Summary
Se describe un nuevo procedimiento detallado para la obtención de imágenes funcionales de ratas despiertas con la cabeza fija.
Abstract
Los anestésicos, comúnmente utilizados en la investigación científica preclínica y fundamental, tienen una influencia depresiva en las funciones metabólicas, neuronales y vasculares del cerebro y pueden influir negativamente en los resultados neurofisiológicos. El uso de animales despiertos para estudios de investigación es ventajoso, pero plantea el gran desafío de mantener a los animales tranquilos y estacionarios para minimizar los artefactos de movimiento a lo largo de la adquisición de datos. Las imágenes despiertas en roedores de menor tamaño (por ejemplo, ratones) son muy comunes, pero siguen siendo escasas en ratas, ya que las ratas son más grandes, más fuertes y tienen una mayor tendencia a oponerse a las restricciones de movimiento y la fijación de la cabeza durante los largos períodos requeridos para obtener imágenes. Se describe un nuevo modelo de neuroimagen de ratas despiertas con la cabeza fija utilizando eslingas cosidas a mano personalizadas, implantes de cabeza impresos en 3D, gorras para la cabeza y un marco para la cabeza. Los resultados adquiridos después de un único ensayo de estimulación de bigote único sugieren un aumento en la intensidad de la respuesta funcional evocada. La adquisición de la respuesta funcional evocada de ratas despiertas con la cabeza fija es más rápida que la de ratas anestesiadas, confiable, reproducible y puede usarse para estudios longitudinales repetidos.
Introduction
La mayoría de las investigaciones de neuroimagen científica básica, preclínica y traslacional se adquieren de animales anestesiados 1,2. Los anestésicos facilitan la experimentación, pero influyen continuamente en el metabolismo del cerebro y del cuerpo, la presión arterial y la frecuencia cardíaca3. El tipo de anestesia y la duración y vía de administración agregan variables de confusión a la interpretación de los datos que podrían contribuir para la reproducibilidad y fallas traslacionales4. Un cuello de botella importante de los estudios de neuroimagen de ratas despiertas y con la cabeza fija es el requisito de mantener a la rata estacionaria y tranquila durante los procesos de preparación y adquisición de datos. Los pequeños movimientos producen artefactos de movimiento injustificados, que pueden afectar negativamente el análisis y las interpretaciones de los datos.
Se ha ideado un nuevo modelo de neuroimagen de ratas despiertas con la cabeza fija utilizando eslingas personalizadas, implantes de cabeza impresos en tres dimensiones (3D), gorras para la cabeza y un marco para la cabeza que ofrece varias ventajas para una fácil experimentación. El implante de cabeza 3D es ligero y cubre una pequeña porción del cráneo necesaria para la transfixia. Los implantes y tapas de cabeza impresos en 3D están diseñados utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD). Los protocolos de estimulación de bigotes, adquisición de datos, análisis de datos y resultados de ratas anestesiadas han sido descritos en detalle en trabajos previos 5,6,7.
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Protocol
Todos los procedimientos cumplieron con las pautas del Instituto Nacional de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Irvine de la Universidad de California. En este estudio se utilizaron siete machos y una rata hembra (Sprague-Dawley, peso: 185-350 g). Después de completar el estudio, las ratas fueron sacrificadas usando una sobredosis de dióxido de carbono.
1. Diseño de diferentes componentes
- Diseño del implante frontal:
- Haga el implante de cabeza utilizando el software CAD (Figura 1C) y diséñelo para obtener imágenes del área posterior al bregma y adyacente a la línea media centrada en la corteza somatosensorial. Asegúrese de que el implante de cabeza cubra un área de 0.9 mm a 1.9 mm en el cráneo lejos del área de imágenes.
- Use solo tres tornillos para anclar el implante de cabeza en el cráneo de la rata. Diseñe todos los orificios de los tornillos para que permanezcan en el lado opuesto de la línea media en el hemisferio contralateral del hemisferio del que se obtiene la imagen.
