Summary
Målet her er at skitsere en protokol til at undersøge mekanismerne for dysbiose i hjerte-kar-sygdomme. Dette papir diskuterer, hvordan man aseptisk indsamler og transplanterer murine fækale prøver, isolerer tarmene og bruger "Swiss-roll" -metoden efterfulgt af immunfarvningsteknikker til at forhøre ændringer i mave-tarmkanalen.
Abstract
Gut mikrobiota dysbiose spiller en rolle i patofysiologien af kardiovaskulære og metaboliske lidelser, men mekanismerne er ikke godt forstået. Fækal mikrobiotatransplantation (FMT) er en værdifuld tilgang til afgrænsning af en direkte rolle af den samlede mikrobiota eller isolerede arter i sygdomspatofysiologi. Det er en sikker behandlingsmulighed for patienter med tilbagevendende Clostridium difficile-infektion . Prækliniske undersøgelser viser, at manipulation af tarmmikrobiota er et nyttigt værktøj til at studere den mekanistiske forbindelse mellem dysbiose og sygdom. Fækal mikrobiota transplantation kan hjælpe med at belyse nye tarmmikrobiota-målrettede lægemidler til styring og behandling af kardiometabolisk sygdom. På trods af en høj succesrate hos gnavere forbliver der translationelle ændringer forbundet med transplantationen. Målet her er at give vejledning i at studere virkningerne af tarmmikrobiom i eksperimentel hjerte-kar-sygdom. I denne undersøgelse beskrives en detaljeret protokol for indsamling, håndtering, behandling og transplantation af fækal mikrobiota i murine undersøgelser. Indsamlings- og behandlingstrinnene er beskrevet for både humane donorer og gnaverdonorer. Endelig beskriver vi brugen af en kombination af de schweiziske rulle- og immunfarvningsteknikker til at vurdere tarmspecifik morfologi og integritetsændringer i hjerte-kar-sygdomme og relaterede tarmmikrobiotamekanismer.
Introduction
Kardiometaboliske lidelser, herunder hjertesygdomme og slagtilfælde, er de førende globale dødsårsager1. Fysisk inaktivitet, dårlig ernæring, fremskreden alder og genetik modulerer patofysiologien af disse lidelser. Akkumulerende beviser understøtter konceptet om, at tarmmikrobiota påvirker kardiovaskulære og metaboliske lidelser, herunder type 2-diabetes2, fedme3 og hypertension4, som kan indeholde en nøgle til udviklingen af nye terapeutiske tilgange til disse sygdomme.
De nøjagtige mekanismer, hvormed mikrobiota forårsager sygdomme, er stadig ukendte, og aktuelle undersøgelser er meget variable, delvis på grund af metodologiske forskelle. Fækal mikrobiotatransplantation (FMT) er en værdifuld tilgang til afgrænsning af en direkte rolle af den samlede mikrobiota eller isolerede arter i sygdomspatofysiologi. FMT anvendes i vid udstrækning i dyreforsøg til at inducere eller undertrykke en fænotype. For eksempel kan kalorieindtag og glukosemetabolisme moduleres ved at overføre fækalt stof fra en syg donor til en sund modtager 5,6. Hos mennesker har FMT vist sig at være en sikker behandlingsmulighed for patienter med tilbagevendende Clostridium difficile-infektion 7. Der er ved at dukke beviser op til støtte for dets anvendelse i håndteringen af hjerte-kar-sygdomme; For eksempel forbedrer FMT fra patienter med magert til metabolisk syndrom insulinfølsomheden8. Tarmdysbiose er også forbundet med forhøjet blodtryk i både humane og gnaverundersøgelser 9,10,11. FMT fra mus, der fodres med en kost med højt saltindhold i kimfrie mus, disponerer modtagerne for betændelse og hypertension12.
