Summary
Denne artikkelen beskriver bruken av et nytt, raskt optisk bildeapparat for makroskopisk fotoluminescens levetidsavbildning av prøver med langt henfall. Integrasjons-, bildeinnsamlings- og analyseprosedyrene beskrives, sammen med forberedelse og karakterisering av sensormaterialene for avbildning og anvendelse av bildeapparatet i studier av biologiske prøver.
Abstract
Dette papiret presenterer en ny fotoluminescens levetid imager designet for å kartlegge molekylært oksygen (O 2) konsentrasjon i forskjellige fosforescerende prøver som spenner fra solid-state, O 2-sensitive belegg til levende dyr vevsprøver farget med løselige O 2-sensitive sonder. Spesielt ble den nanopartikkelbaserte nær-infrarøde sonden NanO2-IR, som er spennende med en 625 nm lysemitterende diode (LED) og avgir ved 760 nm, brukt. Bildesystemet er basert på Timepix3-kameraet (Tpx3Cam) og den optomekaniske adapteren, som også huser en bildeforsterker. O2 fosforescens levetid imaging mikroskopi (PLIM) er vanligvis nødvendig for ulike studier, men dagens plattformer har begrensninger i nøyaktighet, generell fleksibilitet og brukervennlighet.
Systemet som presenteres her er et raskt og svært følsomt bildeapparat, som er bygget på en integrert optisk sensor og avlesningsbrikkemodul, Tpx3Cam. Det er vist å produsere fosforescenssignaler med høy intensitet og stabile levetidsverdier fra overflatefargede tarmvevsprøver eller intraluminalt fargede fragmenter av tyktarmen og tillater detaljert kartlegging av vev O2-nivåer på ca. 20 s eller mindre. Innledende eksperimenter på avbildning av hypoksi i podede svulster i bevisstløse dyr presenteres også. Vi beskriver også hvordan imageren kan konfigureres på nytt for bruk med O2-sensitive materialer basert på Pt-porfyrinfargestoffer ved hjelp av en 390 nm LED for eksitasjonen og et båndpass 650 nm filter for utslipp. Samlet sett ble PLIM-avbildningen funnet å produsere nøyaktige kvantitative målinger av levetidsverdier for sondene som ble brukt og respektive todimensjonale kart overO2-konsentrasjonen . Det er også nyttig for metabolsk avbildning av ex vivo vevsmodeller og levende dyr.
Introduction
O 2 er en av de viktigste miljøparametrene for levende systemer, og kunnskap om fordelingen av O 2 og dens dynamikk er viktig for mange biologiske studier 1,2,3. Vurderingen av oksygenering av vev ved hjelp av fosforescerende sonder 4,5,6,7,8 og PLIM 9,10,11,12,13 blir stadig mer populær i biologisk og medisinsk forskning 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dette skyldes at PLIM, i motsetning til fluorescens- eller fosforescensintensitetsmålinger, ikke påvirkes av eksterne faktorer som sondekonsentrasjon, fotobleking, eksitasjonsintensitet, optisk justering, spredning og autofluorescens.
Imidlertid er nåværende O2 PLIM-plattformer begrenset av følsomhet, bildeinnsamlingshastighet, nøyaktighet og generell brukervennlighet. Tidskorrelert enkeltfoton telling (TCSPC), kombinert med en rasterskanningsprosedyre, brukes ofte i PLIM og fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) enheter20,21,22. Men siden PLIM krever lang pikseloppholdstid (i millisekundområdet), er tiden for bildeinnsamling mye lengre enn det som kreves for FLIM-applikasjoner20,22,23. Andre teknikker, for eksempel gated CCD / CMOS-kameraer, mangler enkeltfotonfølsomhet og har lave bildefrekvenser20,24,25,26. Videre er de eksisterende PLIM-systemene mest brukt i mikroskopisk format, mens makroskopiske systemer er mindre vanlige27.
