Summary
En detaljerad ny procedur för funktionell avbildning av vakna, huvudfixerade råttor beskrivs.
Abstract
Anestetika, som vanligtvis används i preklinisk och grundläggande vetenskaplig forskning, har en depressiv inverkan på hjärnans metaboliska, neuronala och vaskulära funktioner och kan påverka neurofysiologiska resultat negativt. Användningen av vakna djur för forskningsstudier är fördelaktig men utgör den stora utmaningen att hålla djuren lugna och stationära för att minimera rörelseartefakter under datainsamling. Vaken avbildning hos mindre gnagare (t.ex. möss) är mycket vanligt men förblir knappt hos råttor eftersom råttor är större, starkare och har en större tendens att motsätta sig rörelsebegränsningar och huvudfixering under de långa varaktigheter som krävs för avbildning. En ny modell av neuroimaging av vakna, huvudfixerade råttor med hjälp av skräddarsydda handsydda slingor, 3D-printade huvudimplantat, huvudlock och en huvudram beskrivs. Resultaten som förvärvats efter en enda studie av enkel-whisker-stimulering tyder på en ökning av intensiteten hos det framkallade funktionella svaret. Förvärvet av det framkallade funktionella svaret från vakna, huvudfixerade råttor är snabbare än det från sövda råttor, pålitligt, reproducerbart och kan användas för upprepade longitudinella studier.
Introduction
De flesta av de grundläggande, prekliniska och translationella vetenskapliga neuroimagingundersökningarna förvärvas från sövda djur 1,2. Anestetika underlättar experiment men påverkar kontinuerligt hjärnans och kroppens ämnesomsättning, blodtryck och hjärtfrekvens3. Typen av anestesimedel och varaktighet och administreringsväg lägger till förvirrande variabler till datatolkning som kan bidra till reproducerbarhet och translationella misslyckanden4. En stor flaskhals för vakna, huvudfixerade neuroimagingstudier på råtta är kravet att hålla råttan stationär och lugn under hela förberedelse- och datainsamlingsprocesserna. Små rörelser producerar obefogade rörelseartefakter, vilket kan påverka dataanalys och tolkningar negativt.
En ny modell av neuroimaging från vakna, huvudfixerade råttor med hjälp av skräddarsydda slingor, tredimensionella (3D) tryckta huvudimplantat, huvudlock och en huvudram har utformats som erbjuder flera fördelar för enkel experimentering. 3D-huvudimplantatet är lätt och täcker en liten del av skallen som behövs för transfixering. De 3D-printade huvudimplantaten och locken är utformade med hjälp av datorstödd design (CAD) programvara. Protokollen för morrhårsstimulering, datainsamling, dataanalys och resultat från bedövade råttor har beskrivits i detalj i tidigare arbete 5,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden överensstämde med National Institute of Health riktlinjer och godkändes av University of California, Irvine Animal Care and Use Committee. Sju hanar och en honråtta (Sprague-Dawley, vikt: 185-350 g) användes i denna studie. Efter avslutad studie offrades råttorna med hjälp av koldioxidöverdos.
1. Design av olika komponenter
- Design av huvudimplantatet:
- Gör huvudimplantatet med CAD-programvara (figur 1C) och designa det för att avbilda området bakom bregma och intill mittlinjen centrerad på den somatosensoriska cortexen. Se till att huvudimplantatet täcker ett område på 0,9 mm till 1,9 mm på skallen bort från bildområdet.
- Använd endast tre skruvar för att förankra huvudimplantatet på råttans skalle. Designa alla skruvhål så att de förblir på motsatt sida av mittlinjen i den kontralaterala halvklotet på den avbildade halvklotet.
- Placera en stång, ihålig från insidan, i den övre delen av huvudimplantatet så att ledningar kan fästa huvudlocket på huvudimplantatet som visas i figur 1D.
- Huvudlockets utformning:
- Se till att huvudlocket täcker bildområdet helt och skyddar det från alla typer av trauma som visas i figur 1A, B. Lägg till en krökning på huvudkåpan så att den anpassar sig till huvudets form utan att orsaka svårigheter för djurets dagliga aktiviteter i de vanliga berikade burarna.
