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Immunology and Infection

जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका मृत्यु का आकलन करने के लिए कैसपेस सक्रियण का मूल्यांकन

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

यह प्रोटोकॉल इन विट्रो और विवो (चूहों में) संक्रमण, बाँझ अपमान और कैंसर के मॉडल के जवाब में कैसपेज़ सक्रियण (कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -7, कैसपेज़ -8, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -11) का आकलन करने के लिए एक व्यापक विधि का वर्णन करता है ताकि कोशिका मृत्यु मार्गों की शुरुआत निर्धारित की जा सके, जैसे कि पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोप्टोसिस।

Abstract

जन्मजात प्रतिरक्षा रोगजनकों और बाँझ अपमान के जवाब में रक्षा की महत्वपूर्ण पहली पंक्ति प्रदान करती है। इस प्रतिक्रिया का एक प्रमुख यंत्रवत घटक संक्रमित या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को खत्म करने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रचार करने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा क्रमादेशित कोशिका मृत्यु (पीसीडी) की शुरुआत है। हालांकि, अतिरिक्त पीसीडी सूजन और विकृति से जुड़ा हुआ है। इसलिए, पीसीडी के सक्रियण और विनियमन को समझना जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को चिह्नित करने और रोग स्पेक्ट्रम में नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने का एक केंद्रीय पहलू है।

यह प्रोटोकॉल कैसपेस की निगरानी करके जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी सक्रियण को चिह्नित करने के तरीके प्रदान करता है, सिस्टीन-निर्भर प्रोटीज का एक परिवार जो अक्सर एपोप्टोसिस, पाइरोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोप्टोसिस सहित विभिन्न पीसीडी मार्गों से जुड़े होते हैं। प्रारंभिक रिपोर्टों में कैसपेज़ -2, कैसपेज़ -8, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -10 को एपोप्टोसिस में प्रभावक कैसपेज़ के रूप में सर्जक कैसपेज़ और कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6 और कैस्पेज़ -7 के रूप में चित्रित किया गया था, जबकि बाद के अध्ययनों में भड़काऊ कैसपेस, कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -4, कैसपेज़ -5, और कैसपेज़ -11, ड्राइव पाइरोप्टोसिस पाया गया। अब यह ज्ञात है कि पहले से परिभाषित पीसीडी मार्गों में कैसपेस और अन्य जन्मजात प्रतिरक्षा और कोशिका मृत्यु अणुओं के बीच व्यापक क्रॉसस्टॉक है, जो जन्मजात प्रतिरक्षा और पीसीडी की यांत्रिक समझ में एक महत्वपूर्ण ज्ञान अंतर की पहचान करता है और पीएनोप्टोसिस के लक्षण वर्णन की ओर जाता है। पीएनोप्टोसिस एक अद्वितीय जन्मजात प्रतिरक्षा भड़काऊ पीसीडी मार्ग है जो पीएनोप्टोसोम कॉम्प्लेक्स द्वारा विनियमित होता है, जो अन्य कोशिका मृत्यु मार्गों से कैसपेस सहित घटकों को एकीकृत करता है।

यहां, विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में कैसपेस के सक्रियण का आकलन करने के तरीके प्रदान किए जाते हैं। ये विधियां इन विट्रो और विवो दोनों में पीसीडी मार्गों के लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं, क्योंकि सक्रिय कैसपेस प्रोटियोलिटिक दरार से गुजरते हैं जिन्हें इष्टतम एंटीबॉडी और ब्लोटिंग स्थितियों का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता द्वारा देखा जा सकता है। एक प्रोटोकॉल और वेस्टर्न ब्लॉटिंग वर्कफ़्लो स्थापित किया गया है जो एक ही सेलुलर आबादी से कई कैसपेस के सक्रियण के मूल्यांकन की अनुमति देता है, जो पीसीडी प्रक्रियाओं का व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करता है। इस पद्धति को विकास, होमियोस्टेसिस, संक्रमण, सूजन और कैंसर में अनुसंधान क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है ताकि स्वास्थ्य और बीमारी में सेलुलर प्रक्रियाओं में पीसीडी मार्गों का मूल्यांकन किया जा सके।

Introduction

जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली संक्रमण के दौरान और बाँझ उत्तेजनाओं के जवाब में रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करती है, जैसे ऊतक की चोट और होमियोस्टैसिस में परिवर्तन। कोशिका की सतह और साइटोप्लाज्म में जन्मजात प्रतिरक्षा सेंसर भड़काऊ सिग्नलिंग मार्गों और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए रोगज़नक़- या क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी या डीएएमपी, क्रमशः) का जवाब देते हैं। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रमुख प्रक्रियाओं में से एक संक्रमित या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को हटाने और आगे जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए कोशिका मृत्यु का प्रेरण है। प्रोग्राम्ड सेल डेथ (पीसीडी) प्रजातियों में एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया है, जो एक जन्मजात प्रतिरक्षा तंत्र के रूप में इसके विकासवादी महत्व को उजागर करती है।

कई जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी मार्ग हैं जिन्हें सभी सेल प्रकारों में सक्रिय किया जा सकता है। कैसपेस अत्यधिक संरक्षित, इंट्रासेल्युलर, सिस्टीन-निर्भर प्रोटीज का एक प्रमुख परिवार है जो कई पीसीडी मार्गों में महत्वपूर्ण हैं, जिसमें पारंपरिक रूप से गैर-भड़काऊ एपोप्टोसिस मार्ग, साथ ही भड़काऊ पीसीडी मार्ग जैसे पाइरोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोप्टोसिस 1,2,3,4,5 शामिल हैं। . 11 मानव और 10 मुराइन कैसपेस हैं जो अच्छी तरह से परिभाषित हैं, साथ ही छद्म-कैसपेस जो कार्यात्मक हो सकते हैं, और अधिकांश को संवैधानिक रूप से निष्क्रिय मोनोमेरिक या डिमेरिक प्रो-कैसपेस के रूप में व्यक्त किया जाता है जिन्हें सक्रियण 6,7 के लिए दरार की आवश्यकता होती है। कैसपेस में मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स की भर्ती और गठन के लिए महत्वपूर्ण डोमेन भी शामिल हैं। इनमें कैसपेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन (CARD) शामिल है, जो कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -2, कैस्पेज़ -4, कैस्पेज़ -5, कैसपेज़ -9, और कैस्पेज़ -11, या डेथ एफेक्टर डोमेन (डीईडी) में पाया जा सकता है, जो कैसपेज़ -8 और कैसपेज़ -10 में पाया जाता है। उनकी प्रोटियोलिटिक गतिविधि और मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने की उनकी क्षमता दोनों के माध्यम से, कैसपेस जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी के महत्वपूर्ण चालक हैं।

जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी में कैसपेस की भूमिका की पहचान पहली बार एपोप्टोसिस में की गई थी, जहां सर्जक कैसपेस, कैसपेज़ -2, कैसपेज़ -8, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -10, सेल मृत्यु 8,9,10,11,12 को चलाने के लिए निष्पादनकर्ता कैसपेज़, कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6 और कैसपेज़ -7 को सक्रिय करते हैं। सर्जक कैसपेस को विविध सिग्नलिंग कैस्केड द्वारा सक्रिय किया जा सकता है; बाह्य मार्ग बाह्य लिगैंड-प्रेरित मृत्यु रिसेप्टर सिग्नलिंग के माध्यम से कैसपेज़ -8 को सक्रिय करता है, और आंतरिक मार्ग माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता13 के विघटन के माध्यम से कैसपेज़ -9 को सक्रिय करता है। सक्रिय सर्जक कैसपेस अपने सक्रिय रूपों का उत्पादन करने के लिए निष्पादनकर्ता कैसपेस के बड़े और छोटे उत्प्रेरक सबयूनिट्स को अलग करने वाले लिंकर को छोड़ देते हैं। जल्लाद कैसपेस तब कोशिका को अलग करने के लिए अपने सब्सट्रेट्स को छोड़ देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए क्षरण, झिल्ली धब्बा, परमाणु विखंडन और एपोप्टोटिक निकायों की रिहाई14,15 होती है। यह प्रक्रिया आम तौर पर कोशिका मृत्यु के एक गैर-लिटिक और गैर-भड़काऊ रूप में समाप्त होती है जब एफेरोसाइटोसिस 16 द्वारा मरने वाली कोशिकाओं की तत्काल निकासी के साथ युग्मितहोती है। हालांकि, एफेरोसाइटोसिस में दोष या फागोसाइटिक कोशिकाओं की कमी से एपोप्टोटिक कोशिकाओं का संचय हो सकता है, जो तब लिटिक और भड़काऊ कोशिका मृत्यु से गुजरते हैं 17,18.

