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Biology

बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए फ्लोरेसेंस लाइफटाइम मैक्रो इमेजर

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64321
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3, 4, 1
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

Summary

यह पेपर लंबे क्षय उत्सर्जक नमूनों के मैक्रोस्कोपिक फोटोलुमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग के लिए एक नए, तेज ऑप्टिकल इमेजर के उपयोग का वर्णन करता है। इमेजिंग के लिए सेंसर सामग्री की तैयारी और लक्षण वर्णन और जैविक नमूनों का अध्ययन करने में इमेजर के आवेदन के साथ एकीकरण, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है।

Abstract

यह पेपर एक नया फोटोलुमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजर प्रस्तुत करता है जो ठोस अवस्था, ओ 2-संवेदनशील कोटिंग्स से लेकर घुलनशील ओ 2-संवेदनशील जांच से सना जीवित पशु ऊतक के नमूनों तक विभिन्न फॉस्फोरेसेंट नमूनों में आणविक ऑक्सीजन (ओ2) एकाग्रता को मैप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। विशेष रूप से, नैनोपार्टिकल-आधारित नियर-इन्फ्रारेड प्रोब नैनोओ 2-आईआर, जो 625 एनएम प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के साथ उत्तेजित है और 760 एनएम पर उत्सर्जित होता है, का उपयोग किया गया था। इमेजिंग सिस्टम टाइमपिक्स 3 कैमरा (टीपीएक्स 3 कैम) और ऑप्टो-मैकेनिकल एडाप्टर पर आधारित है, जिसमें एक इमेज इंटेंसिफायर भी है। ओ2 फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (पीएलआईएम) आमतौर पर विभिन्न अध्ययनों के लिए आवश्यक है, लेकिन वर्तमान प्लेटफार्मों में उनकी सटीकता, सामान्य लचीलापन और प्रयोज्यता में सीमाएं हैं।

यहां प्रस्तुत प्रणाली एक तेज और अत्यधिक संवेदनशील इमेजर है, जिसे एक एकीकृत ऑप्टिकल सेंसर और रीडआउट चिप मॉड्यूल, टीपीएक्स 3 कैम पर बनाया गया है। यह सतह से सना आंतों के ऊतक के नमूनों या बड़ी आंत के इंट्राल्यूमिनल रूप से दाग वाले टुकड़ों से उच्च तीव्रता वाले फॉस्फोरेसेंस संकेतों और स्थिर जीवनकाल मूल्यों का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है और लगभग 20 सेकंड या उससे कम में ऊतक ओ2 स्तरों के विस्तृत मानचित्रण की अनुमति देता है। बेहोश जानवरों में ग्राफ्टेड ट्यूमर में हाइपोक्सिया की इमेजिंग पर प्रारंभिक प्रयोग भी प्रस्तुत किए गए हैं। हम यह भी वर्णन करते हैं कि इमेजर को उत्तेजना के लिए 390 एनएम एलईडी और उत्सर्जन के लिए बैंडपास 650 एनएम फिल्टर का उपयोग करके पीटी-पोर्फिरीन रंगों पर आधारित ओ2-संवेदनशील सामग्री के साथ उपयोग के लिए फिर से कॉन्फ़िगर किया जा सकता है। कुल मिलाकर, पीएलआईएम इमेजर को उपयोग की जाने वाली जांच के लिए जीवनकाल मूल्यों के सटीक मात्रात्मक माप और ओ2 एकाग्रता के संबंधित दो-आयामी मानचित्रों का उत्पादन करने के लिए पाया गया था। यह पूर्व विवो ऊतक मॉडल और जीवित जानवरों के चयापचय इमेजिंग के लिए भी उपयोगी है।

Introduction

ओ 2 जीवित प्रणालियों के लिए प्रमुख पर्यावरणीय मापदंडों में से एक है, और ओ 2 के वितरण और इसकी गतिशीलता का ज्ञान कई जैविक अध्ययनों 1,2,3 के लिए महत्वपूर्ण है। फॉस्फोरेसेंट प्रोब 4,5,6,7,8 और पीएलआईएम 9,10,11,12,13 के माध्यम से ऊतक ऑक्सीकरण का आकलन जैविक और चिकित्सा अनुसंधान 3,9,14,15,16 में लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है। 17,18,19. ऐसा इसलिए है क्योंकि पीएलआईएम, प्रतिदीप्ति या फॉस्फोरेसेंस तीव्रता माप के विपरीत, बाहरी कारकों जैसे जांच एकाग्रता, फोटोब्लीचिंग, उत्तेजना तीव्रता, ऑप्टिकल संरेखण, प्रकीर्णन और ऑटोफ्लोरेसेंस से प्रभावित नहीं होता है।

हालांकि, वर्तमान ओ2 पीएलआईएम प्लेटफॉर्म उनकी संवेदनशीलता, छवि अधिग्रहण गति, सटीकता और सामान्य प्रयोज्यता से सीमित हैं। समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (टीसीएसपीसी), एक रास्टर स्कैनिंग प्रक्रिया के साथ संयुक्त, अक्सर पीएलआईएम और फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (एफएलआईएम) उपकरणों20,21,22 में उपयोग किया जाता है। हालांकि, चूंकि पीएलआईएम को एक लंबे पिक्सेल निवास समय (मिलीसेकंड रेंज में) की आवश्यकता होती है, इसलिए छवि अधिग्रहण का समय एफएलआईएम अनुप्रयोगों20,22,23 के लिए आवश्यक समय से बहुत लंबा है। सीएमओएस कैमरों जैसी अन्य तकनीकों में एकल फोटॉन संवेदनशीलता की कमी होती है और कम फ्रेम दर20,24,25,26 होती है। इसके अलावा, मौजूदा पीएलआईएम सिस्टम ज्यादातर सूक्ष्म प्रारूप में उपयोग किए जाते हैं, जबकि मैक्रोस्कोपिक सिस्टमकम आम हैं।

