die großen und kleinen katalytischen Untereinheiten von Henker-Caspasen, um ihre aktiven Formen zu erzeugen. Die Henker-Caspasen spalten dann ihre Substrate, um die Zelle zu zerlegen, was zu DNA-Abbau, Membranblasen, Kernfragmentierung und der Freisetzung apoptotischer Körper führt14,15. Dieser Prozess endet typischerweise in einer nicht-lytischen und nicht-entzündlichen Form des Zelltods, wenn er mit der sofortigen Beseitigung der sterbenden Zellen durch Efferozytosegekoppelt ist 16. Defekte in der Efferozytose oder ein Mangel an phagozytischen Zellen können jedoch zur Anhäufung von apoptotischen Zellen führen, die dann einen lytischen und entzündlichen Zelltod durchlaufen17,18.

Es wurde entdeckt, dass die entzündlichen Caspasen, einschließlich Caspase-1 (Mensch und Maus), Caspase-4 und Caspase-5 (Mensch) und Caspase-11 (Maus), während einer Form der entzündlichen angeborenen Immun-PCD (III-PCD) aktiviert werden, die als Pyroptose bezeichnet wird. Die Caspase-1-Aktivierung ist mit der Bildung von Inflammasomen verbunden, bei denen es sich um Multiproteinkomplexe handelt, die einen zytosolischen angeborenen Immunsensor, ein Adaptermolekül (Apoptose-assoziiertes speckartiges Protein, das eine CARD [ASC] enthält) und Caspase-1 enthalten. Die Bildung dieses Komplexes ermöglicht es Caspase-1, eine Proximity-vermittelte Autoproteolyse zu durchlaufen, um seine aktive Form freizusetzen, die Zielsubstrate spalten kann, einschließlich der proinflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-1β und IL-18 und des porenbildenden Moleküls Gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, Caspase-4 und Caspase-5 können GSDMD auch aktivieren, ohne dass das Inflammasom stromaufwärts gebildet wird, nachdem PAMPs wie Lipopolysaccharid (LPS) erkannt wurden19,20. Diese Caspasen durchlaufen eine Dimerisierung, gefolgt von einer Oligomerisierung und Selbstspaltung zur Aktivierung bei Bindung an zytosolisches LPS, was zu einer nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung 24,25,26 und einer Caspase-1-Aktivierung in zellintrinsischer Weise führt, um die IL-1β- und IL-18-Reifung zu induzieren 20. Die Reifung und Freisetzung dieser entzündungsfördernden Zytokine charakterisieren diese Caspasen als "entzündlich". Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die apoptotische Caspase-8 auf dem Inflammasom lokalisiert ist, was eine Verbindung zwischen apoptotischen und pyroptotischen Prozessen herstellt. Studien haben gezeigt, dass die apoptotische Caspase-8 auch für die Regulierung einer anderen Form der PCD, der Nekroptose, entscheidend ist. Der Verlust von Caspase-8 führt zu einer spontanen Rezeptor-interagierenden Serin-Threonin-Kinase 3 (RIPK3)-vermittelten Mixed-Lineage-Kinase-Domänen-ähnlichen Pseudokinase (MLKL)-Aktivierung, um den III-PCD-Weg der Nekroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35 anzutreiben.

Während Caspasen in der Vergangenheit aufgrund der Art des Zelltods, den sie auslösen, als "apoptotisch" oder "entzündlich" eingestuft wurden, deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass es durch Caspasen ein umfangreiches Übersprechen zwischen den angeborenen immunen PCD-Signalwegen gibt 3,4. Zum Beispiel spaltet die inflammatorische Caspase-1 aus Inflammasomen die apoptotische Caspase-7 an ihrer kanonischen Aktivierungsstelle34. Die Caspase-1-Aktivierung kann auch zur Spaltung von apoptotischen Substraten wie der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1)36 führen. In Zellen, denen GSDMD fehlt, kann Caspase-1 auch Caspase-3 spalten37,38. Zusätzlich kann die kanonisch apoptotische Caspase-3 Gasdermin E (GSDME) spalten, um PCD17,18 zu induzieren, und verarbeitet auch GSDMD in eine inaktive Form40. Darüber hinaus wurde eine Caspase-8-Rekrutierung für den Inflammasom-Komplex beobachtet 39,40,41,42,43,44,45, und Caspase-8 ist ein Schlüsselregulator der kanonischen und nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung 39. Es gibt auch überlappende und redundante Rollen für Caspase-8 und Caspase-1 bei vielen entzündlichen Erkrankungen, und die angeborene Immun-PCD, die durch die Aktivierung von pyroptotischen, apoptotischen und nekrototischen Komponenten gekennzeichnet ist, tritt im gesamten Krankheitsspektrumauf 39,46,47,48,49,50.

Basierend auf dieser Wechselwirkung zwischen entzündlichen und apoptotischen Caspasen wurde eine Schlüssellücke im mechanistischen Verständnis der angeborenen Immunität und der PCD identifiziert, die zur Entdeckung der PANoptose führte. PANoptose ist eine einzigartige Form der III-PCD, die als Reaktion auf Krankheitserreger, PAMPs, DAMPs und Veränderungen der Homöostase aktiviert wird und durch PANoptosomen reguliert wird - facettenreiche makromolekulare Komplexe, die Komponenten aus anderen Zelltodwegen integrieren 44,50,51,52,53,54,55 . Die Gesamtheit der biologischen Wirkungen bei der PANoptose kann nicht allein durch Pyroptose, Apoptose oder Nekroptose allein erklärt werden 3,4,35,36,39,46,47,48, da die PANoptose durch die Aktivierung mehrerer Caspasen gekennzeichnet ist, einschließlich Caspase-1, Caspase-11, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-3 und/oder Caspase-7, je nach Kontext 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose wird zunehmend mit Infektions- und Entzündungskrankheiten sowie mit Krebs und Krebstherapien in Verbindung gebracht 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Angesichts der essentiellen Rolle von Caspasen in Zelltodwegen, einschließlich Apoptose, Pyroptose, Nekroptose und PANoptose, ist es wichtig, Techniken zu entwickeln, um ihre Aktivierung zu charakterisieren und die volle Komplexität der PCD-Signalwege zu verstehen. Das Protokoll beschreibt hier eine Methode zur Stimulation von Zellen und zur Messung der anschließenden Aktivierung von Caspasen (Abbildung 1). Diese Methode nutzt die proteolytische Spaltung von Caspasen, die im Allgemeinen für ihre Aktivierung erforderlich ist, um sie zu untersuchen. Durch Western Blot können die Proteingrößen bestimmt werden, was eine klare Visualisierung und Differenzierung von inaktiven Pro-Caspasen und ihren aktivierten, gespaltenen Formen ermöglicht.

Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind 1) seine Fähigkeit, die Aktivierung mehrerer Caspasen parallel aus einer einzigen Population endogener Zellen zu beurteilen, um die PCD-Aktivierung genauer zu bestimmen, und 2) die Verwendung relativ einfacher Labortechniken, die keine umfangreiche Schulung oder teure Ausrüstung erfordern. Frühere Protokolle haben Western Blotting, Fluoreszenzreporter oder Antikörperfärbung verwendet, um die Caspase-Aktivierung in Kulturüberständen, Zell- und Gewebelysaten, ganzen Zellen durch Mikroskopie und in vivo 67,68,69,70,71 zu überwachen, aber diese Techniken überwachen im Allgemeinen nur ein oder zwei Caspasen in einer Probe. Während synthetische Peptidsubstrate, die Caspase-Spaltstellen enthalten, die bei der Spaltung fluoreszieren, zur Überwachung der Caspase-Aktivierung in Zell- oder Gewebelysaten69 verwendet wurden, können diese Substrate oft von mehr als einer Caspase gespalten werden, was es schwierig macht, die spezifische Aktivierung einzelner Caspasen in diesem System zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Western Blot anstelle der Verwendung von fluoreszierenden Reportern oder anderen Tag-basierten Methoden den Forschern, endogene Zellen zu verwenden, anstatt spezifische Zelllinien mit Reportergenen zu erzeugen. Die Verwendung endogener Zellen hat mehrere Vorteile, einschließlich der Tatsache, dass viele immortalisierte Zelllinien einen Mangel an Schlüsselmolekülen für den Zelltodaufweisen 72,73, was die Ergebnisse beeinflussen könnte. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung endogener Zellen die Bewertung verschiedener Zelltypen wie Makrophagen, Epithelzellen und Endothelzellen anstelle einer einzelnen Linie. Western Blot ist auch eine relativ einfache und kostengünstige Technik, die in Labors auf der ganzen Welt durchgeführt werden kann, ohne dass große, teure Geräte oder komplizierte Setups erforderlich sind.

Dieses Protokoll ist in der gesamten Biologie weit verbreitet, um sowohl die zelltodabhängigen als auch die zelltodunabhängigen Funktionen von Caspasen zu verstehen, einschließlich ihrer Gerüstrollen und Funktionen in anderen entzündlichen Signalwegen74. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht einen einheitlichen Ansatz bei der Untersuchung von PCD-Signalwegen des angeborenen Immunsystems und der Entzündungssignalisierung über Krankheiten und Zustände hinweg, und dieses Protokoll kann verwendet werden, um kritische regulatorische Prozesse und mechanistische Verbindungen zu identifizieren, die die Entwicklung zukünftiger therapeutischer Strategien beeinflussen werden.

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Protocol

Die Verwendung und die Verfahren der Tiere wurden vom St. Jude Children's Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösungen

  1. Bereiten Sie L929-konditionierte Medien vor.
    1. Platte 1 × 106 L929-Zellen (siehe Materialtabelle) in einem 182cm2 Gewebekulturkolben mit 50 ml L929-Nährmedien (siehe Tabelle 1 zur Herstellung des Mediums).
    2. Züchten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.
    3. Nach 7 Tagen den Überstand auffangen und mit einem 0,45-μm-Filter filtrieren. Bereiten Sie 50 ml Aliquote vor (lagern Sie gefrorene Aliquote bis zu 1 Jahr bei −80 °C).
  2. Bereiten Sie 500 ml aus Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMDM) -Nährmedien vor (Tabelle 1).
  3. Bereiten Sie 500 ml BMDM-Stimulationsmedien vor (Tabelle 1).
  4. Bereiten Sie 500 ml Medien für die Infektion vor (Tabelle 1).
  5. Bereiten Sie 100 ml 1 m Tris-Puffer vor (Tabelle 1).
  6. Bereiten Sie 4x Natriumdodecylsulfat (SDS)-Puffer vor (Tabelle 1).
  7. Bereiten Sie 1 ml 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT, Tabelle 1) vor.
  8. Bereiten Sie 40 ml Caspase-Lysepuffer vor (Tabelle 1).
  9. Bereiten Sie 100 ml 1,5 m Tris-Puffer vor (Tabelle 1).
  10. Bereiten Sie 100 ml einer 10%igen (Gew./vol) SDS-Lösung vor (Tabelle 1).
  11. Bereiten Sie 50 ml eines 2-fachen Radioimmunpräzipitations-Assays (RIPA)-Puffers vor (Tabelle 1).
  12. Bereiten Sie eine 5 mg/ml LPS-Lösung vor (Tabelle 1).
  13. Bereiten Sie eine 0,5 M ATP-Lösung vor (Tabelle 1).
  14. Bereiten Sie die Western-Blotting-Lösungen vor.
    1. Bereiten Sie 1 l 5x laufenden Pufferstock vor (Tabelle 1).
    2. Bereiten Sie 1 l 10x Transferpufferlager vor (Tabelle 1).
    3. Bereiten Sie 1 l Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 vor (TBST, Tabelle 1).
    4. Bereiten Sie 100 ml einer 5%igen Magermilchblockierlösung vor (Tabelle 1).
  15. Bereiten Sie die primären Antikörperlösungen vor.
    1. Bereiten Sie 10 ml Caspase-1-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    2. Bereiten Sie 10 ml Caspase-11-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    3. Bereiten Sie 10 ml Caspase-3-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    4. Bereiten Sie 10 ml Caspase-7-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    5. Bereiten Sie 10 ml Caspase-8-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    6. Bereiten Sie 10 ml Caspase-9-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
    7. Bereiten Sie 10 ml HRP-konjugierten β-Aktin-Primärantikörper vor (Tabelle 1).
  16. Bereiten Sie die sekundären Antikörperlösungen vor.
    1. Bereiten Sie 10 ml sekundären Anti-Kaninchen-Antikörper vor (Tabelle 1).
    2. Bereiten Sie 10 ml sekundären Anti-Maus-Antikörper vor (Tabelle 1).
    3. Bereiten Sie 10 ml sekundären Anti-Ratten-Antikörper vor (Tabelle 1).

2. Isolierung von Makrophagen aus dem Knochenmark

HINWEIS: Für dieses Protokoll können 6-10 Wochen alte Wildtyp-Mäuse mit intakten PCD-Signalwegen oder mutierte Mäuse verwendet werden, bei denen die PCD-Regulatoren, Effektoren oder interessierenden Moleküle gelöscht oder verändert wurden.

