Summary
Målet här är att skissera ett protokoll för att undersöka mekanismerna för dysbios vid hjärt-kärlsjukdom. Denna uppsats diskuterar hur man aseptiskt samlar in och transplanterar murina fekalprover, isolerar tarmar och använder "Swiss-roll" -metoden, följt av immunfärgningstekniker för att förhöra förändringar i mag-tarmkanalen.
Abstract
Tarmmikrobiota dysbios spelar en roll i patofysiologin för kardiovaskulära och metaboliska störningar, men mekanismerna är inte väl förstådda. Fekal mikrobiotatransplantation (FMT) är ett värdefullt tillvägagångssätt för att avgränsa en direkt roll för den totala mikrobioten eller isolerade arter i sjukdomspatofysiologi. Det är ett säkert behandlingsalternativ för patienter med återkommande Clostridium difficile-infektion . Prekliniska studier visar att manipulering av tarmmikrobioten är ett användbart verktyg för att studera den mekanistiska kopplingen mellan dysbios och sjukdom. Fekal mikrobiotatransplantation kan hjälpa till att belysa nya tarmmikrobiota-riktade terapier för hantering och behandling av kardiometabola sjukdomar. Trots en hög framgångsgrad hos gnagare kvarstår translationella förändringar i samband med transplantationen. Målet här är att ge vägledning för att studera effekterna av tarmmikrobiom vid experimentell hjärt-kärlsjukdom. I denna studie beskrivs ett detaljerat protokoll för insamling, hantering, bearbetning och transplantation av fekal mikrobiota i murina studier. Insamlings- och bearbetningsstegen beskrivs för donatorer från både människor och gnagare. Slutligen beskriver vi hur man använder en kombination av schweiziska rullnings- och immunfärgningstekniker för att bedöma tarmspecifik morfologi och integritetsförändringar i hjärt-kärlsjukdom och relaterade tarmmikrobiotamekanismer.
Introduction
Kardiometaboliska störningar, inklusive hjärtsjukdomar och stroke, är de ledande globala dödsorsakerna1. Fysisk inaktivitet, dålig näring, stigande ålder och genetik modulerar patofysiologin för dessa störningar. Ackumulerande bevis stöder konceptet att tarmmikrobiota påverkar kardiovaskulära och metaboliska störningar, inklusive typ 2-diabetes2, fetma3 och högt blodtryck4, vilket kan vara nyckeln till utvecklingen av nya terapeutiska metoder för dessa sjukdomar.
De exakta mekanismerna genom vilka mikrobiotan orsakar sjukdomar är fortfarande okända, och aktuella studier är mycket varierande, delvis på grund av metodologiska skillnader. Fekal mikrobiotatransplantation (FMT) är ett värdefullt tillvägagångssätt för att avgränsa en direkt roll för den totala mikrobioten eller isolerade arter i sjukdomspatofysiologi. FMT används ofta i djurstudier för att inducera eller undertrycka en fenotyp. Till exempel kan kaloriintag och glukosmetabolism moduleras genom att överföra fekal materia från en sjuk givare till en frisk mottagare 5,6. Hos människa har FMT visat sig vara ett säkert behandlingsalternativ för patienter med återkommande Clostridium difficile-infektion 7. Bevis som stöder dess användning vid hantering av hjärt-kärlsjukdomar växer fram; till exempel förbättrar FMT från mager till metabola patienter insulinkänsligheten8. Tarmdysbios är också associerad med högt blodtryck i både human- och gnagarestudier 9,10,11. FMT från möss som matas med en hög saltdiet i bakteriefria möss predisponerar mottagarna för inflammation och högt blodtryck12.