På trods af den høje FMT-succes hos gnavere er der stadig translationelle udfordringer. Kliniske forsøg med FMT til behandling af fedme og metabolisk syndrom indikerer minimal eller ingen effekt på disse lidelser13,14,15. Således er der behov for flere undersøgelser for at identificere yderligere terapeutiske veje rettet mod tarmmikrobiota til behandling af kardiometaboliske lidelser. De fleste af de tilgængelige beviser på tarmmikrobiota og hjerte-kar-sygdomme er associative. Den beskrevne protokol diskuterer, hvordan man kan udnytte en kombination af FMT og den schweiziske rulleteknik til at vise både en sammenhæng mellem sygdom og tarmmikrobiota og direkte vurdere integriteten af alle dele af tarmtarmen16,17,18.
Det overordnede mål med denne metode er at give vejledning til undersøgelse af virkningerne af tarmmikrobiomet i eksperimentel hjerte-kar-sygdom. Denne protokol giver flere detaljer og nøgleovervejelser i det eksperimentelle design for at fremme fysiologisk oversættelse og øge stringensen og reproducerbarheden af resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt University's Institutional Animal Care and Use Committee godkendte alle procedurer beskrevet i dette manuskript. C57B1/6 hanmus i en alder af 3 måneder, købt hos The Jackson Laboratory, blev opstaldet og passet i overensstemmelse med vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr.
1. Indsamling, opbevaring og behandling af humane fækale prøver
- Saml en afføringsprøve ved hjælp af en steril beholder, hvis emnet er i klinikken. Afføringsprøverne opbevares på køl ved 4 °C inden for 36 timer efter opsamlingen, indtil de er klar til forarbejdning. Alternativt kan du indsamle afføringsprøver ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt værktøj til nem og udvidet DNA-stabilitet ved omgivelsestemperatur, især til hjemmebrug.
- Desinficer en biosikkerhedsniveau damphætte med en 10% blegemiddelopløsning eller andet Miljøstyrelsen-godkendt desinfektionsmiddel.
- Fjern afføringen fra kølig opbevaring og bring den ind i damphætten; Brug en engangsspatel til at fremstille ~1 g alikvoter og opbevar i en fryser til -80 °C, indtil den er helt klar til forarbejdning.
- Kassér alle engangsartikler i biohazard skraldespand. Desinficer alle overflader (hætte og eventuelle overflader, der berøres af processoren) og genstande, der fjernes fra emhætten.
2. Aseptisk indsamling af fækale prøver fra mus
BEMÆRK: Brug aseptiske teknikker, herunder steriliserede instrumenter.
- Aflive musen ved CO2 kvælning. Sprøjt brystet og siderne af musen med 70% ethanol og åbn forsigtigt huden og bughulen for at udsætte mave-tarmkanalen.
- Isoler cecum og brug steril kirurgisk saks til at skære den i halvdelen. Udsæt kort cecum og skær 0,5 cm proximalt fra ileum og 0,5 cm distalt ved krydset med tyktarmen. Overfør det isolerede cecum til en steril petriskål.
- Brug en steril spatel til at overføre cecalindholdet til sterile rør, og opbevar alikvoter i en -80 °C fryser19.
BEMÆRK: Da størstedelen af bakterierne i tarmen er anaerober, kan udsættelse for ilt beskadige eller dræbe organismerne under isolationsproceduren i en rumatmosfære. Således bør fækale prøver isoleres i anaerobe kamre for at opretholde bakteriens levedygtighed.
3. Fækal stoftransplantation
- Resuspender friske eller tidligere frosne fækale pellets i sterilt saltvand i en 1:20 (w: v) andel og hvirvel, indtil de er homogeniseret.
- Før homogenatet gennem et nylonfilter med 30 μm porer for at fjerne store partikler. Der centrifugeres ved 79 × g i 5 minutter, og supernatanten opsamles til transplantation.
- Oral sonde 100 μL gyllen pr. bakteriefri recipientmus i 3 på hinanden følgende dage efterfulgt af sonde hver 3. dag i 2 uger. Brug konventionelle mus til at studere mekanismer i tarmmikrobiotaen, hvis de først er blevet behandlet med antibiotika for at eliminere modtagerens egen endemiske mikrobiota. For eksempel administreres ceftriaxon (400 mg / kg) dagligt til modtagermusene i 5 på hinanden følgende dage ved oral sonde før sonde af fækal opslæmning.