टीसीएसपीसी आधारित पीएलआईएम मैक्रो इमेजर28 को इनमें से कई सीमाओं को दूर करने के लिए स्थापित किया गया था। इमेजर के डिजाइन को एक नए ऑप्टो-मैकेनिकल एडाप्टर, क्रिकेट के उपयोग से बहुत सुविधाजनक बनाया गया था, जिसमें निम्नलिखित हैं: i) दो सी-माउंट एडेप्टर, जो पीछे की तरफ कैमरा मॉड्यूल और सामने की तरफ उद्देश्य लेंस का आसान युग्मन प्रदान करते हैं; (ii) क्रिकेट के बाहरी हिस्से में एक छवि गहनता के लिए एक आंतरिक आवास और उत्तरार्द्ध के लिए एक पावर सॉकेट; iii) फ्रंट-साइड सी-माउंट एडाप्टर के पीछे एक आंतरिक स्थान जहां एक मानक 25 मिमी उत्सर्जन फिल्टर को इंटेंसिफायर के सामने रखा जा सकता है; और iv) रिंग नियामकों के साथ एक अंतर्निहित प्रकाश कोलिमेटिंग ऑप्टिक्स, जो कैमरा चिप पर कुरकुरा छवियों का उत्पादन करने के लिए लेंस और कैमरे के बीच ऑप्टिकल संरेखण / ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है।

इकट्ठे इमेजर में, कैमरा मॉड्यूल को क्रिकेट एडाप्टर के पीछे की तरफ युग्मित किया गया है, जिसमें एक फोटोकैथोड से युक्त एक इमेज इंटेंसिफायर भी है, जिसके बाद एक माइक्रोचैनल प्लेट (एमसीपी), एक एम्पलीफायर और एक तेज सिंटिलेटर, पी 47 फॉस्फोर है। क्रिकेट के अंदर 760 एनएम ± 50 एनएम उत्सर्जन फिल्टर फिट किया गया है, और एक उद्देश्य लेंस, एनएमवी -50 एम 11', फ्रंट साइड सी-माउंट एडाप्टर से जुड़ा हुआ है। अंत में, लेंस और कैमरा रिंग नियामकों के साथ ऑप्टिकल रूप से संरेखित होते हैं।

इंटेंसिफायर की भूमिका आने वाले फोटॉनों का पता लगाना और उन्हें कैमरा चिप पर प्रकाश के तेज विस्फोट में परिवर्तित करना है, जो पंजीकृत हैं और उत्सर्जन क्षय और आजीवन छवियों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। कैमरा मॉड्यूल में एक उन्नत टीसीएसपीसी-आधारित ऑप्टिकल सेंसर सरणी (256 पिक्सेल x 256 पिक्सल) और एक नई पीढ़ी की रीडआउट चिप 29,30,31,32,33 शामिल है, जो 1.6 एनएस के समय रिज़ॉल्यूशन और 80 एमपिक्सेल / सेकंड रीडआउट दर के साथ इमेजिंग चिप के प्रत्येक पिक्सेल पर फोटॉन के आगमन के समय (टीओए) और टाइम ओवर थ्रेशोल्ड (टीओटी) की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है।

इस कॉन्फ़िगरेशन में, इंटेंसिफायर वाले कैमरे में सिंगल-फोटॉन संवेदनशीलता होती है। यह डेटा-संचालित है और त्वरित पिक्सेल डिटेक्टर रीडआउट (एसपीआईडीआर) सिस्टम34 पर आधारित है। इमेजर के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को पहले प्लानर फॉस्फोरेसेंट ओ2 सेंसर और एक रिज़ॉल्यूशन प्लेट मास्क के साथ चित्रित किया गया था। इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन (आईआरएफ) को अन्य सभी मापों के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स के तहत एक प्लानर फ्लोरोसेंट सेंसर की इमेजिंग द्वारा मापा गया था। लगभग 2.6 एनएस की डाई का जीवनकाल पीएलआईएम मोड में आईआरएफ माप के लिए उपयोग किए जाने के लिए पर्याप्त छोटा था। इमेजर क्रमशः 39.4 μm और 30.6 ns (आधे-अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई) के स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ आकार में 18 मिमी x 18 मिमी तक की वस्तुओं की छवि बना सकताहै।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल मैक्रो इमेजर की असेंबली और जैविक नमूनों में ओ 2 एकाग्रता के मानचित्रण के लिए इसके बाद के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो पहले से विशेषता वाले निकट-अवरक्त ओ 2 जांच, नैनोओ2-आईआर 35 के साथ सना हुआ है। जांच प्लैटिनम (II) बेंजोपोरफाइरिन (पीटीबीपी) डाई पर आधारित एक उज्ज्वल, फोटोस्टेबल, सेल-पारगम्य ओ2-सेंसिंग जांच है। यह 625 एनएम पर उत्तेजित है, 760 एनएम पर उत्सर्जन करता है, और शारीरिक सीमा (ओ2 के 0% -21% या 0-210 μM) मेंO2 के लिए एक मजबूत ऑप्टिकल प्रतिक्रिया प्रदान करता है। इमेजर को पीटी (II) -पोर्फिरीन रंगों के आधार पर विभिन्न सेंसर सामग्रियों को चिह्नित करने के लिए भी प्रदर्शित किया जाता है। कुल मिलाकर, इमेजर कॉम्पैक्ट और लचीला है, एक आम फोटोग्राफिक कैमरे के समान। वर्तमान सेटअप में, इमेजर विभिन्न वाइडफील्ड पीएलआईएम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। एक तेज लेजर स्रोत के साथ एलईडी को प्रतिस्थापित करने से इमेजर के प्रदर्शन में और सुधार होगा और संभावित रूप से नैनोसेकंड एफएलआईएम अनुप्रयोगों को सक्षम किया जा सकता है।

