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Immunology and Infection

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Abstract

La inmunidad innata proporciona la primera línea crítica de defensa en respuesta a patógenos e insultos estériles. Un componente mecanicista clave de esta respuesta es el inicio de la muerte celular programada inmune innata (PCD) para eliminar las células infectadas o dañadas y propagar las respuestas inmunes. Sin embargo, el exceso de PCD se asocia con inflamación y patología. Por lo tanto, comprender la activación y regulación de la PCD es un aspecto central de la caracterización de las respuestas inmunes innatas y la identificación de nuevos objetivos terapéuticos en todo el espectro de la enfermedad.

Este protocolo proporciona métodos para caracterizar la activación innata de PCD inmune mediante el monitoreo de caspasas, una familia de proteasas dependientes de cisteína que a menudo se asocian con diversas vías de PCD, incluyendo apoptosis, piroptosis, necroptosis y PANoptosis. Los informes iniciales caracterizaron la caspasa-2, la caspasa-8, la caspasa-9 y la caspasa-10 como caspasas iniciadoras y la caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7 como caspasas efectoras en la apoptosis, mientras que estudios posteriores encontraron que las caspasas inflamatorias, caspasa-1, caspasa-4, caspasa-5 y caspasa-11, impulsan la piroptosis. Ahora se sabe que existe una amplia diafonía entre las caspasas y otras moléculas innatas inmunes y de muerte celular a través de las vías de PCD previamente definidas, identificando una brecha de conocimiento clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y PCD y conduciendo a la caracterización de PANoptosis. PANoptosis es una vía PCD inflamatoria inmune innata única regulada por complejos PANoptosomas, que integran componentes, incluidas las caspasas, de otras vías de muerte celular.

Aquí, se proporcionan métodos para evaluar la activación de las caspasas en respuesta a diversos estímulos. Estos métodos permiten la caracterización de las vías de PCD tanto in vitro como in vivo, ya que las caspasas activadas experimentan una escisión proteolítica que puede visualizarse mediante western blot utilizando anticuerpos óptimos y condiciones de blotting. Se ha establecido un protocolo y un flujo de trabajo de western blotting que permiten evaluar la activación de múltiples caspasas de la misma población celular, proporcionando una caracterización integral de los procesos de PCD. Este método se puede aplicar en todas las áreas de investigación en desarrollo, homeostasis, infección, inflamación y cáncer para evaluar las vías de PCD a lo largo de los procesos celulares en la salud y la enfermedad.

Introduction

El sistema inmune innato actúa como la primera línea de defensa durante la infección y en respuesta a estímulos estériles, como lesiones tisulares y alteraciones en la homeostasis. Los sensores inmunes innatos en la superficie celular y en el citoplasma responden a patrones moleculares asociados a patógenos o daños (PAMP o DAMP, respectivamente) para desencadenar vías de señalización inflamatoria y respuestas celulares. Uno de los procesos clave de la respuesta inmune innata es la inducción de la muerte celular para eliminar las células infectadas o dañadas e impulsar más respuestas inmunes innatas y adaptativas. La muerte celular programada (PCD) es un proceso altamente conservado en todas las especies, destacando su importancia evolutiva como mecanismo inmune innato.

Hay varias vías innatas inmunes de PCD que pueden activarse en todos los tipos de células. Las caspasas son una familia clave de proteasas altamente conservadas, intracelulares y dependientes de cisteína que son críticas en muchas vías de PCD, incluida la vía de apoptosis tradicionalmente no inflamatoria, así como las vías inflamatorias de PCD como piroptosis, necroptosis y PANoptosis 1,2,3,4,5 . Hay 11 caspasas humanas y 10 murinas que están bien definidas, así como pseudo-caspasas que pueden ser funcionales, y la mayoría se expresan constitutivamente como pro-caspasas monoméricas o diméricas inactivas que requieren escisión para la activación 6,7. Las caspasas también contienen dominios importantes para el reclutamiento y la formación de complejos multiproteicos. Estos incluyen el dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD), que se puede encontrar en caspasa-1, caspasa-2, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-9 y caspasa-11, o el dominio efector de muerte (DED), que se encuentra en caspasa-8 y caspasa-10. A través de su actividad proteolítica y su capacidad para formar complejos multiproteicos, las caspasas son impulsores críticos de la PCD inmune innata.

El papel de las caspasas en la PCD inmune innata se identificó por primera vez en la apoptosis, donde las caspasas iniciadoras, caspasa-2, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10, activan las caspasas verdugo, caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, para conducir a la muerte celular 8,9,10,11,12. Las caspasas del iniciador pueden activarse mediante diversas cascadas de señalización; La vía extrínseca activa la caspasa-8 a través de la señalización del receptor de muerte inducida por ligandos extracelulares, y la vía intrínseca activa la caspasa-9 a través de la interrupción de la integridad mitocondrial13. Las caspasas iniciadoras activadas escinden el enlazador separando las subunidades catalíticas grandes y pequeñas de las caspasas ejecutoras para producir sus formas activas. Las caspasas verdugos luego escinden sus sustratos para desmontar la célula, lo que resulta en la degradación del ADN, el blebbing de la membrana, la fragmentación nuclear y la liberación de cuerpos apoptóticos14,15. Este proceso típicamente termina en una forma no lítica y no inflamatoria de muerte celular cuando se combina con la eliminación inmediata de las células moribundas por eferocitosis16. Sin embargo, los defectos en la eferocitosis o la falta de células fagocíticas pueden conducir a la acumulación de células apoptóticas, que luego sufren la muerte celular lítica e inflamatoria17,18.