Den TCSPC-baserte PLIM macro imager28 ble satt opp for å overvinne mange av disse begrensningene. Utformingen av bildeapparatet ble sterkt tilrettelagt ved bruk av en ny optomekanisk adapter, Cricket, som har følgende: i) to C-mount-adaptere, som gir enkel kobling av kameramodulen på baksiden og objektivlinsen på forsiden; ii) et internt hus for en bildeforsterker og en stikkontakt for sistnevnte på ytre side av Cricket; iii) et internt rom bak den fremre C-mount-adapteren der et standard 25 mm utslippsfilter kan plasseres foran forsterkeren; og iv) en innebygd lyskollimerende optikk med ringregulatorer, som tillater optisk justering / fokusering mellom linsen og kameraet for å produsere skarpe bilder på kamerabrikken.
I det monterte bildeapparatet er kameramodulen koblet til baksiden av Cricket-adapteren, som også inneholder en bildeforsterker bestående av en fotokatode etterfulgt av en mikrokanalplate (MCP), en forsterker og en rask scintillator, P47-fosfor. Et 760 nm ± 50 nm utslippsfilter er montert inne i Cricket, og et objektivobjektiv, NMV-50M11'', er festet til forsiden av C-mount-adapteren. Til slutt er linsen og kameraet justert optisk med ringregulatorer.
Forsterkerens rolle er å oppdage innkommende fotoner og konvertere dem til raske lysutbrudd på kamerabrikken, som registreres og brukes til å generere utslippsfall og levetidsbilder. Kameramodulen består av en avansert TCSPC-basert optisk sensorgruppe (256 piksler x 256 piksler) og en ny generasjons avlesningsbrikke 29,30,31,32,33, som tillater samtidig registrering av ankomsttid (TOA) og tid over terskel (TOT) av fotonutbrudd ved hver piksel av bildebrikken med en tidsoppløsning på 1,6 ns og en 80 Mpixel / s avlesningshastighet.
I denne konfigurasjonen har kameraet med forsterkeren enkeltfotonfølsomhet. Den er datadrevet og basert på SPIDR-systemet (Speedy Pixel Detector Readout)34. Den romlige oppløsningen til bildeapparatet ble tidligere karakterisert med plane fosforescerendeO2-sensorer og en oppløsningsplatemaske. Instrumentresponsfunksjonen (IRF) ble målt ved avbildning av en plan fluorescerende sensor under de samme innstillingene som ble brukt for alle de andre målingene. Levetiden til fargestoffet på rundt 2,6 ns var kort nok til at det kunne brukes til IRF-måling i PLIM-modus. Bildeapparatet kan avbilde objekter på opptil 18 mm x 18 mm i størrelse med romlige og tidsmessige oppløsninger på henholdsvis 39,4 μm og 30,6 ns (full bredde ved halv maksimum), henholdsvis28.
Følgende protokoller beskriver samlingen av makrobildeapparatet og dets påfølgende bruk for å kartlegge O2-konsentrasjonen i biologiske prøver farget med den tidligere karakteriserte nær-infrarødeO2-sonden, NanO2-IR35. Sonden er en lys, fotostabil, cellegjennomtrengelig O 2-sensorsonde basert på platina (II) benzoporfyrin (PtBP) fargestoff. Det er spennende ved 625 nm, avgir ved 760 nm, og gir en robust optisk respons på O 2 i det fysiologiske området (0% -21% eller 0-210 μM av O2). Bildeapparatet er også demonstrert for å karakterisere forskjellige sensormaterialer basert på Pt(II)-porfyrinfargestoffer. Samlet sett er bildeapparatet kompakt og fleksibelt, i likhet med et vanlig fotografisk kamera. I det nåværende oppsettet er bildeapparatet egnet for forskjellige bredfelts PLIM-applikasjoner. Å erstatte LED-lampen med en rask laserkilde vil forbedre ytelsen til bildeapparatet ytterligere og potensielt muliggjøre nanosekund FLIM-applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene med dyr ble utført under autorisasjoner utstedt av Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irland) i samsvar med European Communities Council Directive (2010/63 / EU) og ble godkjent av Animal Experimentation Ethics Committee ved University College Cork.