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Protocol

जानवरों के साथ सभी प्रक्रियाओं को यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देश (2010/63 / ईयू) के अनुसार स्वास्थ्य उत्पाद नियामक प्राधिकरण (एचपीआरए, आयरलैंड) द्वारा जारी प्राधिकरणों के तहत किया गया था और यूनिवर्सिटी कॉलेज कॉर्क की पशु प्रयोग नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. नमूना तैयार करना

  1. जीवित ऊतक के नमूनों की जांच के साथ धुंधला होना।
    1. पूर्व विवो अनुप्रयोगों के लिए, 4 सप्ताह की मादा बाल्ब / सी चूहों से ताजा पृथक ऊतक नमूने का उपयोग करें।
    2. प्रयोग के दिन, एक चूहे को डिकैपिटेशन द्वारा इच्छामृत्यु करें, और बृहदान्त्र (बड़ी आंत) के टुकड़ों को जल्दी से विच्छेदित करें, आकार में लगभग 10 मिमी। उन्हें पीबीएस बफर के साथ तुरंत धोएं, डीएमईएम माध्यम में 10 एमएम हेप्स बफर (पीएच 7.2) के साथ पूरक रखें, और 37 डिग्री सेल्सियस36 पर इनक्यूबेट करें।
    3. आंत के सेरसल पक्ष की सतह धुंधला होने के लिए, जीवित ऊतक के नमूनों को एक मिनी-डिश में स्थानांतरित करें, ऊतक के नमूनों को कवर करने के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल नैनोओ 2-आईआर जांच युक्त पूर्ण डीएमईएम के 2 एमएल लागू करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: पोस्टमार्टम ऊतक में कोशिकाएं संस्कृति में कई घंटों तक जीवित रहती हैं। NaNO2-IR मामूली साइटोटॉक्सिसिटी दिखाता है, इसलिए ऊतक अलगाव के बाद सभी प्रयोग 4 घंटे के भीतर पूरे किए गए थे।
    4. गहरे ऊतक इंट्राल्यूमिनल एक्स विवो धुंधला होने के लिए, आंत के टुकड़ों को एक सूखी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और फ़िल्टर पेपर के साथ किसी भी अतिरिक्त डीएमईएम को हटा दें।
    5. हैमिल्टन सिरिंज के साथ लुमेन में 1 मिलीग्राम / एमएल नैनोओ 2-आईआर 35 युक्त डीएमईएम के 1 μL इंजेक्ट करें, और15 मिनट या 4 घंटे तक नमूने को इनक्यूबेट करें।
      नोट: NaNO2-IR मामूली दीर्घकालिक साइटोटोक्सिक प्रभाव दिखाता है; इसलिए, ऊतक अलगाव के बाद सभी प्रयोगों को 4 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।
  2. जीवित जानवरों में दाग वाले ट्यूमर ऊतक की तैयारी
    1. विवो अनुप्रयोगों के लिए, सीरम-मुक्त माध्यम में 18 घंटे के लिए सीटी 26 कोशिकाओं को प्री-स्टेन करें जिसमें 0.05 मिलीग्राम / एमएल पर एनएएनओ 2-आईआर जांच होती है।
    2. एक माउस लें, दाहिने फ्लैंक में इंजेक्शन के क्षेत्र को शेव करें, और 1 × 10 5 गैर-दाग वाली कोशिकाओं और 1 × 105 कोशिकाओं के मिश्रण के सिरिंज 200 μL के साथ इंजेक्ट करें।
    3. चूहों में ट्यूमर को बढ़ने दें, कैलिपर के साथ ट्यूमर के आकार की निगरानी करें और समय-समय पर पशु का वजन37 हो। ग्राफ्टेड ट्यूमर वाले जानवर ट्यूमर के विकास के सातवें दिन इमेजिंग के लिए तैयार हो जाते हैं।
      नोट: ट्यूमर की मात्रा की गणना समीकरण (1) का उपयोग करके की गई थी:
      V = (L × W 2)/2 (1)
      जहां एल ट्यूमर का व्यास है, और डब्ल्यू मैंव्यास एल के लंबवत व्यास है।
    4. इमेजिंग से ठीक पहले ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा जानवरों की बलि दें।