- Skär insidan av huvudlocket i en bredare rektangulär form så att den övre delen av huvudimplantatet kan passa in i den enligt figur 1E. Vinkelrätt mot denna rektangel, skär två andra rektangulära områden för att förankra huvudlocket till huvudimplantatet.
- För en tråd genom huvudimplantatets övre ihåliga stång för fixering av huvudlocket på råtthuvudet enligt figur 1E–G. För den andra ledningen på samma sätt.
OBS: Dessa ledningar kan enkelt tas bort med tång eller pincett. 3D-utskriftsfilerna tillhandahålls (filformat: STL) som kompletterande fil 1 och kompletterande fil 2.
- Huvudramens utformning:
- Designa huvudramen på ett sådant sätt att en skuren del kan röra sig genom huvudimplantatets övre stång och fixeras med en klämma.
- Vinkla den andra snittdelen för att ge extra styrka för att hålla råtthuvudet fixerat för att göra den kontralaterala sidan helt tillgänglig för avbildning. För denna studie, skär stålplattan med tennklipp för att producera huvudramen (figur 1H, I).
OBS: Denna del kan också 3D-skrivas ut.
2. Inledande råttträning
- Låt råttor acklimatisera sig till vivariummiljön i sina burar i 2-3 dagar.
- Börja hantera råttan i ett tyst rum. Öppna buren och låt experimentören lägga handen inuti buren nära råttan i 15-20 minuter för att låta råttan vänja sig.
- När råttan visar lugn genom att inte bli skrämd eller springa bort från experimentens händer, plocka försiktigt upp råttan för hantering. Hantera råttan i 30-45 min varje dag innan slingträning.
3. Slingträning
- Träna råttorna i minst 2-3 dagar i selarna före kirurgisk implantation av huvudimplantatet och huvudlocket.
- Ordna selställningen enligt bild 2A. Rengör seluppsättningen med etanolservetter.
Anmärkning: Alla sling är handsydda och tillverkade av ett nätmaterial antingen på botten eller på båda sidor såsom visas i figur 2A B. - För slingträning, bedöva råttorna med 4% isofluran för induktion och 1% för underhåll tills det inte finns någon baktassklämreflex.
- Under isofluranbedövning placerar du råttorna på en flexibel plastfolie som mäter 20 cm x 8 cm (längd x bredd), där 10 cm x 8 cm av plastfolien är helt täckt med den mjukare delen av kardborrebandet.
OBS: Att bedöva råttorna för slingträning är ett valfritt steg, som främst används för att minska stress och ångest. - Under de första 2 dagarna av träningen, sätt råttan tätt i en babystrumpa (storlek 0-3 månader) med huvudet ut genom ett litet hål snittat i slutet av strumpan.
- Linda en liten bit absorberande dyna runt underkroppsdelen för att hålla råttan torr och samla avföring.
- Svep in råttan i en andningsbar bomullstrasa (storlek: 25 cm x 25 cm). Placera råttan på ett plastark som har kardborreband limmade på den.
- Säkra råttan ytterligare på plastplåten med 0,5 cm breda kardborreband på ett avstånd av 3-6 mm från varandra.
- Säkra råttan i selen. Ta bort gasbedövningen. Låt råttan återhämta sig från gasbedövning i slingan.
- När råttan börjar vispa, erbjud några droppar 10% sackaroslösning som belöning var 10-15: e minut.
- Presentera råttan slumpmässigt med de sensoriska stimuli som kommer att användas under avbildning (här morrhårstimulering, var 15-25: e minut) för att vänja den vid sensoriska stimuli. Stimulera morrhåren manuellt med slumpmässiga intervall.
- Träna råttan i selen i 1 timme dag 1, 2 timmar dag 2 och 3 timmar dag 3 enligt figur 2C.
4. Prekirurgisk förberedelse
- Skriv ut huvudimplantatet och huvudlocket med 3D-skrivaren (bild 1).
- Sterilisera alla kirurgiska instrument och huvudstycken (implantat och lock) genom att nedsänka utrustningen i Metricide28-bakteriedödaren i 10 timmar. Skölj verktygen noggrant med sterilt vatten strax före operationen.
- Utsätt råttan för 4% isofluran och håll sedan vid 1%-2% isofluran tills det inte finns någon baktassnypreflex. Denna operation kan utföras under många typer av anestesi, såsom isofluran, natriumpentobarbital och ketamin-xylazin.