1. Forberedelse av prøver
- Farging med sonden av levende vevsprøver ex vivo
- For ex vivo applikasjoner, bruk ferskt isolerte vevsprøver fra 4 uker gamle kvinnelige Balb / c mus.
- På forsøksdagen avliver du en mus ved halshugging, og dissekerer raskt fragmenter av tykktarmen (tykktarmen), omtrent 10 mm i størrelse. Vask dem umiddelbart med PBS-buffer, sett i DMEM medium supplert med 10 mM Hepes buffer (pH 7,2), og inkuber ved 37 °C36.
- For overflatefarging av den serosale siden av tarmen, overfør de levende vevsprøvene til en mini-tallerken, påfør 2 ml komplett DMEM inneholdende 1 mg/ml NanO2-IR-sonde for å dekke vevsprøvene, og inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
MERK: Celler i post mortem-vev forblir levende i mange timer i kultur. NaNO2-IR viser mindre cytotoksisitet, så alle forsøkene ble fullført innen 4 timer etter vevsisolering. - For dyp vev intraluminal ex vivo farging, overfør tarmbitene til en tørr petriskål, og fjern overflødig DMEM med filterpapir.
- Injiser 1 μl DMEM inneholdende 1 mg/ml NanO2-IR 35 inn i lumen med en Hamilton sprøyte, og inkuber prøvene i15 minutter eller i opptil 4 timer.
MERK: NaNO2-IR viser mindre langsiktige cytotoksiske effekter; Derfor bør alle forsøkene fullføres innen 4 timer etter vevsisolering.
- Fremstilling av farget tumorvev hos levende dyr
- For in vivo applikasjoner, pre-stain CT26 celler i 18 timer i serum-fritt medium inneholdende NaNO2-IR sonde ved 0,05 mg / ml.
- Ta en mus, barber injeksjonsområdet i høyre flanke og injiser med en sprøyte 200 μL av en blanding av 1 × 10 5 ikke-fargede celler og 1 × 105 celler forhåndsfarget med NanO2-IR .
- Tillat svulster å vokse i musene, overvåking av tumorstørrelsen med en tykkelse og dyrevekten med jevne mellomrom37. Dyrene med podede svulster blir klare for avbildning på den syvende dagen av tumorvekst.
MERK: Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av ligning (1):
V = (L × W 2)/2 (1)
hvor L er svulstens diameter, og W erdiameteren vinkelrett på diameteren L. - Ofre dyrene ved cervical dislokasjon like før avbildning.
2. Oppsett av PLIM-bilder
- Ta Cricket-adapteren, og fjern den bakre C-mount-adapteren for å få tilgang til forsterkerhuset inni. Sett MCP-125-bildeforsterkeren inn i dette rommet, og sett C-mount-adapteren tilbake.
- Fjern Crickets fremre C-mount-adapter, sett inn 760 nm ± 50 nm utslippsfilter, og fiks det ved å sette tilbake C-mount.
- Koble Tpx3Cam-kameramodulen til baksiden av Cricket-modulen via C-mount-adapteren
- Koble linsen til forsiden av Cricket-modulen via C-mount-adapteren.
- Monter hele kameraenheten på toppen av den optiske svarte boksen, vendt ned mot scenen der prøvene skal avbildes (figur 1).
- Monter den 624 nm superlyse LED-lampen på en stolpe koblet til et brødbrett inne i den svarte boksen.
- Koble LED-lampen til en strømforsyning og en pulsgenerator. Slå på LED-lampen, og fokuser den for å sikre effektiv og jevn eksitering av bildeprøver.
- Koble kameraet til en annen pulsgenerator, og synkroniser pulsene som sendes til kameraet og LED38.
- Bruk den spesielle kabelen og kontakten på Cricket-enheten, koble forsterkeren til en standard strømforsyning, og sett forsterkningen til 2,7 V.
- Ved hjelp av fokuseringsegenskapene til objektivet og Cricket-adapteren, fokuser kameraoptikken på prøvetrinnet for å generere klare bilder av prøver med god kontrast og lysstyrke.