  1. Euthanasieren Sie eine Maus in einer CO 2 -Kammer mit einer Durchflussrate, die 10% -30% des Käfigvolumens pro Minute für2-3 Minuten verdrängt. Führen Sie dann eine sekundäre Euthanasiemethode durch, z. B. eine Zervixluxation. Befolgen Sie gegebenenfalls alle zusätzlichen einrichtungs-, institutions- und regierungsspezifischen Richtlinien und Vorschriften.
  2. Sezieren Sie die Maus, um die Hinterbeinknochen zu erhalten.
    1. Stecken Sie die Maus auf den Rücken, so dass der Bauch freigelegt ist. Sprühen Sie mit 70% (vol/vol) Ethanol ein, um die Hinterbeine und den Bauch zu sterilisieren.
      ACHTUNG: Ethanol ist brennbar. Halten Sie es von offenen Flammen fern.
    2. Verwenden Sie eine Schere, um einen Schnitt an der Mittellinie des Bauches zu machen; Schneiden Sie weiter in Richtung der Beine, um die Oberschenkelknochen sichtbar zu machen.
    3. Nehmen Sie das rechte hintere Bein und ziehen Sie die Haut vom Körper weg in Richtung Mittellinie. Lösen Sie das Bein vom Körper, indem Sie die Adduktorenmuskeln in Richtung Mittellinie durchtrennen. Schneiden Sie dann das Bein zwischen dem Hüftgelenk und der Wirbelsäule ab. Als nächstes schneiden Sie die Pfote distal zum Knöchel ab und entfernen Sie überschüssiges Gewebe vom Knochen, indem Sie die Haut abziehen und das Wadengewebe mit einer leicht geöffneten Schere entfernen.
    4. Legen Sie das Bein auf ein mit 70% (vol/vol) Ethanol getränktes Handtuch und präzieren Sie das Schienbein und den Oberschenkelknochen.
      1. Fassen Sie die Tibia und den Femur jeweils mit einer separaten Pinzette. Drücken Sie das Schienbein sanft gegen die natürliche Richtung des Kniegelenks. Dies führt dazu, dass die Tibia am Knie bricht.
      2. Verwenden Sie bei Bedarf die Pinzette und die Sezierschere, um das verbleibende hängende Gewebe zu entfernen. Bewahren Sie das Schienbein für die spätere Verwendung auf, indem Sie es auf das mit Ethanol getränkte Handtuch legen.
      3. Sammeln Sie den Oberschenkelknochen auf die gleiche Weise, indem Sie das Knie abbrechen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 oben für das linke Bein, um es aus dem Körper zu entfernen und die Tibia und den Femur zu präparieren.
    6. Besprühen Sie die Knochen mit 70% (vol/vol) Ethanol.
    7. Reinigen Sie die Knochen, indem Sie sie auf ein sauberes, mit 70% (vol/vol) Ethanol getränktes Handtuch legen, den fleischigen Teil des Handtuchs zusammendrücken und das Handtuch gegen den Knochen reiben, um überschüssiges Gewebe zu entfernen.
  3. Sobald beide Oberschenkelknochen und beide Schienbeine sauber sind, besprühen Sie alle vier Knochen mit 70% (vol/vol) Ethanol. Sammeln Sie die Knochen in einer sterilen Petrischale und spülen Sie sie mit 10 ml BMDM-Nährmedien ab, indem Sie das Medium vorsichtig in der Schale schwenken.
  4. Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit 10 ml frischem BMDM-Nährmedium und setzen Sie eine 25-g-Nadel ein.
  5. Nehmen Sie die Tibia mit einer Pinzette auf; Schneiden Sie dann das Sprunggelenk in einem Winkel von ~45° ab.
  6. Spülen Sie das Knochenmark von der Tibia.
    1. Halten Sie das Schienbein über ein 50-ml-Röhrchen, wobei das schmale Ende des Schienbeins nach unten zeigt. Geben Sie das Medium aus der gefüllten Spritze über das Schienbein ab.
    2. Führen Sie die Nadel (zunächst vorsichtig) am oberen Ende des Knochenmarks ein und geben Sie das Medium ab.
    3. Entfernen Sie die Nadel und führen Sie sie erneut ein. Verwenden Sie kurze Hochdruckstöße, um das Medium zu dosieren und die Nadel in das Mark zu bewegen.
    4. Sobald das Medium aus der Unterseite des Knochens herausfließt, verwenden Sie kurze, Hochdruckstöße, um die Zellen weiter auszuspülen. Überwachen Sie die Farbe des Knochens während dieses Vorgangs und entsorgen Sie ihn, wenn der Knochen weiß ist.
    5. Tun Sie dies für beide Tibias.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 5 und 6 oben für die Oberschenkelknochen und schneiden Sie am Hüftgelenk, wie die Tibia am Sprunggelenk geschnitten wurde. Verwenden Sie das gleiche 50-ml-Röhrchen, um das BMDM-Nährmedium zu sammeln, während das Knochenmark gespült wird.
  8. Sobald alle vier Knochen gespült wurden, saugen Sie das Knochenmark und das Medium aus dem 50-ml-Röhrchen 3x durch eine 18-g-Nadel auf einer 10-ml-Spritze auf und ab und spülen Sie jedes Mal die Seiten des Röhrchens ab, um das Mark zu dispergieren.
  9. Stellen Sie das Endvolumen im 50-ml-Röhrchen mit BMDM-Nährmedien auf 30 ml ein und stellen Sie sicher, dass die Zellen gründlich suspendiert sind.
  10. Verwenden Sie ein 70-μm-Zellsieb, um die BMDM-Nährmedien aus dem 50-ml-Röhrchen zu filtern.
  11. Die resultierende Zellsuspension, die die Vorläuferzellen des Knochenmarks enthält, wird in drei 150-mm-Gewebekulturschalen gegeben, indem jeweils 10 ml (oder ~20 × 106 Zellen) hinzugefügt werden. Fügen Sie dann weitere 10 ml BMDM-Nährmedien zu jeder Schüssel hinzu. In einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubieren.