कैसपेज़ -1 (मानव और माउस), कैसपेज़ -4 और कैसपेज़ -5 (मानव), और कैसपेज़ -11 (माउस) सहित भड़काऊ कैसपेस को भड़काऊ जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी (III-पीसीडी) के एक रूप के दौरान सक्रिय होने की खोज की गई है जिसे पाइरोप्टोसिस कहा जाता है। कैसपेज़ -1 सक्रियण ज्वलनशीलता के गठन से जुड़ा हुआ है, जो मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स हैं जिनमें साइटोसोलिक जन्मजात प्रतिरक्षा सेंसर, एक एडाप्टर अणु (एपोप्टोसिस से जुड़े धब्बे जैसे प्रोटीन जिसमें कार्ड [एएससी]), और कैसपेज़ -1 शामिल हैं। इस परिसर का गठन कैसपेज़ -1 को अपने सक्रिय रूप को जारी करने के लिए निकटता-मध्यस्थता ऑटोप्रोटियोलिसिस से गुजरने की अनुमति देता है, जो प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स इंटरल्यूकिन (आईएल) -1 और आईएल -18 और छिद्र बनाने वाले अणु गैसडरमिन डी (जीएसडीएमडी) 19,20,21,22,23 सहित लक्ष्य सब्सट्रेट्स को छोड़ सकता है। . कैसपेज़ -11, कैसपेज़ -4, और कैसपेज़ -5 भी लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) 19,20 जैसे पीएएमपी को महसूस करने के बाद ज्वलनशील के अपस्ट्रीम गठन के बिना जीएसडीएमडी को सक्रिय कर सकते हैं। ये कैसपेस साइटोसोलिक एलपीएस से जुड़ने पर सक्रियण के लिए ऑलिगोमेराइजेशन और आत्म-दरार से गुजरते हैं, जो आईएल -1 और आईएल -18 परिपक्वता 20 को प्रेरित करने के लिए सेल-आंतरिक तरीके से गैर-कैनोनिकल ज्वलनशील सक्रियण 24,25,26 और कैसपेज़ -1 सक्रियण की ओर जाता है। इन प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की परिपक्वता और रिहाई इन कैसपेस को "भड़काऊ" के रूप में चिह्नित करती है। इसके अतिरिक्त, एपोप्टोटिक कैसपेज़ -8 को ज्वलनशीलता के लिए स्थानीयकृत पाया गया है, जो एपोप्टोटिक और पाइरोप्टोटिक प्रक्रियाओं के बीच एक लिंक प्रदान करता है। अध्ययनों में पाया गया है कि एपोप्टोटिक कैसपेस -8 पीसीडी के एक अन्य रूप को विनियमित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है जिसे नेक्रोप्टोसिस कहा जाता है। कैसपेज़ -8 के नुकसान के परिणामस्वरूप नेक्रोप्टोसिस 27,28,29,30,31,32,33,34,35 के III-PCD मार्ग को चलाने के लिए सहज रिसेप्टर-इंटरैक्टिंग सेरीन-थ्रेओनिन किनेज 3 (RIPK3)-मध्यस्थता मिश्रित वंश किनेज डोमेन-जैसे स्यूडोकाइनेज (MLKL) सक्रियण होता है।

जबकि कैस्पेस को ऐतिहासिक रूप से "एपोप्टोटिक" या "भड़काऊ" के रूप में वर्गीकृत किया गया है, जो उनके द्वारा शुरू की जाने वाली कोशिका मृत्यु के प्रकार पर आधारित है, बढ़ते सबूत बताते हैं कि कैसपेस 3,4 के माध्यम से जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी मार्गों के बीच व्यापक क्रॉसस्टॉक है। उदाहरण के लिए, ज्वलनशीलता से भड़काऊ कैसपेज़ -1 अपने कैननिकल सक्रियण साइट34 पर एपोप्टोटिक कैसपेज़ -7 को छोड़ देता है। कैसपेज़ -1 सक्रियण से पॉली (एडीपी-राइबोज) पोलीमरेज़ 1 (पीएआरपी 1)36 जैसे एपोप्टोटिक सब्सट्रेट्स की दरार भी हो सकती है। जीएसडीएमडी की कमी वाली कोशिकाओं में, कैसपेज़ -1 कैसपेज़ -337,38 को भी छोड़ सकता है। इसके अतिरिक्त, कैनोनिकल एपोप्टोटिक कैसपेस -3 पीसीडी17,18 को प्रेरित करने के लिए गैसडर्मिन ई (जीएसडीएमई) को छोड़ सकता है और जीएसडीएमडी को निष्क्रिय रूप40 में भी संसाधित कर सकता है। इसके अलावा, ज्वलनशील परिसर में कैसपेज़ -8 भर्ती 39,40,41,42,43,44,45 देखी गई है, और कैसपेज़ -8 कैननिकल और नॉनकैनोनिकल ज्वलनशील सक्रियण39 का एक प्रमुख नियामक है। कई भड़काऊ स्थितियों में कैसपेज़ -8 और कैसपेज़ -1 के लिए अतिव्यापी और अनावश्यक भूमिकाएं भी हैं, और जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी रोग स्पेक्ट्रम 39,46,47,48,49,50 में पाइरोप्टोटिक, एपोप्टोटिक और नेक्रोप्टोटिक घटकों के सक्रियण की विशेषता है।

भड़काऊ और एपोप्टोटिक कैसपेस के बीच इस क्रॉसटॉक के आधार पर, जन्मजात प्रतिरक्षा और पीसीडी की यांत्रिक समझ में एक महत्वपूर्ण अंतर की पहचान की गई, जिससे पैनोप्टोसिस की खोज हुई। पीएनोप्टोसिस III-PCD का एक अनूठा रूप है जो रोगजनकों, PAMPs, DAMPs और होमोस्टेसिस में परिवर्तन के जवाब में सक्रिय होता है और PANoptosomes द्वारा विनियमित होता है - बहुआयामी मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स जो अन्य कोशिका मृत्यु मार्गों 44,50,51,52,53,54,55 से घटकों को एकीकृत करते हैं . पीएनोप्टोसिस में जैविक प्रभावों की समग्रता को व्यक्तिगत रूप सेअकेले पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस, या नेक्रोप्टोसिस द्वारा जिम्मेदार नहीं ठहराया जा सकता है 3,4,35,36,39,46,47,48, क्योंकि पैनोप्टोसिस को कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -11, कैस्पेज़ -8, कैसपेज़ -9, कैस्पेस -3, और / या कैसपेज़ -7 सहित कई कैसपेस के सक्रियण की विशेषता है। संदर्भ के आधार पर 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . पीएनोप्टोसिस को संक्रामक और भड़काऊ रोगों के साथ-साथ कैंसर और कैंसरउपचारों में तेजी से फंसाया गया है 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 , 54,56
57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

एपोप्टोसिस, पाइरोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोपोसिस सहित कोशिका मृत्यु मार्गों में कैसपेस की आवश्यक भूमिका को देखते हुए, उनके सक्रियण को चिह्नित करने और पीसीडी मार्गों की पूरी जटिलता को समझने के लिए तकनीकविकसित करना महत्वपूर्ण है। यहां प्रोटोकॉल कोशिकाओं को उत्तेजित करने और कैसपेस के बाद के सक्रियण को मापने के लिए एक विधि का विवरण देता है (चित्रा 1)। यह विधि कैसपेस के प्रोटियोलिटिक दरार का लाभ उठाती है, जो आम तौर पर उनके सक्रियण के लिए आवश्यक होती है, उनका अध्ययन करने के साधन के रूप में। पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से, प्रोटीन के आकार को निर्धारित किया जा सकता है, जिससे निष्क्रिय प्रो-कैसपेस और उनके सक्रिय, क्लीवर रूपों के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन और भेदभाव की अनुमति मिलती है।