- For bildebehandling med Pt-porfyrinfargestoffer, erstatt 625 nm LED med en 390 nm LED for eksitasjon, og erstatt 760 nm ± 50 nm filter med et 650 nm ± 50 nm filter i Cricket-modulen.
3. Oppkjøp av bilder
- Plasser prøven foran kameralinsen.
MERK: Bruk et x-y-z justerbart trinn som prøveholder for å justere prøveposisjonen for godt fokus. - Slå av alle lysene i rommet.
- Slå på Sophy-programvaren for å justere driftsparametrene, for eksempel fokusering og prøvejustering.
MERK: Sophy-programvare leveres sammen med kameraet for å sette opp bildeparametrene og registrere dataene. Kontroller at programvaren er koblet til kameraet ved å sjekke kamerakoden. Vi brukte imidlertid et annet program for datainnsamling. - I Moduler velger du uendelige delbilder, og setter pikseldriftsmodusen til tid over terskel.
- Gå til Forhåndsvisning i Moduler, og velg Aktiv modul. Dette åpner vinduet Medpix/Timpix Frames.
- I dette vinduet endrer du fargeskalaen og roterer bildet til ønsket retning.
- Slå på forsterkeren, og start opptaket.
MERK: Bruk opptaksskjermen til Sophy-programvaren for å visuelt bekrefte justeringen og fokuset til prøven og for å optimalisere LED-eksitasjonsparametrene for opptak. - Stopp opptaket, og lukk Sophy-programvaren.
- Gå til terminalen, og bruk den spesialdesignede programvaren til å skaffe rådataene i binært format og etterbehandle dem (https://github.com/svihra/TimePix3).
- Kjør følgende kommandoer i terminalen for å registrere dataene:
CD-dokument/SPIDR/trunk/release/
Ls
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Navn på filen} - t {anskaffelsestid}
MERK: Når du skriver "ls", sjekk listen over filer i gjeldende katalog; bekreft at Tpx3daq er sett. - Vent til alle delbildene er spilt inn.
- For å behandle dataene, kjør følgende kommandoer i terminalen:
cd Dokumenter / DataProcessing / Timepix3 / Timepix3 /
rot
. L dataprosess.cpp++
.x DRGUI. C - Vent til et RRGui-vindu åpnes. Velg alle variablene til venstre og Alle data, Enkeltfil og Centroid til høyre.
- Velg filen for å behandle og kjøre datareduksjonen.
MERK: Alle de behandlede filene vises i samme mappe som råfilen.
- Kjør følgende kommandoer i terminalen for å registrere dataene:
4. Dataanalyse
- Analyser de etterbehandlede dataene med et dedikert program skrevet på C-språk som vil skrive dataene til en .ics bildefil (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
- Åpne de .ics bildefilene ved hjelp av den fritt tilgjengelige programvaren Time Resolved Imaging (se Materialfortegnelse). Bruk to-eksponentialfunksjoner for å passe fosforescenshenfallene.
- Åpne de monterte .ics bildefilene med den tilgjengelige programvaren for bildeanalyse (se Materialfortegnelse).
- Bruk oppslagstabeller til å generere levetidsbilder for fosforescens og kode dem i pseudofargeskala (f.eks. blå farge for korte levetider og rød for lang levetid). Bruk Mål-funksjonen til å beregne gjennomsnittlige levetidsverdier for hele bildet eller bestemte interesseområder (ROI).
- Konverter levetidsverdiene til oksygenkonsentrasjonen ved å bruke ligningen oppnådd ved montering av O 2-kalibreringen av sonden36.
MERK: Ligning (2) ble brukt til dette arbeidet:
O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For ex vivo avbildningsapplikasjoner ble fragmenter av tarmvev farget ved lokal påføring av NanO2-IR-sonden på serosalsiden av vevet. For dypere farging ble 1 μL av sonden injisert i lumen. I sistnevnte tilfelle skjermet den 0,2-0,25 mm tykke tarmveggen sonden fra kameraet. De to fargeprosessene er vist i figur 2A.