- Coloque una barra, ahuecada desde el interior, en la parte superior del implante de cabeza para permitir que los cables fijen la tapa de la cabeza al implante de cabeza como se muestra en la Figura 1D.
- Diseño de la tapa de la cabeza:
- Asegúrese de que la tapa de la cabeza cubra completamente el área de imágenes y la proteja de cualquier tipo de traumatismo como se muestra en la Figura 1A, B. Agregue una curvatura a la tapa de la cabeza para que se alinee con la forma de la cabeza sin causar dificultad a las actividades diarias del animal en las jaulas enriquecidas estándar.
- Corte el lado interno de la tapa de la cabeza en una forma rectangular más ancha para que la parte superior del implante de cabeza pueda encajar en ella, como se muestra en la Figura 1E. Perpendicular a este rectángulo, corte otras dos regiones rectangulares para anclar la tapa de la cabeza al implante de cabeza.
- Pase un cable a través de la barra hueca superior del implante de cabeza para la fijación de la tapa de la cabeza en la cabeza de la rata como se muestra en la Figura 1E-G. Pase el segundo cable de la misma manera.
NOTA: Estos cables se pueden quitar fácilmente con alicates o pinzas. Los archivos de impresión 3D se proporcionan (formato de archivo: STL) como Archivo complementario 1 y Archivo complementario 2.
- Diseño del marco de la cabeza:
- Diseñe el marco de la cabeza de manera que una parte cortada pueda moverse a través de la barra superior del implante de cabeza y se fije con una abrazadera.
- Incline la otra parte cortada para proporcionar resistencia adicional para mantener la cabeza de la rata fija para que el lado contralateral sea completamente accesible para la obtención de imágenes. Para el propósito de este estudio, corte la placa de acero con recortes de estaño para producir el marco de la cabeza (Figura 1H, I).
NOTA: Esta parte también se puede imprimir en 3D.
2. Entrenamiento inicial de ratas
- Permita que las ratas se aclimaten al ambiente del vivero en sus jaulas durante 2-3 días.
- Comience a manipular la rata en una habitación tranquila. Abra la jaula y haga que el experimentador ponga su mano dentro de la jaula cerca de la rata durante 15-20 minutos para permitir que la rata se habitúe.
- Una vez que la rata muestre calma al no asustarse o huir de las manos del experimentador, levante suavemente a la rata para manipularla. Maneje a la rata durante 30-45 minutos cada día antes del entrenamiento con cabestrillo.
3. Entrenamiento con cabestrillo
- Entrene a las ratas durante al menos 2-3 días en los cabestrillo antes de la implantación quirúrgica del implante de cabeza y la tapa de la cabeza.
- Organice la configuración del cabestrillo como se muestra en la figura 2A. Limpie la configuración del cabestrillo con toallitas de etanol.
NOTA: Todas las eslingas están cosidas a mano y hechas de un material de red en la parte inferior o en ambos lados, como se muestra en la Figura 2A, B. - Para el entrenamiento con cabestrillo, anestesiar a las ratas usando isoflurano al 4% para la inducción y al 1% para el mantenimiento hasta que no haya reflejo de pellizco de la pata trasera.
- Bajo anestesia con isoflurano, coloque las ratas en una lámina de plástico flexible que mide 20 cm x 8 cm (largo x ancho), donde 10 cm x 8 cm de la lámina de plástico están completamente cubiertos con la parte más blanda del Velcro.
NOTA: Anestesiar a las ratas para el entrenamiento con cabestrillo es un paso opcional, utilizado principalmente para reducir el estrés y la ansiedad. - Durante los primeros 2 días del entrenamiento, coloque a la rata cómodamente en un calcetín de bebé (tamaño 0-3 meses) con la cabeza hacia afuera a través de un pequeño agujero inciso en el extremo del calcetín.
- Envuelva un pequeño trozo de almohadilla absorbente alrededor de la parte inferior del cuerpo para mantener a la rata seca y recoger los excrementos.
- Envuelva a la rata en un paño de algodón transpirable (tamaño: 25 cm x 25 cm). Coloque la rata en una lámina de plástico que tenga Velcro tiras pegadas a ella.
