Summary
Het huidige protocol beschrijft een procedure voor het uitvoeren van fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie (FSEC) op membraaneiwitten om hun kwaliteit te beoordelen voor downstream functionele en structurele analyse. Representatieve FSEC-resultaten verzameld voor verschillende G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) onder wasmiddel-opgeloste en detergent-vrije omstandigheden worden gepresenteerd.
Abstract
Tijdens structurele opheldering van membraaneiwitten en biofysische karakterisering is het gebruikelijk om talrijke eiwitconstructen te testen die verschillende tags, afkappingen, deleties, fusiepartnerinvoegingen en stabiliserende mutaties bevatten om er een te vinden die niet is geaggregeerd na extractie uit het membraan. Bovendien is bufferscreening om het wasmiddel, additief, ligand of polymeer te bepalen dat de meest stabiliserende conditie voor het membraaneiwit biedt, een belangrijke praktijk. De vroege karakterisering van de kwaliteit van membraaneiwitten door fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie biedt een krachtig hulpmiddel om verschillende constructies of omstandigheden te beoordelen en te rangschikken zonder de vereiste voor eiwitzuivering, en deze tool minimaliseert ook de monsterbehoefte. De membraaneiwitten moeten fluorescerend worden gelabeld, meestal door ze uit te drukken met een GFP-tag of iets dergelijks. Het eiwit kan direct uit hele cellen worden opgelost en vervolgens ruw worden geklaard door centrifugeren; Vervolgens wordt het eiwit doorgegeven via een grootte-uitsluitingskolom en wordt een fluorescerend spoor verzameld. Hier wordt een methode voor het uitvoeren van FSEC en representatieve FSEC-gegevens op de GPCR-doelen sphingosine-1-fosfaatreceptor (S1PR1) en serotoninereceptor (5HT2AR) gepresenteerd.
Introduction
Size exclusion chromatography (SEC), ook bekend als gelfiltratiechromatografie, wordt vaak gebruikt in de eiwitwetenschap1. Tijdens SEC worden eiwitten gescheiden op basis van hun hydrodynamische straal, die een functie is van de eiwitgrootte en -vorm2. Kortom, deze scheiding wordt bereikt door de eiwitmonsters onder stroom aan te brengen op een gepakt bed van poreuze kralen die fungeren als een moleculaire zeef. De gebruikte kralen zijn vaak verknoopte agarose met een gedefinieerd bereik van poriegroottes om eiwitten toe te staan om de poriën van de kralenbinnen te dringen of te worden uitgesloten 3,4,5,6,7. Eiwitten met kleinere hydrodynamische stralen brengen een groter deel van de tijd door in de poriën en stromen dus langzamer door het ingepakte bed, terwijl grotere eiwitten een groter deel van de tijd buiten de kralen doorbrengen (het uitgesloten volume) en sneller door het ingepakte bed bewegen. SEC kan worden gebruikt als een eiwitzuiveringsstap wanneer een preparatieve kolom wordt gebruikt1. Wanneer een analytische kolom wordt gebruikt, kan SEC worden gebruikt om de eiwitkwaliteit en -eigenschappente analyseren 2. Eiwitaggregaten die bijvoorbeeld in een monster aanwezig kunnen zijn en wijzen op eiwitten van slechte kwaliteit, zijn meestal erg groot, wat betekent dat ze alleen in het uitgesloten volume reizen en dus op het vroegste punt uit de kolom worden geëlueerd; Dit volume wordt het kolomleeg- of leegtevolume genoemd. Bovendien kunnen moleculaire gewichtsnormen worden gebruikt om de kolom te kalibreren, waardoor een geschat molecuulgewicht van het eiwit van belang kan worden geïnterpoleerd uit een standaardcurve.
Meestal wordt de eiwitabsorptie bij 280 nm gebruikt om de eiwitelutie te controleren vanuit een grootte-uitsluitingskolom. Dit beperkt het gebruik van SEC als analysetool totdat het eiwit van belang grotendeels vrij is van verontreinigende eiwitten, bijvoorbeeld in de laatste stap van eiwitzuivering. Fluorescerende SEC (FSEC) maakt echter gebruik van een interessant eiwit dat fluorescerend is gelabeld. Daarom kan een fluorescerend signaal worden gebruikt om specifiek de elutie van het eiwit van belang te controleren in de aanwezigheid van andere eiwitten of zelfs ruwe mengsels 8,9. Omdat fluorescerende signalen bovendien zeer gevoelig zijn, kan een succesvolle analyse worden uitgevoerd op monsters met extreem lage eiwithoeveelheden. Het eiwit van belang wordt vaak fluorescerend gelabeld door een groen fluorescerend eiwit (GFP) of verbeterde GFP (eGFP) tag op te nemen in het expressieconstruct. Het fluorescerende signaal kan vervolgens worden bewaakt door excitatie bij 395 nm of 488 nm en het detecteren van de fluorescerende emissie bij 509 nm of 507 nm voor GFP of eGFP, respectievelijk10.
Het voordeel van het gebruik van een fluorescerend signaal om eiwitelutie van een SEC-kolom te controleren, maakt FSEC een waardevol hulpmiddel voor het analyseren van membraaneiwitmonsters wanneer de expressieniveaus bijzonder slecht zijn in vergelijking met oplosbare eiwitten. Cruciaal is dat de kwaliteit en eigenschappen van membraaneiwitten direct na oplosbaarheid uit ruwe lysaten kunnen worden geanalyseerd zonder de noodzaak om het zuiveringsproces eerst te optimaliseren11,12. Om deze redenen kan FSEC worden gebruikt om de kwaliteit van het membraaneiwit snel te analyseren en tegelijkertijd de verschillende factoren te onderzoeken die nodig kunnen zijn om het gedrag van het membraaneiwit in oplossing te verbeteren. Het is bijvoorbeeld gebruikelijk om talloze constructen te testen die verschillende tags, afkappingen, deleties, fusiepartnerinvoegingen en stabiliserende mutaties bevatten om er een te vinden die niet is geaggregeerd na extractie uit het membraan13,14. Bovendien kan bufferscreening om het detergent, additief, ligand of polymeer te bepalen dat de meest stabiliserende conditie voor het membraaneiwit biedt, de beste buffersamenstelling definiëren voor eiwitzuivering of voor het bieden van stabiliteit voor downstream-toepassingen, zoals biofysische testen of structurele karakterisering.