2. पीएलआईएम इमेजिंग सेटअप

  1. क्रिकेट एडाप्टर लें, और अंदर इंटेंसिफायर हाउसिंग तक पहुंच प्राप्त करने के लिए इसके बैक साइड सी-माउंट एडाप्टर को हटा दें। इस डिब्बे में एमसीपी -125 छवि तीव्रक डालें, और सी-माउंट एडाप्टर को वापस रखें।
  2. क्रिकेट के फ्रंट साइड सी-माउंट एडाप्टर को निकालें, 760 एनएम ± 50 एनएम उत्सर्जन फ़िल्टर डालें, और सी-माउंट को वापस लगाकर इसे ठीक करें।
  3. टीपीएक्स 3कैम कैमरा मॉड्यूल को अपने सी-माउंट एडाप्टर के माध्यम से क्रिकेट मॉड्यूल के पीछे की तरफ कनेक्ट करें
  4. लेंस को इसके सी-माउंट एडाप्टर के माध्यम से क्रिकेट मॉड्यूल के सामने की तरफ से कनेक्ट करें।
  5. ऑप्टिकल ब्लैक बॉक्स के शीर्ष पर पूरे कैमरा असेंबली को माउंट करें, उस चरण की ओर मुंह करके जिस पर नमूने चित्रित किए जाएंगे (चित्रा 1)।
  6. ब्लैक बॉक्स के अंदर ब्रेडबोर्ड से जुड़ी पोस्ट पर 624 एनएम सुपर-ब्राइट एलईडी माउंट करें।
  7. एलईडी को बिजली की आपूर्ति और पल्स जनरेटर से कनेक्ट करें। एलईडी पर स्विच करें, और छवि वाले नमूनों के प्रभावी और समान उत्तेजना सुनिश्चित करने के लिए इसे केंद्रित करें।
  8. कैमरे को किसी अन्य पल्स जनरेटर से कनेक्ट करें, और कैमरे और एलईडी38 को भेजी गई दालों को सिंक्रनाइज़ करें।
  9. क्रिकेट इकाई पर विशेष केबल और सॉकेट का उपयोग करके, इंटेंसिफायर को एक मानक बिजली की आपूर्ति से कनेक्ट करें, और लाभ को 2.7 वी पर सेट करें।
  10. लेंस और क्रिकेट एडाप्टर की फोकसिंग क्षमताओं का उपयोग करते हुए, अच्छे कंट्रास्ट और चमक के साथ नमूनों की स्पष्ट छवियां उत्पन्न करने के लिए नमूना चरण पर कैमरा ऑप्टिक्स पर ध्यान केंद्रित करें।
  11. पीटी-पोर्फिरीन रंगों के साथ इमेजर उपयोग के लिए, उत्तेजना के लिए 625 एनएम एलईडी को 390 एनएम एलईडी के साथ बदलें, और क्रिकेट मॉड्यूल में 760 एनएम ± 50 एनएम फिल्टर को 650 एनएम ± 50 एनएम फिल्टर के साथ बदलें।

3. छवि अधिग्रहण

  1. नमूना को कैमरे के लेंस के सामने रखें।
    नोट: अच्छे फोकस के लिए नमूना स्थिति को समायोजित करने के लिए नमूना धारक के रूप में एक्स-वाई-जेड समायोज्य चरण का उपयोग करें।
  2. कमरे की सभी लाइटें बंद कर दें।
  3. परिचालन मापदंडों को ट्यून करने के लिए सोफी सॉफ्टवेयर पर स्विच करें, जैसे कि फोकस िंग और नमूना संरेखण।
    नोट: इमेजिंग पैरामीटर सेट करने और डेटा रिकॉर्ड करने के लिए कैमरे के साथ सोफी सॉफ्टवेयर प्रदान किया जाता है। सुनिश्चित करें कि सॉफ्टवेयर कैमरा कोड की जांच करके कैमरे से जुड़ा हुआ है। हालांकि, हमने डेटा अधिग्रहण के लिए एक अलग कार्यक्रम का उपयोग किया।
  4. मॉड्यूल में, अनंत फ़्रेम का चयन करें, और पिक्सेल ऑपरेशन मोड को सीमा पर समय पर सेट करें।
  5. मॉड्यूल में, पूर्वावलोकन पर जाएँ, और सक्रिय मॉड्यूल का चयन करें। यह Medpix/Timpix Frames विंडो खोलता है।
  6. इस विंडो में, रंग स्केल बदलें, और छवि को वांछित अभिविन्यास में घुमाएं ।
  7. तीव्रक चालू करें, और रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    नोट: नमूने के संरेखण और फ़ोकस को नेत्रहीन रूप से पुष्टि करने और रिकॉर्डिंग के लिए एलईडी उत्तेजना मापदंडों को अनुकूलित करने के लिए सोफी सॉफ़्टवेयर की रिकॉर्डिंग स्क्रीन का उपयोग करें।
  8. रिकॉर्डिंग बंद करें, और Sophy सॉफ़्टवेयर बंद करें।
  9. टर्मिनल पर जाएं, और बाइनरी प्रारूप में कच्चे डेटा को प्राप्त करने के लिए कस्टम-डिज़ाइन किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें और इसे पोस्ट-प्रोसेस करें (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. टर्मिनल में, डेटा रिकॉर्ड करने के लिए निम्न आदेश चलाएँ:
      सीडी दस्तावेज़/एसपीआईडीआर/ट्रंक/रिलीज़/
       एल एस
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {फ़ाइल का नाम} - t {अधिग्रहण समय}
      नोट: "एलएस" टाइप करने पर, वर्तमान निर्देशिका में फ़ाइलों की सूची की जांच करें; पुष्टि करें कि Tpx3daq देखा गया है।
    2. सभी फ़्रेम रिकॉर्ड होने तक प्रतीक्षा करें।
    3. डेटा संसाधित करने के लिए, टर्मिनल में निम्न आदेश चलाएँ :
      सीडी दस्तावेज़/डेटा प्रोसेसिंग/Timepix3/Timepix3/
      जड़
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. RRGui विंडो खुलने की प्रतीक्षा करें। बाईं ओर सभी चर और दाईं ओर सभी डेटा, एकल फ़ाइल और केन्द्रक का चयन करें।
    5. डेटा रिड्यूसर को संसाधित करने और चलाने के लिए फ़ाइल का चयन करें।
      नोट:: सभी संसाधित फ़ाइलें कच्ची फ़ाइल के समान फ़ोल्डर में दिखाई देंगी।