- Injicera atropin (0,05 mg/kg) intramuskulärt för att minska slemhinnor för att hjälpa till att andas.
- Raka råttans huvud 5 mm centrerat runt mittlinjen med en hårtrimmer som börjar mellan ögonen till baksidan av öronen.
- Övervaka partiell syremättnad och hjärtfrekvens genom en pulsoximeter och pulsmätarsond fäst vid råttans bakben.
- Torka råttans huvud och det omgivande området tre gånger med alternerande omgångar betadin och 70% alkoholservetter.
- Fixa råttan i ett stereotaxiskt system.
- Sätt i en vaselin smord rektal sond för att mäta råttans kroppstemperatur och upprätthålla den genom värmefiltens återkopplingssystem för att undvika hypotermi efter anestesiadministrering.
- Administrera lokalbedövningslidokainhydroklorid i en koncentration av 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 kroppsvikt subkutant på operationsstället.
- Applicera oftalmisk salva på båda ögonen för att förhindra torkning.
- Administrera 2% lokalbedövning subkutant över operationsområdet.
- Injicera 3 ml lakterad ringlösning vid rumstemperatur subkutant för att förhindra uttorkning och ge näring under operationen.
5. Kirurgi
- Ta bort den del av huden över operationsområdet (4 mm diameter centrerad runt mittlinjen och mitten av huvudet) med en vass kirurgisk sax. Dissekera och ta bort en del av huden (~ 2 mm diameter, över vänster somatosensorisk cortex) mellan örat och ögat på den temporala delen av huvudet.
- Ta bort, med hjälp av en skalpell, den underliggande hudvävnaden (perikranium) för att exponera skallen. Rengör skallen med steriliserad bomullsgasbindning.
- Dra tillbaka/resektera temporalmuskeln för att exponera önskad storlek för bildområdet [7,5 mm x 7,5 mm för denna studie].
- Exponera skallen på den kontralaterala halvklotet för huvudimplantatet. Placera huvudimplantatet på skallen för att fastställa placeringen av förankringsskruvarna för implantatet enligt figur 2D-F.
- Markera skallen för borrning av skruvarna med India Ink med borr 1. Borra gradhålen för skruvarna med tandborr 3. Skruva fast huvudimplantatet.
- Torka skallen med steril gasbindning. Applicera ett tunt lager vävnadslim runt och under huvudimplantatet för att limma det på skallen. Applicera ett lager tandcement för att ytterligare stödja huvudimplantatet på plats och låt cementet torka i 2-3 minuter.
OBS: Användningen av vävnadslim förutom tandcement säkerställer ett starkt grepp8. - Använd tandborr 3, tunna ett 7,5 mm x 7,5 mm område på vänster sida av skallen strax bakom bregma och lateralt till mittlinjen. Tunna skallen till ~50 μm enligt figur 3A.
- Applicera aktuell antibiotisk salva över operationsområdet och täck den sedan med ett tunt lager silikongummi för att skydda den tunna skallen som visas i figur 3B. Täck operationsområdet med huvudlocket enligt figur 3C. Fäst den på plats med de två små trådbitarna som går igenom både huvudimplantatet och huvudlocket som visas i figur 3D, E. Applicera silikongummi för att täcka huvudlocket och skallen för att stabilisera huvudlocket ytterligare på råttans huvud enligt figur 3F.
OBS: Silikongummi ger ytterligare skydd för tunn skalle. - Injicera råtta med flunixinmeglumin(2,5 mg/kg) subkutant för smärt- och inflammationsbehandling. För att förhindra infektion, injicera Enrosite antibiotikum enrofloxacin (22,7 mg / ml, 10 mg / kg +/-.01), intraperitonealt.
- Flytta råttan till återhämtningskammaren för att bibehålla kroppstemperaturen med en värmande filt och en värmelampa. Övervaka råttan kontinuerligt tills den återfår medvetandet och kan upprätthålla sternal liggande.
- Sätt tillbaka råttan i sin separata bur när den har återhämtat sig helt.
- Under de kommande 3 dagarna, administrera flunixin och buprenorfin för att lindra inflammation och smärta och enrosit för att förhindra infektion två gånger dagligen.