3. Differenzierung der BMDMs und Plattierung für die Experimente

  1. Die plattierten Knochenmark-Vorläuferzellen werden 3 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Entfernen Sie dann jede Schale und fügen Sie weitere 5-8 ml BMDM-Nährmedien hinzu (Tabelle 1). Kehren Sie bei 37 °C in den Inkubator zurück.
  2. Entfernen Sie am 5. Tag nach dem ersten Anrichten jede Schale und fügen Sie weitere 5 ml BMDM-Nährmedien hinzu. Kehren Sie bei 37 °C in den Inkubator zurück.
  3. Entfernen Sie an Tag 6 jede Schüssel und entsorgen Sie die Medien. Fügen Sie dann 10 ml kaltes (bei 4 °C gelagertes) PBS hinzu, um es einmal zu waschen. Entsorgen Sie die 10 ml kalte PBS-Wäsche. Fügen Sie dann 10 ml frisches, kaltes PBS zu jedem Gericht hinzu und inkubieren Sie jedes Gericht 5 Minuten lang auf Eis.
  4. Kratzen Sie die Zellen aus allen drei Schalen vorsichtig mit einem Zellschaber in ein 50-ml-Röhrchen. Die Zellen werden bei 270 × g bei 4 °C vorsichtig 5 Minuten lang heruntergeschleudert; Dann den Überstand verwerfen.
  5. Fügen Sie 20 ml BMDM-Nährmedien hinzu, pipettieren Sie auf und ab, um das Pellet zu resuspendieren, und zählen Sie die Zellen.
    HINWEIS: Es wird erwartet, dass jede Maus ungefähr 60 × 10 6-100 × 106 Zellen liefert.
  6. Planen Sie das 12-Well-Plattenlayout für den gewünschten In-vitro-Zelltod -/Entzündungsstimulations-Assay. Planen Sie, 1 × 106 Zellen pro Vertiefung zu platten. Fügen Sie für jede geplante Stimulation mindestens drei biologische Replikate hinzu und platten Sie einen Satz von Vertiefungen, die in Caspase-Lysepuffer geerntet werden sollen, und einen zweiten Satz von Vertiefungen, die in RIPA-Puffer geerntet werden sollen.
  7. Platte 1 × 106 Zellen in 1 ml BMDM-Nährmedien pro Vertiefung in 12-Well-Platten. Kultivieren Sie über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C, bevor Sie mit der Bewertung des Zelltods/der Entzündung fortfahren. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht das Medium und geben Sie 1 ml warmes (37 °C) PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen.
  8. Entfernen Sie die PBS-Wäsche und fügen Sie 500 μl BMDM-Stimulationsmedien mit Antibiotika (bei nicht-bakteriellen Stimulationen) oder BMDM-Stimulationsmedien ohne Antibiotika (bei bakteriellen Stimulationen) hinzu (Tabelle 1). Inkubieren Sie 2 Stunden lang, bevor Sie mit Schritt 4 für die In-vitro-Stimulation /Infektion fortfahren.

4. Stimulation oder Infektion der Zellen

VORSICHT: Die in diesem Protokoll enthaltenen Wirkstoffe sind potenziell pathogen und sollten mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) mit Genehmigung der zuständigen institutionellen und staatlichen Behörden gehandhabt werden.

  1. Stimulieren Sie die BMDMs, um den Zelltod mit dem interessierenden Auslöser zu aktivieren.
    HINWEIS: Für die Zwecke dieses Protokolls gelten das Influenza-A-Virus (IAV), das Herpes-simplex-Virus 1 (HSV1), Francisella novicidaund LPS + ATP werden zur Veranschaulichung verwendet, es können jedoch auch andere Trigger verwendet werden.
    1. Beispiel Stimulation 1: Infektion mit IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (konstruiert nach Hoffmann et al.75; der Virustiter für die Bestimmung der Infektionsvielfalt [MOI] wird durch einen Plaque-Assay in MDCK-Zellen berechnet):
      1. Berechnen Sie das Virusvolumen, das für die Infektion bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 20 plaquebildenden Einheiten (PFU) benötigt wird, indem Sie Gleichung (1) und Gleichung (2) verwenden:
        Equation 1
        Equation 2
        Equation 3
      2. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs und waschen Sie die Zellen einmal mit 500 μl PBS. Fügen Sie 450 μl IAV (20 MOI) in DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne hitzeinaktiviertes (HI)-FBS zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 1 h in einem befeuchteten Inkubator, um eine Absorption zu ermöglichen.
      3. Entfernen Sie die Platten und fügen Sie 50 μl HI-FBS hinzu. Legen Sie die Platten bei 37 °C wieder in den Inkubator. Inkubieren Sie insgesamt 12 Stunden.
    2. Beispiel Stimulation 2: Infektion mit HSV1 (HF-Stamm; kultiviert wie zuvorbeschrieben 44; der Virustiter für die MOI-Bestimmung wird durch einen Plaque-Assay in Vero-Zellen berechnet):
      1. Berechnen Sie das Virusvolumen, das für die Infektion bei einem MOI von 10 PFU benötigt wird, indem Sie Gleichung (1) und Gleichung (2) aus Schritt 1 im obigen Abschnitt IAV-Infektion verwenden.
        Equation 4
      2. Entfernen Sie die Medien aus den BMDMs. Geben Sie 450 μl HSV1 (MOI 10) in DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne HI-FBS in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 1 h in einem befeuchteten Inkubator, um eine Absorption zu ermöglichen.
      3. Entfernen Sie die Platten und fügen Sie 50 μl HI-FBS hinzu. Legen Sie die Platten bei 37 °C wieder in den Inkubator. Inkubieren Sie insgesamt 12 Stunden.
    3. Beispiel Stimulation 3: Infektion mit F. novicida (U112-Stamm; kultiviert wie zuvorbeschrieben 44 unter aeroben Bedingungen bei 37 °C in BBL Trypticase Sojabrühe ergänzt mit 0,2% L-Cystein über Nacht. Anschließend werden die Bakterien im Verhältnis 1:10 bei 37 °C für weitere 4 h in frischem Medium subkultiviert, bevor die optische Dichte (OD) bei 600 nm unter Verwendung des frischen Mediums als Leerwert entnommen wird. Ein OD-Wert von 1 entspricht 1 × 109 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro ml.)
      1. Berechnen Sie das Volumen von F. novicida , das für eine Infektion bei einem MOI von 50 KBE benötigt wird, indem Sie Gleichung (3) und Gleichung (4) verwenden:
        Equation 5
        Equation 6
        Equation 7
      2. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs. Geben Sie 500 μl F. novicida (MOI 50) in BMDM-Stimulationsmedien ohne Antibiotika in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 4 h in einem befeuchteten Inkubator, um eine Absorption zu ermöglichen.
      3. Waschen Sie die Zellen dreimal mit erwärmtem (37 °C) PBS und fügen Sie 500 μl BMDM-Stimulationsmedien hinzu, die 50 μg/ml Gentamycin enthalten. Legen Sie die Platten bei 37 °C wieder in den Inkubator. Über Nacht inkubieren (16 h).
    4. Beispiel Stimulation 4: Stimulieren Sie mit LPS + ATP.
      1. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs. Geben Sie 500 μl BMDM-Stimulationsmedien mit Antibiotika (Tabelle 1) mit 100 ng/ml LPS in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 3,5 h in einem befeuchteten Inkubator.
      2. 5 μl 0,5 M ATP-Stammlösung (Tabelle 1) in jede Vertiefung geben. Legen Sie die Platten bei 37 °C wieder in den Inkubator. 30 Minuten inkubieren.