Se ha descubierto que las caspasas inflamatorias, incluidas la caspasa-1 (humana y ratón), la caspasa-4 y la caspasa-5 (humana) y la caspasa-11 (ratón), se activan durante una forma de PCD INMUNE INNATA INFLAMATORIA (III-PCD) llamada piroptosis. La activación de la caspasa-1 se asocia con la formación de inflamasomas, que son complejos multiproteicos que contienen un sensor inmune innato citosólico, una molécula adaptadora (proteína moteada asociada a la apoptosis que contiene una CARD [ASC]) y caspasa-1. La formación de este complejo permite que la caspasa-1 se someta a una autoproteólisis mediada por proximidad para liberar su forma activa, que puede escindir sustratos diana incluyendo las citoquinas proinflamatorias interleucina (IL)-1β e IL-18 y la molécula formadora de poros gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . La caspasa-11, la caspasa-4 y la caspasa-5 también pueden activar la GSDMD sin la formación aguas arriba del inflamasoma después de detectar PAMPs como el lipopolisacárido (LPS)19,20. Estas caspasas sufren dimerización seguida de oligomerización y autoescisión para la activación al unirse a LPS citosólico, lo que conduce a la activación no canónica del inflamasoma 24,25,26 y la activación de la caspasa-1 de manera intrínseca celular para inducir la maduración de IL-1β e IL-18 20. La maduración y liberación de estas citoquinas proinflamatorias caracterizan a estas caspasas como "inflamatorias". Además, se ha encontrado que la caspasa-8 apoptótica se localiza en el inflamasoma, proporcionando un vínculo entre los procesos apoptóticos y piroptóticos. Los estudios han encontrado que la caspasa-8 apoptótica también es crítica para regular otra forma de PCD llamada necroptosis. La pérdida de caspasa-8 da como resultado la activación espontánea de la serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por el receptor de serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por la pseudoquinasa de linaje mixto (MLKL) para impulsar la vía III-PCD de necroptosis 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Mientras que las caspasas han sido históricamente clasificadas como "apoptóticas" o "inflamatorias" en función del tipo de muerte celular que inician, la creciente evidencia sugiere que existe una amplia diafonía entre las vías innatas inmunes de PCD a través de caspasas 3,4. Por ejemplo, la caspasa-1 inflamatoria de los inflamasomas escinde la caspasa-7 apoptótica en su sitio de activación canónica34. La activación de la caspasa-1 también puede conducir a la escisión de sustratos apoptóticos como la poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1)36. En las células que carecen de GSDMD, la caspasa-1 también puede escindir la caspasa-337,38. Además, la caspasa-3 canónicamente apoptótica puede escindir la gasdermina E (GSDME) para inducir PCD17,18 y también procesa GSDMD en una forma inactiva40. Además, se ha observado el reclutamiento de caspasa-8 para el complejo inflamasoma 39,40,41,42,43,44,45, y la caspasa-8 es un regulador clave de la activación del inflamasoma canónico y no canónico 39. También hay roles superpuestos y redundantes para la caspasa-8 y la caspasa-1 en muchas condiciones inflamatorias, y la PCD inmune innata caracterizada por la activación de componentes piroptóticos, apoptóticos y necroptóticos ocurre en todo el espectro de la enfermedad 39,46,47,48,49,50.

Sobre la base de esta diafonía entre las caspasas inflamatorias y apoptóticas, se identificó una brecha clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y la PCD, lo que llevó al descubrimiento de la PANoptosis. PANoptosis es una forma única de III-PCD que se activa en respuesta a patógenos, PAMP, DAMP y alteraciones en la homeostasis y está regulada por PANoptosomas, complejos macromoleculares multifacéticos que integran componentes de otras vías de muerte celular 44,50,51,52,53,54,55 . La totalidad de los efectos biológicos en la PANoptosis no pueden explicarse individualmente por piroptosis, apoptosis o necroptosis solas 3,4,35,36,39,46,47,48, ya que la PANoptosis se caracteriza por la activación de múltiples caspasas, incluyendo caspasa-1, caspasa-11, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-3 y/o caspasa-7, dependiendo del contexto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . La PANoptosis ha sido cada vez más implicada en enfermedades infecciosas e inflamatorias, así como en cánceres y terapias contra el cáncer 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Dado el papel esencial de las caspasas a través de las vías de muerte celular, incluso en la apoptosis, la piroptosis, la necroptosis y la PANoptosis, es importante desarrollar técnicas para caracterizar su activación y comprender toda la complejidad de las vías de PCD. El protocolo aquí detalla un método para estimular las células y medir la activación posterior de las caspasas (Figura 1). Este método aprovecha la escisión proteolítica de las caspasas, que generalmente se requiere para su activación, como un medio para estudiarlas. A través de Western blotting, se pueden determinar los tamaños de las proteínas, lo que permite la visualización clara y la diferenciación de las pro-caspasas inactivas y sus formas activadas y escindidas.

Las principales ventajas de este protocolo son 1) su capacidad para evaluar la activación de múltiples caspasas en paralelo de una sola población de células endógenas para determinar con mayor precisión la activación de PCD y 2) el uso de técnicas de laboratorio relativamente simples que no requieren una capacitación extensa o equipos costosos. Los protocolos anteriores han utilizado Western blotting, reporteros fluorescentes o tinción de anticuerpos para monitorear la activación de caspasas en sobrenadantes de cultivo, lisados celulares y tisulares, células enteras mediante microscopía e in vivo 67,68,69,70,71, pero estas técnicas generalmente solo monitorean una o dos caspasas en una muestra. Además, mientras que los sustratos peptídicos sintéticos que contienen sitios de escisión de caspasa que fluorescen sobre la escisión se han utilizado para monitorear la activación de caspasas en lisados celulares o tisulares69, estos sustratos a menudo pueden ser escindidos por más de una caspasa, lo que dificulta determinar la activación específica de caspasas individuales en este sistema. Además, el uso de Western blot en lugar del uso de reporteros fluorescentes u otros métodos basados en etiquetas permite a los investigadores usar células endógenas en lugar de crear líneas celulares específicas con genes reporteros. El uso de células endógenas tiene múltiples ventajas, incluido el hecho de que muchas líneas celulares inmortalizadas son deficientes en moléculas clave de muerte celular72,73, lo que podría afectar los resultados. Además, el uso de células endógenas permite la evaluación de diversos tipos de células, como macrófagos, células epiteliales y células endoteliales, en lugar de un solo linaje. Western blot también es una técnica relativamente simple y rentable que se puede llevar a cabo en laboratorios de todo el mundo sin la necesidad de equipos grandes y costosos o configuraciones complicadas.

Este protocolo es ampliamente aplicable en toda la biología para comprender las funciones dependientes de la muerte celular e independientes de la muerte celular de las caspasas, incluidas sus funciones de andamiaje y funciones en otras vías de señalización inflamatoria74. La aplicación de este método permite un enfoque unificado en el estudio de las vías innatas inmunes de PCD y la señalización inflamatoria a través de enfermedades y afecciones, y este protocolo se puede utilizar para identificar procesos regulatorios críticos y conexiones mecanicistas que informarán el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas.