Het algemene doel van de FSEC-methode is dus om een SEC-kolomelutieprofiel te verzamelen voor een doelmembraaneiwit van belang. Bovendien, omdat fluorescentie wordt gebruikt, wordt dit SEC-spoor verzameld op het vroegst mogelijke punt in de optimalisatie van de constructies en omstandigheden voorafgaand aan een langdurige zuivering. Het FSEC-spoor kan worden gebruikt als een vergelijkend hulpmiddel om de kans op succes van het zuiveren van een membraaneiwit met verschillende buffercondities of membraaneiwitconstructies te beoordelen. Op deze manier kan de verzameling FSEC-profielen worden gebruikt als een snel iteratief proces om te komen tot een optimaal constructieontwerp en buffersamenstelling voordat de inspanning wordt besteed aan het genereren van de hoeveelheden zuiver eiwit die nodig zijn voor andere analysemethoden.
Protocol
1. Was- en buffervoorbereiding voor FSEC
- Bereid een wasmiddelvoorraadoplossing.
- Om een stockoplossing van 20 ml te bereiden, weegt u 4 g dodecyl maltoside (DDM) poeder en 0,4 g cholesterylhemisuccinaat (CHS) poeder af en maakt u het tot 20 ml met gedestilleerd H2O van laboratoriumkwaliteit.
- Na het toevoegen van alle componenten, meng met end-over-end inversie bij 4 °C totdat de componenten volledig zijn opgelost. Een nachtelijke end-over-end menging bij 4 °C wordt aanbevolen.
- Aliquot en bewaar de wasmiddelvoorraden bij −20 °C tot gebruik. Als de voorraad onmiddellijk moet worden gebruikt, bewaar de wasmiddelvoorraad dan op ijs.
OPMERKING: De standaard wasmiddelenvoorraad die bij dit werk werd gebruikt, was een mengsel van 20% (w/v) DDM en 2% (w/v) CHS (zie materiaaltabel). Verschillende wasmiddelen kunnen worden gebruikt (bijv. lauryl maltose neopentyl glycol; LMNG), of het gebruik van wasmiddelvrije extractie met polymeren zoals styreen-maleïnezuur (SMA) kan worden getest. Dit moet worden besloten bij het ontwerpen van de te testen experimentele omstandigheden.
- Bereid een oplosbuffer voor.
- Bereid een oplosbuffer door het juiste gewicht of volume van de componenten te combineren om een eindconcentratie van 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20 % (v/v) glycerol en 1x proteaseremmercocktail (zie materiaaltabel) in een bekerglas te bereiken.
OPMERKING: In deze studie was de bereiding van 50 ml oplosbaarheidsbuffer voldoende voor het verwerken van vijf monsters. - Voeg een volume van 0,7 ml (bijv. 35 ml bij het maken van 50 ml buffer) gedestilleerd H2O van laboratoriumkwaliteit toe aan het bekerglas.
- Meng op een magneetroerder en stel met behulp van een pH-meter de pH van de buffer in op 7,5 door de druppelsgewijze toevoeging van geconcentreerde NaOH.
- Vul met behulp van een meetcilinder de buffer aan tot het uiteindelijke vereiste volume met gedestilleerd H2O van laboratoriumkwaliteit.
- Bereid een oplosbuffer door het juiste gewicht of volume van de componenten te combineren om een eindconcentratie van 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20 % (v/v) glycerol en 1x proteaseremmercocktail (zie materiaaltabel) in een bekerglas te bereiken.
- Bereid de sec-loopbuffer voor.
- Bereid de SEC-loopbuffer voor door het juiste gewicht of volume van de componenten te combineren om een eindconcentratie van 100 mM HEPES, 150 mM NaCl en 10% (v/v) glycerol in een bekerglas te bereiken.
OPMERKING: In de huidige studie was het voorbereiden van 600 ml SEC-buffer voldoende voor het uitvoeren van vijf monsters. - Voeg een volume van 0,7 ml (bijv. 420 ml bij het maken van 600 ml buffer) gedestilleerd H2O van laboratoriumkwaliteit toe aan het bekerglas.
- Meng op een magneetroerder en stel met behulp van een pH-meter de pH van de buffer in op 7,5 door de druppelsgewijze toevoeging van geconcentreerde NaOH.
- Vul met behulp van een meetcilinder de buffer aan tot het uiteindelijke vereiste volume met gedestilleerd H2O van laboratoriumkwaliteit.
- Filtreer de SEC-buffer door een poriënfilter met een poriënfilter van 0,45 μm onder vacuüm (zie materiaaltabel).
- Zodra de buffer door het filter is gegaan, ontgast u deze door deze onder het vacuüm te laten totdat er geen bellen meer verschijnen wanneer u deze schudt.
- Voeg een eindconcentratie van 0,03% (g/v) DDM en 0,003% (w/v) CHS toe aan de SEC-buffer door het vereiste volume van de wasmiddelvoorraad toe te voegen die in stap 1 is bereid (bijvoorbeeld 0,9 ml bij het maken van 600 ml SEC-buffer).
- Koel de buffer voor gebruik voor.
OPMERKING: Verschillende buffers kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de geteste omstandigheden. Als bijvoorbeeld het effect van verschillende wasmiddelen op het eiwit van belang wordt getest, zou idealiter een buffer met hetzelfde wasmiddel moeten worden gemaakt als degene die wordt gebruikt om het eiwit op te lossen. Bij het testen van wasmiddelvrije omstandigheden met SMA moet het wasmiddel volledig uit de SEC-buffer worden weggelaten. Zie echter de discussiesectie voor meer informatie over protocolwijzigingen voor het screenen van reinigingsmiddelen.
- Bereid de SEC-loopbuffer voor door het juiste gewicht of volume van de componenten te combineren om een eindconcentratie van 100 mM HEPES, 150 mM NaCl en 10% (v/v) glycerol in een bekerglas te bereiken.