4. डेटा विश्लेषण

  1. सी-भाषा में लिखे गए एक समर्पित प्रोग्राम के साथ पोस्ट-प्रोसेस्ड डेटा का विश्लेषण करें जो डेटा को .ics छवि फ़ाइल (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam) में लिखेगा।
  2. स्वतंत्र रूप से उपलब्ध समय समाधान इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके .ics छवि फ़ाइलों को खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। फॉस्फोरेसेंस क्षय को फिट करने के लिए दो-घातीय कार्यों का उपयोग करें।
  3. उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ फिट की गई .ics छवि फ़ाइलों को खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. लुकअप टेबल्स का उपयोग करके, फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम छवियां उत्पन्न करें, और उन्हें स्यूडोकलर स्केल (जैसे, छोटे जीवनकाल के लिए नीला रंग और लंबे जीवनकाल के लिए लाल) में एन्कोड करें। संपूर्ण छवि या रुचि के विशिष्ट क्षेत्रों (ROIs) के लिए औसत जीवनकाल मूल्यों की गणना करने के लिए माप फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  5. प्रोब36 के ओ2 अंशांकन की फिटिंग से प्राप्त समीकरण का उपयोग करके जीवनकाल मूल्यों को ऑक्सीजन एकाग्रता में परिवर्तित करें।
    नोट: समीकरण (2) इस काम के लिए इस्तेमाल किया गया था:
    O 2 [μM] = −86.16 + 770.35 × e-0.049 × LT (2)

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Representative Results

पूर्व विवो इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, आंतों के ऊतकों के टुकड़े ऊतक के सेरसल पक्ष पर नैनोओ 2-आईआर जांच के सामयिक अनुप्रयोग से दागदार थे। गहरे धुंधलापन के लिए, जांच के 1 μL को लुमेन में इंजेक्ट किया गया था। बाद के मामले में, 0.2-0.25 मिमी मोटी आंतों की दीवार ने जांच को कैमरे से बचाया। दो धुंधला प्रक्रियाओं को चित्रा 2 ए में प्रदर्शित किया गया है।

परिणामी तीव्रता और पीएलआईएम छवियों को चित्रा 2 बी-जी में प्रस्तुत किया गया है। रंग स्पष्ट रूप से जीवनकाल मूल्यों में अंतर को दर्शाते हैं और इसलिए, ऊतक के सेरसल और म्यूकोसल पक्षों के ऑक्सीकरण में अंतर। चित्रा 2 सी और चित्रा 2 डी ऊतकों के समान सेटों को संदर्भित करते हैं जो शीर्ष पर (चित्रा 2 सी) और इंट्राल्यूमिनल (चित्रा 2 डी) दागदार थे। जैसा कि अपेक्षित था, ऊतकों ने समान पीएलआईएम पैटर्न दिखाए। हालांकि, ऊतक के म्यूकोसल पक्ष के इंट्राल्यूमिनल धुंधलापन (चित्रा 2 डी) ने उच्च जीवनकाल मूल्यों को दिखाया, जो आंत की आंतरिक सतह में कम ऑक्सीकरण को दर्शाता है, सेरसल पक्ष (चित्रा 2 सी) के सामयिक धुंधलापन की तुलना में, जिसने कम जीवनकाल दिखाया। यह आंत की बाहरी सतह में उच्च ऑक्सीकरण को दर्शाता है।

जीवनकाल संकेतों की स्थिरता और आंत की श्वसन गतिविधि की जांच करने के लिए, 2 घंटे (चित्रा 2 डी-जी) से अधिक इंट्राल्यूमिनल रूप से दाग वाले नमूनों पर एक टाइम-लैप्स पीएलआईएम विश्लेषण आयोजित किया गया था। इनक्यूबेशन के 15 मिनट (54.4 μs ± 0.9 μs) और 2 h (61.1 μs ± 0.8 μs) के बीच जीवनकाल मूल्यों में वृद्धि देखी गई, जो आंत के ल्यूमिनल भाग मेंO2 के स्तर में कमी को दर्शाता है। इसके अलावा, इनक्यूबेशन के 2 घंटे के बाद कम ओ2 स्तर साबित करते हैं कि ऊतक श्वसन विच्छेदन, तैयारी, धुंधला, इनक्यूबेशन और इमेजिंग चरणों की पूरी अवधि के लिए जारी रहा। इसके अतिरिक्त, चित्रा 2 डी-जी में देखे गए लुमेन के आकार में परिवर्तन को लुमेन में इंजेक्ट की गई जांच के वितरण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि एलटी सिग्नल उस क्षेत्र को दर्शाता है जहां जांच स्थित है।

विवो में इमेजर के भविष्य के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए, चूहों में उगाए गए ग्राफ्टेड चमड़े के नीचे के ट्यूमर में हाइपोक्सिया की इमेजिंग पर एक प्रारंभिक अध्ययन बलिदान के तुरंत बाद किया गया था (चित्रा 3)। इस मामले में, बाल्ब / सी चूहों को सीटी 26 कोशिकाओं के मिश्रण के 200 μL के साथ दाहिने फ्लैंक में चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया था, जो 0.05 मिलीग्राम / एमएल नैनोओ 2-आईआर जांच के साथ बिना दाग या दाग वाले थे। पीएलआईएम ट्यूमर के विकास के सातवें दिन किया गया था, और चूहों को इमेजिंग (यानी, पोस्टमार्टम) से ठीक पहले बलिदान किया गया था। विकास के सातवें दिन चूहों में ट्यूमर क्षेत्रों की छवियां चित्रा 3 ए, बी में दिखाई गई हैं।