BEMÆRK: Undersøgelser tyder på, at mindst 2 uger af denne behandling er nødvendig for at fremkalde kardiovaskulære ændringer, herunder blodtryk20. - Sørg for, at bakteriefrie recipientmus er enkeltanbragt i gnotobiotiske filmisolatorer og fodret med steril mad og vand.
4. Systoliske blodtryksmålinger
BEMÆRK: Gnotobiotiske mus, der fik FMT fra konventionelt opstaldede 3 måneder gamle C57Bl/6-mus, blev implanteret med osmotiske minipumper (Alzet, model 2002) til infusion af lavdosis angiotensin II (140 ng/kg/min) i 2 uger. Blodtrykket blev overvåget ugentligt via halemanchet. Protokollen for implantering af osmotiske minipumper er tidligere rapporteret21. Halemanchet blev udført som kort opsummeret nedenfor. En ikke-invasiv metode til måling af blodtryk, såsom halemanchet, er velegnet til FMT-undersøgelser i gnotobiotiske mus. De detaljerede trin til, hvordan man udfører halemanchet, er beskrevet tidligere22.
- Hent kort musene fra de gnotobiotiske isolatorer og forvarm halemanchetmaskinens platform og museholder.
- Placer de bevidste mus i fastholdelser på den opvarmede platform og saml mindst tre runder systoliske trykmålinger ved hjælp af halemanchet plethysmografi. Udfør følgende trin nedenfor på 3 på hinanden følgende dage før de korrekte måledage for at træne mus til at blive fastholdt for at reducere stress.
- Placer forsigtigt musen i den forvarmede holder og lad halen være udenfor. Tape forsigtigt toppen ned uden at klemme den for ikke at stresse musen.
- Lad musen hvile i holderen; Placer på platformen i 3-5 minutter dækket af et ark for at akklimatisere sig.
- Gennemsnittet af målingerne fra alle runder for et gennemsnitligt systolisk tryk for hvert dyr.
5. Vurdering af FMT til kardiovaskulære ændringer
- Efter blodtryksmåling aflives musene og opsamles cekalindholdet aseptisk som beskrevet i punkt 2.
- Høst tarmene og andre væv, herunder hjertet, aorta, leveren, mesenteriske arterier og nyrer, for at undersøge tarmmikrobiotaens rolle i kardiometabolisk sundhed. For at høste væv skal du lokalisere vævet i musen og bruge en saks til at udskille dem.
- Kør en metagenomisk sekventeringsanalyse på fækale prøver / cecalindhold indsamlet fra donor- og modtagermusene for at bekræfte engraftment af tarmmikrobiota efter FMT23. Det første bevis på vellykket kolonisering af mikrobiota bekræfter, at donorens og modtagerens mikrobiota er ens.
- Brug schweizerrulleteknikken (se afsnit 6) på det høstede tarmvæv kombineret med immunfarvning og histologi til at undersøge morfologiske og cellulære ekspressionsændringer24.
6. Gør tarmtarm schweiziske ruller
- Dag 1
- I en korrekt aflivet mus sprøjtet med 70% ethanol, dissekeres musetarmen fra analsiden (fastgjort i retroperitoneum) til mavesiden. Placer hele den isolerede mave-tarmkanal i en petriskål indeholdende fosfatbufret saltvand (PBS). Hold forsigtigt den proksimale ende fra mavenden og fjern det omgivende fedt og bindevæv med hånden.
- Isoler tyndtarmen (cephalad fra tillægget) og lav en Z-type zigzag med hver længde. Skær derefter for at opnå tolvfingertarmen, jejunum og ileum successivt, som tidligere beskrevet25. Isoler tyktarmen ved at skære sektionen af tarmen under cecum.
- Skær tolvfingertarmen, jejunum, ileum og tyktarm.