Trots den höga graden av FMT-framgång hos gnagare kvarstår translationella utmaningar. Kliniska prövningar med FMT för att behandla fetma och metaboliskt syndrom indikerar minimala eller inga effekter på dessa störningar13,14,15. Således behövs fler studier för att identifiera ytterligare terapeutiska vägar som riktar sig mot tarmmikrobioten för behandling av kardiometaboliska störningar. De flesta av de tillgängliga bevisen på tarmmikrobioten och hjärt-kärlsjukdom är associativa. Det beskrivna protokollet diskuterar hur man använder en kombination av FMT och den schweiziska rullningstekniken för att visa både ett samband mellan sjukdom och tarmmikrobiota och direkt bedöma integriteten hos alla delar av tarmen16,17,18.
Det övergripande målet med denna metod är att ge vägledning för att studera effekterna av tarmmikrobiomet vid experimentell hjärt-kärlsjukdom. Detta protokoll ger mer detaljer och viktiga överväganden i den experimentella designen för att främja fysiologisk översättning och öka noggrannheten och reproducerbarheten av resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt University's Institutional Animal Care and Use Committee godkände alla procedurer som beskrivs i detta manuskript. C57B1/6 hanmöss vid 3 månaders ålder, köpta från The Jackson Laboratory, inhystes och vårdades i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Insamling, förvaring och bearbetning av humana avföringsprover
- Samla ett avföringsprov med en steril behållare om ämnet är i kliniken. Kyl avföringsproverna vid 4 °C inom 36 timmar efter uppsamling tills de är klara för bearbetning. Alternativt kan du samla avföringsprover med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt verktyg för enkel och utökad DNA-stabilitet vid omgivningstemperatur, särskilt för hemmabruk.
- Sanera en dragskåp på biosäkerhetsnivå med en 10% blekmedelslösning eller annat desinfektionsmedel som godkänts av miljöskyddsmyndigheten.
- Ta bort avföringen från sval förvaring och ta in i dragskåpet; använd en engångsspatel för att göra ~ 1 g alikvoter och förvara i en frys på -80 ° C tills den är helt klar för bearbetning.
- Kassera alla engångsartiklar i biohazard papperskorgen. Desinficera alla ytor (huven och alla ytor som berörs av processorn) och föremål som tas bort från huven.
2. Aseptisk insamling av avföringsprover från möss
Använd aseptiska tekniker, inklusive steriliserade instrument.
- Avliva musen genom CO 2-kvävning. Spraya bröstet och sidorna av musen med 70% etanol och öppna försiktigt huden och bukhålan för att exponera mag-tarmkanalen.
- Isolera blindtarmen och använd steril kirurgisk sax för att skära den i hälften. Kortfattat exponera cecum och skär 0,5 cm proximalt från ileum och 0,5 cm distalt vid korsningen med tjocktarmen. Överför den isolerade blindtarmen till en steril petriskål.
- Använd en steril spatel för att överföra cecalinnehåll till sterila rör och förvara alikvoter i en frys19 på -80 °C.
OBS: Eftersom majoriteten av bakterierna i tarmen är anaerober kan exponering för syre skada eller döda organismerna under isoleringsproceduren i en rumsatmosfär. Således bör fekala prover isoleras i anaeroba kamrar för att upprätthålla bakteriens livskraft.
3. Transplantation av avföring
- Återsuspendera färska eller tidigare frysta fekala pellets i steril saltlösning i en 1:20 (w: v) andel och virvel tills homogeniserad.
- För homogenatet genom ett 30 μm pornylonfilter för att avlägsna stora partiklar. Centrifugera vid 79 × g i 5 minuter och samla upp supernatanten som ska användas för transplantation.
- Oral sondmatning: 100 μL flytgödsel per bakteriefri mottagarmus under 3 dagar i följd, följt av sondmatning var 3:e dag i 2 veckor. Använd konventionella möss för att studera mekanismer i tarmmikrobioten om de först har behandlats med antibiotika för att eliminera mottagarens egen endemiska mikrobiota. Administrera till exempel ceftriaxon (400 mg / kg) dagligen till mottagarmössen i 5 på varandra följande dagar genom oral sondmatning före sondmatning av fekal uppslamning.