5. Sammeln des kombinierten Überstands und des Proteinlysats, das für Caspase-Western-Blots verwendet werden soll

  1. Entfernen Sie nach 4 h, 12 h oder 16 h Inkubation (der spezifische Zeitpunkt hängt vom verwendeten Auslöser ab) die Platte aus dem Inkubator.
  2. Entfernen Sie 150 μl des Überstandes; Verwerfen oder speichern Sie diese für andere überstehende Analysen (z. B. Enzyme-linked Immunosorbent Assay [ELISA]). Entfernen Sie nicht den restlichen Überstand.
  3. Stellen Sie die Proteinsammellösung her, indem Sie 50 μl Caspase-Lysepuffer + 100 μl 4x SDS-Puffer pro Well kombinieren (Tabelle 1). Geben Sie dann 150 μl der Mischung in jede Vertiefung.
  4. Pipettieren Sie die Mischung für jede Vertiefung auf und ab, um die lysierten Zellen und den Überstand zu sammeln. Kratzen Sie während des Pipettierens auch den Boden der Vertiefung mit der Pipettenspitze ab, um die Zellen aufzubrechen. Nach dem Schaben und Pipettieren wird das Proteinlysat in markierten 1,5-ml-Röhrchen gesammelt.
  5. Verwenden Sie einen Heizblock, um alle Rohre 12 Minuten lang auf 100 °C zu erhitzen.
  6. Pelletieren Sie alle unlöslichen Komponenten durch Zentrifugieren bei 14.500 × g für 30 s bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Dies ist ein Pausenpunkt – das Protein aus dem kombinierten Überstand und den Proteinlysaten kann entweder sofort verwendet oder bis zu 2 Monate bei -20 °C oder bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden, bis es gebrauchsfertig ist.

6. Sammeln des Proteinlysats, das für Caspase-Western-Blots verwendet werden soll

  1. Entfernen Sie nach 4 h, 12 h oder 16 h Inkubation (der spezifische Zeitpunkt hängt vom verwendeten Auslöser ab) die Platte aus dem Inkubator. Entfernen Sie den gesamten Überstand; verwerfen oder für andere überstehende Analysen (z.B. ELISA) aufbewahren.
  2. Erzeugen Sie den 1x RIPA-Puffer, indem Sie die 2x RIPA-Stammlösung (Tabelle 1) in einem gleichen Volumen deionisiertem Wasser verdünnen. Fügen Sie dann eine Phosphatase-Inhibitor-Tablette und eine Proteasehemmer-Tablette hinzu und lassen Sie sie sich auflösen. Fügen Sie 150 μl 1x RIPA-Puffer und 50 μl 4x SDS zu jeder Vertiefung hinzu.
  3. Für jede Vertiefung pipettieren Sie die Mischung auf und ab, um die lysierten Zellen zu sammeln. Kratzen Sie während des Pipettierens auch den Boden der Vertiefung mit der Pipettenspitze ab, um die Zellen aufzubrechen. Nach dem Schaben und Pipettieren wird das Proteinlysat in markierten 1,5-ml-Röhrchen gesammelt.
  4. Verwenden Sie einen Heizblock, um alle Rohre 12 Minuten lang auf 100 °C zu erhitzen.
  5. Pelletieren Sie alle unlöslichen Komponenten durch Zentrifugieren bei 14.500 × g für 30 s bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Dies ist ein Pausenpunkt – die Proteinlysate können entweder sofort verwendet oder bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden, bis sie gebrauchsfertig sind.

7. Durchführung von Western Blot unter Verwendung der Lysate, die aus den BMDMs gemäß den obigen Schritten oder aus Gewebehomogenaten entnommen wurden

HINWEIS: Wenn Sie Gewebe verwenden, kann es von Hand oder durch einen kraftbetriebenen Gewebehomogenisator homogenisiert werden. Das Protokoll von Simpson76 bietet eine detaillierte Beschreibung der Gewebehomogenisierung.