- Asegure aún más la rata a la lámina de plástico utilizando tiras de Velcro de 0,5 cm de ancho a una distancia de 3-6 mm entre sí.
- Asegure la rata en el cabestrillo. Retire la anestesia gaseosa. Permita que la rata se recupere de la anestesia con gas en el cabestrillo.
- Cuando la rata comience a batir, ofrezca unas gotas de solución de sacarosa al 10% como recompensa cada 10-15 minutos.
- Presente aleatoriamente a la rata los estímulos sensoriales que se utilizarán durante la obtención de imágenes (aquí estimulación de bigotes, cada 15-25 minutos) para acostumbrarla a los estímulos sensoriales. Estimula manualmente los bigotes a intervalos aleatorios.
- Entrene a la rata en el cabestrillo durante 1 h el día 1, 2 h el día 2 y 3 h el día 3 como se muestra en la Figura 2C.
4. Preparación prequirúrgica
- Imprima el implante de cabeza y la tapa de la cabeza con la impresora 3D (Figura 1).
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y tocados (implantes y tapones) sumergiendo el equipo en el germicida Metricide28 durante 10 horas. Enjuague bien las herramientas con agua estéril justo antes de la cirugía.
- Exponga a la rata al 4% de isoflurano y luego mantenga al 1% -2% de isoflurano hasta que no haya reflejo de pellizco de la pata trasera. Esta cirugía se puede realizar bajo muchos tipos de anestesia, como isoflurano, pentobarbital sódico y ketamina-xilazina.
- Inyecte atropina (0.05 mg / kg) por vía intramuscular para reducir las secreciones mucosas para ayudar en la respiración.
- Afeite la cabeza de la rata 5 mm centrada alrededor de la línea media con un recortador de pelo que comienza desde entre los ojos hasta la parte posterior de las orejas.
- Controle la saturación parcial de oxígeno y la frecuencia cardíaca a través de un oxímetro de pulso y una sonda de monitor de frecuencia cardíaca asegurada a la pata trasera de la rata.
- Limpie la cabeza de la rata y el área circundante tres veces con rondas alternas de betadina y toallitas con alcohol al 70%.
- Arregla la rata en un sistema estereotáxico.
- Inserte una sonda rectal lubricada con vaselina para medir la temperatura corporal de la rata y mantenerla a través del sistema de retroalimentación de la manta calefactora para evitar la hipotermia después de la administración de anestesia.
- Administrar clorhidrato de lidocaína anestésico local a una concentración de 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 peso corporal por vía subcutánea en el sitio quirúrgico.
- Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar que se seque.
- Administrar anestesia local al 2% por vía subcutánea sobre el sitio quirúrgico.
- Inyecte 3 ml de solución de ringer lactato a temperatura ambiente por vía subcutánea para prevenir la deshidratación y proporcionar nutrición durante la cirugía.
5. Cirugía
- Retire la parte de la piel sobre el sitio quirúrgico (4 mm de diámetro centrado alrededor de la línea media y el centro de la cabeza) con tijeras quirúrgicas afiladas. Diseccionar y eliminar parte de la piel (~2 mm de diámetro, sobre la corteza somatosensorial izquierda) entre la oreja y el ojo en la parte temporal de la cabeza.
- Extraer, con un bisturí, el tejido subyacente de la piel (pericráneo) para exponer el cráneo. Limpie el cráneo con una gasa de algodón esterilizada.
- Retraer / resecar el músculo temporal para exponer el tamaño deseado para el área de imagen [7.5 mm por 7.5 mm para este estudio].
- Exponga el cráneo en el hemisferio contralateral para el implante de cabeza. Coloque el implante de cabeza en el cráneo para determinar la ubicación de los tornillos de anclaje para el implante como se muestra en la Figura 2D-F.
- Marque el cráneo para perforar los tornillos usando tinta india con broca 1. Perfore los orificios de rebabas para los tornillos con la broca dental 3. Atornille el implante de cabeza en su lugar.