De resulterende intensitets- og PLIM-bildene er presentert i figur 2B-G. Fargene gjenspeiler tydelig forskjellen i levetidsverdier og dermed forskjellen i oksygenering av serosale og slimhinnesider av vevet. Figur 2C og figur 2D refererer til lignende sett med vev som ble farget topisk (figur 2C) og intraluminalt (figur 2D). Som forventet viste vevene lignende PLIM-mønstre. Den intraluminale fargingen av slimhinnesiden av vevet (figur 2D) viste imidlertid høyere levetidsverdier, noe som reflekterte lavere oksygenering i tarmens indre overflate, sammenlignet med topikal farging av serosalsiden (figur 2C), som viste lavere levetid. Dette reflekterer høyere oksygenering i tarmens ytre overflate.
For å undersøke stabiliteten til livstidssignalene og respirasjonsaktiviteten i tarmen ble det utført en time-lapse PLIM-analyse på de intraluminalt fargede prøvene over 2 timer (figur 2D-G). En økning i levetidsverdiene ble observert mellom 15 minutter (54,4 μs ± 0,9 μs) og 2 timer (61,1 μs ± 0,8 μs ) av inkubasjonen, noe som gjenspeiler en reduksjon iO2-nivåer i tarmens luminale del. I tillegg viser de laveO2-nivåene etter 2 timers inkubasjon at vevets respirasjon fortsatte i hele perioden med disseksjon, forberedelse, farging, inkubasjon og avbildningstrinn. I tillegg kan endringen i formen på lumen observert i figur 2D-G tilskrives fordelingen av sonden injisert i lumen, noe som betyr at LT-signalet reflekterer området der sonden befinner seg.
For å vurdere den fremtidige ytelsen til bildeapparatet in vivo, ble det utført en innledende studie på avbildning av hypoksi i podede subkutane svulster dyrket hos mus umiddelbart etter ofring (figur 3). I dette tilfellet ble Balb/c-mus injisert subkutant i høyre flanke med 200 μL av en blanding av CT26-celler, som var ufarget eller farget med en 0,05 mg/ml NanO2-IR-sonde. PLIM ble utført på den syvende dagen av tumorveksten, og musene ble ofret like før avbildningen (dvs. post mortem). Bilder av svulstområdene i musene på den syvende vekstdagen er vist i figur 3A,B.
Intensitetsbildene (venstre) og PLIM (høyre) for tumorområdene i musene på den syvende dagen av tumorvekst (figur 3B) viser ytelsen og følsomheten til både bildeapparatet og sonden i slike eksperimenter (mer detaljerte statistiske data ikke vist). Dyrene ble avbildet i 20 s hver. Musenes venstre flanker ble barbert og avbildet som blanke. De produserte ingen PLIM-signaler. I motsetning til dette produserte regioner med svulsten og sonden stabile levetidssignaler på ~ 50 μs. Målet med dette eksperimentet var å evaluere brukbarheten til bildeapparatet for in vivo-studier med levende dyr og modeller av menneskelig sykdom. Mens denne delen viste foreløpige kvalitative resultater, er en tilsvarende artikkel under utarbeidelse, som gir en grundigere kvantitativ vurdering.