6. Vaken bildbehandling
- Bedöva råttan med 4% isofluran för induktion och 1% för underhåll när det inte finns någon baktassklämreflex. Injicera acepromazin (0,3-0,5 mg / kg) subkutant.
OBS: Denna koncentration av acepromazin ligger under milda sederingsnivåer och hjälper bara till att hålla råttorna lugna under hela bildprocessen. - Använd anpassade remsor av kardborreband, fixa råttan på plastplåten som används under träningsprocedurerna. Linda in underkroppsdelen med en absorptionsdyna och placera råttan tätt i selen.
- Ta bort kiselgummit. Ta bort huvudlocket genom att ta bort fixeringstrådarna. Fäst huvudramen i huvudimplantatet enligt figur 2G.
- Lås huvudramen i klämmor enligt figur 2H, I.
- Ta bort gasbedövning. Spola bildområdet med saltlösning 3x och rengör med våt gasväv. Torka bildområdet och gör en brunn med vaselin runt bildområdet. Fyll brunnen med steriliserad saltlösning och täck med en glasskiva (figur 2E).
- Se förvärvsprocedurerna för inbyggd signaloptisk avbildning, whiskerstimuleringsprotokollet och dataanalys och presentation, som har diskuterats i detalj tidigare 6,7.
- Under hela experimentet, övervaka råttorna för tecken på agitation och rastlöshet, vilket kan minskas ytterligare genom att täcka råttornas ögon med en mjuk trasa eller gasbindning (valfritt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa optiska bildsignalerna från en enda studie av en sövd råtta och det summerade svaret (av 40 insamlade försök) av en vaken råtta visas (figur 4). Signalintensiteten för enkelmorrhårsstimulering av en vaken råtta kan visualiseras vid en högre tröskel än för den sövda råttan, vilket visar en starkare signal från det vakna djuret. C2-morrhåren hos råttor stimuleras vid 5 Hz i 1 s, och det funktionella svaret visas som en fraktionerad förändring jämfört med baslinjen. De mörkare områdena (under den negativa tröskeln) är huvudområdena för neuronaktivitet, och de ljusa vita områdena (över den positiva tröskeln) visar det syresatta blodsvaret på stimulering9. Bilderna är inriktade så att från vänster till höger är från rostral till caudal (C) och uppifrån och ner är medial till lateral (L) riktning, som visas av pilarna.
Figur 1: Huvudlock, huvudimplantat och huvudram. (A) Huvudlocket (ovanifrån): sidan av ovanifrån visar krökningen för att rikta in sig längs huvudets krökning för att skydda huvudet. De två ihåliga rektangulära delarna är för metalltrådarna att passera genom huvudlocket. (B) Huvudkåpan (nedifrån) visar det bredare rektangulära snittet för att passa i huvudimplantatets övre stång och de två vinkelräta skärningarna för ledningarna att röra sig genom implantatet och huvudlocket för att hålla dem på plats. (C) Huvudimplantat med de tre skurna hålen för förankringsskruvarna. Förankringsskruvarnas positioner på huvudimplantatet kan justeras enligt råttans huvud. D) Huvudlock och huvudimplantat (sidovy). Sidovyn av huvudimplantatet visar den rektangulära stången ihålig från insidan för att låta tråden passera igenom för att förankra huvudlocket till huvudimplantatet. (E-G) Vy över huvudimplantatet förankrat i huvudlocket genom ett trådstycke; Vy från nedsida, sida och ovanifrån för att visa hur huvudimplantatet är monterat inuti huvudlocket. (H) Huvudram, (I) huvudimplantat förankrat i huvudramen. Avståndet mellan två linjer på skalan (som visas av den blå rektangeln) är 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Slingor, huvudimplantat och fixering av huvudramen för vaken, huvudfixerad avbildning. (A,B) Kundanpassat sele med nätmaterial för antingen endast botten eller båda sidor. c) råtta placerad på plastduken, fastsatt med kardborreband, under selträning, (D-F) ovanifrån och från sidan av huvudimplantatet på en råttskalle ovanför den kontralaterala halvklotet. Prickade linjer visar bildområdet. Topp- och sidovyerna visar tydligt de tre hålen för att fästa huvudimplantatet på skallen med förankringsskruven. (E) Sidovyn visar den ihåliga stång genom vilken tråden passerar för att förankra huvudlocket till huvudimplantatet när råttorna inte avbildas. Ett ben av huvudramen passerade genom den ihåliga delen av huvudimplantatet för avbildning av råttbarken. (G) Huvudram genom huvudimplantatet för vakna, huvudfixerade råttor. (H) Huvudramen genom