- Seque el cráneo con una gasa estéril. Aplique una capa delgada de adhesivo tisular alrededor y debajo del implante de cabeza para pegarlo al cráneo. Aplique una capa de cemento dental para apoyar aún más el implante de cabeza en su lugar y deje que el cemento se seque durante 2-3 minutos.
NOTA: El uso de adhesivo tisular además del cemento dental asegura una fuerte sujeción8. - Usando la broca dental 3, adelgaza un área de 7.5 mm x 7.5 mm en el lado izquierdo del cráneo justo posterior a la bregma y lateral a la línea media. Adelgazar el cráneo a ~50 μm como se muestra en la Figura 3A.
- Aplique ungüento antibiótico tópico sobre el sitio quirúrgico y luego cúbralo con una capa delgada de caucho de silicona para proteger el cráneo adelgazado como se muestra en la Figura 3B. Cubra el sitio quirúrgico con la tapa de la cabeza como se muestra en la Figura 3C. Fíjelo en su lugar con los dos pequeños trozos de cables que atraviesan tanto el implante de cabeza como la tapa de la cabeza, como se muestra en la Figura 3D, E. Aplique caucho de silicona para cubrir la tapa de la cabeza y el cráneo para estabilizar la tapa de la cabeza más adelante en la cabeza de la rata, como se muestra en la Figura 3F.
NOTA: El caucho de silicona proporciona protección adicional al cráneo adelgazado. - Inyecte a la rata con flunixina meglumina (2,5 mg/kg) por vía subcutánea para el manejo del dolor y la inflamación. Para prevenir la infección, inyecte el antibiótico Enrosita enrofloxacino (22,7 mg/ml, 10 mg/kg +/-0,01), por vía intraperitoneal.
- Mueva la rata a la cámara de recuperación para ayudar a mantener su temperatura corporal con una manta de calentamiento y una lámpara de calor. Monitoree a la rata continuamente hasta que recupere la conciencia y pueda mantener la decúbito esternal.
- Devuelva la rata a su jaula separada una vez que se recupere por completo.
- Durante los próximos 3 días, administre flunixina y buprenorfina para aliviar la inflamación y el dolor y enrosite para prevenir la infección dos veces al día.
6. Imágenes despiertas
- Anestesiar a la rata con isoflurano al 4% para la inducción y al 1% para el mantenimiento cuando no hay reflejo de pellizco de la pata trasera. Inyecte acepromazina (0,3-0,5 mg/kg) por vía subcutánea.
NOTA: Esta concentración de acepromazina está por debajo de los niveles leves de sedación y solo ayuda a mantener a las ratas tranquilas durante todo el proceso de obtención de imágenes. - Usando tiras personalizadas de Velcro, fije la rata en la lámina de plástico utilizada durante los procedimientos de entrenamiento. Envuelva la parte inferior del cuerpo con una almohadilla de absorción y coloque la rata cómodamente en el cabestrillo.
- Retire la goma de silicona. Retire la tapa de la cabeza quitando los cables de fijación. Fije el marco de la cabeza en el implante de cabeza como se muestra en la Figura 2G.
- Bloquee el marco de la cabeza con abrazaderas como se muestra en la Figura 2H, I.
- Retire la anestesia gaseosa. Enjuague el área de imágenes con solución salina 3x y limpie con una gasa húmeda. Seque el área de imágenes y haga un pozo, usando vaselina, alrededor del área de imágenes. Llene el pozo con solución salina esterilizada y cúbralo con un portaobjetos de vidrio (Figura 2E).
- Consulte los procedimientos de adquisición de imágenes ópticas de señal intrínseca, el protocolo de estimulación de bigotes y el análisis y presentación de datos, que se han discutido en detalle anteriormente 6,7.
- A lo largo del experimento, monitoree a las ratas para detectar signos de agitación e inquietud, que pueden reducirse aún más cubriendo los ojos de las ratas con un paño suave o una gasa (opcional).