2. Monstervoorbereiding voor FSEC
- Bereid de celkorrels voor.
OPMERKING: Het startpunt voor de test is het oogsten van de celpellet uit een suspensiecelexpressiecultuur van het GFP-gelabelde (of een ander fluorescerend gelabeld) eiwit van belang. De exacte timing en omstandigheden voor de oogst zullen afhangen van het eiwit dat wordt uitgedrukt, de cellijn die wordt gebruikt, de omstandigheden waarin de cellen zijn gekweekt en de methode waarmee eiwitexpressie is geïnduceerd. Deze gegevens vallen buiten het toepassingsgebied van dit protocol. In deze studie werd 0,5-1 g Sf21-celpellet gebruikt per te testen aandoening, overeenkomend met 25-50 ml cultuur 2-3 dagen na infectie met ongeveer 4 x 106 levensvatbare cellen / ml van een 1:20 verdunning van P2-baculovirus. Houd er rekening mee dat het hier beschreven protocol is getest en even goed blijkt te werken met vergelijkbare natte gewichten van celpellets van andere eukaryotische cellijnen (bijv. HEK293E).- Wanneer de cellen uit de suspensieculturen klaar zijn om te oogsten, breng dan 25-50 ml kweekaliquots over naar 50 ml conische buizen.
- Tegenwicht bieden aan de buizen en gebruik een benchtopcentrifuge in een uitklapbare emmer (zie materiaaltabel) bij 2.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
- Verwijder en gooi het kweeksupernatant weg door het voorzichtig weg te kieperen, of gebruik een pipet van 50 ml met een pipetvuller als de celkorrel bijzonder los zit.
- Als de cellen onmiddellijk voor analyse worden gebruikt, plaatst u de celpellet op ijs en gaat u direct verder met stap 5. Als de cellen moeten worden bewaard voor gebruik in een later stadium, vries de cellen dan in door ze bij -80 °C te plaatsen.
- Als de celkorrel bij -80 °C is bewaard, ontdooi deze dan snel door hem gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen of totdat het monster niet langer bevroren is. Verplaats het monster onmiddellijk naar ijs na deze stap.
- Suspensie en oplossing het monster.
- Voeg 2 ml van de oplosbuffer (stap 1.2) toe aan de celpellet.
- Incubeer met end-over-end inversie bij 4 °C gedurende 15-30 minuten tot het homogeen is.
- Voeg voorgemengde wasmiddelvoorraad (stap 1.1) toe (bijv. 100 μL 20% DDM/2% CHS-voorraad) voor een eindconcentratie van 1% DDM/0,1% CHS.
- Solubilize gedurende 30 min met end-over-end inversie bij 4 °C.
OPMERKING: Indien gewenst kunnen meerdere omstandigheden parallel worden getest. Het aantal parallelle monsters dat tegelijkertijd kan worden verwerkt, is afhankelijk van het beschikbare systeem voor het uitvoeren van het SEC-experiment. In de hier beschreven opstelling was het mogelijk om maximaal vijf monsters tegelijk te verwerken.
- Voer een centrifugatiestap met lage snelheid uit.
- Centrifugeer het monster in een voorgekoelde (4 °C) tafelcentrifuge in een uitklapbare emmer bij 2.000 x g gedurende 15 minuten.
- Voer een snelle centrifugatiestap uit.
- Breng het supernatant voorzichtig over van de centrifugatie bij lage snelheid naar ultracentrifugatiebuizen (bijv. Buizen van 0,5-2 ml) met behulp van een naald met stomp uiteinde die is bevestigd aan een spuit van 5 ml, waarbij u voorzichtig moet zijn om de pellet niet te storen van de spin bij lage snelheid.
- Balanceer paren buizen tot op 0,05 g en plaats ze in een ultracentrifugatierotor met vaste hoek (zie materiaaltabel).
- Centrifugeer bij 4 °C gedurende 30 minuten bij 250.000 x g.
3. Grootte uitsluiting chromatografie (SEC)
- Bereid het snelle eiwitvloeistofchromatografiesysteem (FPLC) voor en breng de kolom in evenwicht.
- Bereid het systeem voor volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel), bijvoorbeeld door het systeem te vullen met SEC-buffer en de pompen van lucht te zuiveren.
- Sluit de SEC-kolom aan op de FPLC en zorg ervoor dat er geen lucht in de kolom komt. Dit wordt bereikt door tegendruk uit te oefenen op de SEC-kolom met een spuit gevuld met water (bevestigd aan de onderkant van de kolom) om een drop-to-drop-verbinding uit te voeren met het stroompad van het FPLC-systeem.
- Breng de SEC-kolom vooraf in evenwicht door deze eerst te wassen in 1,5 kolomvolumes (36 ml voor een kolom van 24 ml) gedestilleerd en gefilterd H2O van laboratoriumkwaliteit, gevolgd door 1,5 kolomvolumes SEC-buffer bij de aanbevolen stroomsnelheid en druk voor de kolom (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Het FPLC-systeem dat in deze studie werd gebruikt om FSEC uit te voeren, bevond zich in een koude omgeving en had een lusklep met vijf posities en een plaatfractiecollector met zes posities. Met deze opstelling kunnen vijf monsters worden geladen en sequentieel op dezelfde kolom worden uitgevoerd op een geautomatiseerde manier zonder handmatige tussenkomst tussen de runs. Voor het uitvoeren van de SEC-experimenten werd een in de handel verkrijgbare voorverpakte kolom van 24 ml gebruikt (zie materiaaltabel), die een hars bevatte waarmee eiwitten in het molecuulgewichtsbereik van 10-600 kDa konden worden opgelost. Als het eiwit van belang bijzonder groot is, kan in plaats daarvan een alternatieve kolommatrix worden gebruikt, waardoor eiwitten tot 5.000 kDa in molecuulgewicht kunnen worden gescheiden. Houd er rekening mee dat de aanwezigheid van wasmiddel/lipidemicel de totale grootte van het membraaneiwit met > 150 kDa zal vergroten, afhankelijk van het gebruikte eiwit en wasmiddel.
- Pas het voorbeeld toe op de kolom en voer het SEC-experiment uit.