OBS: Studier tyder på att minst 2 veckor av denna behandling är nödvändig för att framkalla kardiovaskulära förändringar, inklusive blodtryck20. - Se till att bakteriefria mottagarmöss är enhysta i gnotobiotiska filmisolatorer och matas med steril mat och vatten.
4. Systoliska blodtrycksmätningar
OBS: Gnotobiotiska möss som fick FMT från konventionellt inhysta 3 månader gamla C57Bl/6-möss implanterades med osmotiska minipumpar (Alzet, modell 2002) för infusion av lågdos angiotensin II (140 ng/kg/min) i 2 veckor. Blodtrycket övervakades varje vecka via svansmanschetten. Protokollet för implantering av osmotiska minipumpar har tidigare rapporterats21. Tail-manschetten utfördes som kort sammanfattas nedan. En icke-invasiv metod för att mäta blodtryck, såsom svansmanschett, är lämplig för FMT-studier på gnotobiotiska möss. De detaljerade stegen för hur man utför svansmanschetten har beskrivits tidigare22.
- Hämta kortfattat mössen från de gnotobiotiska isolatorerna och förvärm bakmanschettmaskinplattformen och mushållaren.
- Placera de medvetna mössen i fasthållningar på den uppvärmda plattformen och samla minst tre omgångar systoliska tryckmätningar med hjälp av svansmanschettpletysmografi. Utför följande steg nedan 3 dagar i följd före rätt mätdagar, för att träna möss att vara fasthållna för att minska stress.
- Placera försiktigt musen i den förvärmda hållaren och lämna svansen utanför. Tejpa försiktigt ner toppen utan att klämma fast den för att inte stressa musen.
- Låt musen vila i hållaren; Placera på plattformen i 3-5 minuter täckt av ett ark för att acklimatisera.
- Medelvärde mätningarna från alla omgångar för ett genomsnittligt systoliskt tryck för varje djur.
5. Bedömning av FMT till kardiovaskulära förändringar
- Efter blodtrycksmätning, avliva mössen och samla aseptiskt upp cecalinnehållet enligt beskrivningen i avsnitt 2.
- Skörda tarmarna och andra vävnader, inklusive hjärtat, aorta, lever, mesenteriska artärer och njurar, för att undersöka tarmmikrobiotans roll i kardiometabolisk hälsa. För att skörda vävnader, lokalisera vävnaden i musen och använd sax för att skära ut dem.
- Kör en metagenomisk sekvenseringsanalys på fekala prover / cecalinnehåll som samlats in från givar- och mottagarmössen för att bekräfta engraftment av tarmmikrobioten efter FMT23. Det första beviset på framgångsrik kolonisering av mikrobiota bekräftar att givaren och mottagarens mikrobiota är likartade.
- Använd Swiss-roll-tekniken (se avsnitt 6) på den skördade tarmvävnaden, i kombination med immunfärgning och histologi för att undersöka morfologiska och cellulära uttrycksförändringar24.
6. Gör tarmtarmen schweiziska rullar
- Dag 1
- I en korrekt avlivad mus sprayad med 70% etanol, dissekera mustarmen från analsidan (fixerad i retroperitoneum) till magsidan. Placera hela det isolerade mag-tarmkanalen i en petriskål som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Håll försiktigt den proximala änden från magänden och ta bort det omgivande fettet och bindväven för hand.
- Isolera tunntarmen (cephalad från bilagan) och gör en zigzag av Z-typ med varje längd. Skär sedan för att erhålla tolvfingertarmen, jejunum och ileum successivt, som tidigare beskrivits25. Isolera tjocktarmen genom att skära delen av tarmen under blindtarmen.
- Skär tolvfingertarmen, jejunum, ileum och kolon.
- Spola och tvätta tarmen inuti med PBS med en spruta och en nål med en kulspets, för att inte riva tarmarna.