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Protocol

El uso y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del St. Jude Children's Research Hospital.

1. Preparación de las soluciones

  1. Prepare los medios acondicionados para L929.
    1. Placa 1 × 106 células L929 (ver Tabla de materiales) en un matraz de cultivo de tejidos de 182cm2 que contiene 50 ml de medios de cultivo L929 (ver Tabla 1 para la preparación del medio).
    2. Cultivar las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2.
    3. Después de 7 días, recoja el sobrenadante y filtre con un filtro de 0,45 μm. Preparar 50 ml de alícuotas (almacenar las alícuotas congeladas a -80 °C durante un máximo de 1 año).
  2. Preparar 500 ml de medios de cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea (DMO) (Tabla 1).
  3. Preparar 500 mL de medios de estimulación BMDM (Tabla 1).
  4. Preparar 500 mL de medios para la infección (Tabla 1).
  5. Preparar 100 mL de tampón Tris 1 M (Tabla 1).
  6. Prepare 4 tampón de dodecil sulfato de sodio (SDS) (Tabla 1).
  7. Preparar 1 mL de 1 M de 1,4-ditiothreitol (DTT, Tabla 1).
  8. Preparar 40 mL de tampón de lisis de caspasa (Tabla 1).
  9. Preparar 100 mL de tampón Tris de 1,5 M (Tabla 1).
  10. Preparar 100 ml de una solución de SDS al 10% (peso / vol) (Tabla 1).
  11. Preparar 50 ml de un tampón 2x del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Tabla 1).
  12. Prepare una solución de 5 mg/ml de LPS (Tabla 1).
  13. Preparar una solución de ATP 0,5 M (Tabla 1).
  14. Prepare las soluciones de Western Blotting.
    1. Preparar 1 L de 5x existencias reguladoras en funcionamiento (Tabla 1).
    2. Preparar 1 L de 10x existencias reguladoras de transferencia (Tabla 1).
    3. Preparar 1 L de solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST, Tabla 1).
    4. Prepare 100 ml de una solución bloqueadora de leche descremada al 5% (peso / vol) (Tabla 1).
  15. Preparar las soluciones primarias de anticuerpos.
    1. Preparar 10 ml de anticuerpo primario caspasa-1 (Tabla 1).
    2. Preparar 10 mL de anticuerpo primario caspasa-11 (Tabla 1).
    3. Preparar 10 mL de anticuerpo primario caspasa-3 (Tabla 1).
    4. Preparar 10 mL de anticuerpo primario caspasa-7 (Tabla 1).
    5. Preparar 10 mL de anticuerpo primario caspasa-8 (Tabla 1).
    6. Preparar 10 mL de anticuerpo primario caspasa-9 (Tabla 1).
    7. Preparar 10 ml de anticuerpo primario de β-actina conjugado con HRP (Tabla 1).
  16. Preparar las soluciones de anticuerpos secundarios.
    1. Preparar 10 mL de anticuerpo secundario anti-conejo (Tabla 1).
    2. Preparar 10 ml de anticuerpo secundario anti-ratón (Tabla 1).
    3. Preparar 10 ml de anticuerpo secundario anti-rata (Tabla 1).

2. Aislar macrófagos derivados de la médula ósea

NOTA: Para este protocolo, se pueden usar ratones de tipo salvaje de 6-10 semanas de edad con vías de PCD intactas o ratones mutantes con los reguladores, efectores o moléculas de interés de PCD eliminados o alterados.

  1. Eutanasia a un ratón en una cámara deCO2 con un caudal que desplaza el 10% -30% del volumen de la jaula por minuto durante 2-3 min. Luego, realice un método de eutanasia secundaria, como la dislocación cervical. Siga todas las pautas y regulaciones adicionales específicas de instalaciones, instituciones y gobiernos cuando corresponda.
  2. Disecciona el ratón para recuperar los huesos de las patas traseras.
    1. Fije el ratón en su espalda para que el abdomen quede expuesto. Rocíe con etanol al 70% (vol/vol) para esterilizar las patas traseras y el abdomen.
      PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable. Manténgalo alejado de llamas abiertas.
    2. Use tijeras para hacer una incisión en la línea media del abdomen; Continúe cortando hacia las piernas para hacer visibles los fémures.
    3. Tome la pierna trasera derecha y retire la piel del cuerpo hacia la línea media. Separe la pierna del cuerpo cortando los músculos aductores hacia la línea media; Luego, corte la pierna entre la articulación de la cadera y la columna vertebral. A continuación, corte la pata distal al tobillo y elimine el exceso de tejido del hueso pelando la piel y usando tijeras ligeramente abiertas para quitar el tejido de la pantorrilla.
    4. Coloque la pierna sobre una toalla empapada en etanol al 70% (vol/vol) y disecte la tibia y el fémur.
      1. Sujete la tibia y el fémur cada uno con un conjunto separado de fórceps. Presione suavemente la tibia contra la dirección natural de la articulación de la rodilla; Esto hará que la tibia se rompa en la rodilla.
      2. Use los fórceps y las tijeras de disección si es necesario para eliminar cualquier tejido colgante restante. Guarde la tibia para usarla más tarde colocándola sobre la toalla empapada en etanol.
      3. Recoge el fémur de la misma manera, rompiendo la rodilla.
    5. Repita los pasos 3 y 4 anteriores para la pierna izquierda para extraerla del cuerpo y diseccionar la tibia y el fémur.
    6. Rocíe los huesos con etanol al 70% (vol/vol).
    7. Limpie los huesos colocándolos sobre una toalla limpia empapada en etanol al 70% (vol/vol), apretando la parte carnosa en la toalla y frotando la toalla contra el hueso para eliminar el exceso de tejido.
  3. Una vez que ambos fémures y ambas tibias estén limpios, rocíe los cuatro huesos con etanol al 70% (vol / vol). Recoja los huesos en una placa de Petri estéril y enjuáguelos con 10 ml de medios de cultivo BMDM agitando suavemente los medios en el plato.
  4. Llene una jeringa de 10 ml con 10 ml de medios de cultivo de DMO frescos y coloque una aguja de 25 G.
  5. Levante la tibia con fórceps; Luego, corte la articulación del tobillo en un ángulo de ~ 45 °.
  6. Enjuague la médula ósea de la tibia.
    1. Sostenga la tibia sobre un tubo de 50 ml, con el extremo estrecho de la tibia apuntando hacia abajo. Dispense el medio sobre la tibia de la jeringa llena.
    2. Inserte la aguja (suavemente al principio) en el extremo superior de la médula y dispense el medio.
    3. Retire la aguja y vuelva a insertarla. Use empujes cortos de alta presión para dispensar el medio y mover la aguja hacia la médula.
    4. Una vez que el medio comienza a fluir desde la parte inferior del hueso, use empujes cortos y de alta presión para continuar eliminando las células. Controle el color del hueso durante este proceso, y cuando el hueso sea blanco, deséchelo.
    5. Haga esto para ambas tibias.
  7. Repita los pasos 5 y 6 anteriores para los fémures, cortando en la articulación de la cadera como la tibia se cortó en la articulación del tobillo. Use el mismo tubo de 50 ml para recolectar los medios de cultivo de BMDM a medida que se lava la médula.
  8. Una vez que se hayan lavado los cuatro huesos, aspire la médula y los medios del tubo de 50 ml hacia arriba y hacia abajo 3 veces a través de una aguja de 18 G en una jeringa de 10 ml, enjuagando los lados del tubo cada vez para dispersar la médula.
  9. Ajuste el volumen final en el tubo de 50 ml a 30 ml con medios de cultivo BMDM y asegúrese de que las células estén completamente suspendidas.
  10. Utilice un filtro celular de 70 μm para filtrar los medios de cultivo de DMMO del tubo de 50 ml.
  11. Coloque la suspensión celular resultante, que contiene las células progenitoras de la médula ósea, en tres placas de cultivo de tejido de 150 mm agregando 10 ml (o ~ 20 × 106 células) a cada una. Luego, agregue 10 ml adicionales de medios de cultivo BMDM a cada plato. Incubar en una incubadora humidificada a 37 °C.