- Breng het supernatant van de snelle centrifugatiestap over in een spuit van 1 ml met behulp van een naald met stomp uiteinde die aan de spuit is bevestigd. Dit maakt monsterterugwinning uit de centrifugebuis mogelijk zonder de pellet te verstoren.
- Stel de voorbeeldlus in om te laden. Vul een monsterlus van 500 μl over door 600-700 μl van het monster uit de spuit in de laadpoort te injecteren. Afhankelijk van het gebruikte systeem kan deze laadstap in de methode worden geprogrammeerd om ervoor te zorgen dat er geen fouten worden gemaakt.
- Injecteer tijdens de methode het monster uit de lus in de kolom door het te legen met 4 ml SEC-buffer bij het aanbevolen debiet en de aanbevolen druk voor de kolom (zie materiaaltabel).
- Voer de kolom uit met hetzelfde debiet totdat 1,5 kolomvolumes (36 ml voor een kolom van 24 ml) van de buffer zijn doorgegeven.
- Begin bij 0,25 van het kolomvolume (6 ml voor een kolom van 24 ml) met het verzamelen van 0,2 ml fracties om 90 fracties te verzamelen.
OPMERKING: Aangezien het leegtevolume van de kolom naar verwachting 0,3 kolomvolumes zal zijn, zorgt het begin van het verzamelen van fracties onmiddellijk voorafgaand aan dit volume ervoor dat de elutie van al het eiwit wordt gecontroleerd, inclusief alle eiwitten die aanwezig zijn in het leegtevolume.
4. Fluorescerende sporenverzameling en -analyse
- Breng de monsters van de fractiecollector (stap 3.2.5) over naar een plaat met 96 putten en lees het fluorescerende signaal af.
- Voordat u een fluorescentiemeting uitvoert, verdunt u de verzamelde monsters. Breng met behulp van een meerkanaalspipet 90 μL gedestilleerd H2O van laboratoriumkwaliteit over van een reservoir naar elke put van een ondoorzichtige plaat met 96 putten met vlakke bodem (zie materiaaltabel).
- Als fracties tijdens stap 3.2.5 in een blok met 96 putten zijn verzameld, gebruikt u een meerkanaalspipet om 10 μl van de SEC-fracties van het blok over te brengen naar de ondoorzichtige 96-putplaat met vlakke bodem en mengt u door op en neer te pipetteren. Anders, als SEC-fracties tijdens stap 3.2.5 in afzonderlijke buizen werden verzameld, breng dan 10 μL van elke fractie één voor één over naar de ondoorzichtige 96-putplaat met platte bodem, waarbij elke keer op en neer wordt gepipetteerd om de monsters te mengen.
- Plaats de ondoorzichtige vlakke bodemplaat met 96 putten in de plaatlezer en meet de fluorescentie. Als GFP het fluorescerende label is (hier gebruikt), stelt u de excitatie zo dicht mogelijk bij 488 nm in en detecteert u de fluorescerende emissie zo dicht mogelijk bij 507 nm.
OPMERKING: De verdunning die nodig is voordat de fluorescentiewaarde wordt uitgevoerd, is afhankelijk van de totale hoeveelheid eiwit die van belang is in de uitdrukkingscultuur en de gevoeligheid van de gebruikte plaatlezer. In de voorbeelden die in deze studie werden getoond, werden de monsters 10-voudig verdund in water. Als suggestie voor een startpunt moeten de fracties 5-10-voudig worden verdund in water of buffer voordat ze worden gedetecteerd. Als het geregistreerde FSEC-sporensignaal bijzonder laag is, kunnen in plaats daarvan kleinere verdunningen of zelfs een onverdund monster worden gebruikt. Het apparaat dat in deze studie voor detectie werd gebruikt, was een plaatlezer die in staat was tot excitatie bij 488 nm en fluorescerende emissie bij 507 nm (zie materiaaltabel).
- Plot de FSEC-sporen.
- Exporteer de gegevens van de plaatlezer in een RAW-indeling (onbewerkte tekst of een bestand met door komma's gescheiden waarden). Deze ruwe gegevens worden uitgezet op de Y-as van het FSEC-spoor.
- Bereken voor de X-as het volume waarbij elke fractie werd verzameld. De eerste put moet het elutievolume zijn waarbij de eerste fractie werd verzameld om rekening te houden met de fractioneringsvertraging (6 ml in dit voorbeeld). De fracties hierna moeten achtereenvolgens toenemen met het verzamelde fractievolume (0,2 ml in dit voorbeeld).
- Zodra de gegevens van de X-as en de Y-as zijn berekend, kopieert en plakt u de gegevens in de grafische software (zie Materiaaltabel) om het fluorescerende signaal in elke put uit te zetten tegen het volume waarmee het uit de kolom is geëlueerd.
OPMERKING: Figuur 1 toont een schematische weergave van de stappen die nodig zijn om een FSEC-experiment uit te voeren.
- Analyseer de FSEC-sporen.
- Beoordeel de hoeveelheid eiwitelutie bij het leegtevolume (ongeveer 8 ml voor een kolom van 24 ml), wat aangeeft dat het eiwit zeer groot is en waarschijnlijk ongevouwen / geaggregeerd is.
- Beoordeel de hoeveelheid eiwiteluting in eventuele latere pieken, die wijzen op gevouwen eiwit. Dit zal naar verwachting tussen 10 ml en 16 ml zijn voor een kolom van 24 ml, afhankelijk van de eiwitgrootte (indien geassocieerd met een wasmiddel / lipidemicel). Let goed op de piekvorm, vooral als het een brede of gespleten piek is van meer dan 3-4 ml (voor een kolom van 24 ml), omdat dit duidt op een polydisperse monster.
- Bereken de verhouding tussen de monomere piekhoogte en de leegtepiekhoogte door het maximale signaal dat in de monomeerpiek is opgenomen te delen door het maximale signaal in de leegtepiek.