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ हैं 1) पीसीडी सक्रियण को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए अंतर्जात कोशिकाओं की एक आबादी से समानांतर में कई कैसपेस के सक्रियण का आकलन करने की इसकी क्षमता और 2) अपेक्षाकृत सरल प्रयोगशाला तकनीकों का उपयोग जिन्हें व्यापक प्रशिक्षण या महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है। पिछले प्रोटोकॉल ने कल्चर सुपरनैटेंट, सेल और ऊतक लाइसेट, माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पूरी कोशिकाओं और विवो 67,68,69,70,71 में कैसपेज़ सक्रियण की निगरानी के लिए पश्चिमी सोख्ता, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर या एंटीबॉडी स्टेनिंग का उपयोग किया है, लेकिन ये तकनीक आम तौर पर एक नमूने में केवल एक या दो कैसपेस की निगरानी करती हैं। इसके अलावा, जबकि दरार पर फ्लोरेस वाले कैसपेज़ क्लीवेज साइटों वाले सिंथेटिक पेप्टाइड सब्सट्रेट्स का उपयोग सेल या ऊतक लाइसेट69 में कैसपेज़ सक्रियण की निगरानी के लिए किया गया है, इन सब्सट्रेट्स को अक्सर एक से अधिक कैसपेज़ द्वारा छोड़ा जा सकता है, जिससे इस प्रणाली में व्यक्तिगत कैसपेस के विशिष्ट सक्रियण को निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर या अन्य टैग-आधारित विधियों के उपयोग के बजाय पश्चिमी सोख्ता का उपयोग शोधकर्ताओं को रिपोर्टर जीन के साथ विशिष्ट सेल लाइनें बनाने के बजाय अंतर्जात कोशिकाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है। अंतर्जात कोशिकाओं का उपयोग करने के कई फायदे हैं, जिसमें यह तथ्य भी शामिल है कि कई अमर सेल लाइनों में प्रमुख सेल डेथ अणुओं72,73 की कमी है, जो परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इसके अतिरिक्त, अंतर्जात कोशिकाओं का उपयोग करने से एकल वंश के बजाय मैक्रोफेज, उपकला कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे विभिन्न सेल प्रकारों के मूल्यांकन की अनुमति मिलती है। वेस्टर्न ब्लॉटिंग भी एक अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी तकनीक है जिसे बड़े, महंगे उपकरण या जटिल सेटअप की आवश्यकता के बिना दुनिया भर की प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल जीव विज्ञान में व्यापक रूप से कैसपेस के कोशिका मृत्यु-निर्भर और कोशिका मृत्यु-स्वतंत्र कार्यों दोनों को समझने के लिए लागू होता है, जिसमें उनकी मचान भूमिकाएं और अन्य भड़काऊ सिग्नलिंगमार्गों में कार्य शामिल हैं। इस पद्धति को लागू करने से जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी मार्गों और बीमारियों और स्थितियों में भड़काऊ सिग्नलिंग के अध्ययन में एक एकीकृत दृष्टिकोण की अनुमति मिलती है, और इस प्रोटोकॉल का उपयोग महत्वपूर्ण नियामक प्रक्रियाओं और यांत्रिक कनेक्शनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो भविष्य की चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सूचित करेंगे।

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Protocol

जानवरों के उपयोग और देखभाल पर सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च हॉस्पिटल कमेटी द्वारा पशु उपयोग और प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी।

1. समाधान तैयार करना

  1. L929-वातानुकूलित मीडिया तैयार करें।
    1. प्लेट 1 × 182 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में 106 एल929 कोशिकाएं (सामग्री की तालिका देखें) जिसमें 50 एमएल एल 929 संस्कृति मीडिया होता है (मीडिया की तैयारी के लिए तालिका 1 देखें)।
    2. कोशिकाओं को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में उगाएं।
    3. 7 दिनों के बाद, सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें, और 0.45 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें। 50 एमएल एलिकोट तैयार करें (1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एलिकोट स्टोर करें)।
  2. अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) संस्कृति मीडिया के 500 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
  3. बीएमडीएम उत्तेजना मीडिया के 500 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
  4. संक्रमण के लिए 500 एमएल मीडिया तैयार करें (तालिका 1)।
  5. 1 एम ट्रिस बफर का 100 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
  6. 4x सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS) बफर तैयार करें (तालिका 1)।
  7. 1 M 1,4-dithiotheritol (DTT, तालिका 1) का 1 एमएल तैयार करें।
  8. कैसपेज़ लाइसिस बफर के 40 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
  9. 1.5 एम ट्राइस बफर का 100 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
  10. 10% (wt/vol) SDS समाधान का 100 mL तैयार करें (तालिका 1)।
  11. 2x रेडियोइम्यूनोप्रिसिपेशन परख (RIPA) बफर के 50 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
  12. एक 5 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस समाधान तैयार करें (तालिका 1)।
  13. एक 0.5 एम एटीपी समाधान तैयार करें (तालिका 1)।
  14. पश्चिमी सोख्ता समाधान तैयार करें।
    1. 5x रनिंग बफर स्टॉक का 1 L तैयार करें (तालिका 1)।
    2. 10x स्थानांतरण बफर स्टॉक का 1 L तैयार करें (तालिका 1)।
    3. ट्वीन 20 (टीबीएसटी, तालिका 1) के साथ 1 एल ट्राइस-बफर्ड खारा तैयार करें।
    4. 5% (wt/vol) स्किम मिल्क ब्लॉकिंग सॉल्यूशन का 100 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
  15. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    1. कैसपेज़ -1 प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    2. कैसपेज़ -11 प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    3. कैसपेज़ -3 प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    4. कैसपेज़ -7 प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    5. कैसपेज़ -8 प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    6. कैसपेज़ -9 प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    7. एचआरपी-संयुग्मित β-एक्टिन प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
  16. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    1. एंटी-खरगोश द्वितीयक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    2. एंटी-माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।
    3. एंटी-रैट सेकेंडरी एंटीबॉडी के 10 एमएल तैयार करें (तालिका 1)।

2. अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को अलग करना

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, बरकरार पीसीडी मार्गों के साथ 6-10 सप्ताह के जंगली प्रकार के चूहों या पीसीडी नियामकों, प्रभावकों, या हटाए गए या परिवर्तित किए गए रुचि के अणुओं के साथ उत्परिवर्ती चूहों का उपयोग किया जा सकता है।