3. Diferenciación de los BMDM y chapado para los experimentos

  1. Incubar las células progenitoras de médula ósea plateadas a 37 °C durante 3 días. Luego, retire cada plato y agregue 5-8 ml adicionales de medios de cultivo de DMMO (Tabla 1). Volver a la incubadora a 37 °C.
  2. El día 5 después del emplatado inicial, retire cada plato y agregue 5 ml adicionales de medios de cultivo de DMM. Volver a la incubadora a 37 °C.
  3. El día 6, retire cada plato y deseche los medios. Luego, agregue 10 ml de PBS frío (almacenado a 4 ° C) para lavar una vez. Deseche los 10 ml de lavado frío de PBS. Luego, agregue 10 ml de PBS fresco y frío a cada plato e incube cada plato en hielo durante 5 minutos.
  4. Con un raspador celular, raspe suavemente las células de los tres platos en un tubo de 50 ml. Girar suavemente las células a 270 × g a 4 °C durante 5 min; Luego, deseche el sobrenadante.
  5. Agregue 20 ml de medios de cultivo de DMO, pipetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender el pellet y contar las células.
    NOTA: Se espera que cada ratón produzca aproximadamente 60 × 10 6-100 × 106 celdas.
  6. Planifique el diseño de la placa de 12 pocillos para el ensayo deseado de estimulación de la muerte celular / inflamación in vitro . Planifique colocar 1 × 106 celdas por pocillo. Para cada estimulación planificada, incluya al menos tres réplicas biológicas, y coloque un conjunto de pozos para ser cosechados en tampón de lisis de caspasa y un segundo conjunto de pozos para ser cosechados en tampón RIPA.
  7. Placa 1 × 106 células en 1 mL de medios de cultivo de BMDM por pocillo en placas de 12 pocillos. Cultivar durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C antes de proceder a la evaluación de muerte celular/inflamación. Después de la incubación durante la noche, retire el medio y agregue 1 ml de PBS tibio (37 ° C) a cada pocillo para lavar las células.
  8. Retire el lavado PBS y agregue 500 μL de medios de estimulación de DMO con antibióticos (si realiza estimulaciones no bacterianas) o medios de estimulación de DMM sin antibióticos (si realiza estimulaciones bacterianas) (Tabla 1). Incubar durante 2 h antes de pasar al paso 4 para la estimulación/infección in vitro .

4. Estimular o infectar las células

PRECAUCIÓN: Los agentes incluidos en este protocolo son potencialmente patógenos y deben manipularse con las precauciones adecuadas en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) con la aprobación de las autoridades institucionales y gubernamentales pertinentes.