OPMERKING: Deze waarde vertegenwoordigt de monodispersiteitsindex en maakt een kwantitatieve meting van de eiwitkwaliteit mogelijk; Grotere waarden geven de best mogelijke kwaliteit aan, terwijl waarden onder 1 duiden op problematische monsters, omdat ze meer geaggregeerd eiwit hebben dan gevouwen eiwit. - Als meerdere FSEC-runs moeten worden vergeleken en het belangrijkste kenmerk is de hoeveelheid monomeer in elk geval, plot de sporen als het ruwe signaal dat door de plaatlezer wordt geregistreerd (bijv. RFU).
OPMERKING: Als een vergelijking van de hoeveelheid monomeer in vergelijking met het ongevouwen eiwit belangrijker is, moet het signaal worden genormaliseerd tot een percentage van het totale signaal met behulp van de minimale en maximale metingen in het spoor, wat de verschillen in de verhouding tussen geaggregeerd en monomeer eiwit tussen de sporen zal accentueren.
Figuur 1: Schematische weergave van de stappen die nodig zijn om een FSEC-experiment uit te voeren. (1) Cellen die het fluorescerend gelabelde eiwit van belang tot expressie brengen, worden opgelost. (2) De ruwe oplosbaarheid wordt eerst geklaard met een spin met lage snelheid, gevolgd door (3) een spin met hoge snelheid. (4) Het geklaarde monstersupernatant wordt geladen en uitgevoerd op een geschikte SEC-kolom, en (5) de fracties worden verzameld. (6) Monsters van de fracties worden overgebracht naar een 96-well plaat en een GFP-fluorescerend signaal wordt gedetecteerd met behulp van een plaatlezer om (7) het FSEC-spoor te plotten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
Eerst werden het dynamisch bereik en de ondergrenzen van eGFP-detectie voor de plaatlezer die in deze studie werd gebruikt, onderzocht. Een gezuiverde eGFP-standaard met een bekende concentratie werd in een eindvolume van 50 μL verdund tot 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 ng·μL−1 en 0,390625 ng·μL−1, en de fluorescentie werd afgelezen met een excitatie van 488 nm en een emissie van 507 nm (figuur 2 ). Dit experiment gaf aan dat de plaatlezer een lagere detectiegrens had van 30 ng eGFP-gelabeld eiwit per put en een dynamisch bereik van maximaal 500 ng eGFP-gelabeld eiwit per put vóór signaalverzadiging. Met behulp van de waarde voor de ondergrens en ervan uitgaande dat de eiwitelutie beperkt is tot 0,33 van het kolomvolume, is slechts 1,28 μg eGFP-gelabeld eiwit van belang vereist voor SEC-kolombelasting om een detecteerbaar FSEC-signaal te kunnen waarnemen.
Figuur 2: eGFP-standaardcurve. Spreidingsgrafiek van het fluorescerende signaal voor gezuiverde eGFP-standaard verdund tot 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 en 0,390625 ng·μL−1. (A) Alle verdunningen worden weergegeven, ook die met het verzadigde signaal. (B) Een ingezoomde spreidingsgrafiek met alleen de standaarden die in het dynamisch bereik van de plaatlezer vallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ten tweede werd de kolom van 24 ml die voor deze studie werd gebruikt, gekalibreerd met moleculaire gewichtsnormen. Met behulp van dezelfde buffer- en loopomstandigheden als gebruikt voor de FSEC-analyse, werden de molecuulgewichtsstandaarden blauwe dextran (>2.000 kDa), ferritine (440 kDa), aldolase (158 kDa), conalbumine (75 kDa) en ovalbumine (43 kDa) individueel geïnjecteerd en door de kolom lopen, en elutiesporen werden verzameld bij 280 nm absorptie. De geregistreerde elutievolumes waren respectievelijk 8,9 ml, 12,4 ml, 15,2 ml, 16,9 ml en 18 ml. Wanneer deze elutievolumes werden omgezet in Kav (vergelijking 1) en werden uitgezet tegen log molecuulgewichten, kon een standaardcurve worden aangepast. Hierdoor kon het molecuulgewicht van de in deze studie geteste GPCR's worden geschat door interpolatie van de standaardcurve (figuur 3). Het FSEC-spoor van de GPCR-serotoninereceptor 2A (5HT2AR) na oplosbaarheid in het wasmiddel DDM duidde bijvoorbeeld op een elutievolume van 13,4 ml. Dit 5HT2AR-elutievolume valt tussen de elutievolumes die zijn geregistreerd voor ferritine en aldolase en levert een geschat molecuulgewicht op van ongeveer 300 kDa. Het 5HT 2A R-construct dat in deze studie wordt gebruikt, is ongeveer 50 kDa (inclusief de eGFP-tag), wat betekent dat als wordt aangenomen dat 5HT2AR monomeer is,250kDa molecuulgewicht kan worden toegeschreven aan het DDM-reinigingsmiddel / lipidemicel. De vergelijking voor de conversie van elutievolumes is als volgt (vergelijking 1):
(Vergelijking 1)
waarbij V e het elutievolume is, V 0 het kolomleegvolume en Vc het totale kolomvolume.
Figuur 3: Kalibratiecurve van de SEC-kolom met behulp van molecuulgewichtsnormen . (A) Een representatief FSEC-spoor van 5HT2AR opgelost in DDM, met de relatieve elutieposities van de molecuulgewichtsstandaarden blauw dextran (Void), ferritine, aldolase, conalbumine en ovalbumine gemarkeerd. Ferritine, aldolase, conalbumine en ovalbumine zijn respectievelijk gekleurd in groen, paars, rood en cyaan. (B) De kalibratiecurve van het molecuulgewicht met behulp van de elutieposities van de standaarden na conversie naar Kav (vergelijking 1), uitgezet tegen het log molecuulgewicht (Mr). De Mr van 5HT2AR in DDM werd geïnterpoleerd vanuit de curve met behulp van Kav en wordt weergegeven op de curve (blauw vierkant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FSEC werd vervolgens gebruikt om de kwaliteit en eigenschappen van de GPCR sphingosine-1-fosfaatreceptor (S1PR1)15 te beoordelen. Insectencellen die GFP-gelabelde menselijke S1PR 1 tot expressie brengen, werden verwerkt voor FSEC zoals beschreven in het protocol (figuur 1).