ट्यूमर के विकास के सातवें दिन चूहों में ट्यूमर क्षेत्रों के लिए तीव्रता (बाएं) और पीएलआईएम (दाएं) छवियां (चित्रा 3 बी) ऐसे प्रयोगों में इमेजर और जांच दोनों के प्रदर्शन और संवेदनशीलता को प्रदर्शित करती हैं (अधिक विस्तृत सांख्यिकीय डेटा नहीं दिखाया गया है)। जानवरों को प्रत्येक 20 सेकंड के लिए चित्रित किया गया था। चूहों के बाएं फ्लैंक को मुंडा दिया गया और एक रिक्त स्थान के रूप में चित्रित किया गया। उन्होंने कोई पीएलआईएम संकेत नहीं दिया। इसके विपरीत, ट्यूमर और जांच वाले क्षेत्रों ने ~ 50 μs के स्थिर जीवनकाल संकेत ों का उत्पादन किया। इस प्रयोग का उद्देश्य जीवित जानवरों और मानव रोग के मॉडल के साथ विवो अध्ययन में इमेजर की प्रयोज्यता का मूल्यांकन करना था। जबकि इस भाग ने प्रारंभिक गुणात्मक परिणाम दिखाए, एक संबंधित पेपर तैयार किया जा रहा है, जो अधिक गहन मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करता है।

इसके बाद, इमेजर को पीटी (द्वितीय) -पोर्फिरीन रंगों के आधार पर सेंसर सामग्री के पीएलआईएम इमेजिंग में भी प्रदर्शित किया गया था। पीटी-ऑक्टाथाइलपोर्फिन डाई (पीटीओईपी) की रासायनिक संरचना और संबंधित सेंसर सामग्री की तैयारी के तकनीकी विवरण 6,39 में कहीं और वर्णित हैं। पीटीओईपी-पॉलीस्टाइनिन-आधारित फॉस्फोरेसेंट सॉलिड-स्टेट सेंसर कोटिंग्स को एक पारदर्शी पॉलिएस्टर फिल्म (माइलर) पर छोटे धब्बों के रूप में जमा किया गया था, फिल्म को पीबीएस बफर (एयर-सैचुरेटेड ऑक्सीजन युक्त अवस्था) या पीबीएस में ग्लूकोज और ग्लूकोज ऑक्सीडेज युक्त पीबीएस में डुबोकर चित्रित किया गया था, जो पूरी तरह से डीऑक्सीजनेटेड स्थिति प्रदान करता है। ऑक्सीजन युक्त (25.6 μs ± 0.5 μs) और डीऑक्सीजनेटेड स्थितियों (65.7 μs ± 1.5 μs) में प्राप्त जीवनकालसंकेत पहले रिपोर्ट किए गए परिणामों से मेल खाते हैं। ऑक्सीजन युक्त और डीऑक्सीजनेटेड सेंसर की तीव्रता और पीएलआईएम छवियां चित्रा 4 ए, बी में दी गई हैं।

Figure 1
चित्र 1: इमेजर38 का प्रयोगात्मक सेटअप। सेन एट अल 38 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। कॉपीराइट: ऑप्टिकल सोसाइटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: शीर्ष और इंट्राल्यूमिनल रूप से सना हुआ माउस आंत के नमूनों का ओ 2 पीएलआईएम। (ए) (बी) फॉस्फोरेसेंस तीव्रता और (सी) एनएएनओ 2-आईआर जांच के साथ शीर्ष रूप से सना हुआ आंत की पीएलआईएम छवियों का उपयोग करके दो धुंधला विधियों का चित्रण। (D-G) धुंधला होने के बाद 15 मिनट, 30 मिनट, 1 घंटे और 2 घंटे में इंट्राल्यूमिनल रूप से सना हुआ आंत का टाइमलैप्स पीएलआईएम। पीएलआईएम छवियों को एक छद्म रंग पैमाने में प्रस्तुत किया जाता है: नीला रंग कम जीवनकाल से मेल खाता है, और लाल रंग उच्च जीवनकाल मूल्यों से मेल खाता है। स्केल बार = 5 मिमी। संक्षिप्त नाम: पीएलआईएम = फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: चूहों के दाहिने फ्लैंक में ग्राफ्टेड ट्यूमर का ओ2 पीएलआईएम । (ए) जीवित जानवरों में ट्यूमर के विकास का ग्राफिकल चित्रण। फॉस्फोरेसेंस तीव्रता (बाएं) और पीएलआईएम (दाएं) ट्यूमर के विकास के सातवें दिन (बी) ट्यूमर क्षेत्रों की छवियां। पीएलआईएम छवि को एक छद्म रंग पैमाने में प्रस्तुत किया गया है: नीला रंग कम जीवनकाल से मेल खाता है, और लाल रंग उच्च जीवनकाल मूल्यों से मेल खाता है। स्केल बार = 5 मिमी। संक्षिप्त नाम: पीएलआईएम = फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीटीओईपी-आधारित सेंसर स्पॉट की फॉस्फोरेसेंस तीव्रता। (ए) ऑक्सीजन युक्त और (बी) डीऑक्सीजनेटेड अवस्थाओं में पीटीओईपी सेंसर स्पॉट की फॉस्फोरेसेंस तीव्रता (बाएं) और पीएलआईएम (दाएं) छवियां। पीएलआईएम छवियों को एक छद्म रंग पैमाने में प्रस्तुत किया जाता है: नीला कम जीवनकाल से मेल खाता है, और लाल रंग उच्च जीवनकाल मूल्यों से मेल खाता है। संक्षेप: पीएलआईएम = फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी; पीटीओईपी = प्लैटिनम ऑक्टेथाइलपोरफाइरिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