  1. Bereiten Sie 1x Laufpuffer vor: Kombinieren Sie 200 ml des 5x laufenden Pufferlagers (Tabelle 1) und 800 ml deionisiertes Wasser. Machen Sie diesen 1x laufenden Puffer kurz vor jedem Experiment.
  2. Bereiten Sie das Elektrophoresegerät mit einem 12%igen (wt/vol) Polyacrylamid-Gel mit 10 Vertiefungen vor. Füllen Sie das Elektrophoresegerät mit 1x Laufpuffer. Entfernen Sie dann den Gelkamm.
    HINWEIS: Um Caspase-1, Caspase-11, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8 und Caspase-9 für jede Probe zu analysieren, werden sechs Gele benötigt.
  3. Planen Sie für Caspase-1-, Caspase-3-, Caspase-7- und Caspase-8-Blots 30 μl des kombinierten Überstands und des Proteinlysats in Caspase-Lysepuffer oder dem Gewebehomogenat. Für Caspase-11- und Caspase-9-Blots sollten 20 μl des Proteinlysats in RIPA-Puffer oder im Gewebehomogenat verwendet werden. Wenn die Proben bei −20 °C oder −80 °C gelagert wurden, tauen Sie sie zuerst auf Eis auf.
  4. Alle Proben werden 5 Minuten lang auf 100 °C erhitzt und vor dem Laden 30 s lang bei 4 °C bei 14.500 × g zentrifugiert. Laden Sie dann langsam 20 oder 30 μl der Probe in jede Spur. Vermeiden Sie, dass Proben in die anderen Fahrspuren überlaufen. Um alle sechs Caspasen gleichzeitig zu bewerten, verwenden Sie das gleiche Verfahren, um die entsprechenden Proben in jedes der sechs Gele zu laden.
  5. Schließen Sie das Elektrophoresegerät an die Stromquelle an. Stellen Sie dann die Leistung für 20 Minuten auf 80 V ein, um den Gellauf zu starten, und stellen Sie dann die Leistung für 45-60 Minuten auf 130 V ein.
  6. Beobachten Sie die Farbstofffront sorgfältig und schalten Sie das Gerät aus, wenn sich die Farbstofffront am unteren Rand des Gels befindet, aber noch nicht aus dem Gel herausgedrückt wurde.
  7. Während das Gel läuft, bereiten Sie 1x Transferpuffer vor, indem Sie 700 ml deionisiertes Wasser, 100 ml des 10-fachen Transferpufferlagers (Tabelle 1) und 200 ml Methanol kombinieren. Machen Sie die 1x-Lösung jedes Mal frisch.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, da Methanol brennbar ist. Führen Sie die Vorbereitung des Transferpuffers nicht in der Nähe von offenen Flammen durch.
  8. Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Elektrophoresegerät, indem Sie den Gelablöser verwenden.
  9. Richten Sie für jedes Gel einen Transferstapel ein.
    1. Aktivieren Sie eine PVDF-Membran, indem Sie sie 1 Minute lang in Methanol einweichen.
    2. Befeuchten Sie zwei Stücke Filterpapier, das Gel und die PVDF-Membran 5 Minuten lang im Transferpuffer. Bewahren Sie die PVDF-Membran und das Gel während dieser 5-minütigen Inkubation in getrennten Behältern auf.
    3. Montieren Sie den Transferstapel auf dem halbtrockenen System. Beginnen Sie auf der unteren Platinanodenseite und legen Sie ein Stück Filterpapier, die PVDF-Membran, das Gel und schließlich ein Stück Filterpapier ein. Rollen Sie die Luftblasen zwischen den Schichten vorsichtig aus oder drücken Sie sie heraus und schließen Sie die Oberseite des Systems. Stellen Sie sicher, dass die Sicherheitsabdeckung gesichert ist, bevor Sie fortfahren.
  10. Schließen Sie das Gerät an die Stromquelle an. Stellen Sie die Stromversorgung für 45 Minuten auf 25 V ein.
  11. Nachdem die Übertragung abgeschlossen ist, zerlegen Sie den Transferstapel und sammeln Sie die Membran. Legen Sie es in eine quadratische Petrischale (Inkubationsschale).
  12. Führen Sie eine Membranblockierung durch, indem Sie 15 ml einer 5%igen Magermilchlösung hinzufügen (Tabelle 1). Inkubieren Sie die Membran auf einem Schaukelschüttler bei 50 U/min bis 70 U/min bei Raumtemperatur für 1 h.
    HINWEIS: Dies ist ein Pausenpunkt – die Membran kann entweder nach 1 h entfernt oder über Nacht in Blockierlösung bei 4 °C gelagert werden.
  13. Entfernen Sie nach 1 Stunde oder Inkubation über Nacht die Blockierlösung. 10 ml der verdünnten Antikörperlösung (Anti-Caspase-1-Antikörper, Anti-Caspase-11-Antikörper, kombinierter Anti-Caspase-3- und Anti-gespaltener Caspase-3-Antikörper, kombinierter Anti-Caspase-7- und Anti-Cleaved-Caspase-7-Antikörper, kombinierter Anti-Caspase-8- und Anti-Cleaved-Caspase-8-Antikörper oder Anti-Caspase-9-Antikörper) (Tabelle 1). Bei 50 U/min bis 70 U/min auf einen Schaukelshaker legen, um bei Raumtemperatur 2 h oder bei 4 °C über Nacht (16 h) zu inkubieren.
  14. Sammeln Sie die Antikörperlösung (verwenden Sie sie bis zu 3x oder entsorgen Sie sie) und waschen Sie sie durch Zugabe von 15 ml TBST (Tabelle 1) zur Membran auf einem Schaukelschüttler bei 50 U/min bis 70 U/min bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Sie die TBST.
  15. Wiederholen Sie den Waschgang mit 15 ml TBST nach Schritt 14 insgesamt 3x.
  16. 10 ml der verdünnten sekundären HRP-konjugierten Antikörperlösung (Anti-Kaninchen für Blots, die mit primären Antikörpern gegen Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8 oder Caspase-9 gefärbt sind; Anti-Maus für Blots, die mit primärem Antikörper gegen Caspase-1 gefärbt sind; Anti-Ratte für Bplots, die mit primärem Antikörper gegen Caspase-11 gefärbt sind) (Tabelle 1). Auf einem Schaukelschüttler bei 50 U/min bis 70 U/min bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
  17. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie, indem Sie 15 ml TBST auf einem Schaukelschüttler bei 50 U/min bis 70 U/min bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf die Membran geben. Entsorgen Sie die TBST.
  18. Wiederholen Sie den Waschgang mit 15 ml TBST nach Schritt 17 insgesamt 3x.
  19. Fügen Sie der Membran 10 ml des hochempfindlichen HRP-Substrats hinzu. 1 Minute bei Raumtemperatur im Dunkeln ruhen lassen.
  20. Entfernen Sie die Membran vom Substrat. Fahren Sie direkt mit der Bildgebung fort, indem Sie einen Chemilumineszenz-Imager verwenden, wobei das weiße Zubehörfach in der unteren Position eingesetzt ist. Belichten Sie die Membran im automatischen Belichtungsmodus (in der Regel ~1-2 min Belichtungszeit).
  21. Unter Verwendung der Membran aus dem Caspase-9- oder Caspase-11-Blotting (d. h. einer Membran mit RIPA-Lysatproben) 10 ml Stripping-Puffer hinzufügen und 5 Minuten lang auf einem Wippshaker bei 50 U/min bis 70 U/min bei Raumtemperatur inkubieren.
  22. Entsorgen Sie den Stripping-Puffer und waschen Sie ihn, indem Sie 15 ml TBST auf einem Wippshaker bei 50 U/min bis 70 U/min bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf die Membran geben. Entsorgen Sie die TBST.
  23. Wiederholen Sie den Waschgang mit 15 ml TBST nach Schritt 22 insgesamt 3x.
  24. Führen Sie eine Membranblockierung durch, indem Sie 15 ml einer 5%igen Magermilchlösung hinzufügen. Inkubieren Sie die Membran auf einem Schaukelschüttler bei 50 U/min bis 70 U/min bei Raumtemperatur für 1 h.
    HINWEIS: Dies ist ein Pausenpunkt – die Membran kann entweder nach 1 h entfernt oder über Nacht in Blockierlösung bei 4 °C gelagert werden.
  25. Entfernen Sie nach 1 Stunde oder Inkubation über Nacht die Blockierlösung. Fügen Sie 10 ml der verdünnten Anti-β-Aktin-Antikörperlösung (HRP-konjugiert) hinzu. Bei 50 U/min bis 70 U/min auf einen Wippshaker legen, um 1,5 h bei Raumtemperatur zu inkubieren.
  26. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie, indem Sie 15 ml TBST auf einem Schaukelschüttler bei 50 U/min bis 70 U/min bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf die Membran geben. Entsorgen Sie die TBST.
  27. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 15 ml TBST nach Schritt 26 insgesamt 3x.
  28. Fügen Sie der Membran 10 ml des HRP-Substrats mit Standardempfindlichkeit hinzu. 1 Minute bei Raumtemperatur im Dunkeln ruhen lassen.
  29. Fahren Sie direkt mit der Bildgebung fort, indem Sie einen Chemilumineszenz-Imager verwenden, wobei das weiße Zubehörfach in der unteren Position eingesetzt ist. Belichten Sie die Membran im automatischen Belichtungsmodus (in der Regel <1 Minute Belichtungszeit).

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Representative Results

PANoptose wurde als Reaktion auf zahlreiche bakterielle, virale und Pilzinfektionen und andere entzündliche Reize sowie in Krebszellen beobachtet 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 . In diesen Fällen wurde über die Aktivierung mehrerer Caspasen berichtet. Unter Verwendung der Beispielstimulationen in diesem Protokoll, von denen bekannt ist, dass sie PANoptose induzieren, nämlich IAV, HSV1 und F. novicida 44,48,50,51,53,57, wird erwartet, dass die Spaltung als Ersatz für die Aktivierung multipler Caspasen beobachtet werden kann (Abbildung 2A-C ). Zusätzlich ist LPS + ATP als Steuerung enthalten; Diese Kombination ist ein kanonischer NLRP3-Inflammasom-Auslöser, von dem erwartet wird, dass er eine Caspase-1-Aktivierung induziert. Die Aktivierung von Caspase-1 kann als Reaktion auf jeden dieser Auslöser durch die Spaltung der p45-Proform mit der p20-aktiven Form visualisiert werden (Abbildung 2D). Die p20-Form kann dann GSDMD spalten und den Zelltodeinleiten 19.