huvudimplantatet med sina två ben fastspända för vaken, huvudfixerad avbildning (I) av vakna, huvudfixerade råttor under bildsessionerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Placering av huvudimplantat. (A) Den tunna skallen förberedelse för vaken, huvudfixerad avbildning. (B) Huvudimplantat fixerat på råttskallen och det tunna skalleavbildningsområdet täckt med gummisilikon. c) Huvudlocket är placerat på huvudimplantatet. (D,E) Huvudkåpan förankrad i huvudimplantatet med belagda metalltrådar. (F) Huvudlocket och det omgivande området täckt med gummisilikon för ytterligare stöd vid fixering och skydd av skallen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Funktionella svar vid C2-morrhårsstimulering. (A) Ett representativt funktionellt svar från en enda prövning av en 5 Hz C2-stimulering av morrhår under 1 s vaken, huvudfixerad råttavbildning, där varje försök varar i 7 s med ett intervall mellan försöken på 3 s ± 2 s. Tröskelvärdet för gråskalerepresentation av fraktionerad förändring från baslinjen (−3,5 × 10−3 till 3,5 × 10−3). (B) Ett representativt funktionellt svar från en prövning av en 5 Hz C2 whiskerstimulering för 1 s av en sövd (natriumpentobarbital) råtta. Tröskelvärdet för gråskalerepresentation av fraktionerad förändring från baslinjen (−2,5 × 10−4 till 2,5 × 10−4). Det funktionella svaret hos den vakna, huvudfixerade råttan är 140 gånger starkare än hos den bedövade råttan. Varje ram är en 0,5 s ram. Bilderna är inriktade så att från vänster till höger är från rostral till caudal och från topp till botten är från medial till lateral riktning som visas av pilarna. De mörkare områdena (under den negativa tröskeln) är huvudområdena för neuronaktivitet, och de ljusa vita områdena (över den positiva tröskeln) visar det syresatta blodsvaret på stimulering. Skalstång = 1 mm. Förkortningar: C = caudal; L = lateral. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: 3D-utskriftsfil för huvudimplantatet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: 3D-utskriftsfil för huvudlocket. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av vaken, huvudfixerad råttavbildning erbjuder många fördelar när det gäller enkelhet och anpassning. De specialdesignade lyftselarna gör att råttorna kan lindas in genom andningsbart nätmaterial, vilket eliminerar behovet av att innesluta djur i slutna plasthållkammare under längre perioder10,11. Råttor hålls lugna och stressfria under de långa varaktigheterna av på varandra följande bildsessioner med en mycket låg dos acepromazin under nivåerna av mild sedering hos råttor (1,0-2,5 mg / kg)12. För att hålla råttan stadig och ytterligare eliminera rörelseartefakter under bildsessionerna används kardborreband. Kardborrebanden placeras 3-6 mm från varandra för att undvika onödig kroppsförträngning under långa timmar. Råttorna tränas och vänjer sig vid lyftselar i ung ålder för att säkerställa att de förblir lugna och bekväma när de vilar i sina lyftselar under förberedelser och datainsamling. Baserat på de preliminära resultaten är unga råttor som väger cirka 150-175 g lättare och snabbare att träna än äldre råttor.
Huvudimplantatet på råtthuvudet väger bara 0,174 g och det avtagbara huvudlocket väger 1,483 g. Huvudimplantatet täcker ett område på 0,5 cm till 1,5 cm på en halvklot, vilket möjliggör fullständig tillgänglighet av den andra halvklotet för neuroimaging. Storleken på huvudkåpan säkerställer full täckning av operationsområdet. Vikterna på huvudimplantatet och huvudlocket verkar inte hindra rörligheten och de dagliga aktiviteterna, och råttorna kan hållas tillsammans i standardburar. Med hjälp av denna huvud- och kroppsbegränsande metod kan råttorna avbildas i 2-3 timmar varje gång på olika dagar för longitudinella studier. Flera bildsessioner kan utföras på en enda råtta i minst upp till 3 månader med den här inställningen. Det tar totalt 25 min att 3D-printa huvudimplantatet och huvudlocket. Delarna är lätt anpassningsbara beroende på gnagarens storlek och kan även anpassas för att användas i möss. För studier som kräver differentiering av råttorna kan olika färger och material ge enkel identifiering. Dessutom kan den övre delen av locket anpassas för att lägga till symboler, siffror eller bokstäver för enkel identifiering.