  1. Estimular las BMDMs para activar la muerte celular con el disparador de interés.
    NOTA: Para los fines de este protocolo, virus de la influenza A (IAV), virus del herpes simple 1 (HSV1), Francisella novicida, y LPS + ATP se utilizan para la ilustración, pero se pueden utilizar otros disparadores.
    1. Ejemplo de estimulación 1: Infectar con IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (construido según Hoffmann et al.75; el título viral para la determinación de multiplicidad de infección [MOI] se calcula mediante un ensayo de placa en células MDCK):
      1. Calcule el volumen de virus necesario para la infección en una multiplicidad de infección (MOI) de 20 unidades formadoras de placa (PFU) utilizando la ecuación (1) y la ecuación (2):
        Equation 1
        Equation 2
        Equation 3
      2. Retire los medios de los BMDM y lave las células una vez con 500 μL de PBS. Agregue 450 μL de IAV (20 MOI) en DMEM alto en glucosa sin inactivado por calor (HI)-FBS a cada pocillo. Incubar las placas a 37 °C durante 1 h en una incubadora humidificada para permitir la absorción.
      3. Retire las placas y agregue 50 μL de HI-FBS. Devolver las placas a la incubadora a 37 °C. Incubar durante un total de 12 h.
    2. Ejemplo de estimulación 2: Infectar con HSV1 (cepa HF; cultivada como se describió anteriormente44; el título viral para la determinación de MOI se calcula mediante un ensayo de placa en células Vero):
      1. Calcule el volumen de virus necesario para la infección a un MOI de 10 PFU utilizando la ecuación (1) y la ecuación (2) del paso 1 en la sección de infección por IAV anterior.
        Equation 4
      2. Retire los medios de los BMDM. Agregue 450 μL de HSV1 (MOI 10) en DMEM alto en glucosa sin HI-FBS a cada pocillo. Incubar las placas a 37 °C durante 1 h en una incubadora humidificada para permitir la absorción.
      3. Retire las placas y agregue 50 μL de HI-FBS. Devolver las placas a la incubadora a 37 °C. Incubar durante un total de 12 h.
    3. Ejemplo de estimulación 3: Infectar con F. novicida (cepa U112; cultivada como se describió anteriormente44 en condiciones aeróbicas a 37 °C en caldo de soja BBL tripticasa suplementado con L-cisteína al 0,2% durante la noche. Luego, subcultive las bacterias en una proporción de 1:10 a 37 ° C durante otras 4 h en medio fresco antes de tomar la densidad óptica (OD) a 600 nm utilizando el medio fresco como un espacio en blanco. Un valor de DO de 1 equivale a 1 × 109 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml.)
      1. Calcule el volumen de F. novicida necesario para la infección a un MOI de 50 UFC utilizando la ecuación (3) y la ecuación (4):
        Equation 5
        Equation 6
        Equation 7
      2. Retire los medios de los BMDM. Agregue 500 μL de F. novicida (MOI 50) en medios de estimulación de BMDM sin antibióticos a cada pocillo. Incubar las placas a 37 °C durante 4 h en una incubadora humidificada para permitir la absorción.
      3. Lavar las células tres veces con PBS calentado (37 °C) y añadir 500 μL de medios de estimulación BMDM que contengan 50 μg/ml de gentamicina. Devolver las placas a la incubadora a 37 °C. Incubar durante la noche (16 h).
    4. Ejemplo de estimulación 4: Estimular con LPS + ATP.
      1. Retire los medios de los BMDM. Agregue 500 μL de medios de estimulación de BMDM con antibióticos (Tabla 1) que contengan 100 ng / ml de LPS a cada pocillo. Incubar las placas a 37 °C durante 3,5 h en una incubadora humidificada.
      2. Añadir 5 μL de solución madre de ATP 0,5 M (Tabla 1) a cada pocillo. Devolver las placas a la incubadora a 37 °C. Incubar durante 30 min.

5. Recolección del sobrenadante combinado y el lisado de proteínas que se utilizará para los Western blots de caspasa

  1. Después de 4 h, 12 h o 16 h de incubación (el momento específico depende del gatillo utilizado), retire la placa de la incubadora.
  2. Retire 150 μL del sobrenadante; deseche o guarde esto para otros análisis de sobrenadantes (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas [ELISA]). No retire el sobrenadante restante.
  3. Crear la solución de recolección de proteínas combinando 50 μL de tampón de lisis de caspasa + 100 μL de tampón SDS 4x por pocillo (Tabla 1). Luego, agregue 150 μL de la mezcla a cada pocillo.
  4. Para cada pocillo, pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo para recoger las células lisadas y el sobrenadante. Durante el pipeteo, también raspe el fondo del pozo con la punta de la pipeta para interrumpir las células. Después de raspar y pipetear, recoger el lisado de proteínas en tubos marcados de 1,5 ml.
  5. Utilice un bloque de calor para calentar todos los tubos a 100 °C durante 12 min.
  6. Granular cualquier componente insoluble centrifugando a 14.500 × g durante 30 s a temperatura ambiente.
    NOTA: Este es un punto de pausa: la proteína del sobrenadante combinado y los lisados de proteínas puede usarse inmediatamente o almacenarse a -20 ° C durante un máximo de 2 meses o a -80 ° C durante un máximo de 6 meses hasta que esté listo para usar.

6. Recolección del lisado proteico que se utilizará para los Western blots de caspasa

  1. Después de 4 h, 12 h o 16 h de incubación (el momento específico depende del gatillo utilizado), retire la placa de la incubadora. Retire todo el sobrenadante; deseche o guarde esto para otros análisis de sobrenadante (por ejemplo, ELISA).
  2. Crear el tampón 1x RIPA diluyendo la solución madre 2x RIPA (Tabla 1) en un volumen igual de agua desionizada. Luego, agregue una tableta inhibidora de la fosfatasa y una tableta inhibidora de la proteasa, y deje que se disuelvan. Agregue 150 μL de 1x tampón RIPA y 50 μL de 4x SDS a cada pocillo.
  3. Para cada pocillo, pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo para recoger las células lisadas. Durante el pipeteo, también raspe el fondo del pozo con la punta de la pipeta para interrumpir las células. Después de raspar y pipetear, recoger el lisado de proteínas en tubos marcados de 1,5 ml.
  4. Utilice un bloque de calor para calentar todos los tubos a 100 °C durante 12 min.
  5. Granular cualquier componente insoluble centrifugando a 14.500 × g durante 30 s a temperatura ambiente.
    NOTA: Este es un punto de pausa: los lisados de proteínas pueden usarse inmediatamente o almacenarse a -20 ° C o -80 ° C hasta que estén listos para usar.

7. Realizar Western blot utilizando los lisados recogidos de los BMDM siguiendo los pasos anteriores o de homogeneizados tisulares

NOTA: Si se utiliza tejido, se puede homogeneizar a mano o a través de un homogeneizador de tejido accionado por potencia. El protocolo de Simpson76 proporciona una descripción detallada de la homogeneización tisular.