In ähnlicher Weise wird die Aktivierung der apoptotischen Initiator-Caspase, Caspase-8, beobachtet, was durch das Vorhandensein der p18-gespaltenen Form gekennzeichnet ist (Abbildung 2A-D). Die schwache Aktivierung von Caspase-9 kann in einigen Fällen auch bei diesen Stimuli beobachtet werden (Abbildung 2A-D). Stromabwärts dieser Initiatoren werden die Effektor-Caspasen Caspase-3 und Caspase-7 aktiviert; Diese Aktivierung wird als Bildung der p17/19-gespaltenen Form von Caspase-3 und der p20-gespaltenen Form von Caspase-7 beobachtet (Abbildung 2A-D). Bisher wurde die Aktivierung von Caspase-11 bei PANoptose nicht umfassend evaluiert, aber ihre Aktivierung wurde in einigen Kontexten beobachtet54. Caspase-11 bleibt eine wichtige entzündliche Caspase, und ihre Aktivierung kann durch die Bildung ihrer p26-gespaltenen Form beobachtet werden. Während eine gewisse Caspase-11-Aktivierung auf niedrigem Niveau beobachtet wird, wird keine robuste Aktivierung als Reaktion auf eine IAV-, HSV1- oder F. novicida-Infektion oder LPS + ATP-Stimulation beobachtet (Abbildung 2A-D).

Zellen, denen vorgeschaltete PANoptose-Sensoren fehlen, erleiden keinen Zelltod als Reaktion auf PANoptose-induzierende Reize. Beispielsweise induziert eine IAV-Infektion die Bildung des ZBP1-PANoptosoms 48,51,53,57, und Zbp1-/--Zellen sind während der IAV-Infektion vor dem Zelltod geschützt (Abbildung 3A). In ähnlicher Weise induzieren HSV1- und F. novicida-Infektionen die Bildung des AIM2-PANoptosoms44, und Aim2-/--Zellen erleiden als Reaktion auf diese Infektionen keinen robusten Zelltod (Abbildung 3B, C). In Zellen, denen der für die PANoptosombildung notwendige vorgeschaltete Sensor fehlt, ist die Aktivierung von Caspasen deutlich reduziert oder sogar eliminiert, wie die Verringerung der Intensität der gespaltenen Banden in den Western Blots zeigt (Abbildung 2A-C). In ähnlicher Weise sind Zellen, denen vorgeschaltete Inflammasomsensoren fehlen, als Reaktion auf ihre jeweiligen Reize vor dem Zelltod geschützt, und Nlrp3-/- -Zellen erleiden keinen Zelltod als Reaktion auf LPS + ATP (Abbildung 3D). Diese Zellen zeigen auch eine reduzierte Caspase-Aktivierung (Abbildung 2D).

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über den experimentellen Ablauf. Knochenmark wird isoliert und in aus Knochenmark gewonnene Makrophagen differenziert. Diese Zellen werden dann mit einem Auslöser stimuliert, der die angeborene Immunsignalisierung und den Zelltod aktiviert, wie z. B. eine Infektion oder einen Entzündungsreiz. Nachdem die Zellen aktiviert wurden und beginnen, sich einer PCD zu unterziehen, wird das Lysat gesammelt und durch Western Blot analysiert, um die Caspase-Spaltung in ihre aktiven Formen zu überwachen. Abkürzungen: BMDMs = aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen; DAMPs = schädigungsassoziierte molekulare Muster; III-PCD = entzündlicher angeborener immunprogrammierter Zelltod; PAMPs = Pathogen-assoziierte molekulare Muster; PCD = programmierter Zelltod. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Aktivierung von Caspasen als Reaktion auf Reize. Die Caspase-Aktivierung von Zellkulturlysaten kann durch Bewertung der Größe der Produkte, die auf einem elektrophoretischen Gel laufen, beurteilt werden. (A-D) Immunoblot-Analyse von pro- (P45) und aktiviertem (P20) CASP1, pro- (P43) und gespaltenem (P36 und P26) CASP11, pro- (P35) und gespaltenem (P17/P19) CASP3, pro- (P35) und gespaltenem (P20) CASP7, pro- (P55) und gespaltenem (P44 und P18) CASP8 sowie pro- (P49) und gespaltenem (P37) CASP9 in WT und Zbp1−/−, WT und Aim2−/−, oder WT- und Nlrp3−/−-BMDMs nach (A) IAV-Infektion, (B) HSV1-Infektion, (C) Francisella novicida-Infektion oder (D) LPS + ATP-Stimulation. Die Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Abkürzungen: BMDMs = aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen; CASP1 = Caspase-1; CASP3 = Caspase-3; CASP7 = Caspase-7; CASP8 = Caspase-8; CASP9 = Caspase-9; CASP11 = Caspase-11; HSV1 = Herpes-simplex-Virus 1; IAV = Influenza-A-Virus; LPS = Lipopolysaccharid; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Hemmung des Zelltods, wenn keine Caspase-Aktivierung auftritt. (A-D) Repräsentative Bilder des Zelltods bei WT und Zbp1−/−, WT und Aim2−/− oder WT und Nlrp3−/− BMDMs nach (A) IAV-Infektion, (B) HSV1-Infektion, (C) Francisella novicida-Infektion oder (D) LPS + ATP-Stimulation. Die rote Maske kennzeichnet tote Zellen. Maßstabsbalken = 50 μm. Die Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Abkürzungen: BMDMs = aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen; HSV1 = Herpes-simplex-Virus 1; IAV = Influenza-A-Virus; LPS = Lipopolysaccharid; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. 

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Discussion

Die Überwachung der Caspase-Spaltung und -Aktivierung liefert eines der umfassendsten Bilder der PCD-Aktivierung des angeborenen Immunsystems als Teil der angeborenen Immunantwort. Das hier beschriebene Protokoll demonstriert eine Strategie zur Überwachung der Caspase-Aktivierung als Reaktion auf IAV-, HSV1- und F. novicida-Infektionen und den sterilen Auslöser LPS + ATP, aber zahlreiche andere Stimuli können PCD induzieren und könnten in dieser Methode verwendet werden, wie in mehreren Veröffentlichungen gezeigt wurde 44,48,49,50,51,52,53,54,56, 57,58,59,60,61,62. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die angeborene Immun-PCD als Reaktion auf neue Auslöser zu charakterisieren, bei denen die Mechanismen der PCD unbekannt bleiben. Die Verwendung einer Kombination von Wildtyp- und genetisch defizienten Zellen und der Vergleich der Aktivierung verschiedener Caspasen zwischen diesen Populationen kann neue Einblicke in die Sensoren und Regulatoren liefern, die an der PCD als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus beteiligt sind.