- Skyl og vask tarmen inde ved hjælp af PBS med en sprøjte og en nål med en kuglespids for ikke at rive tarmen.
- Sæt tarmen på filterpapir. Mærk papiret med navnet på sektionen (f.eks. Tolvfingertarmen) og derefter 'P' i øverste højre hjørne for proksimal eller 'D' for distal i nederste højre hjørne.
- Klip tarmen i længderetningen med en saks med kuglespids. Åbn tarmen på filterpapiret. Vask med mere PBS efter behov.
- Sandwich tarmen mellem to filterpapirer. Hæft filterpapiret fire steder / hjørner nær tarmen.
- Sug i 10% formalinneutral bufferopløsning (4,0 g natriumphosphat, monobasisk, 6,5 g natriumphosphat, dibasisk, 100 ml 37% formaldehyd, 900 ml destilleret vand). Ryst ved hjælp af en platformvipper ved 5 o / min ved stuetemperatur natten over.
- Dag 2
- Forbered 2% agarose i destilleret vand og opvarm med en omrøringsstang i et bægerglas dækket med aluminiumsfolie.
- Hent vævene; Strip det øverste filterpapir. Rul tarmen fra den proksimale side, så den proksimale side først går ind, og rul indad, så lumen også er inde på diaset. Pin med en 30 G nål eller to efter behov.
- Opsug 1 ml agarose ved hjælp af engangspipetter med kandidatoverførsel, og hæld agarosen på en rullet tarmsektion på en plan overflade, samtidig med at du undgår luftbobler i vævene.
- Lad agarosen afkøle og størkne. Brug et barberblad til at trimme den ekstra agarose omkring vævssektionen.
- Sæt tarmsektionerne i vævsbehandlings- / indlejringskassetter (større end de almindelige for at imødekomme den øgede højde på grund af agarose). 70% ethanol lægges i blød ved 4 °C.
- Forbered paraffinindlejrede vævsglas og fortsæt til immunfarvning som beskrevet nedenfor.
7. Immunfarvning af tarmens tarmkanal
- Afparaffinisering
- Gå gennem følgende bade med dias i et stativ: xylen i 3 min, frisk xylen igen i 3 min, xylen med 100% ethanol (1: 1) i 3 min, 95% ethanol i 3 min, 70% ethanol i 3 min og 50% ethanol i 3 min.
- Skyl forsigtigt med koldt rindende vand fra hanen. Opbevares i et bad med ledningsvand.
- Antigen hentning
- Efter afparaffinisering koges objektglassene i et stativ i et bad med antigenudtagningsbuffer (0,01 M trinatriumcitratdihydrat ved pH 6 og 0,05 % Tween-20) ved 100 °C i 20 minutter.
- Kør under koldt ledningsvand.
- Farvning
- Fjern gliderne fra badet og læg vævet med forsiden opad i en glidekasse med våde laboratorieservietter/køkkenrulle i bunden. Tegn en kontur omkring vævet med en hydrofob markørpen.
- Drop Tris-bufret saltvand (TBS) + 0,025% Triton X-100 på vævet og inkuber i 5 min. Gentag dette trin.
- Blok med TBS + 10% føtalt bovint serum (FBS) + 1% bovint serumalbumin (BSA) i 2 timer ved stuetemperatur. Vend diasene på deres side, og fjern blokeringsbufferen på en laboratorieserviet.
- Der tilsættes primær antistofopløsning og inkuberes ved 4 °C i mindst 2 timer eller natten over. Vask forsigtigt med TBS + 0,025% Triton X-100 ved forsigtigt at pipettere ~200 μL over sektionen.
- Tilsæt sekundær antistofopløsning og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Skyl objektglassene 3 x 5 min med TBS ved at skylle med en pipette som i trin 7.3.4.
- Monter med monteringsmedium og en coverslip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De trin, der er beskrevet ovenfor, er opsummeret i figur 1. Musececalindhold eller menneskelig afføring resuspenderes i sterilt saltvand for at forberede en gylle til at give til kimfrie mus (100 μL) med sonde, først i 3 på hinanden følgende dage, derefter en gang hver 3. dag. I slutningen af protokollen måles blodtrykket ved hjælp af halemanchetmetoden, mus aflives, og væv høstes til vurdering af ændringer i tarmmikrobiota og kardiovaskulære og metaboliske ændringer.