Det finns flera viktiga steg för framgångsrik implantation och avbildning, varav den viktigaste är råttornas träning och tillvänjning. Råttorna presenteras slumpmässigt med sensoriska stimuli för att minimera potentialen för associativt lärande, vilket kan påverka bildresultaten. Operationen och alla kirurgiska instrument måste vara sterila för att förhindra infektion, och användningen av lokala antibiotika är absolut nödvändig. Användningen av acepromazin i början av avbildningen är viktig för att hålla djuren lugna och tysta för att undvika onödiga rörelser under bildsessionerna. Råttans skalle måste vara torr för korrekt fixering, och skiktet av deponerad tandcement måste vara tillräckligt tunt för att huvudkåpan ska passa in i huvudimplantatet.
För den aktuella studien var avbildningsområdet centrerat på den somatosensoriska cortexen. Det gallrade området mäter cirka 7,5 mm x 7,5 mm, vilket är omfattningen av det område som kan avbildas i den aktuella studien. Det avbildade området kan dock ökas till 11 mm x 11 mm om det behövs. En annan fördel med denna design är att den möjliggör avbildning av hela det tunna området trots cortexens krökning.
Tidigare rapporterade huvudimplantat kräver nästan 7-12 förankringsskruvar för att fixera huvudimplantatet på råttans huvud13,14. Detta utesluter avbildning av ett större område genom tunn skallberedning. En annan fixeringsmetod kräver fixering av ett hartsmaterial över ett stort område med hjälp av huvudskruvar, vilket gör skallen otillgänglig för avbildning14. Den vakna avbildningen av råttor med MR kräver immobilisering av djur i cylindriska rör, vilket gör avbildningsupplevelserna stressande för djuren11,15. I vissa andra inställningar sticker huvudimplantatet ut ur huvudet och kan trassla in sig i standardburar16,17. Huvudimplantatet och huvudlocket eliminerar användningen av fixering av glasskivor och plattning av den tunna skallen för kronisk avbildning18,19. Huvudimplantatets storlek och användningen av krökning på huvudlocket eliminerar behovet av att göra ändringar i standardburarna som i andra kroniska förfaranden18,19. Huvudimplantaten hos möss är enklare eftersom endast en enda mutter- och skruvkonfiguration används, vilket inte är möjligt hos råttor, eftersom råttor är mycket starkare och svårare att hålla stabila20.
Begränsningen med huvudimplantatet är att det, trots sin lilla storlek, kräver förankring av implantatet till skallen med skruvar. Huvudimplantatet är nödvändigt för att hålla djurets huvud stadigt men begränsar avbildning av hela råtthjärnan. En fördel med att använda detta huvudimplantat är dock att det kan användas för att avbilda ett bredare område för framkallad sensorisk stimulering med hjälp av olika neuroimaging-modaliteter såsom inbyggd signaloptisk avbildning, doppleroptisk koherenstomografi och laserspeckle-avbildning.
De kortikala funktionella representationerna baserade på inneboende signaler från vakna, huvudfixerade råttor tenderar att vara starkare i intensitet än hos bedövade råttor med samma whiskerstimuleringsprotokoll. En liknande ökning av styrkan hos framkallad inneboende signalrespons har rapporterats hos vakna apor21,22. Nuvarande arbete pågår för att förbättra huvudimplantatet och huvudlockets design för mer utmanande miljöer som den naturalistiska livsmiljön23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha och Amirsoheil Zareh för deras hjälp under träning av råttorna och förberedelse av slingorna. Finansiering tillhandahölls av National Institutes of Health (NIH, bidragsnummer: NS119852) och Leducq Foundation (bidragsnummer: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