  1. एक प्रवाह दर के साथ सीओ2 कक्ष में एक माउस को इच्छामृत्यु करें जो 2-3 मिनट के लिए प्रति मिनट पिंजरे की मात्रा का 10% -30% विस्थापित करता है। फिर, एक द्वितीयक इच्छामृत्यु विधि करें, जैसे कि ग्रीवा अव्यवस्था। सभी अतिरिक्त सुविधा-, संस्थान-, और सरकार-विशिष्ट दिशानिर्देशों और नियमों का पालन करें जहां भी लागू हो।
  2. पिछले पैर की हड्डियों को पुनः प्राप्त करने के लिए माउस को विच्छेदित करें।
    1. माउस को उसकी पीठ पर पिन करें ताकि पेट उजागर हो। पिछले पैरों और पेट को निष्फल करने के लिए 70% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
      चेतावनी: इथेनॉल ज्वलनशील है। इसे खुली आग की लपटों से दूर रखें।
    2. पेट की मध्य रेखा पर चीरा लगाने के लिए कैंची का उपयोग करें; फीमर को दृश्यमान बनाने के लिए पैरों की ओर काटना जारी रखें।
    3. दाहिने पिछले पैर को लें और त्वचा को शरीर से दूर मध्य रेखा की ओर खींचें। जोड़ की मांसपेशियों को मध्य रेखा की ओर अलग करके पैर को शरीर से अलग करें; फिर, कूल्हे के जोड़ और रीढ़ के बीच पैर काटें। इसके बाद, पंजे को टखने से बाहर काट लें, और त्वचा को छीलकर हड्डी से अतिरिक्त ऊतक को हटा दें और बछड़े के ऊतकों को हटाने के लिए थोड़ी खुली कैंची का उपयोग करें।
    4. पैर को 70% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल से लथपथ तौलिया पर रखें और टिबिया और फीमर को विच्छेदित करें।
      1. टिबिया और फीमर प्रत्येक को बल के एक अलग सेट के साथ पकड़ें। धीरे से घुटने के जोड़ की प्राकृतिक दिशा के खिलाफ टिबिया दबाएं; इससे टिबिया घुटने पर टूट जाएगी।
      2. किसी भी शेष लटकते ऊतक को हटाने के लिए यदि आवश्यक हो तो बल का उपयोग करें और कैंची का विच्छेदन करें। टिबिया को इथेनॉल से भीगे हुए तौलिये पर रखकर बाद में उपयोग के लिए सहेजें।
      3. घुटने को काटकर, उसी तरह फीमर को इकट्ठा करें।
    5. बाएं पैर के लिए ऊपर चरण 3 और 4 को दोहराएं ताकि इसे शरीर से निकाला जा सके और टिबिया और फीमर का विच्छेदन किया जा सके।
    6. हड्डियों को 70% (वॉल्यूम /वॉल्यूम) इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
    7. हड्डियों को एक साफ 70% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल से लथपथ तौलिया पर रखकर, तौलिया में मांसल भाग को निचोड़कर, और अतिरिक्त ऊतक को हटाने के लिए हड्डी के खिलाफ तौलिया रगड़कर साफ करें।
  3. एक बार जब फीमर और दोनों टिबिया साफ हो जाते हैं, तो सभी चार हड्डियों को 70% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। हड्डियों को एक बाँझ पेट्री डिश में इकट्ठा करें और डिश में मीडिया को धीरे से शुभकामनाएं देकर उन्हें 10 एमएल बीएमडीएम कल्चर मीडिया के साथ कुल्ला करें।
  4. ताजा बीएमडीएम संस्कृति मीडिया के 10 एमएल के साथ 10 एमएल सिरिंज भरें और 25 ग्राम सुई संलग्न करें।
  5. बल का उपयोग करके टिबिया उठाएं; फिर, टखने के जोड़ को ~ 45 ° कोण पर काटें।
  6. टिबिया से अस्थि मज्जा को फ्लश करें।
    1. टिबिया को 50 एमएल ट्यूब पर रखें, जिसमें टिबिया का संकीर्ण छोर नीचे की ओर इशारा करता है। भरे हुए सिरिंज से टिबिया के ऊपर मीडिया को वितरित करें।
    2. मज्जा के शीर्ष छोर पर सुई (धीरे से पहले) डालें और मीडिया को वितरित करें।
    3. सुई निकालें और फिर फिर डालें। मीडिया को वितरित करने और सुई को मज्जा में ले जाने के लिए छोटे, उच्च दबाव वाले पुश का उपयोग करें।
    4. एक बार जब मीडिया हड्डी के तल से बाहर बहना शुरू कर देता है, तो कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए छोटे, उच्च दबाव वाले पुश का उपयोग करें। इस प्रक्रिया के दौरान हड्डी के रंग की निगरानी करें, और जब हड्डी सफेद हो, तो इसे त्याग दें।
    5. दोनों टिबिया के लिए ऐसा करें।
  7. फीमर के लिए ऊपर चरण 5 और 6 दोहराएं, कूल्हे के जोड़ को काटें क्योंकि टिबिया टखने के जोड़ पर कट गई थी। मज्जा फ्लश होने के रूप में बीएमडीएम संस्कृति मीडिया को इकट्ठा करने के लिए उसी 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करें।
  8. एक बार जब सभी चार हड्डियों को फ्लश कर दिया जाता है, तो 10 एमएल सिरिंज पर 18 ग्राम सुई के माध्यम से 50 एमएल ट्यूब से मज्जा और मीडिया को 3 गुना ऊपर और नीचे रखें, मज्जा को फैलाने के लिए हर बार ट्यूब के किनारों को धोएं।
  9. बीएमडीएम संस्कृति मीडिया के साथ 50 एमएल ट्यूब में अंतिम मात्रा को 30 एमएल में समायोजित करें, और सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं पूरी तरह से निलंबित हैं।
  10. 50 एमएल ट्यूब से बीएमडीएम संस्कृति मीडिया को फ़िल्टर करने के लिए 70 μm सेल छन्नी का उपयोग करें।
  11. परिणामी सेल निलंबन, जिसमें अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाएं होती हैं, को प्रत्येक में 10 एमएल (या ~ 20 × 10 6 कोशिकाओं) को जोड़कर तीन 150 मिमी ऊतकसंवर्धन व्यंजनों में प्लेट करें। फिर, प्रत्येक डिश में बीएमडीएम संस्कृति मीडिया का एक अतिरिक्त 10 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।

3. प्रयोगों के लिए BMDM और चढ़ाना को अलग करना

  1. 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटेड अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर, प्रत्येक डिश को हटा दें, और बीएमडीएम संस्कृति मीडिया (तालिका 1) के अतिरिक्त 5-8 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर पर लौटें।
  2. प्रारंभिक चढ़ाना के बाद 5 वें दिन, प्रत्येक डिश को हटा दें, और बीएमडीएम संस्कृति मीडिया के अतिरिक्त 5 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर पर लौटें।
  3. दिन 6 पर, प्रत्येक पकवान को हटा दें, और मीडिया को छोड़ दें। फिर, एक बार धोने के लिए 10 एमएल ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) पीबीएस जोड़ें। ठंडे पीबीएस धोने के 10 एमएल को छोड़ दें। फिर, प्रत्येक पकवान में 10 एमएल ताजा, ठंडा पीबीएस जोड़ें, और प्रत्येक डिश को 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  4. एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके, धीरे से सभी तीन व्यंजनों से कोशिकाओं को एक 50 एमएल ट्यूब में स्क्रैप करें। धीरे से 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 270 × ग्राम पर कोशिकाओं को घुमाएं; फिर, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  5. 20 एमएल बीएमडीएम कल्चर मीडिया जोड़ें, गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें, और कोशिकाओं की गिनती करें।
    नोट: यह उम्मीद की जाती है कि प्रत्येक माउस लगभग 60 × 10 6-100 × 106 कोशिकाओं का उत्पादन करेगा।
  6. वांछित इन विट्रो सेल मृत्यु / सूजन उत्तेजना परख के लिए 12-वेल प्लेट लेआउट की योजना बनाएं। 1 × 106 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से प्लेट करने की योजना बनाएं। प्रत्येक नियोजित उत्तेजना के लिए, कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियां शामिल करें, और कैसपेज़ लाइसिस बफर में काटे जाने वाले कुओं के एक सेट को प्लेट करें और आरआईपीए बफर में काटे जाने वाले कुओं का दूसरा सेट।
  7. प्लेट 1 × 12-वेल प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से बीएमडीएम कल्चर मीडिया के 1 एमएल में 106 कोशिकाएं हैं। कोशिका मृत्यु / सूजन मूल्यांकन के लिए आगे बढ़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में रात भर कल्चर करें। रात भर इनक्यूबेशन के बाद, मीडिया को हटा दें, और कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक कुएं में 1 एमएल गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस जोड़ें।
  8. पीबीएस वॉश को हटा दें, और एंटीबायोटिक दवाओं (यदि गैर-जीवाणु उत्तेजना ओं का प्रदर्शन कर रहे हैं) या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना बीएमडीएम उत्तेजना मीडिया (यदि जीवाणु उत्तेजना का प्रदर्शन कर रहे हैं) के साथ बीएमडीएम उत्तेजना मीडिया के 500 μL जोड़ें (तालिका 1)। इन विट्रो उत्तेजना / संक्रमण के लिए चरण 4 पर जाने से पहले 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

4. कोशिकाओं को उत्तेजित या संक्रमित करना

चेतावनी: इस प्रोटोकॉल में शामिल एजेंट संभावित रूप से रोगजनक हैं और संबंधित संस्थागत और सरकारी अधिकारियों से अनुमोदन के साथ जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल 2) सुविधा में उचित सावधानियों के साथ संभाला जाना चाहिए।