Bei der Durchführung dieser Methode sollten mehrere technische Punkte berücksichtigt werden. Erstens, da bei dieser Methode Zellen infiziert oder anderweitig stimuliert werden, um den Zelltod zu induzieren, ist es wichtig, sterile Techniken für die Isolierung der Zellen und für die anschließenden Stimulationen zu verwenden. Eine Kontamination kann die Ergebnisse erheblich beeinflussen und auch unter nicht stimulierten Bedingungen zu einer Caspase-Aktivierung führen. Um dies zu testen, ist es am besten, beim Sammeln der Proben und beim Laden von Gelen für die Caspase-Blots immer eine unstimulierte Kontrolle einzubeziehen. Darüber hinaus ist beim Plattieren der Zellen darauf zu achten, dass die Zellen genau gezählt werden und keine Verklumpung auftritt. Wenn die Zellen verklumpt sind, wird eine inkonsistente Anzahl von Zellen in den Vertiefungen abgelagert, und der MOI und die Menge an Protein pro Vertiefung werden beeinflusst. Bei der Durchführung der westlichen Blots empfiehlt es sich, das Streifenmuster der ungespaltenen Pro-Form der Caspase zu vergleichen und die gespaltene Form zu überwachen, um sicherzustellen, dass konsistente Mengen an Protein gesammelt und über die Vertiefungen geladen wurden. Wenn jedoch in einer Probe ein hohes Maß an Caspase-Aktivierung vorhanden ist, kann dies zu einer Verzerrung des Signals führen, was zu einer scheinbaren Verringerung der Pro-Form in den anderen Proben führt, wie wir in diesem Beispiel mit Caspase-8 bei HSV1- und F. novicida-Infektionen zeigen (Abbildung 2B, C). Dies geschieht wahrscheinlich aufgrund einer ungleichmäßigen Antikörperbindung, die durch das Vorhandensein von zu viel Protein an einer bestimmten Stelle auf der Membran verursacht wird, oder aufgrund von Bildgebungsartefakten, bei denen das Substrat in einer einzelnen Probe übersättigt wird. Das Anpassen der Antikörperverdünnungen oder Bildgebungseinstellungen kann helfen, dieses Problem zu lösen. Darüber hinaus kann es bei der erstmaligen Etablierung einer Infektion oder Stimulation von Vorteil sein, einen Zeitverlauf zu verwenden, um festzustellen, wann die Aktivierung jeder Caspase auftritt. Ohne einen zeitlichen Verlauf können die Daten irreführend sein, da der individuell gewählte Zeitpunkt zu früh oder zu spät sein könnte, was dazu führen könnte, dass die Caspase-Aktivierung übersehen wird und unangemessene Schlussfolgerungen über ihre Beteiligung gezogen werden. In ähnlicher Weise kann auch das Testen verschiedener MOIs auf infektiöse Reize von Vorteil sein, um die spezifischen Bedingungen zu identifizieren, unter denen Caspase(n) aktiviert werden.

Auch der Elektrophoreseschritt erfordert Präzision. Bei der Vorbereitung des Ladens der Proben auf das Gel sollten die Röhrchen immer zuerst zentrifugiert und nur der Überstand geladen werden. Unlösliches Protein kann den Ablauf des Gels und die anschließende Analyse der Daten beeinträchtigen. Der kombinierte Überstand und das Proteinlysat sollten für den Nachweis von Caspase-1 anstelle eines reinen Zelllysats verwendet werden. Dies wird die Empfindlichkeit der Erkennung erheblich verbessern. Caspase-3, Caspase-7 und Caspase-8 können auch im kombinierten Überstand und Proteinlysat gut nachgewiesen werden. Für die besten Ergebnisse beim Nachweis von Caspase-11 und Caspase-9 ist jedoch das im RIPA-Puffer gesammelte Proteinlysat ausreichend. Da die relative Häufigkeit jeder Caspase innerhalb des Lysats gering sein kann, sollte so viel Probe wie möglich auf das Gel geladen werden. Dies erfordert ein langsames und gleichmäßiges Pipettieren, um ein Überlaufen in die benachbarten Vertiefungen zu vermeiden. Wenn eine schlechte Trennung zwischen der pro- und der gespaltenen Form der Caspasen beobachtet wird, kann die Gellaufzeit verlängert oder ein geringerer Prozentsatz an Acrylamid verwendet werden, um die Trennung zu optimieren.

Schließlich wurden die in diesem Protokoll aufgeführten Antikörper für die Verwendung mit Maus-BMDMs optimiert, und mehrere Gruppen haben sie rigoros getestet, indem sie genetisch defiziente Zellen als Kontrollen verwendeten, um zu bestätigen, dass es keine unspezifischen Banden bei den interessierenden Molekulargewichten gibt. Während andere Antikörper auch funktionieren können, sind die hier aufgeführten optimal. Darüber hinaus funktionieren viele dieser Antikörper auch gut in Gewebelysaten, und andere Zellpopulationen können auch in vitro zur Analyse gesammelt und stimuliert werden. Die Verwendung von Zelllinien oder Primärzellen von Menschen oder anderen Spezies ist ebenfalls möglich, erfordert jedoch eine zusätzliche Bewertung der Antikörper zur Optimierung. Humane Anti-Caspase-1 (1:1.000) und humane Anti-Caspase-8 (1:1.000; siehe Materialtabelle) wurden erfolgreich für solche Bewertungen verwendet, und die gleichen Anti-Caspase-3-, Anti-Caspase-3-, Anti-Caspase-7- und Anti-Spalt-Caspase-7-Antikörper, die in diesem Protokoll enthalten sind, können sowohl für Maus- als auch für menschliche Zellenverwendet werden 44,56,62.

Das Verständnis von PCD-Signalwegen, einschließlich Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose, als integraler Bestandteil der angeborenen Immunantwort nimmt zu, da die Wechselwirkungen zwischen PCD-Signalwegen zunehmend charakterisiert werden und Zelltodmoleküle als therapeutische Ziele im gesamten Krankheitsspektrum identifiziert werden 3,4 . Die weitere Identifizierung der Sensoren des angeborenen Immunsystems, die sowohl PCD als auch III-PCD induzieren, und die Charakterisierung des Zeitpunkts und des Zusammenspiels der Caspase-Aktivierung wird die Fähigkeit zur therapeutischen Modulation der angeborenen Immun-PCD-Signalwege verbessern und die Patientenergebnisse verbessern.

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Disclosures

T.-D.K. ist Berater für Pfizer.

Acknowledgments

Wir danken den Mitgliedern des Kanneganti-Labors für ihre Kommentare und Vorschläge, und wir danken J. Gullett, PhD, für die Unterstützung bei der wissenschaftlichen Redaktion. Die Arbeit in unserem Labor wird durch die Zuschüsse AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 und CA253095 (an T.-D.K.) der National Institutes of Health (NIH) sowie durch die American Libanese Syrian Associated Charities (an T.-D.K.) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer

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References

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Immunologie und Infektion Heft 191
Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods
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Han, J. H., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).

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