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Representative Results
Se muestran las señales de imagen óptica representativas de un único ensayo de una rata anestesiada y la respuesta sumada (de 40 ensayos recopilados) de una rata despierta (Figura 4). La intensidad de la señal para la estimulación de un solo bigote de una rata despierta se puede visualizar en un umbral más alto que para la rata anestesiada, mostrando una señal más fuerte del animal despierto. Los bigotes C2 de las ratas se estimulan a 5 Hz durante 1 s, y la respuesta funcional se muestra como un cambio fraccional en comparación con la línea de base. Las áreas más oscuras (por debajo del umbral negativo) son las principales áreas de actividad neuronal, y las áreas blancas brillantes (por encima del umbral positivo) muestran la respuesta sanguínea oxigenada a la estimulación9. Las imágenes están alineadas de manera que de izquierda a derecha es de rostral a caudal (C) y de arriba a abajo es la dirección medial a lateral (L), como se muestra en las flechas.
Figura 1: Tapa para la cabeza, implante de cabeza y marco para la cabeza. (A) La tapa de la cabeza (vista superior): el lado de la vista superior muestra la curvatura para alinearse a lo largo de la curvatura de la cabeza para proteger la cabeza; Las dos partes rectangulares huecas son para que los cables metálicos pasen a través de la tapa de la cabeza. (B) La tapa de la cabeza (vista inferior) muestra el corte rectangular más ancho para encajar en la barra superior del implante de cabeza y los dos cortes perpendiculares para que los cables se muevan a través del implante y la tapa de la cabeza para mantenerlos en su lugar. (C) Implante de cabeza con los tres orificios de corte para los tornillos de anclaje. Las posiciones de los tornillos de anclaje en el implante de cabeza se pueden ajustar de acuerdo con la cabeza de la rata. (D) Tapa para la cabeza e implante para la cabeza (vista lateral); La vista lateral del implante de cabeza muestra la barra rectangular ahuecada desde el interior para permitir que el cable pase para anclar la tapa de la cabeza al implante de cabeza. (E-G) Vista del implante de cabeza anclado en la tapa de la cabeza a través de una pieza de alambre; Vista inferior, vista lateral y vista superior para mostrar cómo se coloca el implante de cabeza dentro de la tapa frontal. (H) Marco de cabeza, (I) implante de cabeza anclado en el marco de la cabeza. La distancia entre dos líneas en la escala (como se muestra en el rectángulo azul) es de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cabestrillos, implante de cabeza y fijación del marco de la cabeza para imágenes despiertas y fijas con la cabeza. (A,B) Cabestrillo personalizado con material de red solo para el fondo o para ambos lados; (C) rata colocada en la lámina de plástico, fijada con tiras Velcro, durante el entrenamiento con cabestrillo; (D-F) vistas superior y lateral del implante de cabeza en un cráneo de rata por encima del hemisferio contralateral. Las líneas punteadas muestran el área de la imagen. Las vistas superior y lateral muestran claramente los tres orificios para fijar el implante de cabeza al cráneo con el tornillo de anclaje. (E) La vista lateral muestra la barra hueca a través de la cual pasa el alambre para anclar la tapa de la cabeza al implante de cabeza cuando no se toman imágenes de las ratas. Una pata del marco de la cabeza pasó a través de la parte hueca del implante de cabeza para obtener imágenes de la corteza de la rata. (G) Marco de la cabeza a través del implante de cabeza para ratas despiertas con la cabeza fija. (H) El marco de la cabeza a través del implante de cabeza con sus dos patas sujetadas para imágenes despiertas con la cabeza fija (I) de ratas despiertas con la cabeza fija durante las sesiones de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Colocación del implante de cabeza. (A) La preparación delgada del cráneo para imágenes despiertas con la cabeza fija. (B) Implante de cabeza fijado en el cráneo de rata y el área de imágenes de cráneo delgado cubierta con silicona de goma. (C) Tapa de cabeza colocada en el implante de cabeza. (D,E) Tapa de cabeza anclada al implante de cabeza mediante alambres metálicos recubiertos. (F) La tapa