- Sätt tarmen på filterpapper. Märk papperet med namnet på sektionen (t.ex. tolvfingertarmen) och sedan "P" i det övre högra hörnet för proximalt eller "D" för distalt i det högra nedre hörnet.
- Skär tarmen i längdriktningen med kulsax. Öppna tarmen på filterpapperet. Tvätta med mer PBS efter behov.
- Smörj tarmen mellan två filterpapper. Häfta filterpapperna på fyra punkter / hörn nära tarmen.
- Blötlägg i 10% formalin neutral buffertlösning (4,0 g natriumfosfat, monobasisk, 6,5 g natriumfosfat, dibasisk, 100 ml 37% formaldehyd, 900 ml destillerat vatten). Skaka med en plattformsvippa vid 5 rpm vid rumstemperatur över natten.
- Dag 2
- Förbered 2% agaros i destillerat vatten och värm med en omrörningsstång i en bägare täckt med aluminiumfolie.
- Hämta vävnaderna; Ta bort det övre filterpapperet. Rulla tarmen från den proximala sidan så att den proximala sidan går in först och rulla inåt så att lumen också är inuti på bilden. Fäst med en 30 G nål eller två, efter behov.
- Aspirera 1 ml agaros med engångsöverföringspipetter och häll agarosen på en valsad tarmsektion på en plan yta samtidigt som man undviker luftbubblor i vävnaderna.
- Låt agarosen svalna och stelna. Använd ett rakblad för att trimma den extra agarosen runt vävnadssektionen.
- Sätt tarmsektionerna i vävnadsbearbetning / inbäddningskassetter (större än de vanliga för att rymma den ökade höjden på grund av agaros). Blötlägg i 70% etanol vid 4 °C.
- Förbered paraffininbäddade vävnadsglas och fortsätt till immunfärgning, som beskrivs nedan.
7. Immunfärgning av tarmen tarmkanalen
- Avparaffinisering
- Passera genom följande bad med glas i ett galler: xylen i 3 min, färsk xylen igen i 3 min, xylen med 100% etanol (1: 1) i 3 min, 95% etanol i 3 min, 70% etanol i 3 min och 50% etanol i 3 min.
- Skölj försiktigt med kallt rinnande kranvatten. Förvara i ett bad med kranvatten.
- Hämtning av antigen
- Efter avparaffinisering, koka glasen i ett galler i ett bad av antigenhämtningsbuffert (0,01 M trinatriumcitratdihydrat vid pH 6 och 0,05% Tween-20) vid 100 ° C i 20 minuter.
- Kör under kallt kranvatten.
- Färgning
- Ta bort objektglasen från badet och placera näsduken med framsidan uppåt i en glidlåda med våtservetter/pappershanddukar i botten. Rita en kontur runt vävnaden med en hydrofob markörpenna.
- Släpp Tris-buffrad saltlösning (TBS) + 0,025% Triton X-100 på vävnaden och inkubera i 5 minuter. Upprepa det här steget.
- Blockera med TBS + 10% fetalt bovint serum (FBS) + 1% bovint serumalbumin (BSA) i 2 timmar vid rumstemperatur. Vänd objektglasen på sidan och ta bort blockeringsbufferten på en laboratorieduk.
- Tillsätt primär antikroppslösning och inkubera vid 4 °C i minst 2 timmar eller över natten. Tvätta försiktigt med TBS + 0,025% Triton X-100 genom att försiktigt pipettera ~ 200 μL över sektionen.
- Tillsätt sekundär antikroppslösning och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Skölj objektglasen 3 x 5 min med TBS genom att skölja med pipett, som i steg 7.3.4.