  1. Prepare 1x tampón de funcionamiento: Combine 200 ml de la reserva reguladora de 5x (Tabla 1) y 800 ml de agua desionizada. Haga este búfer de ejecución 1x justo antes de cada experimento.
  2. Preparar el aparato de electroforesis con un gel de poliacrilamida al 12% (peso/vol) con 10 pocillos. Llene el aparato de electroforesis con un búfer de funcionamiento 1x. Luego, retire el peine de gel.
    NOTA: Para analizar caspasa-1, caspasa-11, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8 y caspasa-9 para cada muestra, se necesitarán seis geles.
  3. Para las manchas caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7 y caspasa-8, planee usar 30 μL del sobrenadante combinado y lisado de proteínas en el tampón de lisis de caspasa o en el homogeneizado tisular. Para las manchas de caspasa-11 y caspasa-9, planee usar 20 μL del lisado de proteínas en el tampón RIPA o en el homogeneizado tisular. Si las muestras se han almacenado a -20 °C o -80 °C, descongélelas primero en hielo.
  4. Para todas las muestras, calentar a 100 °C durante 5 min y centrifugar a 14.500 × g durante 30 s a 4 °C antes de cargar. Luego, cargue lentamente 20 o 30 μL de la muestra en cada carril. Evite que cualquier muestra se desborde en los otros carriles. Para evaluar las seis caspasas a la vez, utilice el mismo procedimiento para cargar las muestras apropiadas en cada uno de los seis geles.
  5. Conecte el aparato de electroforesis a la fuente de alimentación. Luego, ajuste la alimentación a 80 V durante 20 minutos para comenzar la carrera de gel, y luego ajuste la potencia a 130 V durante 45-60 min.
  6. Observe cuidadosamente el frente del tinte y apague la alimentación cuando el frente del tinte esté en la parte inferior del gel pero aún no haya sido expulsado del gel.
  7. Mientras el gel está funcionando, prepare 1x tampón de transferencia combinando 700 ml de agua desionizada, 100 ml de la reserva reguladora de transferencia 10x (Tabla 1) y 200 ml de metanol. Haga que la solución 1x sea fresca cada vez.
    NOTA: Tenga cuidado ya que el metanol es inflamable. Realice la preparación del búfer de transferencia lejos de llamas abiertas.
  8. Retire el gel del aparato de electroforesis suavemente utilizando el liberador de gel.
  9. Configure una pila de transferencia para cada gel.
    1. Active una membrana de PVDF sumergiéndola en metanol durante 1 min.
    2. Moje previamente dos trozos de papel de filtro, el gel y la membrana de PVDF en tampón de transferencia durante 5 min. Mantenga la membrana de PVDF y el gel en recipientes separados durante esta incubación de 5 minutos.
    3. Ensamble la pila de transferencia en el sistema semiseco. Comenzando en el lado inferior del ánodo de platino, coloque una pieza de papel de filtro, la membrana de PVDF, el gel y, finalmente, una pieza de papel de filtro. Extienda suavemente o presione las burbujas de aire entre las capas y cierre la parte superior del sistema. Asegúrese de que la cubierta de seguridad esté asegurada antes de continuar.
  10. Conéctelo a la fuente de alimentación. Ajuste la alimentación a 25 V durante 45 min.
  11. Una vez completada la transferencia, desmonte la pila de transferencia y recoja la membrana; Colóquelo en una placa de Petri cuadrada (bandeja de incubación).
  12. Realice el bloqueo de la membrana agregando 15 ml de una solución de leche descremada al 5% (peso / vol) (Tabla 1). Incubar la membrana en un agitador oscilante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente durante 1 h.
    NOTA: Este es un punto de pausa: la membrana puede retirarse después de 1 h o almacenarse en una solución de bloqueo a 4 °C durante la noche.
  13. Después de 1 h o durante la noche de incubación, retire la solución de bloqueo. Agregue 10 ml de la solución de anticuerpos diluidos (anticuerpo anti-caspasa-1, anticuerpo anti-caspasa-11, anti-caspasa-3 combinado y anti-caspasa-3 escindido, anticuerpo combinado anti-caspasa-7 y anti-caspasa-7 escindido, anticuerpo combinado anti-caspasa-8 y anticuerpo anti-caspasa-8 escindido, o anticuerpo anti-caspasa-9) (Tabla 1). Colocar en una coctelera oscilante a 50 rpm a 70 rpm para incubar a temperatura ambiente durante 2 h o a 4 °C durante la noche (16 h).
  14. Recoja la solución de anticuerpos (reutilice hasta 3 veces o deséchela) y lávela agregando 15 ml de TBST (Tabla 1) a la membrana en un agitador oscilante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. Descarte el TBST.
  15. Repita el lavado con 15 ml de TBST siguiendo el paso 14 un total de 3x.
  16. Añadir 10 ml de la solución diluida de anticuerpos secundarios conjugados con HRP (anti-conejo para blots teñidos con anticuerpos primarios contra caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8 o caspasa-9; anti-ratón para blots teñidos con anticuerpos primarios contra caspasa-1; anti-rata para blots teñidos con anticuerpo primario contra caspasa-11) (Tabla 1). Incubar en una coctelera oscilante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente durante 1 h.
  17. Retire la solución de anticuerpos y lávela agregando 15 ml de TBST a la membrana en un agitador oscilante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. Descarte el TBST.
  18. Repita el lavado con 15 ml de TBST siguiendo el paso 17 un total de 3x.
  19. Agregue 10 ml del sustrato HRP de alta sensibilidad a la membrana. Déjelo reposar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 minuto.
  20. Retire la membrana del sustrato. Proceda directamente a la imagen, utilizando un generador de imágenes de quimioluminiscencia con la bandeja trans blanca accesoria insertada en la posición inferior. Exponga la membrana utilizando el modo de exposición automática (generalmente ~ 1-2 min de tiempo de exposición).
  21. Usando la membrana de la caspasa-9 o caspasa-11 secante (es decir, una membrana con muestras de lisado RIPA), agregue 10 ml de tampón de extracción e incube en un agitador oscilante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente durante 5 min.
  22. Deseche el tampón de extracción y lave agregando 15 ml de TBST a la membrana en un agitador oscilante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. Descarte el TBST.
  23. Repita el lavado con 15 ml de TBST siguiendo el paso 22 un total de 3x.
  24. Realice el bloqueo de la membrana agregando 15 ml de una solución de leche descremada al 5% (peso / vol). Incubar la membrana en un agitador oscilante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente durante 1 h.
    NOTA: Este es un punto de pausa: la membrana puede retirarse después de 1 h o almacenarse en una solución de bloqueo a 4 °C durante la noche.
  25. Después de 1 h o durante la noche de incubación, retire la solución de bloqueo. Agregue 10 ml de la solución diluida de anticuerpos anti-β-actina (HRP-conjugado). Colocar en un agitador oscilante a 50 rpm a 70 rpm para incubar a temperatura ambiente durante 1,5 h.
  26. Retire la solución de anticuerpos y lave agregando 15 ml de TBST a la membrana en un agitador oscilante a 50 rpm a 70 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. Descarte el TBST.
  27. Repita el lavado con 15 ml de TBST siguiendo el paso 26 un total de 3x.
  28. Agregue 10 ml del sustrato HRP de sensibilidad estándar a la membrana. Déjelo reposar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 minuto.
  29. Proceda directamente a la imagen, utilizando un generador de imágenes de quimioluminiscencia con la bandeja trans blanca accesoria insertada en la posición inferior. Exponga la membrana utilizando el modo de exposición automática (generalmente <1 min de tiempo de exposición).

