Summary
Uyanık, kafası sabitlenmiş sıçanların fonksiyonel görüntülemesi için ayrıntılı yeni bir prosedür tanımlanmıştır.
Abstract
Preklinik ve temel bilimsel araştırmalarda yaygın olarak kullanılan anestezikler, beynin metabolik, nöronal ve vasküler fonksiyonları üzerinde depresif bir etkiye sahiptir ve nörofizyolojik sonuçları olumsuz yönde etkileyebilir. Araştırma çalışmaları için uyanık hayvanların kullanılması avantajlıdır, ancak veri toplama boyunca hareket artefaktlarını en aza indirmek için hayvanları sakin ve sabit tutmanın en büyük zorluğunu ortaya koymaktadır. Daha küçük boyutlu kemirgenlerde (örneğin, fareler) uyanık görüntüleme çok yaygındır, ancak sıçanlar daha büyük, daha güçlü olduğu ve görüntüleme için gereken uzun süreler boyunca hareket kısıtlamalarına ve kafa fiksasyonuna karşı çıkma eğilimi daha yüksek olduğu için sıçanlarda yetersiz kalır. Özelleştirilmiş elle dikilmiş askılar, 3D baskılı kafa implantları, kafa kapakları ve bir kafa çerçevesi kullanılarak uyanık, başa sabitlenmiş sıçanların yeni bir nörogörüntüleme modeli açıklanmaktadır. Tek bıyıklı stimülasyonun tek bir denemesinden sonra elde edilen sonuçlar, uyarılmış fonksiyonel yanıtın yoğunluğunda bir artış olduğunu göstermektedir. Uyandırılan fonksiyonel yanıtın uyanık, başa sabitlenmiş sıçanlardan elde edilmesi, anestezi uygulanan sıçanlardan daha hızlıdır, güvenilir, tekrarlanabilir ve tekrarlanan uzunlamasına çalışmalar için kullanılabilir.
Introduction
Temel, preklinik ve translasyonel bilimsel nörogörüntüleme araştırmalarının çoğu anestezi uygulanan hayvanlardan elde edilir 1,2. Anestezikler deneyleri kolaylaştırır, ancak beynin ve vücudun metabolizmasını, kan basıncını ve kalp atış hızını sürekli olarak etkiler3. Anestezinin türü ve uygulama süresi ve yolu, tekrarlanabilirliğe ve translasyonel başarısızlıklara katkıda bulunabilecek veri yorumlamasına kafa karıştırıcı değişkenler eklemektedir4. Uyanık, kafası sabitlenmiş sıçan nörogörüntüleme çalışmalarının önemli bir darboğazı, sıçanı hazırlık ve veri toplama süreçleri boyunca sabit ve sakin tutma gerekliliğidir. Küçük hareketler, veri analizini ve yorumlarını olumsuz yönde etkileyebilecek yersiz hareket eserleri üretir.
Özelleştirilmiş askılar, üç boyutlu (3D) baskılı kafa implantları, kafa kapakları ve kolay deney için çeşitli avantajlar sunan bir kafa çerçevesi kullanan uyanık, başa sabitlenmiş sıçanlardan yeni bir nörogörüntüleme modeli geliştirilmiştir. 3D kafa implantı hafiftir ve transfiksasyon için gereken kafatasının küçük bir bölümünü kaplar. 3D baskılı kafa implantları ve kapakları, bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak tasarlanmıştır. Bıyık stimülasyonu, veri toplama, veri analizi ve anestezi uygulanan sıçanlardan elde edilen sonuçların protokolleri önceki çalışmalarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır 5,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Ulusal Sağlık Enstitüsü yönergelerine uygundu ve Kaliforniya Üniversitesi, Irvine Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada yedi erkek ve bir dişi sıçan (Sprague-Dawley, ağırlık: 185-350 g) kullanılmıştır. Çalışma tamamlandıktan sonra, sıçanlar aşırı dozda karbondioksit kullanılarak kurban edildi.
1. Farklı bileşenlerin tasarımı
- Kafa implantının tasarımı:
- CAD yazılımını kullanarak kafa implantını yapın (Şekil 1C) ve bregma'nın arkasındaki ve somatosensoriyel korteks merkezli orta çizgiye bitişik alanı görüntülemek için tasarlayın. Kafa implantının kafatasında görüntüleme alanından uzakta 0,9 mm ila 1,9 mm'lik bir alanı kapladığından emin olun.
- Kafa implantını sıçanın kafatasına sabitlemek için sadece üç vida kullanın. Tüm vida deliklerini, görüntülenen yarımkürenin kontralateral yarımküresinde orta çizginin karşı tarafında kalacak şekilde tasarlayın.
- Tellerin kafa kapağını Şekil 1D'de gösterildiği gibi kafa implantına sabitlemesine izin vermek için kafa implantının üst kısmına içeriden oyulmuş bir çubuk yerleştirin.
- Kafa kapağının tasarımı:
- Kafa kapağının görüntüleme alanını tamamen kapladığından ve Şekil 1A, B'de gösterildiği gibi her türlü travmadan koruduğundan emin olun. Kafa kapağına bir eğrilik ekleyin, böylece standart zenginleştirilmiş kafeslerde hayvanın günlük aktivitelerine zorluk çıkarmadan başın şekline hizalanır.