Ten eerste werden de optimale membraanextractiecondities onderzocht door de detergentia DDM en LMNG te testen tegen wasmiddelvrije extractie met SMA (figuur 4A). De monodispersiteitsindex werd gebruikt om de kwaliteit van het eiwitmonster en de verhouding tussen het eiwit in de leegte (~ 8 ml kolomretentie) te beoordelen in vergelijking met het monodisperse monster (14-15 ml kolomretentie). Het monster opgelost in LMNG vertoonde een superieur FSEC-profiel met een betere monomeerpiekvorm en een lagere eiwitaggregaatpiek, wat aangeeft dat oplosbaarheid en zuivering in LMNG de meest stabiliserende omstandigheden waren voor dit membraaneiwit. Daarentegen had het in DDM opgeloste monster een relatief slechter FSEC-profiel, met een grotere aggregaatpiek en een bredere monomere piek, wat wijst op polydispersiteit in het monster.
Ten tweede werd het effect van ligandadditie op het FSEC-profiel onderzocht door tijdens de oplosbaarheid sfingosine-1-fosfaat (S1P) aan het monster toe te voegen. In dit geval werd DDM gebruikt als oplosbaarheidsreagens en werden de FSEC-sporen van S1PR1 in de aan- en afwezigheid van S1P vergeleken (figuur 4B). Het monster opgelost in aanwezigheid van S1P vertoonde een superieur FSEC-spoor met verminderde aggregatie. Dit gaf aan dat zuivering in aanwezigheid van een ligand voordelig was voor het verbeteren van de kwaliteit van het eiwitmonster door de receptor in oplossing te stabiliseren, maar ook voordelig was als surrogaatmarker van eiwitactiviteit, omdat de resultaten suggereerden dat het eiwit correct was gevouwen en bekwaam voor ligandbinding.
Figuur 4: FSEC met behulp van een ruw extract van S1PR 1 dat optimale membraanextractieomstandigheden en ligandbinding aangeeft. (A) Vergelijking van de FSEC-sporen van S1PR1 opgelost in styreen-maleïnezuur co-polymeer (SMA; blauw), lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG; rood), of dodecyl maltoside (DDM; zwart). (B) Vergelijking van de FSEC-sporen van S1PR 1 opgelost in DDM in aanwezigheid (rood) of afwezigheid (zwart) van de agonist sfingosine-1-fosfaat (S1P). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FSEC werd ook gebruikt om de stabiliteit op lange termijn van 5HT2AR onder verschillende omstandigheden te onderzoeken. GFP-gelabeld humaan 5HT2AR werd opgelost uit insectencelmembranen in detergent (DDM) of SMA-polymeer en geanalyseerd door FSEC op verschillende tijdstippen na opslag bij 4 °C of kamertemperatuur (figuur 5). Na enkele dagen van incubatie vertoonde 5HT2AR in DDM een significante daling van de monomere piekhoogte bij beide temperaturen, en significante toenames in de geaggregeerde piek werden waargenomen. Daarentegen vertoonde 5HT2AR in SMA-lipidedeeltje (SMALP) geen significante daling van de monomere piekhoogte in de loop van het experiment, wat aangeeft dat het eiwit in SMALP langer stabiel bleef, zelfs bij ongunstige temperaturen. Dit kan van belang zijn bij het overwegen van eiwitpreparaten voor downstream biofysische toepassingen zoals oppervlakteplasmonresonantie (SPR)-experimenten waarvoor het monster gedurende een lange periode stabiel en actief moet zijn voor de succesvolle voltooiing van de bindingsexperimenten.
Figuur 5: Effect van tijd en temperatuur op de kwaliteit van 5HT 2A R geëxtraheerd uit het membraan met behulp van DDM of SMALP, zoals geanalyseerd door FSEC. (A) Representatieve FSEC-sporen van 5HT2AR opgelost in DDM en bewaard bij kamertemperatuur gedurende 1 dag (grijs), 2 dagen (groen) of 5 dagen (blauw). B) Histogrammen van de genormaliseerde monomere piekhoogte voor DDM-monsters die zijn opgeslagen bij 4 °C (blauw) of RT (groen) in vergelijking met SMALP-monsters die zijn opgeslagen bij 4 °C (grijs) of RT (zwart). Foutbalken zijn representatief voor de SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De generieke systematische benaderingen voor conditiescreening met FSEC die hier worden gepresenteerd, maken de snelle optimalisatie van oplosbaarheids- en zuiveringsparameters voor de productie van membraaneiwitten mogelijk. Dit betekent dat stabiele en functioneel actieve membraaneiwitten snel kunnen worden geproduceerd voor biofysische en structurele studies. Bovendien kan FSEC worden uitgevoerd met behulp van laboratoriumapparatuur die waarschijnlijk al aanwezig is in membraaneiwitlaboratoria, en dus is er geen vereiste voor de aankoop van een gespecialiseerd instrument voor het uitvoeren van de testen.
Kritieke stappen
De tijd die nodig is tussen het punt van oplosbaarheid van cellen in detergens tot het punt waarop het monster door de SEC-kolom wordt geleid (stappen 2.1.5-3.2.5) is tijdkritisch en er mogen geen pauzes tussen deze stappen zijn. Alle stappen moeten worden uitgevoerd bij 4 °C of op ijs, en de tijd die nodig is om deze stappen uit te voeren moet tot een minimum worden beperkt. Deze tijd- en temperatuurbeperkingen zijn nodig om het FSEC-profiel voor het membraaneiwit vast te leggen voordat het zich mogelijk ontvouwt of afbreekt. Nadat het membraaneiwit is opgelost, is er een groter risico op ontvouwen, aggregatie en afbraak, zelfs bij 4 °C. Idealiter moeten alle monsters waarvoor de FSEC-sporen moeten worden vergeleken, de SEC-kolom in dezelfde tijdsduur na de oplosbaarheidsstap passeren. In de praktijk is dit moeilijk, vooral als de monsters sequentieel door een enkele kolom worden geleid, maar het is mogelijk om maximaal vijf SEC-sporen binnen 3 uur van elkaar te verzamelen, en in dit tijdsbestek zou er geen significante degradatie moeten zijn.