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Representative Results

La PANoptosis se ha observado en respuesta a numerosas infecciones bacterianas, virales y fúngicas y otros estímulos inflamatorios, así como en células cancerosas 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 . En estos casos, se ha reportado la activación de múltiples caspasas. Utilizando las estimulaciones de ejemplo en este protocolo que se sabe que inducen PANoptosis, a saber, IAV, HSV1 y F. novicida 44,48,50,51,53,57, se espera que se pueda observar la escisión como un sustituto para la activación de caspasas múltiples (Figura 2A-C ). Además, LPS + ATP se incluye como control; esta combinación es un desencadenante canónico del inflamasoma NLRP3 que se espera que induzca la activación de la caspasa-1. La activación de la caspasa-1 se puede visualizar en respuesta a cada uno de estos desencadenantes por la escisión de la pro-forma p45 a la forma activa p20 (Figura 2D). La forma p20 puede entonces escindir GSDMD e iniciar la muerte celular19.

Del mismo modo, se observa la activación de la caspasa iniciadora apoptótica, caspasa-8, como lo denota la presencia de la forma escindida p18 (Figura 2A-D). La débil activación de la caspasa-9 también se puede observar en algunos casos con estos estímulos (Figura 2A-D). Aguas abajo de estos iniciadores, se activan las caspasas efectoras caspasa-3 y caspasa-7; esta activación se observa como la formación de la forma hendida p17/19 de caspasa-3 y la forma escindida p20 de caspasa-7 (Figura 2A-D). Hasta la fecha, la activación de la caspasa-11 no ha sido ampliamente evaluada en la PANoptosis, pero su activación ha sido observada en algunos contextos54. La caspasa-11 sigue siendo una caspasa inflamatoria importante, y su activación se puede observar por la formación de su forma escindida p26. Si bien se observa cierta activación de caspasa-11 de bajo nivel, no se observa una activación robusta en respuesta a la infección por IAV, HSV1 o F. novicida o estimulación LPS + ATP (Figura 2A-D).

Las células que carecen de sensores de PANoptosis aguas arriba no sufren muerte celular en respuesta a estímulos inductores de PANoptosis. Por ejemplo, la infección por IAV induce la formación del ZBP1-PANoptosoma 48,51,53,57, y las células Zbp1-/- están protegidas de la muerte celular durante la infección por IAV (Figura 3A). Del mismo modo, las infecciones por HSV1 y F. novicida inducen la formación del AIM2-PANoptosoma44, y las células Aim2-/- no experimentan una muerte celular robusta en respuesta a estas infecciones (Figura 3B, C). En las células que son deficientes en el sensor aguas arriba necesario para la formación de PANoptosomas, la activación de las caspasas se reduce significativamente o incluso se elimina, como se puede ver por la reducción en la intensidad de las bandas escindidas en los Western blots (Figura 2A-C). Del mismo modo, las células que carecen de sensores inflamasómicos aguas arriba están protegidas de la muerte celular en respuesta a sus respectivos estímulos, y las células Nlrp3-/- no experimentan muerte celular en respuesta a LPS + ATP (Figura 3D). Estas células también muestran una activación reducida de la caspasa (Figura 2D).

Figure 1
Figura 1: Visión general del procedimiento experimental. La médula ósea se aísla y se diferencia en macrófagos derivados de la médula ósea. Estas células se estimulan con un desencadenante que activa la señalización inmune innata y la muerte celular, como una infección o un estímulo inflamatorio. Después de que las células se activan y comienzan a someterse a PCD, el lisado se recoge y se analiza mediante Western blot para controlar la escisión de la caspasa a sus formas activas. Abreviaturas: BMDMs = macrófagos derivados de la médula ósea; DAMPs = patrones moleculares asociados al daño; III-PCD = muerte celular inmunitaria innata inflamatoria programada; PAMPs = patrones moleculares asociados a patógenos; PCD = muerte celular programada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Activación de caspasas en respuesta a estímulos. La activación de la caspasa a partir de lisados de cultivo celular se puede evaluar evaluando el tamaño de los productos que funcionan con un gel electroforético. (A-D) Análisis inmunoblot de CASP1 pro- (P45) y activado (P20), pro- (P43) y escindido (P36 y P26) CASP11, pro- (P35) y escindido (P17/P19) CASP3, pro- (P35) y escindido (P20) CASP7, pro- (P55) y escindido (P44 y P18) CASP8, y pro- (P49) y escidido (P37) CASP9 en WT y Zbp1−/−, WT y Aim2−/−, o WT y Nlrp3−/− DMO después de (A) infección por IAV, (B) infección por HSV1, (C) infección por Francisella novicida o (D) estimulación LPS + ATP. Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes. Abreviaturas: BMDMs = macrófagos derivados de la médula ósea; CASP1 = caspasa-1; CASP3 = caspasa-3; CASP7 = caspasa-7; CASP8 = caspasa-8; CASP9 = caspasa-9; CASP11 = caspasa-11; HSV1 = virus del herpes simple 1; IAV = virus de la influenza A; LPS = lipopolisacárido; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Inhibición de la muerte celular cuando no se produce la activación de la caspasa. (A-D) Imágenes representativas de muerte celular en WT y Zbp1−/−, WT y Aim2−/−, o WT y Nlrp3−/− BMDMs después de (A) infección por IAV, (B) infección por HSV1, (C) infección por Francisella novicida, o (D) estimulación LPS + ATP. La máscara roja denota células muertas. Barras de escala = 50 μm. Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes. Abreviaturas: BMDMs = macrófagos derivados de la médula ósea; HSV1 = virus del herpes simple 1; IAV = virus de la influenza A; LPS = lipopolisacárido; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 

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Discussion

El monitoreo de la escisión y activación de la caspasa proporciona una de las imágenes más completas de la activación innata de PCD inmune como parte de la respuesta inmune innata. El protocolo descrito aquí demuestra una estrategia para monitorizar la activación de caspasas en respuesta a infecciones por IAV, HSV1 y F. novicida y el desencadenante estéril LPS+ATP, pero muchos otros estímulos pueden inducir PCD y podrían ser utilizados en este método, como se ha demostrado en varias publicaciones 44,48,49,50,51,52,53,54,56, 57,58,59,60,61,62. Este procedimiento también se puede utilizar para caracterizar la PCD inmune innata en respuesta a nuevos desencadenantes, donde los mecanismos de PCD siguen siendo desconocidos. El uso de una combinación de células de tipo salvaje y genéticamente deficientes y la comparación de la activación de diferentes caspasas entre estas poblaciones puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los sensores y reguladores involucrados en la PCD en respuesta a un estímulo dado.