उपरोक्त प्रोटोकॉल नए इमेजर की असेंबली और माइक्रोसेकंड एफएलआईएम / पीएलआईएम मोड में इसके संचालन का विस्तृत विवरण देते हैं। टीसीएसपीसी-आधारित नई पीढ़ी का टीपीएक्स 3 कैम कैमरा, छवि तीव्र, उत्सर्जन फिल्टर और मैक्रो-लेंस के साथ ऑप्टो-मैकेनिकल एडाप्टर क्रिकेट के माध्यम से मिलकर, एक स्थिर, कॉम्पैक्ट और लचीला ऑप्टिकल मॉड्यूल का उत्पादन करता है जिसे संचालित करना आसान है। इमेजर को विभिन्न नमूनों और विश्लेषणात्मक कार्यों की एक श्रृंखला के साथ अच्छा प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया था, जिसमें फॉस्फोरेसेंट सामग्री और जीवित ऊतक ओ2 इमेजिंग के लक्षण वर्णन शामिल थे। इमेजिंग प्रयोगों में निकट-अवरक्त पीटी (द्वितीय)-बेंजोपोरफाइरिन-आधारित सेल-पारगम्य घुलनशील जांच नैनोओ 2-आईआर और लाल-उत्सर्जक पीटी (द्वितीय)-पोर्फिरिन-आधारित ठोस-अवस्था सेंसर का उपयोग किया गया था। इन सेंसरों का उपयोग उनके बड़े स्टोक्स के बदलाव, लंबे उत्सर्जन जीवनकाल, उच्च संवेदनशीलता, तेज प्रतिक्रिया और अच्छी फोटोकैमिकल स्थिरता के कारण ओ2 के बुझने वाले फॉस्फोरेसेंस का पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।

इन अलग-अलग ओ2-संवेदनशील जांच और ठोस-राज्य कोटिंग्स, जब मैक्रो इमेजर पर परीक्षण किया जाता है, तो परिणाम उत्पन्न होते हैं जो पहले प्रकाशित डेटा40 के अनुरूप होते हैं। सामग्रियों ने बदलती पर्यावरणीय परिस्थितियों के लिए अच्छी एकरूपता, विपरीत और जीवनकाल प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया, विशेष रूप से तापमान और ऑक्सीकरण स्थिति के संदर्भ में। कॉन्फोकल टीसीएसपीसी-पीएलआईएम माइक्रोस्कोप पर उत्पादित लोगों के साथ इन परिणामों की तुलना से पता चलता है कि नया इमेजर सटीक है, इसमें बेहतर गुणवत्ता वाले जीवनकाल रीडिंग हैं, और उच्च गति और संवेदनशीलता 28,38,40 के साथ पीएलआईएम छवियों को प्राप्त करता है।

इमेजर ने विभिन्न प्रकार के फॉस्फोरेसेंटली दाग वाले जैविक नमूनों के साथ आशाजनक प्रदर्शन का भी प्रदर्शन किया। इस प्रकार, सना हुआ श्वसन कोशिकाओं, लाइव पोस्टमॉर्टम पशु ऊतक, पूरे अंगों और ग्राफ्टेड ट्यूमर के निलंबन वाले नमूनों के लिए विस्तृत ओ2 एकाग्रता मानचित्र तैयार किए गए थे। इमेजर ने सतह से और यहां तक कि ऊतक 28,36,38 के अंदर 0.5 मिमी तक की गहराई पर जीवनकाल मूल्यों के माप प्रदान किए हैं।

चूंकि फॉस्फोरेसेंस जीवनकाल मान तापमान41 से बहुत प्रभावित होते हैं, इसलिए छवि वाले नमूनों के तंग तापमान नियंत्रण को लागू करना आवश्यक है, जैसे कि गर्म नमूना चरण और / या इनक्यूबेटर कक्ष का उपयोग करके। यूवी उत्तेजना का उपयोग करते समय, नमूना धारकों को सावधानीपूर्वक चुनना महत्वपूर्ण है, क्योंकि कई सामग्रियों में इस वर्णक्रमीय क्षेत्र में ऑटोफ्लोरेसेंस होता है, जो नमूने के वास्तविक जीवनकाल मूल्य को प्रभावित करता है। इस अध्ययन में सभी पीएलआईएम इमेजिंग 20 सेकंड के एकीकरण समय के लिए 4 वी की एलईडी शक्ति और 50 एनएस की पल्स चौड़ाई पर की गई थी; हालाँकि, इन मापदंडों को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है। छवि अधिग्रहण समय के 20 सेकंड के दौरान लगभग 104,500 फ्रेम दर्ज किए जाते हैं। अंत में, परिवेश प्रकाश हस्तक्षेप से बचने के लिए एक अंधेरे कक्ष में माप करना महत्वपूर्ण है।