  1. ब्याज के ट्रिगर के साथ सेल मृत्यु को सक्रिय करने के लिए बीएमडीएम को प्रोत्साहित करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी), हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस 1 (एचएसवी 1), Francisella novicida, और एलपीएस + एटीपी का उपयोग चित्रण के लिए किया जाता है, लेकिन अन्य ट्रिगर्स का उपयोग किया जा सकता है।
    1. उदाहरण उत्तेजना 1: आईएवी (ए / प्यूर्टो रिको / 8/34, एच 1 एन 1 [पीआर 8]) के साथ संक्रमित (हॉफमैन एट अल .75 के अनुसार निर्मित; संक्रमण की बहुलता के लिए वायरल टिटर [एमओआई] निर्धारण की गणना एमडीसीके कोशिकाओं में एक पट्टिका परख द्वारा की जाती है):
      1. समीकरण (1) और समीकरण (2) का उपयोग करके 20 पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर संक्रमण के लिए आवश्यक वायरस की मात्रा की गणना करें:
        Equation 1
        Equation 2
        Equation 3
      2. BMDMs से मीडिया को हटा दें और पीबीएस के 500 μL के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें। प्रत्येक कुएं में हीट-इनएक्टिवेटेड (एचआई)-एफबीएस के बिना उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में आईएवी (20 एमओआई) का 450 μL जोड़ें। अवशोषण की अनुमति देने के लिए एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
      3. प्लेटों को हटा दें और HI-FBS के 50 μL जोड़ें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस करें। कुल 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. उदाहरण उत्तेजना 2: एचएसवी 1 (एचएफ स्ट्रेन; पहले वर्णित44 के रूप में सुसंस्कृत) के साथ संक्रमित; एमओआई निर्धारण के लिए वायरल टिटर की गणना वेरो कोशिकाओं में एक पट्टिका परख द्वारा की जाती है:
      1. उपरोक्त आईएवी संक्रमण अनुभाग में चरण 1 से समीकरण (1) और समीकरण (2) का उपयोग करके 10 पीएफयू के एमओआई पर संक्रमण के लिए आवश्यक वायरस की मात्रा की गणना करें।
        Equation 4
      2. BMDMs से मीडिया को हटा दें। प्रत्येक कुएं में HI-FBS के बिना उच्च-ग्लूकोज DMEM में HSV1 (MOI 10) के 450 μL जोड़ें। अवशोषण की अनुमति देने के लिए एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
      3. प्लेटों को निकालें, और HI-FBS के 50 μL जोड़ें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस करें। कुल 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. उदाहरण उत्तेजना 3: बीबीएल ट्रिप्टिकेस सोया ब्रोथ में 37 डिग्री सेल्सियस पर एरोबिक परिस्थितियों में पहले वर्णित44 के रूप में एफ. नोविसिडा (यू 112 स्ट्रेन) के साथ संक्रमित करें, जो रात भर 0.2% एल-सिस्टीन के साथ पूरक है। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1: 10 के अनुपात में बैक्टीरिया को ताजा माध्यम में एक और 4 घंटे के लिए 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) लेने से पहले एक रिक्त माध्यम के रूप में ताजा माध्यम का उपयोग करके। 1 का ओडी मान 10 9 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) प्रति एमएल× 1 के बराबर है।
      1. समीकरण (3) और समीकरण (4) का उपयोग करके 50 सीएफयू के एमओआई पर संक्रमण के लिए आवश्यक एफ नोविसिडा की मात्रा की गणना करें:
        Equation 5
        Equation 6
        Equation 7
      2. BMDM से मीडिया को हटा दें। प्रत्येक कुएं में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना BMDM उत्तेजना मीडिया में F. Novicida (MOI 50) का 500 μL जोड़ें। अवशोषण की अनुमति देने के लिए एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
      3. गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं और 500 μL BMDM उत्तेजना मीडिया जोड़ें जिसमें 50 μg / mL gentamycin हो। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस करें। रात भर इनक्यूबेट करें (16 घंटे)।
    4. उदाहरण उत्तेजना 4: एलपीएस + एटीपी के साथ उत्तेजित करें।
      1. BMDM से मीडिया को हटा दें। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ BMDM उत्तेजना मीडिया के 500 μL जोड़ें (तालिका 1) जिसमें प्रत्येक कुएं में 100 ng/ mL LPS होता है। एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 3.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
      2. प्रत्येक कुएं में 0.5 एम एटीपी स्टॉक समाधान (तालिका 1) का 5 μL जोड़ें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस करें। 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

5. कैसपेज़ वेस्टर्न ब्लोट्स के लिए उपयोग किए जाने वाले संयुक्त सुपरनैटेंट और प्रोटीन लाइसेट को इकट्ठा करना

  1. 4 घंटे, 12 घंटे, या 16 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद (विशिष्ट समय उपयोग किए गए ट्रिगर पर निर्भर है), इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें।
  2. सतह पर तैरने वाले के 150 μL को हटा दें; अन्य सुपरनैटेंट विश्लेषणों (जैसे, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख [एलिसा]) के लिए इसे त्याग दें या सहेजें। शेष सतह पर तैरने वाले को न निकालें।
  3. कैस्पेज़ लाइसिस बफर + 100 μL के 4x SDS बफर प्रति अच्छी तरह से संयोजन करके प्रोटीन संग्रह समाधान बनाएं (तालिका 1)। फिर, प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण के 150 μL जोड़ें।
  4. प्रत्येक कुएं के लिए, मिश्रण को ऊपर और नीचे लिटाएं ताकि लाइस्ड कोशिकाओं और सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा किया जा सके। पाइपिंग करते समय, कोशिकाओं को बाधित करने के लिए पिपेट टिप के साथ कुएं के निचले हिस्से को भी खुरचें। स्क्रैपिंग और पिपेटिंग के बाद, प्रोटीन लाइसेट को लेबल 1.5 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करें।
  5. 12 मिनट के लिए सभी ट्यूबों को 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए हीट ब्लॉक का उपयोग करें।
  6. कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 14,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके किसी भी अघुलनशील घटकों को गोली मार दें।
    नोट: यह एक विराम बिंदु है - संयुक्त सुपरनैटेंट और प्रोटीन लाइसेट से प्रोटीन को या तो तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या -20 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने तक या -80 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि उपयोग करने के लिए तैयार न हो।

6. कैसपेज़ पश्चिमी धब्बों के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन लाइसेट को इकट्ठा करना

  1. 4 घंटे, 12 घंटे, या 16 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद (विशिष्ट समय उपयोग किए गए ट्रिगर पर निर्भर है), इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें। सभी सतह पर तैरने वाले को हटा दें; इसे अन्य सतह पर तैरने वाले विश्लेषणों (जैसे, एलिसा) के लिए छोड़ दें या सहेजें।
  2. 2x RIPA स्टॉक समाधान (तालिका 1) को विआयनीकृत पानी की समान मात्रा में पतला करके 1x RIPA बफर बनाएं। फिर, एक फॉस्फेट अवरोधक टैबलेट और एक प्रोटीज अवरोधक टैबलेट जोड़ें, और उन्हें घुलने दें। प्रत्येक कुएं में 1x RIPA बफर का 150 μL और 4x SDS का 50 μL जोड़ें।
  3. प्रत्येक कुएं के लिए, लाइस्ड कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए मिश्रण को ऊपर और नीचे करें। पाइपिंग करते समय, कोशिकाओं को बाधित करने के लिए पिपेट टिप के साथ कुएं के निचले हिस्से को भी खुरचें। स्क्रैपिंग और पिपेटिंग के बाद, प्रोटीन लाइसेट को लेबल 1.5 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करें।
  4. 12 मिनट के लिए सभी ट्यूबों को 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए हीट ब्लॉक का उपयोग करें।
  5. कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 14,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके किसी भी अघुलनशील घटकों को गोली मार दें।
    नोट: यह एक विराम बिंदु है - प्रोटीन लाइसेट को या तो तुरंत उपयोग किया जा सकता है या उपयोग करने के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

7. ऊपर दिए गए चरणों का पालन करते हुए या ऊतक होमोजेनेट्स से बीएमडीएम से एकत्र किए गए लाइसेट का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता करना

नोट: यदि ऊतक का उपयोग किया जाता है, तो इसे हाथ से या शक्ति-संचालित ऊतक होमोजेनाइज़र के माध्यम से समरूप किया जा सकता है। सिम्पसन76 द्वारा प्रोटोकॉल ऊतक समरूपीकरण का विस्तृत विवरण प्रदान करता है।