Et vigtigt skridt i valget af mikrobiota er at sikre, at sygdomsfænotypen af interesse er til stede i donoren og er forbundet med dysbiotiske ændringer. For eksempel er en diæt med højt saltindhold stærkt forbundet med dysbiose og kardiovaskulær dysfunktion. Denne undersøgelse brugte en musedonor, der blev fodret med en 8% NaCl-diæt. Ændringer i tarmmikrobiota som reaktion på det høje saltindhold omfattede et fald i bakteriel biodiversitet (figur 2A), som grupperede sig separat fra den normale saltmikrobiota (figur 2B). Firmicutes/Bacteroidetes-forholdet blev også øget (figur 2C), hvilket tyder på høje saltinducerede mikrobiotaændringer (modificeret fra Ferguson et al.12).
For at bestemme rollen af høj saltinduceret dysbiose i disposition for hypertension blev FMT fra mus med højt saltfodret til kimfrie mus udført, og blodtryksresponser på en lav subpressordosis angiotensin II (Ang II) vurderet. C57BL/6 hanmus i en alder af 3 måneder blev anvendt i dette studie. Modtagermus blev implanteret med osmotiske minipumper for at administrere en kontinuerlig lav dosis Ang II (140 ng/kg/) i 2 uger hos mus. Mus, der modtog FMT fra donorer med højt saltfoder, udviste en signifikant stigning i blodtrykket med Ang II-behandling sammenlignet med normale saltmikrobiotamodtagere (figur 3). Dette fund indikerer, at FMT primede modtagermusene til at udvikle hypertension12. Detaljer om halemanchetprotokollen hos gnavere er tidligere blevet rapporteret12,26.
Dysbiotisk tarmmikrobiota bidrager til sygdom dels på grund af en betændt og utæt tarmvæg. Således kan undersøgelse af tarmvæggen ved immunhistokemi bruges til at forhøre ændringer i specifikke tarmområder i enhver sygdomstilstand, selv ud over FMT. Figur 4 viser, at vi kan udføre immunhistokemi på ileum ved hjælp af en schweizisk rulleteknik og forskellige pletmarkører, såsom hæmatoxylin og eosin (H&E), Massons trikrome og immuncellemarkører såsom anti-CD3 og anti-CD68., som tidligere beskrevet 12, og apolipoprotein AI (AI), som havde akkumuleret i ileum hos proteinuriske mus (figur 4).
Figur 1: Diagram, der opsummerer protokoldesignet. Fækale prøver indsamlet fra et menneske eller konventionel mus anvendes til transplantation i kimfrie mus. Forkortelser: FMT = fækal mikrobiota transplantation; BP = blodtryk. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mus på en diæt med højt saltindhold udviser tarmmikrobiota dysbiose. (A) Vurdering af arternes biodiversitet i cecalindhold opnået fra mus på normal salt (sort) og højt saltindhold (rød) kost. (B) Ikke-metrisk multidimensionel skalering viser, at bakterierne fra normale salt- og diætmus med højt saltindhold danner separate klynger. (C) Højt saltindhold er forbundet med et øget forhold mellem Firmicutes og Bacteroidetes. (***p < 0,0001 ved hjælp af to-halet uparret elevs t-tests). Denne figur er tilpasset fra Ferguson et al.12. Forkortelser: NMDS = ikke-metrisk multidimensionel skalering; NS = normalt salt; HS = højt saltindhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: FMT fra mus med højt saltindhold disponerer kimfrie mus for angiotensin II-induceret hypertension. Overførsel af højt saltinduceret dysbiotisk tarmmikrobiota var forbundet med signifikant øget systolisk tryk hos kimfrie mus sammenlignet med mus, der modtog normal salttarmmikrobiota. Denne figur er tilpasset fra Ferguson et al.12. Forkortelser: FMT = fækal mikrobiota transplantation; BP = blodtryk; Ang II = angiotensin II; NS = normalt salt; HS = højt saltindhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunhistokemisk billede, der illustrerer, hvordan man vurderer sygdomsmarkørændringer i tarmen. Repræsentative billeder, der viser apolipoprotein AI-plet i ilea opnået fra mus, der havde hyperlipidæmi uden (A) eller med (B) proteinuri. Forstørrelse: 5x ved en skala på 200 μm (A,B, venstre); 10x på en skala fra 100 μm (A,B, højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En værdifuld tilgang til at studere tarmmikrobiotas kausale rolle i kardiovaskulær og metabolisk sygdom er at overføre den samlede mikrobiota eller vælge arter af interesse til kimfrie mus. Her beskriver vi protokoller til indsamling af fækale prøver fra mennesker og konventionelt husede mus i kimfrie mus for at studere tarmmikrobiotas rolle i hypertensive lidelser.