de la cabeza y el área circundante cubierta con goma-silicona para un mayor apoyo en la fijación y protección del cráneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Respuestas funcionales de las estimulaciones de bigotes C2. (A) Una respuesta funcional representativa de un único ensayo de una estimulación de bigotes C2 de 5 Hz durante 1 s de imágenes de ratas despiertas con la cabeza fija, y cada ensayo duró 7 s con un intervalo entre ensayos de 3 s ± 2 s. El umbral de representación en escala de grises del cambio fraccional desde el inicio (−3,5 × 10−3 a 3,5 × 10−3). (B) Una respuesta funcional representativa de un único ensayo de una estimulación de bigotes C2 de 5 Hz durante 1 s de una rata anestesiada (pentobarbital sódico). El umbral de representación en escala de grises del cambio fraccional desde el inicio (−2,5 × 10−4 a 2,5 × 10−4). La respuesta funcional de la rata despierta con la cabeza fija es 140 veces más fuerte que la de la rata anestesiada. Cada fotograma es un fotograma de 0,5 s. Las imágenes están alineadas de manera que de izquierda a derecha es de rostral a caudal y de arriba a abajo es de la dirección medial a lateral como se muestra en las flechas. Las áreas más oscuras (por debajo del umbral negativo) son las principales áreas de actividad neuronal, y las áreas blancas brillantes (por encima del umbral positivo) muestran la respuesta sanguínea oxigenada a la estimulación. Barra de escala = 1 mm. Abreviaturas: C = caudal; L = lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: archivo de impresión 3D para el implante de cabeza. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: archivo de impresión 3D para la tapa de la cabeza. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El uso de imágenes de ratas despiertas y con la cabeza fija ofrece muchas ventajas en términos de facilidad y personalización. Las eslingas diseñadas a medida permiten que las ratas se envuelvan a través de material de red transpirable, eliminando la necesidad de encerrar a los animales en cámaras de restricción de plástico cerradas durante largos períodos de tiempo10,11. Las ratas se mantienen tranquilas y libres de estrés durante las largas sesiones de imagen sucesivas utilizando una dosis muy baja de acepromazina por debajo de los niveles de sedación leve en ratas (1,0-2,5 mg/kg)12. Para mantener a la rata estable y eliminar aún más los artefactos de movimiento durante las sesiones de imágenes, se utilizan tiras Velcro. Las tiras Velcro se colocan a 3-6 mm entre sí para evitar la constricción innecesaria del cuerpo durante largas horas. Las ratas son entrenadas y habituadas con eslingas a una edad temprana para garantizar que permanezcan tranquilas y cómodas descansando en sus eslingas durante la preparación y la adquisición de datos. Según los resultados preliminares, las ratas jóvenes que pesan alrededor de 150-175 g son más fáciles y rápidas de entrenar que las ratas mayores.
El implante de cabeza en la cabeza de rata pesa solo 0,174 g, y la tapa de cabeza extraíble pesa 1,483 g. El implante de cabeza cubre un área de 0,5 cm a 1,5 cm en un hemisferio, lo que permite una accesibilidad completa del otro hemisferio para la neuroimagen. El tamaño de la tapa de la cabeza garantiza una cobertura total del sitio quirúrgico. Los pesos del implante de cabeza y la tapa de la cabeza no parecen obstaculizar la movilidad y las actividades diarias, y las ratas pueden alojarse juntas en jaulas estándar. Usando este método de restricción de cabeza y cuerpo, las ratas pueden ser fotografiadas durante 2-3 h cada vez en diferentes días para estudios longitudinales. Se pueden realizar múltiples sesiones de imágenes en una sola rata durante al menos hasta 3 meses utilizando esta configuración. Se tarda un total de 25 minutos en imprimir en 3D el implante de cabeza y la tapa de la cabeza. Las piezas son fácilmente personalizables dependiendo del tamaño del roedor y también se pueden personalizar para ser utilizadas en ratones. Para los estudios que requieren la diferenciación de las ratas, diferentes colores y materiales pueden proporcionar una fácil identificación. Además, la parte superior de la tapa se puede personalizar para agregar símbolos, números o letras para una fácil identificación.