- Montera med monteringsmedium och täckglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stegen som beskrivs ovan sammanfattas i figur 1. Musens cecalinnehåll eller mänsklig avföring återsuspenderas i steril saltlösning för att förbereda en uppslamning för att ge till bakteriefria möss (100 μL) genom sondmatning, först i 3 på varandra följande dagar, sedan en gång var tredje dag. I slutet av protokollet mäts blodtrycket med svansmanschettmetoden, möss avlivas och vävnader skördas för bedömning av förändringar i tarmmikrobioten och kardiovaskulära och metaboliska förändringar.
Ett viktigt steg i valet av mikrobiota är att se till att sjukdomsfenotypen av intresse är närvarande hos givaren och är förknippad med dysbiotiska förändringar. Till exempel är en högsaltdiet starkt kopplad till dysbios och kardiovaskulär dysfunktion. Denna studie använde en musdonator som matades med en 8% NaCl-diet. Förändringar i tarmmikrobioten som svar på det höga saltet inkluderade en minskning av bakteriell biologisk mångfald (figur 2A), som kluster separat från den normala saltmikrobioten (figur 2B). Firmicutes / Bacteroidetes-förhållandet ökade också (figur 2C), vilket tyder på höga saltinducerade mikrobiotaförändringar (modifierad från Ferguson et al.12).
För att bestämma rollen av hög saltinducerad dysbios i predisposition för högt blodtryck utfördes FMT från högsaltmatade möss till bakteriefria möss och blodtryckssvar på en låg subpressordos av angiotensin II (Ang II) utvärderades. C57BL/6 hanmöss vid 3 månaders ålder användes i denna studie. Mottagarmöss implanterades med osmotiska minipumpar för att administrera en kontinuerlig låg dos av Ang II (140 ng / kg /) i 2 veckor i möss. Möss som fick FMT från högsaltmatade givare uppvisade en signifikant ökning av blodtrycket med Ang II-behandling jämfört med normala saltmikrobiotamottagare (figur 3). Detta resultat indikerar att FMT grundade mottagarmössen för att utveckla hypertoni12. Detaljer om svansmanschettprotokollet hos gnagare har rapporterats tidigare12,26.
Dysbiotisk tarmmikrobiota bidrar till sjukdom delvis på grund av en inflammerad och läckande tarmvägg. Således kan undersökning av tarmväggen genom immunhistokemi användas för att förhöra förändringar i specifika tarmområden i något sjukdomstillstånd även bortom FMT. Figur 4 visar att vi kan utföra immunhistokemi på ileum med hjälp av en schweizisk rullteknik och olika fläckmarkörer, såsom hematoxylin och eosin (H&E), Massons trikrom och immuncellsmarkörer såsom anti-CD3 och anti-CD68., som tidigare beskrivits 12, och apolipoprotein AI (AI), som hade ackumulerats i ileum hos proteinuriska möss (figur 4).
Bild 1: Diagram som sammanfattar protokolldesignen. Fekala prover som samlats in från en människa eller konventionell mus används för transplantation till bakteriefria möss. Förkortningar: FMT = fekal mikrobiotatransplantation; BP = blodtryck. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Möss på en högsaltdiet uppvisar tarmmikrobiota dysbios. A) Uppskattning av arters biologiska mångfald i cekalinnehåll från möss på normala saltdieter (svarta) och saltrika (röda). (B) Icke-metrisk flerdimensionell skalning visar att bakterierna från normala salt- och högsaltdietmöss bildar separata kluster. (C) Högt salt är förknippat med ett ökat förhållande mellan Firmicutes och Bacteroidetes. (***p < 0,0001, med tvåsidiga oparade Students t-test). Denna siffra är anpassad från Ferguson et al.12. Förkortningar: NMDS = icke-metrisk flerdimensionell skalning; NS = normalt salt; HS = högt salt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: FMT från högsaltmatade möss predisponerar bakteriefria möss för angiotensin II-inducerad hypertoni. Överföring av högsaltinducerad dysbiotisk tarmmikrobiota var associerad med signifikant ökat systoliskt tryck hos bakteriefria möss jämfört med möss som fick normal salttarmmikrobiota. Denna siffra är anpassad från Ferguson et al.12. Förkortningar: FMT = fekal mikrobiotatransplantation; BP = blodtryck; Ang II = angiotensin II; NS = normalt salt; HS = högt salt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunhistokemi bild som illustrerar hur man bedömer förändringar i sjukdomsmarkören i tarmen. Representativa bilder som visar apolipoprotein AI-fläck i ilea erhållen från möss som hade hyperlipidemi utan (A) eller med (B) proteinuri. Förstoring: 5x i skala 200 μm (A,B, vänster); 10x på en skala på 100 μm (A,B, höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett värdefullt tillvägagångssätt för att studera tarmmikrobiotans kausala roll i kardiovaskulär och metabolisk sjukdom är att överföra den totala mikrobioten eller välja arter av intresse till bakteriefria möss. Här beskriver vi protokoll för att samla fekala prover från människor och konventionellt inrymda möss i bakteriefria möss för att studera tarmmikrobiotans roll vid hypertensiva störningar.