  1. 1x रनिंग बफर तैयार करें: 5x रनिंग बफर स्टॉक (तालिका 1) के 200 mL और 800 mL विआयनीकृत पानी को मिलाएं। प्रत्येक प्रयोग से ठीक पहले इस 1x रनिंग बफर को बनाएं।
  2. 10 कुओं के साथ 12% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) पॉलीक्रिलामाइड जेल के साथ वैद्युतकणसंचलन तंत्र तैयार करें। वैद्युतकणसंचलन तंत्र को 1x रनिंग बफर के साथ भरें। फिर, जेल कंघी को हटा दें।
    नोट: प्रत्येक नमूने के लिए कैस्पेज़ -1, कैसपेज़ -11, कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -7, कैसपेज़ -8 और कैसपेज़ -9 का विश्लेषण करने के लिए, छह जैल की आवश्यकता होगी।
  3. कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -7, और कैसपेज़ -8 ब्लोट्स के लिए, कैसपेज़ लाइसिस बफर या ऊतक होमोजेनेट में संयुक्त सुपरनैटेंट और प्रोटीन लाइसेट के 30 μL का उपयोग करने की योजना है। कैसपेज़ -11 और कैसपेज़ -9 ब्लोट्स के लिए, आरआईपीए बफर या ऊतक होमोजेनेट में प्रोटीन लाइसेट के 20 μL का उपयोग करने की योजना बनाएं। यदि नमूने -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए हैं, तो उन्हें पहले बर्फ पर पिघलाएं।
  4. सभी नमूनों के लिए, 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, और लोड होने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 14,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, धीरे-धीरे प्रत्येक लेन में नमूने के 20 या 30 μL लोड करें। अन्य लेन में किसी भी नमूने के अतिप्रवाह से बचें। एक बार में सभी छह कैसपेस का मूल्यांकन करने के लिए, छह जैल में से प्रत्येक में उपयुक्त नमूने लोड करने के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग करें।
  5. वैद्युतकणसंचलन तंत्र को बिजली स्रोत से कनेक्ट करें। फिर, जेल रन शुरू करने के लिए 20 मिनट के लिए पावर को 80 वी पर सेट करें, और फिर 45-60 मिनट के लिए पावर को 130 वी में समायोजित करें।
  6. डाई फ्रंट को ध्यान से देखें, और जब डाई फ्रंट जेल के निचले हिस्से में हो, लेकिन अभी तक जेल से बाहर नहीं धकेला गया है तो पावर ऑफ करें।
  7. जब जेल चल रहा है, तो 700 एमएल विआयनीकृत पानी, 10 एक्स ट्रांसफर बफर स्टॉक के 100 एमएल (तालिका 1), और मेथनॉल के 200 एमएल के संयोजन से 1 एक्स ट्रांसफर बफर तैयार करें। हर बार 1x घोल को ताजा बनाएं।
    नोट: सावधानी बरतें क्योंकि मेथनॉल ज्वलनशील है। खुली लपटों से दूर स्थानांतरण बफर तैयारी करें।
  8. जेल रिलीजर का उपयोग करके वैद्युतकणसंचलन तंत्र से जेल को धीरे से हटा दें।
  9. प्रत्येक जेल के लिए एक स्थानांतरण स्टैक सेट करें।
    1. 1 मिनट के लिए मेथनॉल में भिगोकर पीवीडीएफ झिल्ली को सक्रिय करें।
    2. फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों, जेल और पीवीडीएफ झिल्ली को 5 मिनट के लिए ट्रांसफर बफर में पहले से गीला करें। इस 5 मिनट के दौरान पीवीडीएफ झिल्ली और जेल को अलग-अलग कंटेनरों में रखें इनक्यूबेशन।
    3. अर्ध-शुष्क प्रणाली पर स्थानांतरण स्टैक को इकट्ठा करें। नीचे प्लैटिनम एनोड साइड पर शुरू करते हुए, फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा, पीवीडीएफ झिल्ली, जेल और अंत में फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखें। परतों के बीच हवा के बुलबुले को धीरे से रोल आउट करें या दबाएं, और सिस्टम के शीर्ष को बंद करें। सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले सुरक्षा कवर सुरक्षित है।
  10. पावर स्रोत से कनेक्ट करें। 45 मिनट के लिए पावर को 25 वी पर सेट करें।
  11. स्थानांतरण पूरा होने के बाद, स्थानांतरण स्टैक को अलग करें, और झिल्ली को इकट्ठा करें; इसे एक चौकोर पेट्री डिश (इनक्यूबेशन ट्रे) में रखें।
  12. 5% (wt/vol) स्किम दूध के घोल के 15 एमएल को जोड़कर झिल्ली अवरोधन करें (तालिका 1)। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर एक रॉकिंग शेकर पर झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह एक विराम बिंदु है - झिल्ली को या तो 1 घंटे के बाद हटाया जा सकता है या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉकिंग समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है।
  13. 1 घंटे या रात भर इनक्यूबेशन के बाद, ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें। पतला एंटीबॉडी समाधान (एंटी-कैसपेज़ -1 एंटीबॉडी, एंटी-कैस्पेज़ -11 एंटीबॉडी, संयुक्त एंटी-कैसपेज़ -3 और एंटी-क्लीवर कैसपेज़ -3 एंटीबॉडी, संयुक्त एंटी-कैसपेज़ -7 और एंटी-क्लीवर कैसपेज़ -7 एंटीबॉडी, संयुक्त एंटी-कैसपेज़ -8 और एंटी-क्लीवर कैसपेज़ -8 एंटीबॉडी, या एंटी-कैस्पेज़ -9 एंटीबॉडी) के 10 एमएल जोड़ें (तालिका 1)। कमरे के तापमान पर 2 घंटे या रात भर (16 घंटे) के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर एक रॉकिंग शेकर पर रखें।
  14. एंटीबॉडी समाधान एकत्र करें (3x तक पुन: उपयोग करें या इसे छोड़ दें), और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर रॉकिंग शेकर पर झिल्ली में 15 एमएल टीबीएसटी (तालिका 1) जोड़कर धोएं। TBST को छोड़ दें।
  15. चरण 14 के बाद टीबीएसटी के 15 एमएल के साथ धोने को कुल 3x के साथ दोहराएं।
  16. पतला द्वितीयक एचआरपी-संयुग्मित एंटीबॉडी समाधान के 10 एमएल जोड़ें (कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -7, कैसपेज़ -8, या कैस्पेज़ -9 के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी से सना धब्बा के लिए एंटी-खरगोश; कैसपेज़ -1 के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी से सना धब्बा के लिए एंटी-माउस; कैसपेज़ -11 के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी से सना धब्बा के लिए एंटी-चूहा) (तालिका 1)। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर एक रॉकिंग शेकर पर इनक्यूबेट करें।
  17. एंटीबॉडी समाधान को हटा दें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर रॉकिंग शेकर पर झिल्ली में 15 एमएल टीबीएसटी जोड़कर धो लें। TBST को छोड़ दें।
  18. चरण 17 के बाद टीबीएसटी के 15 एमएल के साथ धोने को कुल 3x के बाद दोहराएं।
  19. झिल्ली में उच्च संवेदनशीलता एचआरपी सब्सट्रेट के 10 एमएल जोड़ें। इसे 1 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर बैठने दें।
  20. सब्सट्रेट से झिल्ली को हटा दें। निचली स्थिति में डाली गई एक्सेसरी व्हाइट ट्रांस ट्रे के साथ एक केमिल्यूमिनेसेंस इमेजर का उपयोग करके सीधे इमेजिंग पर आगे बढ़ें। ऑटो एक्सपोज़र मोड (आमतौर पर ~ 1-2 मिनट एक्सपोजर समय) का उपयोग करके झिल्ली को उजागर करें।
  21. कैसपेज़ -9 या कैसपेज़ -11 ब्लोटिंग (यानी, आरआईपीए लाइसेट नमूने के साथ एक झिल्ली) से झिल्ली का उपयोग करके, 10 एमएल स्ट्रिपिंग बफर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर एक रॉकिंग शेकर पर इनक्यूबेट करें।
  22. स्ट्रिपिंग बफर को छोड़ दें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर रॉकिंग शेकर पर झिल्ली में 15 एमएल टीबीएसटी जोड़कर धो लें। TBST को छोड़ दें।
  23. चरण 22 के बाद टीबीएसटी के 15 एमएल के साथ धोने को कुल 3x के बाद दोहराएं।
  24. 5% (wt/vol) स्किम दूध के घोल के 15 एमएल को जोड़कर झिल्ली अवरोधन करें। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर एक रॉकिंग शेकर पर झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह एक विराम बिंदु है - झिल्ली को या तो 1 घंटे के बाद हटाया जा सकता है या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉकिंग समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है।
  25. 1 घंटे या रात भर इनक्यूबेशन के बाद, ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें। पतला एंटी-β-एक्टिन (एचआरपी-संयुग्मित) एंटीबॉडी समाधान के 10 एमएल जोड़ें। 1.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर एक रॉकिंग शेकर पर रखें।
  26. एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम से 70 आरपीएम पर रॉकिंग शेकर पर झिल्ली में 15 एमएल टीबीएसटी जोड़कर धो लें। TBST को छोड़ दें।
  27. चरण 26 के बाद टीबीएसटी के 15 एमएल के साथ धोने को कुल 3x के साथ दोहराएं।
  28. झिल्ली में मानक-संवेदनशीलता एचआरपी सब्सट्रेट के 10 एमएल जोड़ें। इसे 1 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर बैठने दें।
  29. निचली स्थिति में डाली गई एक्सेसरी व्हाइट ट्रांस ट्रे के साथ एक केमिल्यूमिनेसेंस इमेजर का उपयोग करके सीधे इमेजिंग पर आगे बढ़ें। ऑटो एक्सपोज़र मोड (आमतौर पर <1 मिनट एक्सपोजर समय) का उपयोग करके झिल्ली को उजागर करें।

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Representative Results

पीएनोप्टोसिस कई जीवाणु, वायरल और फंगल संक्रमण और अन्य भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ-साथ कैंसर कोशिकाओंमें 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 के जवाब में देखा गया है . इन मामलों में, कई कैसपेस के सक्रियण की सूचना दी गई है। इस प्रोटोकॉल में उदाहरण उत्तेजनाओं का उपयोग करते हुए, जो पीएनोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए जाने जाते हैं, अर्थात् आईएवी, एचएसवी 1, और एफ नोविसिडा 44,48,50,51,53,57, यह उम्मीद की जाती है कि दरार को कई कैसपेस के सक्रियण के लिए एक सरोगेट के रूप में देखा जा सकता है (चित्रा 2 ए-सी) ). इसके अतिरिक्त, एलपीएस + एटीपी को नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है; यह संयोजन एक कैनोनिकल एनएलआरपी 3 ज्वलनशील ट्रिगर है जो कैसपेज़ -1 सक्रियण को प्रेरित करने की उम्मीद है। कैसपेज़ -1 के सक्रियण को पी 45 प्रो-फॉर्म के दरार से पी 20 सक्रिय रूप (चित्रा 2 डी) के दरार द्वारा इनमें से प्रत्येक ट्रिगर के जवाब में देखा जा सकता है। पी 20 फॉर्म तब जीएसडीएमडी को छोड़ सकता है और कोशिका मृत्यु19 शुरू कर सकता है।