Hos mus bruger vi aseptisk opsamlet cecalindhold behandlet i et aerobt kammer, og hos mennesker samler afføring. FMT kan udføres straks, mens prøven stadig er frisk eller snapfrosset i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til brug. Hvis prøven ikke umiddelbart kan fryses, som i tilfælde af mennesker, der indsamler deres prøver derhjemme, er det vigtigt at bruge et konserveringsmiddel til nukleinsyrer såsom ethanol. De fleste bakterier i tarmen er anaerober; Ved forberedelse af fækale prøver til transplantation skal det gøres hurtigt for at undgå at udsætte bakterier for aerobe miljøer, da dette kan reducere effektiviteten på grund af en nedsat mængde anaerober i blandingen27. For en longitudinel undersøgelse bør metagenomisk sekventering af prøverne udføres sammen for at undgå batcheffekter. Prøver til FMT kan komme fra en eller flere donorer, der samles sammen og derefter distribueres til flere modtagere på tværs af forsøgsgrupperne.
Det er yderst afgørende, at FMT's succes bekræftes eksperimentelt, før man udforsker mekanistiske implikationer. Fækalt eller cecal indhold kan analyseres ved metagenomics og ligheder vurderet mellem donorer og modtagere. De forventede resultater vil være lignende mikrobiel mangfoldighed gennem alfadiversitetsindekser, hovedkoordinatanalyse og funktionelle profiler. Det er først da, at konklusionen om, at tarmmikrobiota spiller en vigtig rolle i sygdomsætiologi, kan udledes. Dette trin er endnu vigtigere, hvis undersøgelsen bruger konventionelt husede mus, der blev forbehandlet med antibiotika for at nedbryde deres endemiske mikrobiota. Dette skyldes, at hvis dette trin ikke lykkedes, kan de overlevende modtageres bakterier påvirke sygdomsresultaterne. Vellykket FMT, især i prækliniske studier, resulterer imidlertid ikke altid meningsfuldt i klinisk oversættelse. Derfor er yderligere bekræftende trin nødvendige for at implicere direkte tarmrelaterede mekanismer i sygdomspatofysiologi, herunder ændringer i tarmmorfologi ved hjælp af schweizerrulleteknikken beskrevet her.
Der er en etableret direkte rolle immuncelleaktivering i udviklingen af hypertension, demonstreret gennem adoptive overførselsstudier28,29,30. Selvom kimfrie mus er guldstandarden til bestemmelse af mikrobiotaens årsagsrolle i sygdom, kan modellen være begrænset til at studere inflammatoriske mekanismer ved kardiometaboliske sygdomme. Bakteriefrie mus har et uudviklet immunsystem, hvilket dæmper deres translationelle relevans i studiet af samspillet mellem tarmmikrobiota og inflammation. Alternativt kan denne protokol ændres til at transplantere fækale prøver i konventionelle mus efter udtømning af deres mikrobiota ved hjælp af antibiotika eller tarmrensning med polyethylenglycol31,32. FMT i konventionelt opstaldede mus, der er forbehandlet med antibiotika, eliminerer behovet for det strengt kontrollerede og dyre miljø, der er nødvendigt for at opretholde bakteriefrie mus. Nuværende beviser viser, at valget af antibiotika, hvad enten det er en eller en kombination, og behandlingsprotokol varierer mellem undersøgelser33,34,35. Valget af antibiotika vil bestemme de typer bakterier, der vil blive udtømt på grund af variationer i virkningsmekanismer og følgelig påvirke fænotypen. Således bør det eksperimentelle design tage hensyn til de typer bakterier, der vides at formidle fænotypen, og bredspektret antibiotika, indgivelsesmåde og regime bør vælges i overensstemmelse hermed.