Probleemoplossing
Als er bij het uitvoeren van het FSEC-experiment een laag of geen fluorescerend signaal is, is het mogelijk dat het membraaneiwit van belang de gekozen cellijn niet tot expressie heeft gebracht, een zeer lage expressie van de gekozen cellijn heeft of niet is opgelost in het gekozen detergent. Als de monsters werden verdund voordat het fluorescentiesignaal werd verzameld en het FSEC-spoor werd geregistreerd, zou een eenvoudige eerste stap zijn om een lagere verdunning of geen verdunning van de SEC-fracties te proberen. Als dit nog steeds geen interpreteerbaar FSEC-spoor oplevert, moeten de expressie en oplosbaarheid van het eiwit worden gecontroleerd.
De analyse van de eiwitexpressie kan worden bereikt door de fluorescentie van het monster na stap 2.2.2 te controleren. Als er een zeer laag of geen fluorescerend signaal van dit monster is (bijvoorbeeld een signaal heel dicht bij de achtergrond), is er waarschijnlijk een probleem met de eiwitexpressie. Er kunnen stappen worden ondernomen om de expressieniveaus van het membraaneiwit te verbeteren, zoals het overschakelen naar een alternatieve cellijn of het aanpassen van de groeiomstandigheden, de inductie van expressie en de tijd tussen de inductie / infectie / transfectie en de oogst. Bijzonder slechte eiwitexpressie kan echter wijzen op een onstabiel membraaneiwit en dus op een slechte constructkeuze.
Als de expressie is gecontroleerd en er een duidelijk fluorescerend signaal boven de achtergrond is voorafgaand aan FSEC, kan de oplosbaarheidsefficiëntie worden gecontroleerd door het resterende fluorescerende signaal van het monster na stap 2.4.3 (oplosbaar membraaneiwit) te meten in vergelijking met het monster na stap 2.2.2 (totaal eiwit). Het is gebruikelijk dat de oplosbaarheidsefficiëntie 20% -30% is en nog steeds de succesvolle analyse en zuivering van het membraaneiwit mogelijk maakt. Als de oplosbaarheidsefficiëntie echter minder dan 20% is, kan een ander reinigingsmiddel voor oplosbaarheid of andere oplosomstandigheden nodig zijn. Als pogingen om de oplosbaarheid te verbeteren niet succesvol zijn, kan dit wijzen op een bijzonder onstabiel membraaneiwit en dus een slechte constructiekeuze.
Als een zeer late elutiepiek wordt waargenomen in het FSEC-spoor (bijv. 18-24 ml), geeft dit aan dat het fluorescerende eiwit een eiwitmolecuulgewicht heeft dat veel lager is dan verwacht. Dit kan worden veroorzaakt doordat het membraaneiwit van belang wordt afgebroken, wat resulteert in "vrije" GFP. Men moet controleren of het eiwit intact is voor en na oplosbaarheid met behulp van in-gel GFP-fluorescentie. Als het eiwit van belang lijkt af te breken of geproteolyseerd te zijn, kan de hoeveelheid proteaseremmer tweevoudig tot viervoudig worden verhoogd. Een hoge gevoeligheid voor proteasen of afgebroken eiwit zelfs vóór de oplosbaarheid kan echter wijzen op een bijzonder onstabiel eiwit en dus een slechte constructiekeuze.
Wijzigingen en verdere toepassingen van FSEC
Gewoonlijk is de fluorescerende tag die wordt gebruikt in FSEC GFP of eGFP, zoals beschreven in dit protocol. Er zijn echter veel verschillende fluorescerende eiwittags beschikbaar. De keuze van de te gebruiken fluorescerende tag hangt af van het hebben van een plaatlezer die de juiste excitatie- en emissieparameters kan bereiken om het fluorescerende signaal voor de geselecteerde fluorescerende tag te registreren en een fluorofoor te hebben met weinig tot geen verandering in kwantumopbrengst in verschillende omgevingsomstandigheden. Bovendien is FSEC niet beperkt tot fluorescerende eiwitten, maar kan het ook even goed werken met een eiwit dat is gelabeld met een fluorescerende kleurstof. Er zou bijvoorbeeld een NTA-kleurstof kunnen worden gebruikt, die gunstig zou binden aan histidine-gelabelde membraaneiwitconstructies. Bovendien kan een fluorescerend gelabeld antilichaam dat chemisch is gelabeld met een fluorescerende kleurstof en specifiek is voor het binden van het membraaneiwit van belang of een zuiveringslabel dat is opgenomen in het membraaneiwitconstruct, indirect een doelwit voor FSEC labelen.
Bij het uitvoeren van wasmiddelscreening met behulp van FSEC kan een keuze worden gemaakt of de buffer die wordt gebruikt om de SEC-kolom te laten lopen, het bijpassende wasmiddel moet bevatten waarin het eiwit is opgelost of dat een standaardwasmiddel moet worden gebruikt voor alle runs. Een nauwkeurigere weergave van het gedrag van het eiwit zal worden verkregen als het hele experiment wordt uitgevoerd met het bijpassende wasmiddel. Het kan echter tijdrovend en verspillend zijn als de kolom opnieuw in evenwicht moet worden gebracht in een nieuw wasmiddel voordat elke run wordt uitgevoerd. Bovendien, aangezien het belangrijkste doel van wasmiddelscreening is om sporen te vergelijken, zullen de trends in de sporen blijven, zelfs als de omstandigheden niet ideaal zijn. Er kan dus een compromis worden bereikt waarbij het eiwit wordt opgelost in het wasmiddel van belang, maar de kolom wordt uitgevoerd in een standaardbuffer met een enkel wasmiddel over alle runs (bijv. DDM)11, wat tijd en verbruiksartikelen voor wasmiddelen kan besparen.