Se deben considerar varios puntos técnicos al realizar este método. En primer lugar, como este método implica infectar o estimular las células para inducir la muerte celular, es importante utilizar técnicas estériles para el aislamiento de las células y para las estimulaciones posteriores. La contaminación puede afectar significativamente los resultados, lo que lleva a la activación de la caspasa incluso en condiciones no estimuladas. Para probar esto, es mejor incluir siempre un control no estimulado al recolectar las muestras y cargar geles para las manchas de caspasa. Además, al colocar las células, es importante asegurarse de que las células se cuenten con precisión y que no se produzca aglutinación. Si las células se agrupan, se depositará un número inconsistente de células en los pocillos, y el MOI y la cantidad de proteína por pocillo se verán afectados. Al realizar las manchas occidentales, es una buena práctica comparar el patrón de bandas de la forma pro-pro-típica de la caspasa, así como monitorear la forma hendida para asegurarse de que se recolectaron cantidades consistentes de proteína y se cargaron a través de los pozos. Sin embargo, cuando hay un alto nivel de activación de caspasa en una muestra, esto puede causar una distorsión en la señal, lo que lleva a lo que parece ser una reducción en la pro-forma en las otras muestras, como mostramos con caspasa-8 en HSV1 y F. novicida infecciones en este ejemplo (Figura 2B, C). Esto probablemente ocurre debido a la unión desigual de anticuerpos causada por la presencia de demasiada proteína en un punto particular de la membrana, o debido a artefactos de imagen donde el sustrato se sobresatura en una sola muestra. Ajustar las diluciones de anticuerpos o la configuración de imágenes puede ayudar a superar este problema. Además, al establecer una infección o estimulación por primera vez, el uso de un curso de tiempo puede ser beneficioso para identificar cuándo ocurre la activación de cada caspasa. Sin un curso de tiempo, los datos pueden ser engañosos, ya que el punto de tiempo individual seleccionado podría ser demasiado temprano o demasiado tarde, lo que hace que se pierda la activación de la caspasa y se saquen conclusiones inapropiadas sobre su participación. Del mismo modo, probar diferentes MOI para detectar estímulos infecciosos también puede ser beneficioso para identificar las condiciones específicas bajo las cuales se activan las caspasas.

El paso de electroforesis también requiere precisión. Al prepararse para cargar las muestras en el gel, los tubos siempre deben centrifugarse primero, y solo se debe cargar el sobrenadante. La proteína insoluble puede interferir con el funcionamiento del gel y el posterior análisis de los datos. El sobrenadante y el lisado de proteínas combinados deben utilizarse para la detección de caspasa-1 en lugar de un lisado celular puro; Esto mejorará en gran medida la sensibilidad de la detección. La caspasa-3, la caspasa-7 y la caspasa-8 también se pueden detectar bien en el sobrenadante combinado y el lisado de proteínas. Sin embargo, para obtener los mejores resultados al detectar caspasa-11 y caspasa-9, el lisado de proteínas recogido en el tampón RIPA es suficiente. Como la abundancia relativa de cada caspasa dentro del lisado puede ser baja, se debe cargar la mayor cantidad de muestra posible en el gel. Esto requiere un pipeteo lento y constante para evitar el desbordamiento en los pozos vecinos. Si se observa una separación deficiente entre las formas pro y escindida de las caspasas, el tiempo de funcionamiento del gel puede extenderse, o se puede usar un porcentaje menor de acrilamida para optimizar la separación.

Finalmente, los anticuerpos enumerados en este protocolo se han optimizado para su uso con BMDM de ratón, y varios grupos los han probado rigurosamente utilizando células genéticamente deficientes como controles para confirmar que no hay bandas no específicas en los pesos moleculares de interés. Mientras que otros anticuerpos también pueden funcionar, los que se enumeran aquí son óptimos. Además, muchos de estos anticuerpos también funcionan bien en los lisados tisulares, y otras poblaciones celulares también pueden ser recolectadas y estimuladas in vitro para su análisis. El uso de líneas celulares o células primarias de humanos u otras especies también es posible, pero requerirá una evaluación adicional de los anticuerpos para la optimización. Los anticuerpos humanos anti-caspasa-1 (1:1.000) y anti-caspasa-8 humana (1:1.000; ver Tabla de materiales) se han utilizado con éxito para tales evaluaciones, y los mismos anticuerpos anti-caspasa-3, caspasa-3, anti-caspasa-7 y caspasa-7 hendida incluidos en este protocolo se pueden usar tanto para células de ratón como humanas 44,56,62.

La importancia de comprender las vías de PCD, incluyendo piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis, como un componente integral de la respuesta inmune innata está creciendo, ya que la diafonía entre las vías de PCD se está caracterizando cada vez más, y las moléculas de muerte celular se están identificando como objetivos terapéuticos en todo el espectro de la enfermedad 3,4 . Continuar identificando los sensores inmunes innatos que inducen PCD y III-PCD y caracterizar el momento y la interacción de la activación de caspasa mejorará la capacidad de modular terapéuticamente las vías innatas de PCD inmune y mejorar los resultados del paciente.

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Disclosures

T.-D.K. es consultor de Pfizer.

Acknowledgments

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Kanneganti por sus comentarios y sugerencias, y agradecemos a J. Gullett, PhD, por el apoyo de edición científica. El trabajo en nuestro laboratorio está respaldado por las subvenciones AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 y CA253095 (a T.-D.K.) y por las Caridades Asociadas Libanesas Sirias Americanas (a T.-D.K.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer

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Inmunología e infección Número 191
Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata
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