Hos möss använder vi aseptiskt uppsamlat cecalinnehåll som bearbetas i en aerob kammare, och hos människor samlar avföring. FMT kan utföras omedelbart medan provet fortfarande är färskt eller snäppfryst i flytande kväve och förvaras vid -80 °C tills det är klart att användas. Om provet inte kan frysas omedelbart, till exempel när människor samlar sina prover hemma, är det viktigt att använda ett konserveringsmedel för nukleinsyror som etanol. De flesta bakterier i tarmen är anaerober; Vid beredning av fekala prover för transplantation måste det göras snabbt för att undvika att utsätta bakterier för aeroba miljöer, eftersom detta kan minska effekten på grund av en minskad mängd anaerober i blandningen27. För en longitudinell studie bör metagenomisk sekvensering av proverna utföras tillsammans för att undvika batcheffekter. Prover för FMT kan komma från en eller flera givare som slås samman och sedan distribueras till flera mottagare över experimentgrupperna.
Det är oerhört viktigt att FMT: s framgång bekräftas experimentellt innan man utforskar mekanistiska konsekvenser. Fekalt eller cecal innehåll kan analyseras genom metagenomik och likheter bedöms mellan givare och mottagare. De förväntade resultaten skulle vara liknande mikrobiell mångfald genom alfadiversitetsindex, huvudkoordinatanalys och funktionella profiler. Det är först då som slutsatsen att tarmmikrobioten spelar en viktig roll i sjukdomsetiologi kan härledas. Detta steg är ännu viktigare om studien använder konventionellt inhysta möss som förbehandlades med antibiotika för att tömma deras endemiska mikrobiota. Detta beror på att om detta steg inte lyckades kan de överlevande mottagarnas bakterier påverka sjukdomsutfallet. Framgångsrik FMT, särskilt i prekliniska studier, resulterar dock inte alltid i klinisk översättning. Således är ytterligare bekräftande steg nödvändiga för att implicera direkta tarmrelaterade mekanismer i sjukdomspatofysiologi, inklusive förändringar i tarmmorfologi med hjälp av den schweiziska rulltekniken som beskrivs här.
Det finns en etablerad direkt roll av immuncellsaktivering i utvecklingen av hypertoni, demonstrerad genom adoptiva överföringsstudier28,29,30. Även om bakteriefria möss är guldstandarden för att bestämma mikrobiotans kausala roll vid sjukdom, kan modellen vara begränsad när det gäller att studera inflammatoriska mekanismer för kardiometaboliska sjukdomar. Bakteriefria möss har ett outvecklat immunförsvar, vilket dämpar deras translationella relevans när de studerar samspelet mellan tarmmikrobiota och inflammation. Alternativt kan detta protokoll modifieras för att transplantera fekala prover till konventionella möss, efter utarmning av deras mikrobiota med antibiotika eller tarmrengöring med polyetylenglykol31,32. FMT i konventionellt inhysta möss förbehandlade med antibiotika eliminerar behovet av den strikt kontrollerade och dyra miljön som krävs för att upprätthålla bakteriefria möss. Nuvarande bevis visar att valet av antibiotika, oavsett om det är en eller en kombination, och behandlingsprotokoll varierar mellan studier33,34,35. Valet av antibiotika kommer att bestämma vilka typer av bakterier som kommer att tömmas, på grund av, variationer i verkningsmekanismer, och följaktligen påverka fenotypen. Således bör den experimentella designen ta hänsyn till de typer av bakterier som är kända för att förmedla fenotypen, och bredspektrumantibiotika, administreringssätt och regim bör väljas i enlighet därmed.