Deretter ble bildeapparatet også demonstrert i PLIM-avbildning av sensormaterialer basert på Pt(II)-porfyrinfargestoffer. Den kjemiske strukturen til Pt-oktaetylporfinfargestoff (PtOEP) og tekniske detaljer om fremstillingen av de tilsvarende sensormaterialene er beskrevet andre steder 6,39. De PtOEP-polystyrenbaserte fosforescerende solid-state sensorbeleggene avsatt på en gjennomsiktig polyesterfilm (Mylar) som små flekker ble avbildet ved å senke filmen i PBS-buffer (luftmettet oksygenert tilstand) eller i PBS inneholdende glukose og glukoseoksidase, noe som gir en fullstendig deoksygenert tilstand. Livstidssignalene oppnådd i oksygenerte (25,6 μs ± 0,5 μs) og deoksygenerte forhold (65,7 μs ± 1,5 μs) stemte overens med resultatene rapportert tidligere6. Intensitets- og PLIM-bildene av de oksygenerte og deoksygenerte sensorene er gitt i figur 4A, B.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett av imager38. Gjengitt med tillatelse fra Sen et al.38. Opphavsrett: Det optiske selskap. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: O2 PLIM av de topisk og intraluminalt fargede tarmprøvene fra mus. (A) Illustrasjon av de to fargemetodene ved bruk av (B) fosforescensintensitet og (C) PLIM-bilder av tarmen lokalt farget med NanO2-IR-sonden. (VG Nett) Timelapse PLIM i tarmen med intraluminalt farget tarm ved 15 minutter, 30 minutter, 1 time og 2 timer etter farging. PLIM-bildene presenteres i en pseudofargeskala: den blå fargen tilsvarer en lavere levetid, og den røde fargen tilsvarer høyere levetidsverdier. Skalastenger = 5 mm. Forkortelse: PLIM = fosforescens levetid imaging mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: O2 PLIM av podede svulster i musenes høyre flanker . (A) Grafisk illustrasjon av tumorutvikling hos levende dyr. Fosforescensintensitet (venstre) og PLIM (høyre) bilder av tumorområder på (B) syvende dag av tumorvekst. PLIM-bildet presenteres i en pseudofargeskala: den blå fargen tilsvarer en lavere levetid, og den røde fargen tilsvarer høyere levetidsverdier. Skala bar = 5 mm. Forkortelse: PLIM = fosforescens levetid imaging mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fosforescensintensitet for det PtOEP-baserte sensorpunktet. Fosforescensintensitet (venstre) og PLIM (høyre) bilder av PtOEP-sensorpunktet i (A) oksygenerte og (B) deoksygenerte tilstander. PLIM-bildene presenteres i en pseudofargeskala: den blå tilsvarer en lavere levetid, og den røde fargen tilsvarer høyere levetidsverdier. Forkortelser: PLIM = fosforescens levetid imaging mikroskopi; PtOEP = platinaoktetylporfyrin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene ovenfor gir en detaljert beskrivelse av monteringen av den nye bildeapparatet og dens drift i mikrosekund FLIM / PLIM-modus. Den TCSPC-baserte nye generasjonen Tpx3Cam-kamera, kombinert ved hjelp av den optomekaniske adapteren Cricket med bildeforsterkeren, utslippsfilteret og makroobjektivet, produserer en stabil, kompakt og fleksibel optisk modul som er enkel å betjene. Bildeapparatet ble vist å fungere godt med en rekke forskjellige prøver og analytiske oppgaver, som inkluderte karakterisering av fosforescerende materialer og levende vev O2-avbildning. Den nær-infrarøde Pt(II)-benzoporfyrinbaserte cellepermeable løselige sonden NanO2-IR og de rødemitterende Pt(II)-porfyrinbaserte solid-state-sensorene ble brukt i bildeeksperimentene. Disse sensorene har blitt brukt til slukket fosforescensdeteksjon av O2 på grunn av deres store Stokes skift, lang utslippslevetid, høy følsomhet, rask respons og god fotokjemisk stabilitet.
Disse forskjellige O 2-følsomme sondene og solid-state-beleggene, når de ble testet på makrobildeapparatet, ga resultater som er i samsvar med tidligere publiserte data40. Materialene viste god ensartethet, kontrast og levetidsrespons på endrede miljøforhold, spesielt når det gjelder temperatur og oksygeneringstilstand. Sammenligningen av disse resultatene med de som er produsert på det konfokale TCSPC-PLIM-mikroskopet, viser at den nye bildeapparatet er nøyaktig, har bedre levetidsavlesninger og skaffer PLIM-bilder med høy hastighet og følsomhet28,38,40.
Bildeapparatet viste også lovende ytelse med fosforescerende fargede biologiske prøver av forskjellige typer. Dermed ble detaljerteO2-konsentrasjonskart produsert for prøvene som inneholdt suspensjoner av fargede respirasjonsceller, levende postmortem dyrevev, hele organer og podede svulster. Bildeapparatet har gitt målinger av levetidsverdier fra overflaten og til og med på dybder på opptil 0,5 mm inne i vevet28,36,38.