इसी तरह, एपोप्टोटिक सर्जक कैसपेज़, कैसपेज़ -8 की सक्रियता देखी जाती है, जैसा कि पी 18 क्लीवर फॉर्म (चित्रा 2 ए-डी) की उपस्थिति से दर्शाया गया है। कैसपेज़ -9 की कमजोर सक्रियता भी इन उत्तेजनाओं के साथ कुछ मामलों में देखी जा सकती है (चित्रा 2 ए-डी)। इन आरंभकर्ताओं के डाउनस्ट्रीम में, प्रभावक कैसपेस कैसपेज़ -3 और कैसपेज़ -7 सक्रिय होते हैं; इस सक्रियण को कैसपेज़ -3 के पी 17/19 क्लीवर रूप और कैसपेज़ -7 (चित्रा 2 ए-डी) के पी 20 क्लीवर रूप के गठन के रूप में देखा जाता है। आज तक, कैसपेज़ -11 के सक्रियण का पीएनोप्टोसिस में व्यापक रूप से मूल्यांकन नहीं किया गया है, लेकिन इसकी सक्रियता कुछसंदर्भों में देखी गई है। कैसपेज़ -11 एक महत्वपूर्ण भड़काऊ कैसपेज़ बना हुआ है, और इसकी सक्रियता को इसके पी 26 क्लीवर रूप के गठन से देखा जा सकता है। जबकि कुछ निम्न-स्तरीय कैसपेज़ -11 सक्रियण देखा जाता है, आईएवी, एचएसवी 1, या एफ नौविसिडा संक्रमण या एलपीएस + एटीपी उत्तेजना (चित्रा 2 ए-डी) के जवाब में मजबूत सक्रियण नहीं देखा जाता है।

अपस्ट्रीम पीएनोप्टोसिस सेंसर की कमी वाली कोशिकाएं पीएनोप्टोसिस-उत्प्रेरण उत्तेजनाओं के जवाब में कोशिका मृत्यु से नहीं गुजरती हैं। उदाहरण के लिए, आईएवी संक्रमण ZBP1-PANoptosome 48,51,53,57 के गठन को प्रेरित करता है, और Zbp1-/- कोशिकाओं को आईएवी संक्रमण के दौरान कोशिका मृत्यु से बचाया जाता है (चित्रा 3 ए)। इसी तरह, एचएसवी 1 और एफ नौविसिडा संक्रमण एआईएम 2-पीएनोप्टोसोम44 के गठन को प्रेरित करते हैं, और एआईएम 2-/ - कोशिकाएं इन संक्रमणों के जवाब में मजबूत कोशिका मृत्यु से गुजरने में विफल रहती हैं (चित्रा 3 बी, सी)। उन कोशिकाओं में जो पीएनोपोसोम गठन के लिए आवश्यक अपस्ट्रीम सेंसर में कमी होती है, कैसपेस की सक्रियता काफी कम हो जाती है या यहां तक कि समाप्त हो जाती है, जैसा कि पश्चिमी धब्बों (चित्रा 2 ए-सी) में क्लीवर बैंड की तीव्रता में कमी से देखा जा सकता है। इसी तरह, अपस्ट्रीम ज्वलनशीलता सेंसर की कमी वाली कोशिकाओं को उनकी संबंधित उत्तेजनाओं के जवाब में कोशिका मृत्यु से बचाया जाता है, और एनएलआरपी 3-/- कोशिकाएं एलपीएस + एटीपी (चित्रा 3 डी) के जवाब में कोशिका मृत्यु से नहीं गुजरती हैं। ये कोशिकाएं कम कैसपेस सक्रियण भी दिखाती हैं (चित्रा 2 डी)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का अवलोकन। अस्थि मज्जा को अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में अलग और विभेदित किया जाता है। इन कोशिकाओं को तब एक ट्रिगर के साथ उत्तेजित किया जाता है जो जन्मजात प्रतिरक्षा संकेतन और कोशिका मृत्यु को सक्रिय करता है, जैसे कि संक्रमण या एक भड़काऊ उत्तेजना। कोशिकाओं के सक्रिय होने और पीसीडी से गुजरना शुरू करने के बाद, लाइसेट को पश्चिमी सोख्ता द्वारा एकत्र और विश्लेषण किया जाता है ताकि उनके सक्रिय रूपों में कैसपेज़ दरार की निगरानी की जा सके। संक्षेप: बीएमडीएम = अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज; डीएएमपी = क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न; III-PCD = भड़काऊ जन्मजात प्रतिरक्षा क्रमादेशित कोशिका मृत्यु; पीएएमपी = रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न; पीसीडी = प्रोग्राम्ड सेल डेथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: उत्तेजनाओं के जवाब में कैसपेस का सक्रियण। सेल कल्चर लाइसेट से कैसपेस सक्रियण का मूल्यांकन इलेक्ट्रोफोरेटिक जेल पर चलने वाले उत्पादों के आकार का मूल्यांकन करके किया जा सकता है। (ए-डी) प्रो- (पी45) और एक्टिवेटेड (पी20) सीएएसपी1, प्रो- (पी43) और क्लीवर (पी36 और पी26) सीएएसपी11, प्रो- (पी35) और क्लीवर (पी17/पी19) सीएएसपी3, प्रो-(पी35) और क्लीवर (पी20) सीएएसपी7, प्रो-(पी55) और क्लीवर (पी44 और पी18) का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण या (ए) आईएवी संक्रमण, (बी) एचएसवी 1 संक्रमण, (सी) फ्रांसिसेला नोविसिडा संक्रमण, या (डी) एलपीएस + एटीपी उत्तेजना के बाद डब्ल्यूटी और एनएलआरपी 3−/- बीएमडीएम। छवियां तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि हैं। संक्षेप: बीएमडीएम = अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज; CASP1 = कैसपेज़ -1; CASP3 = कैसपेज़ -3; CASP7 = कैसपेज़ -7; CASP8 = कैसपेज़ -8; CASP9 = कैसपेज़ -9; CASP11 = कैसपेज़ -11; एचएसवी 1 = हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस 1; आईएवी = इन्फ्लूएंजा ए वायरस; एलपीएस = लिपोपॉलेसेकेराइड; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कैस्पेस सक्रियण नहीं होने पर कोशिका मृत्यु का निषेध। (ए-डी) (ए) आईएवी संक्रमण, (बी) एचएसवी 1 संक्रमण, (सी) फ्रांसिसेला नोविसिडा संक्रमण, या (डी) एलपीएस + एटीपी उत्तेजना के बाद डब्ल्यूटी और जेडबीपी 1−-, डब्ल्यूटी और एआईएम 2−/-, या डब्ल्यूटी और एनएलआरपी 3−/- बीएमडीएम में कोशिका मृत्यु की प्रतिनिधि छवियां। लाल मुखौटा मृत कोशिकाओं को दर्शाता है। स्केल सलाखों = 50 μm. छवियां तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि हैं। संक्षेप: बीएमडीएम = अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज; एचएसवी 1 = हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस 1; आईएवी = इन्फ्लूएंजा ए वायरस; एलपीएस = लिपोपॉलेसेकेराइड; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कैसपेस दरार और सक्रियण की निगरानी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप में जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी सक्रियण की सबसे व्यापक तस्वीरों में से एक प्रदान करती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आईएवी, एचएसवी 1, और एफ नौविसिडा संक्रमण और बाँझ ट्रिगर एलपीएस + एटीपी के जवाब में कैसपेस सक्रियण की निगरानी करने की रणनीति प्रदर्शित करता है, लेकिन कई अन्य उत्तेजनाएं पीसीडी को प्रेरित कर सकती हैं और इस विधि में उपयोग की जा सकती हैं, जैसा कि कई प्रकाशनों में दिखाया गया है 44,48,49,50,51,52,53,54,56, 57,58,59,60,61,62. इस प्रक्रिया का उपयोग नए ट्रिगर्स के जवाब में जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी को चिह्नित करने के लिए भी किया जा सकता है, जहां पीसीडी के तंत्र अज्ञात रहते हैं। जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से कमी वाली कोशिकाओं के संयोजन का उपयोग करना और इन आबादी के बीच विभिन्न कैसपेस के सक्रियण की तुलना करना किसी दिए गए उत्तेजना के जवाब में पीसीडी में शामिल सेंसर और नियामकों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