इस प्रकार, पीएलआईएम इमेजर महत्वपूर्ण आकार की मैक्रोस्कोपिक वस्तुओं के साथ तेज, मात्रात्मक जीवनकाल माप कर सकता है। जबकि लेजर-स्कैनिंग पीएलआईएम-टीसीएसपीएस संभव है, यह ऑक्सीजन-सेंसिंग रंगों के लिए आवश्यक लंबे समय के कारण बहुत धीमा होगा। यह इमेजर, हालांकि, तेज है और एक साथ सभी पिक्सेल रिकॉर्ड कर सकता है। इसके अलावा, तीव्रता-आधारित माप फ्लोरोसेंट / फॉस्फोरेसेंट डाई एकाग्रता, एक अस्थिर एलईडी या लेजर तीव्रता, फोटोब्लीचिंग, ऑप्टिकल घटकों के संरेखण और नमूनों से प्रकीर्णन से प्रभावित हो सकते हैं। इसके विपरीत, टीसीएसपीसी-आधारित मैक्रो इमेजर अनिवार्य रूप से इन कारकों से स्वतंत्र है। इसलिए, यह ओ2 के सटीक और अंशांकन-मुक्त माप कर सकता है। कैमरे के नुकसान में इसकी अपेक्षाकृत जटिल डेटा प्रोसेसिंग और बड़े डेटा आकार (~ 2 जीबी) शामिल हैं।

भविष्य में, इमेजर का उपयोग न केवल ओ2 सांद्रता को मैप करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि परीक्षण किए गए नमूनों के अन्य रासायनिक और जैव रासायनिक मापदंडों जैसे पीएच और ग्लूकोज डायनामिक्स, संबंधित जांच या सेंसर का उपयोग करके भी किया जा सकता है। यह इसे विभिन्न ऊतक और रोग मॉडल के साथ शारीरिक अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण बनाता है। इमेजर को नैनोसेकंड एफएलआईएम मोड में संचालित करने के लिए अपग्रेड भी किया जा सकता है। हालांकि, इसके लिए वर्तमान एलईडी को तेज उत्तेजना स्रोत (जैसे, पीएस लेजर) के साथ बदलने की आवश्यकता होती है। दोहरी पीएलआईएम / एफएलआईएम मोड में सिस्टम ऑपरेशन भी मुख्य रूप से संभव है।

कुल मिलाकर, इमेजर वाइडफील्ड टीसीएसपीसी-पीएलआईएम अनुप्रयोगों में अच्छी कार्यक्षमता और परिचालन प्रदर्शन के साथ-साथ सादगी और बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वाइड-फील्ड इमेजर्स ज्यादातर तीव्रता-आधारित इमेजिंग करते हैं, जिसमें फॉस्फोरेसेंट तीव्रता को फोटोब्लीचिंग, माप ज्यामिति, नमूनों से प्रकीर्णन आदि जैसे कारकों से प्रभावित किया जा सकता है। वर्तमान इमेजर लाइफटाइम इमेजिंग पर आधारित है, जो माप को गुणात्मक से अधिक मात्रात्मक बनाता है। इसके अलावा, क्रिकेट एडाप्टर और इमेज इंटेंसिफायर के साथ Tpx3Cam ऑप्टिकल कैमरा का एकीकरण एकल-फोटॉन संवेदनशीलता, सादगी, लचीलापन और माप की मजबूती प्रदान करता है। अन्य प्रणालियों के विपरीत, इसे प्रयोगों की साइट पर ले जाया जा सकता है और नमूना और माप कार्य की आवश्यकताओं के आधार पर 360 ° घुमाया जा सकता है। अपने वर्तमान उद्देश्य के साथ, जो एक अन्य लेंस के लिए बदलना आसान है, इमेजर कुछ ही सेकंड में आकार में 18 मिमी x 18 मिमी तक के नमूनों को माप सकता है और 256 पिक्सेल x 256 पिक्सेल के उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ। यह पेपर परीक्षण के लिए नमूने तैयार करने और विभिन्न पीएलआईएम अनुप्रयोगों में इमेजर का उपयोग करने के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

साइंस फाउंडेशन आयरलैंड से इस काम के लिए वित्तीय सहायता, एसएफआई/12/आरसी/2276_P2, एसएफआई/17/आरसी-पीएचडी/3484 और 18/एसपी/3522 और ब्रेकथ्रू कैंसर रिसर्च (प्रेसिजन ऑन्कोलॉजी आयरलैंड) को कृतज्ञता पूर्वक स्वीकार किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
627 nm LED Parts Express Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter Edmund Optics 84-788 Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice Envigo, UK Balb/c
Black box Thorlabs XE25C9/M
Cricket Adapter Photonis Cricket-2
CT26 cells  ATCC CT26.WT https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM Sigma-Aldrich D0697 Other media can also be used
ImageJ Software ImageJ Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen Photonis PP0360EF
Mini dishes Sarstedt 83.3900.300 35 mm diameter 
Mylar plastic film, 75 micron  RS Ireland 785-0795 Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR home-made n/a The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. 
NMV-50M11” 50 mm lens Navitar Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard Thorlabs MB1836
Petri Dishes Sarstedt 82.1472.001 92 mm diameter
Power Supply Tenma 72-10495
Pulse Generator Tenma TGP110
Sophy Amsterdam Scientific Instruments n/z Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam Amsterdam Scientific Instruments TPXCAM
Tri2 Software University of Oxford n/a Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage Thorlabs LT3

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जीव विज्ञान अंक 194
बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए फ्लोरेसेंस लाइफटाइम मैक्रो इमेजर
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Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C., Tangney, M., Hirvonen, L. M., Nomerotski, A., Papkovsky, D. B. Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (194), e64321, doi:10.3791/64321 (2023).

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