Siden fosforescens levetidsverdier er sterkt påvirket av temperatur41, er det nødvendig å implementere tett temperaturkontroll av de avbildede prøvene, for eksempel ved å bruke et oppvarmet prøvetrinn og / eller et inkubatorkammer. Mens du bruker UV-eksitasjon, er det viktig å nøye velge prøveholderne, da mange materialer har autofluorescens i dette spektralområdet, noe som påvirker prøvens sanne levetidsverdi. All PLIM-avbildning i denne studien ble utført med en LED-effekt på 4 V og en pulsbredde på 50 ns for en integrasjonstid på 20 s; Disse parametrene kan imidlertid justeres etter behov. Omtrent 104 500 bilder er registrert i løpet av 20-tallet av bildeinnsamlingstiden. Til slutt er det viktig å utføre målingene i et mørkt kammer for å unngå forstyrrelser i omgivelseslyset.
Dermed kan PLIM-avbildningen utføre raske, kvantitative levetidsmålinger med makroskopiske objekter av betydelig størrelse. Mens laserskanning av PLIM-TCSPS er mulig, ville det være for sakte på grunn av de lange oppholdstidene som kreves for oksygenfølende fargestoffer. Dette bildet er imidlertid raskt og kan ta opp alle pikslene samtidig. Videre kan intensitetsbaserte målinger påvirkes av fluorescerende / fosforescerende fargestoffkonsentrasjon, en ustabil LED- eller laserintensitet, fotobleking, justering av de optiske komponentene og spredning fra prøvene. Den TCSPC-baserte makroavbildningen er derimot i hovedsak uavhengig av disse faktorene. Derfor kan den utføre nøyaktige og kalibreringsfrie målinger av O2. Ulempene med kameraet inkluderer dets relativt komplekse databehandling og store datastørrelser (~ 2 Gb).
I fremtiden kan bildeapparatet også brukes ikke bare til å kartleggeO2-konsentrasjoner , men også andre kjemiske og biokjemiske parametere for testede prøver, for eksempel pH og glukosedynamikk, ved hjelp av tilsvarende sonder eller sensorer. Dette gjør det til et nyttig verktøy for fysiologiske studier med ulike vevs- og sykdomsmodeller. Bildeapparatet kan også oppgraderes til å fungere i nanosekund FLIM-modus. Dette krever imidlertid utskifting av de nåværende lysdiodene med en raskere eksitasjonskilde (f.eks. en ps-laser). Systemdrift i dobbel PLIM/FLIM-modus er også hovedsakelig mulig.
Alt i alt demonstrerer imageren enkelhet og allsidighet, sammen med god funksjonalitet og driftsytelse i widefield TCSPC-PLIM-applikasjoner. Kommersielt tilgjengelige bredfeltsbilder utfører for det meste intensitetsbasert avbildning, der fosforescerende intensiteter kan påvirkes av faktorer som fotobleking, målegeometri, spredning fra prøver, etc. Den nåværende bildeapparatet er basert på levetidsbilder, noe som gjør målingene mer kvantitative enn kvalitative. Videre gir integrasjonen av Tpx3Cam optisk kamera med Cricket-adapteren og bildeforsterkeren enkeltfoton følsomhet, enkelhet, fleksibilitet og robusthet av målingene. I motsetning til andre systemer kan den bæres til forsøksstedet og roteres 360 ° basert på kravene til prøven og måleoppgaven. Med sitt nåværende mål, som er enkelt å endre for et annet objektiv, kan bildeapparatet måle prøver på opptil 18 mm x 18 mm i størrelse i løpet av få sekunder og med en høy romlig oppløsning på 256 piksler x 256 piksler. Denne artikkelen beskriver trinnvise prosedyrer for hvordan du klargjør prøver for testing og bruk av bildeapparatet i de forskjellige PLIM-applikasjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til dette arbeidet fra Science Foundation Ireland, tilskudd SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 og 18/SP/3522, og Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) er takknemlig anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
- Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M.