इस विधि को करते समय कई तकनीकी बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, जैसा कि इस विधि में कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने के लिए कोशिकाओं को संक्रमित करना या अन्यथा उत्तेजित करना शामिल है, कोशिकाओं के अलगाव के लिए और बाद की उत्तेजनाओं के लिए बाँझ तकनीकों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। संदूषण परिणामों को काफी प्रभावित कर सकता है, जिससे उत्तेजित परिस्थितियों में भी कैसपेस सक्रियण हो सकता है। इसके लिए परीक्षण करने के लिए, नमूने एकत्र करते समय और कैसपेज़ ब्लोट्स के लिए जैल लोड करते समय हमेशा एक अनियंत्रित नियंत्रण शामिल करना सबसे अच्छा है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं को चढ़ाते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को सटीक रूप से गिना जाता है और झुरमुट नहीं होता है। यदि कोशिकाओं को बंद कर दिया जाता है, तो कोशिकाओं की असंगत संख्या कुओं में जमा हो जाएगी, और एमओआई और प्रति कुएं प्रोटीन की मात्रा प्रभावित होगी। पश्चिमी धब्बों का प्रदर्शन करते समय, कैस्पेज़ के अशुद्ध, प्रो-फॉर्म के बैंडिंग पैटर्न की तुलना करना अच्छा अभ्यास है, साथ ही यह सुनिश्चित करने के लिए क्लीवर फॉर्म की निगरानी करना कि प्रोटीन की लगातार मात्रा एकत्र की गई थी और कुओं में लोड की गई थी। हालांकि, जब एक नमूने में कैसपेस सक्रियण का उच्च स्तर होता है, तो यह सिग्नल में विकृति पैदा कर सकता है, जिससे अन्य नमूनों में प्रो-फॉर्म में कमी प्रतीत होती है, जैसा कि हम इस उदाहरण में एचएसवी 1 और एफ नोविसिडा संक्रमण में कैसपेज़ -8 के साथ दिखाते हैं (चित्रा 2 बी, सी)। यह संभवतः झिल्ली पर एक विशेष स्थान पर बहुत अधिक प्रोटीन की उपस्थिति के कारण असमान एंटीबॉडी बाइंडिंग के कारण होता है, या इमेजिंग कलाकृतियों के कारण होता है जहां सब्सट्रेट एक ही नमूने में ओवरसैचुरेटेड हो जाता है। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने या इमेजिंग सेटिंग्स को समायोजित करने से इस समस्या को दूर करने में मदद मिल सकती है। इसके अतिरिक्त, पहली बार संक्रमण या उत्तेजना स्थापित करते समय, प्रत्येक कैसपेस की सक्रियता कब होती है, यह पहचानने के लिए टाइम कोर्स का उपयोग करना फायदेमंद हो सकता है। एक समय पाठ्यक्रम के बिना, डेटा भ्रामक हो सकता है, क्योंकि चयनित व्यक्तिगत समय बिंदु बहुत जल्दी या बहुत देर से हो सकता है, जिससे कैसपेस सक्रियण छूट जाता है और इसकी भागीदारी के बारे में अनुचित निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं। इसी तरह, संक्रामक उत्तेजनाओं के लिए विभिन्न एमओआई का परीक्षण उन विशिष्ट स्थितियों की पहचान करने के लिए भी फायदेमंद हो सकता है जिनके तहत कैसपेज़ (एस) सक्रिय होते हैं।

वैद्युतकणसंचलन चरण को भी परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। जेल पर नमूने लोड करने की तैयारी करते समय, ट्यूबों को हमेशा पहले सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए, और केवल सतह पर तैरने वाला लोड किया जाना चाहिए। अघुलनशील प्रोटीन जेल के चलने और डेटा के बाद के विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकता है। शुद्ध सेल लाइसेट के बजाय कैसपेज़ -1 का पता लगाने के लिए संयुक्त सुपरनैटेंट और प्रोटीन लाइसेट का उपयोग किया जाना चाहिए; यह पता लगाने की संवेदनशीलता में काफी सुधार करेगा। कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -7, और कैसपेज़ -8 को संयुक्त सुपरनैटेंट और प्रोटीन लाइसेट में भी अच्छी तरह से पता लगाया जा सकता है। हालांकि, कैसपेज़ -11 और कैसपेज़ -9 का पता लगाते समय सर्वोत्तम परिणामों के लिए, आरआईपीए बफर में एकत्र किया गया प्रोटीन लाइसेट पर्याप्त है। चूंकि लाइसेट के भीतर प्रत्येक कैसपेज़ की सापेक्ष बहुतायत कम हो सकती है, इसलिए जितना संभव हो उतना नमूना जेल पर लोड किया जाना चाहिए। इसके लिए पड़ोसी कुओं में अतिप्रवाह से बचने के लिए धीमी और स्थिर पाइपिंग की आवश्यकता होती है। यदि कैसपेस के प्रो- और क्लीवर रूपों के बीच खराब अलगाव देखा जाता है, तो जेल रन टाइम बढ़ाया जा सकता है, या पृथक्करण को अनुकूलित करने के लिए एक्रिलामाइड के कम प्रतिशत का उपयोग किया जा सकता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध एंटीबॉडी को माउस बीएमडीएम के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, और कई समूहों ने आनुवंशिक रूप से कमी वाली कोशिकाओं का उपयोग करके उन्हें सख्ती से परीक्षण किया है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि रुचि के आणविक भार पर कोई गैर-विशिष्ट बैंड नहीं हैं। जबकि अन्य एंटीबॉडी भी काम कर सकते हैं, यहां सूचीबद्ध लोग इष्टतम हैं। इसके अतिरिक्त, इनमें से कई एंटीबॉडी ऊतक लाइसेट में भी अच्छी तरह से काम करते हैं, और अन्य सेल आबादी को विश्लेषण के लिए विट्रो में भी एकत्र और उत्तेजित किया जा सकता है। मनुष्यों या अन्य प्रजातियों से सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करना भी संभव है लेकिन अनुकूलन के लिए एंटीबॉडी के अतिरिक्त मूल्यांकन की आवश्यकता होगी। इस तरह के आकलन के लिए मानव एंटी-कैसपेज़ -1 (1: 1,000) और मानव एंटी-कैस्पेज़ -8 (1: 1,000; सामग्री की तालिका देखें) का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, और इस प्रोटोकॉल में शामिल एक ही एंटी-कैसपेज़ -3, एंटी-क्लीवर कैसपेज़ -3, एंटी-कैस्पेज़ -7, और एंटी-क्लीवर कैसपेज़ -7 एंटीबॉडी का उपयोग माउस और मानव कोशिकाओं दोनों के लिए किया जा सकता है।

जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक अभिन्न घटक के रूप में पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पीएनोप्टोसिस सहित पीसीडी मार्गों को समझने का महत्व बढ़ रहा है, क्योंकि पीसीडी मार्गों के बीच क्रॉसस्टॉक की विशेषता तेजी से बढ़ रही है, और कोशिका मृत्यु अणुओं को रोग स्पेक्ट्रम 3,4 में चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में पहचाना जा रहा है . जन्मजात प्रतिरक्षा सेंसर की पहचान करना जारी रखना जो पीसीडी के साथ-साथ III-पीसीडी को प्रेरित करता है और कैसपेस सक्रियण के समय और अंतःक्रिया को चिह्नित करता है, जन्मजात प्रतिरक्षा पीसीडी मार्गों को चिकित्सीय रूप से संशोधित करने और रोगी के परिणामों में सुधार करने की क्षमता में सुधार करेगा।

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Disclosures

टी.डी.के. फाइजर के लिए एक सलाहकार हैं।

Acknowledgments

हम अपनी टिप्पणियों और सुझावों के लिए कन्नेगंती प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं, और हम वैज्ञानिक संपादन समर्थन के लिए जे गुललेट, पीएचडी को धन्यवाद देते हैं। हमारी प्रयोगशाला में काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित है एआई 101935, एआई 124346, एआई 160179, एआर 056296, और सीए 253095 (टी-डीके को) और अमेरिकी लेबनानी सीरियाई एसोसिएटेड चैरिटीज (टी-डीके को)। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 191
जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका मृत्यु का आकलन करने के लिए कैसपेस सक्रियण का मूल्यांकन
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Han, J. H., Tweedell, R. E.,… More

Han, J. H., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).

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