Detta protokoll har sina begränsningar. Bakteriefria möss hålls i gnotobiotiska anläggningar, vilket gör experimentella förfaranden relaterade till att studera hjärt-kärlsjukdomar utmanande. Till exempel är radiotelemetri guldstandardmetoden för att mäta blodtryck, men innebär mycket invasiva kirurgiska ingrepp. Detta är inte praktiskt för immuna, naiva bakteriefria möss. Således används en icke-invasiv svansmanschett för detta ändamål för att undvika mikrobiell kontaminering12. Typiskt, för att få relativt noggranna mätningar med hjälp av svansmanschettpletysmografi, tränas djur och acklimatiseras till plattformen före systoliska tryckmätningar. I bakteriefria FMT-studier bör forskare överväga att samla in och beräkna medelvärdet av flera mätningar36.
Dessa utmaningar kan förekomma i andra slutpunkter utöver blodtrycket. Till exempel kräver studier som undersöker beteendemässiga aspekter av hjärt-kärlsjukdomar ofta frekvent hantering och extern exponering. En studie som undersökte effekterna av en fiberrik diet i maternell fetma-inducerad kognitiv och social dysfunktion visade framgångsrik FMT hos konventionella möss som förbehandlades med antibiotika37. Studier som undersöker longitudinella kardiovaskulära svar kan överväga FMT i konventionellt inrymda möss.
Förutom att mäta blodtrycket kan djur avlivas och vävnader skördas för vidare undersökning. I synnerhet måste cecalinnehåll samlas in för att utvärderas för framgångsrik engraftment av den transplanterade mikrobioten. Detta detaljerade protokoll kommer att vägleda forskare i att studera mekanismen för tarmmikrobiomet från FMT till vävnadsnivåer och är tillämpligt på funktionella studier. Detta är viktigt eftersom det finns en enorm mängd metodologisk och för närvarande tillgänglig litteratur. För mekanistiska ändamål kan plasma, tarmar, njurar, hjärtan och andra vävnader skördas för att undersöka de involverade vägarna. De kausala effekterna av tarmmikrobioten vid sjukdom är kopplade till metaboliterna de producerar och deras frisättning i systemet på grund av en läckande tarm. Hälsan hos hela tarmen kan bedömas genom histologiska och immunfärgningsmetoder. Swiss-roll-tekniken har använts för att påvisa effekten av sjukdomen FMT hos möss12,24.
Tarmmikrobiotans bidrag i hjärt-kärlsjukdomar som högt blodtryck förblir associativt. Här presenterade vi metodologiska metoder för att samla, bearbeta och transplantera avföring från människor eller konventionella möss till bakteriefria möss. Protokollet sammanfattar ytterligare experimentella metoder och parametrar för att undersöka för att avgränsa en orsak och / eller effekt av tarmmikrobioten i kardiometabolisk hälsa. Studier bör replikeras för att säkerställa reproducerbarhet och noggrannhet av önskad fenotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter, ekonomiska eller andra, deklareras av författarna.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (till A.K.) från National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (till J.A.I.); och National Heart, Lung and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (till A.K.) och NIH-bidrag 1P01HL116263 (till V.K.). Figur 1 skapades med Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M.
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