Door de gebruikte FLPC-apparatuur aan te passen, kan de doorvoer van het FSEC-protocol aanzienlijk worden verhoogd en kan de monsterbehoefte worden geminimaliseerd. Een FPLC- of HPLC-systeem kan bijvoorbeeld worden uitgerust met een autosampler, een analysekolom met een kleiner bedvolume (zoals een analytische SEC-kolom van 3,2 ml) en een in-line fluorescerende detector voor het bewaken van continue FSEC-sporen rechtstreeks vanuit de kolom. De resulterende opstelling zou het mogelijk maken om meer FSEC-runs in een kortere periode uit te voeren en de handmatige plotstap te verwijderen, waardoor een groter aantal omstandigheden in een korter tijdsbestek kan worden getest. Bovendien zou de monstervereiste verder worden verminderd, omdat er voor elke run minder monsters zouden moeten worden voorbereid en op de FSEC-kolom zouden moeten worden geladen. Dit zou mogelijkheden bieden om de expressieculturen te reduceren tot een op plaat gebaseerd formaat, omdat er zo weinig materiaal nodig zou zijn voor de analyse.
Sterke en zwakke punten van de FSEC in vergelijking met andere methoden
Een nadeel van FSEC is dat de membraaneiwitconstructies moeten worden ontworpen om het fluorescerende label te introduceren, en bij introductie is er een kleine mogelijkheid dat de plaatsing van het label de functie of vouwing van het membraaneiwit van belang kan verstoren. Bovendien bewaakt het FSEC-protocol, zoals hier beschreven, de kenmerken van een membraaneiwit in aanwezigheid van cellysaat, een ruw mengsel van eiwitten. Het gedrag van een membraaneiwit in deze omgeving kan anders zijn dan wanneer het membraaneiwit van belang wordt onderworpen aan een preparatieve SEC-kolom aan het einde van de zuivering wanneer het volledig is geïsoleerd van andere eiwitten. Bovendien biedt FSEC een enigszins kwalitatieve maat voor de eiwitkwaliteit. Door het FSEC-spoor om te zetten in een monodispersiteitsindex, zoals beschreven in stap 4.3.3 van het protocol, kan echter een kwantitatieve maat voor de eiwitkwaliteit worden verkregen.
FSEC is niet de enige methode die kan worden gebruikt bij de vroege analyse van membraaneiwitconstructies, oploscondities en zuiveringsbuffersamenstelling. De alternatieve benaderingen hebben zowel voor- als nadelen ten opzichte van FSEC. Er bestaan bijvoorbeeld op fluoroforen gebaseerde thermostabiliteitstests, met name het gebruik van de kleurstof 7-diethylamino-3-(4′-maleimidylfenyl)-4-methylcumarine (CPM)16,17. Het voordeel van deze methode is dat, in tegenstelling tot FSEC, dat een kwalitatieve maat voor de eiwitkwaliteit biedt, thermostabiliteitstests een kwantitatieve maat bieden in de vorm van een relatieve smelttemperatuur. Bovendien is het niet verplicht om een fluorescerend label op het eiwitconstruct te introduceren. De nadelen van thermostabiliteitstests in vergelijking met FSEC zijn echter dat gezuiverd eiwit moet worden gebruikt en dat de test niet compatibel is met alle eiwitconstructen, omdat het afhankelijk is van de voordelige posities van inheemse cysteïneresiduen in het gevouwen eiwit.
Een andere methode die overeenkomsten heeft met zowel FSEC- als op fluorofoor gebaseerde thermostabiliteitstests is een test die de temperatuurgevoeligheid van een membraaneiwit meet. In deze test wordt het eiwit uitgedaagd met verschillende temperaturen en wordt het eiwit gedetecteerd dat in oplossing blijft na centrifugatie. Detectie in deze methode is op verschillende manieren uitgevoerd, waaronder het meten van de fluorescentie in oplossing18, de fluorescentie van een SDS-PAGE-gelband19 of de signaalintensiteit in een western blot20. Een belangrijk nadeel van deze benaderingen is echter dat de test zeer arbeidsintensief is en gevoelig voor hoge ruis in de resultaten, omdat elk individueel temperatuurpunt onafhankelijk moet worden verzameld.
Ten slotte kunnen verschillende meer geavanceerde biofysische technieken worden gebruikt om de kwaliteit van membraaneiwitten op een vergelijkbare manier te beoordelen als FSEC, bijvoorbeeld flow-geïnduceerde dispersieanalyse21, thermoforese op microschaal22 of SPR. Hoewel zeer krachtige benaderingen, is het nadeel van deze methoden de vereiste voor zeer gespecialiseerde instrumenten om de analyses uit te voeren.
Kortom, FSEC biedt een waardevol hulpmiddel voor gebruik in membraaneiwitproductiecampagnes, en hoewel het niet de enige optie is, heeft het verschillende duidelijke voordelen ten opzichte van andere methoden, zoals hierboven vermeld. De kruisvalidatie van de resultaten door orthogonale assays wordt altijd aanbevolen en geen van de hierboven besproken methoden sluit elkaar wederzijds uit.
Disclosures
Peak Proteins is een contractonderzoeksorganisatie die tegen betaling eiwitexpressie, zuivering, massaspectrometrie en structurele bepaling levert.
Acknowledgments
We willen graag de hulp en steun van het hele Peak Proteins-team bedanken. Vanuit het celwetenschappelijke team willen we Ian Hampton bedanken voor zijn waardevolle inzichten en begeleiding in de expressie van insectencellen. We willen Mark Abbott bedanken voor het verstrekken van de middelen en de mogelijkheid om dit project voort te zetten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
| 10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
| 15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
| 2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
| 50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
| 96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
| ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
| ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
| ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
| Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
| Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
| Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
| Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
| Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
| eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
| Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
| HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
| High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
| Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
| Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
| MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
| Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
| Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
| pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
| Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
| Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
| Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
| Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
| Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
| Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |
References
- Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
- Erickson, H. P. Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy. Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).
- Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water. Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).
- Lathe, G. H., Ruthven, C. R. The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water. Biochemical Journal. 60 (4), (1955).
- Polson, A. Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar. Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).
- Hjertén, S., Mosbach, R. 34;Molecular-sieve" chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide. Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).
- Porath, J., Flodin, P. Gel filtration: A method for desalting and group separation. Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).
- Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).
- Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).
- Hanson, M. A., et al. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335 (6070), 851-855 (2012).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents. Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).
- Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
- Harborne, S. P. D., et al. IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector. Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).
- Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -P. Defining thermostability of membrane proteins by western blotting. Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).
- Pedersen, M. E., Østergaard, J., Jensen, H. Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization. Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).