Denne protokol har sine begrænsninger. Bakteriefrie mus opbevares i gnotobiotiske faciliteter, hvilket gør eksperimentelle procedurer relateret til undersøgelse af hjerte-kar-sygdomme udfordrende. For eksempel er radiotelemetri guldstandardmetoden til måling af blodtryk, men involverer meget invasive kirurgiske procedurer. Dette er ikke praktisk for immune, naive kimfrie mus. Således anvendes en ikke-invasiv halemanchet til dette formål for at undgå mikrobiel kontaminering12. For at opnå relativt nøjagtige målinger ved hjælp af halemanchet plethysmografi trænes dyrene typisk og akklimatiseres til platformen før systoliske trykmålinger. I bakteriefri FMT-undersøgelser bør forskere overveje at indsamle og gennemsnit flere målinger36.
Disse udfordringer kan forekomme i andre endepunkter end blodtryk. For eksempel kræver undersøgelser, der udforsker adfærdsmæssige aspekter af hjerte-kar-sygdomme, ofte hyppig håndtering og ekstern eksponering. En undersøgelse, der undersøgte virkningerne af en fiberrig kost i moderens fedme-induceret kognitiv og social dysfunktion, viste vellykket FMT hos konventionelle mus, der blev forbehandlet med antibiotika37. Undersøgelser, der undersøger langsgående kardiovaskulære reaktioner, kan overveje FMT hos konventionelt husede mus.
Ud over at måle blodtrykket kan dyr aflives og væv høstes til yderligere undersøgelse. Især skal cecalindholdet indsamles for at blive evalueret for vellykket indkapsling af den transplanterede mikrobiota. Denne detaljerede protokol vil guide forskere i at studere mekanismen i tarmmikrobiomet fra FMT til vævsniveauer og kan anvendes til funktionelle undersøgelser. Dette er vigtigt, fordi der er en enorm mængde metodologisk og aktuelt tilgængelig litteratur. Til mekanistiske formål kan plasma, tarme, nyrer, hjerter og andre væv høstes for at undersøge de involverede veje. De kausale virkninger af tarmmikrobiota i sygdom er forbundet med de metabolitter, de producerer, og deres frigivelse i systemet på grund af en utæt tarm. Hele tarmens sundhed kan vurderes gennem histologiske og immunfarvningsmetoder. Schweizerrulleteknikken er blevet brugt til at påvise effekten af sygdom FMT hos mus12,24.
Bidraget fra tarmmikrobiota i hjerte-kar-sygdomme som hypertension forbliver associativt. Her præsenterede vi metodiske tilgange til at indsamle, behandle og transplantere fækalt stof fra mennesker eller konventionelle mus til kimfrie mus. Protokollen opsummerer yderligere eksperimentelle fremgangsmåder og parametre, der skal undersøges ved afgrænsning af en årsag og / eller virkning af tarmmikrobiota i kardiometabolisk sundhed. Undersøgelser bør replikeres for at sikre reproducerbarhed og stringens af den ønskede fænotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter, økonomiske eller på anden måde, erklæres af forfatterne.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (til A.K.) fra National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (til J.A.I.); og National Heart, Lung and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (til AK) og NIH-tilskud 1P01HL116263 (til V.K.). Figur 1 blev oprettet ved hjælp af Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M.
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