Hay varios pasos importantes para la implantación exitosa y la obtención de imágenes, el más importante de los cuales es el entrenamiento y la habituación de las ratas. A las ratas se les presentan al azar estímulos sensoriales para minimizar el potencial de aprendizaje asociativo, que puede influir en los resultados de las imágenes. La cirugía y todos los instrumentos quirúrgicos deben ser estériles para prevenir la infección, y el uso de antibióticos locales es imperativo. El uso de acepromazina al inicio de la imagen es importante para mantener a los animales tranquilos y silenciosos para evitar movimientos innecesarios durante las sesiones de imagen. El cráneo de la rata debe estar seco para una fijación adecuada, y la capa de cemento dental depositado debe ser lo suficientemente delgada como para que la tapa de la cabeza quepa en el implante de cabeza.
Para el estudio actual, el área de imágenes se centró en la corteza somatosensorial. El área adelgazada mide aproximadamente 7.5 mm x 7.5 mm, que es la extensión del área que se puede visualizar en el estudio actual. Sin embargo, el área de la imagen se puede aumentar a 11 mm x 11 mm si es necesario. Otra ventaja de este diseño es que permite obtener imágenes de toda el área adelgazada a pesar de la curvatura de la corteza.
Los implantes de cabeza previamente reportados requieren casi 7-12 tornillos de anclaje para fijar el implante de cabeza en la cabeza de la rata13,14. Esto impide la obtención de imágenes de un área más grande a través de la preparación del cráneo adelgazado. Otro método de fijación requiere la fijación de un material de resina sobre un área grande utilizando tornillos de cabeza, lo que hace que el cráneo sea inaccesible para la obtención de imágenes14. La imagen despierta de ratas mediante resonancia magnética requiere la inmovilización de los animales en tubos cilíndricos, lo que hace que las experiencias de imagen sean estresantes para los animales11,15. En algunas otras configuraciones, el implante de cabeza sobresale de la cabeza y podría enredarse en jaulas estándar16,17. El implante de cabeza y la tapa de la cabeza eliminan el uso de la fijación de portaobjetos de vidrio y el aplanamiento del cráneo delgado para la imagen crónica18,19. El tamaño del implante de cabeza y el uso de curvatura en la tapa de la cabeza eliminan la necesidad de realizar cambios en las jaulas estándar como en otros procedimientos crónicos18,19. Los implantes de cabeza en ratones son más fáciles porque solo se utiliza una configuración de tuerca y tornillo, lo que no es posible en ratas, ya que las ratas son mucho más fuertes y más difíciles de mantener estables20.
La limitación del implante de cabeza es que, a pesar de su pequeño tamaño, requiere anclar el implante al cráneo mediante tornillos. El implante de cabeza es necesario para mantener la cabeza del animal estable, pero limita las imágenes de todo el cerebro de la rata. Sin embargo, una ventaja de usar este implante de cabeza es que se puede usar para obtener imágenes de un área más amplia para la estimulación sensorial evocada utilizando varias modalidades de neuroimagen, como imágenes ópticas de señal intrínseca, tomografía de coherencia óptica doppler e imágenes de moteado láser.
Las representaciones funcionales corticales basadas en señales intrínsecas de ratas despiertas con la cabeza fija tienden a ser más fuertes en intensidad que en ratas anestesiadas que utilizan el mismo protocolo de estimulación de bigotes. Un aumento similar en la fuerza de la respuesta de la señal intrínseca evocada ha sido reportado en monos despiertos21,22. Actualmente se está trabajando para mejorar el diseño del implante de cabeza y la tapa para entornos más desafiantes como el hábitat naturalista23.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha y Amirsoheil Zareh por su ayuda durante el entrenamiento de las ratas y la preparación de las hondas. El financiamiento fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, Número de subvención: NS119852) y la Fundación Leducq (Número de subvención: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
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