- Kafa kapağının iç tarafını daha geniş dikdörtgen bir şekilde kesin, böylece kafa implantının üst kısmı Şekil 1E'de gösterildiği gibi içine sığabilir. Bu dikdörtgene dik olarak, kafa kapağını kafa implantına sabitlemek için diğer iki dikdörtgen bölgeyi kesin.
- Kafa kapağının Şekil 1E-G'de gösterildiği gibi sıçan kafasına sabitlenmesi için kafa implantının üst içi boş çubuğundan bir tel geçirin. İkinci teli de aynı şekilde geçirin.
NOT: Bu teller pense veya forseps kullanılarak kolayca çıkarılabilir. 3D baskı dosyaları Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2 olarak sağlanır (dosya formatı: STL).
- Kafa çerçevesinin tasarımı:
- Kafa çerçevesini, kesilen bir parçanın kafa implantının üst çubuğundan geçebileceği ve bir kelepçe kullanılarak sabitlenebileceği şekilde tasarlayın.
- Diğer kesim kısmını, karşıt tarafı görüntüleme için tamamen erişilebilir hale getirmek üzere sıçan kafasını sabit tutmak için ekstra güç sağlamak üzere açın. Bu çalışmanın amacı doğrultusunda, kafa çerçevesini üretmek için çelik plakayı kalay makaslarla kesin (Şekil 1H, I).
NOT: Bu bölüm 3D olarak da basılabilir.
2. İlk sıçan eğitimi
- Sıçanların kafeslerindeki vivaryum ortamına 2-3 gün boyunca alışmalarına izin verin.
- Sıçanı sessiz bir odada tutmaya başlayın. Kafesi açın ve deneycinin, sıçanın alışmasına izin vermek için ellerini 15-20 dakika boyunca sıçanın yanındaki kafesin içine koymasını sağlayın.
- Sıçan, ürkmeyerek veya deneycinin ellerinden kaçarak sakinlik gösterdiğinde, sıçanı işlemek için yavaşça alın. Askı eğitiminden önce sıçanı her gün 30-45 dakika tutun.
3. Askı eğitimi
- Sıçanları, kafa implantının ve kafa kapağının cerrahi implantasyonundan önce askılarda en az 2-3 gün boyunca eğitin.
- Askı kurulumunu Şekil 2A'da gösterildiği gibi düzenleyin. Askı düzeneğini etanol mendiller kullanarak temizleyin.
NOT: Tüm askılar elle dikilir ve Şekil 2A, B'de gösterildiği gibi altta veya her iki tarafta bir ağ malzemesinden yapılmıştır. - Askı eğitimi için, arka pençe sıkışma refleksi kalmayana kadar indüksiyon için% 4 izofluran ve bakım için% 1 kullanarak sıçanları uyuşturun.
- İzofluran anestezisi altında, sıçanları 20 cm x 8 cm (uzunluk x genişlik) ölçülerinde esnek bir plastik tabaka üzerine yerleştirin, burada plastik tabakanın 10 cm x 8 cm'si Velcro'nun daha yumuşak kısmı ile tamamen kaplanır.
NOT: Sıçanların askı eğitimi için anestezi altına alınması, öncelikle stres ve kaygıyı azaltmak için kullanılan isteğe bağlı bir adımdır. - Eğitimin ilk 2 günü boyunca, sıçanı çorabın sonunda kesilmiş küçük bir delikten kafası dışarı çıkararak bir bebek çorabına (0-3 ay boyu) sıkıca koyun.
- Sıçanı kuru tutmak ve dışkıları toplamak için alt vücut kısmının etrafına küçük bir emici ped parçası sarın.
- Sıçanı nefes alabilen pamuklu bir beze sarın (boyut: 25 cm x 25 cm). Sıçanı, üzerine Velcro şeritleri yapıştırılmış plastik bir tabakaya yerleştirin.
- Sıçanı, birbirinden 3-6 mm mesafede 0,5 cm genişliğinde Velcro şeritler kullanarak plastik tabakaya daha da sabitleyin.
- Sıçanı askıda sabitleyin. Gaz anestezisini çıkarın. Sıçanın askıdaki gaz anestezisinden kurtulmasına izin verin.
- Sıçan çırpmaya başladığında, her 10-15 dakikada bir ödül olarak birkaç damla% 10 sakkaroz çözeltisi sunun.
- Sıçanı, duyusal uyaranlara alıştırmak için görüntüleme sırasında kullanılacak duyusal uyaranlarla rastgele sunun (burada bıyık stimülasyonu, her 15-25 dakikada bir). Bıyıkları rastgele aralıklarla manuel olarak uyarın.
- Sapandaki sıçanı Şekil 2C'de gösterildiği gibi 1. günde 1 saat, 2. günde 2 saat ve 3. günde 3 saat boyunca eğitin.
4. Cerrahi öncesi hazırlık
- Kafa implantını ve kafa kapağını 3D yazıcıyı kullanarak yazdırın (Şekil 1).
- Ekipmanı 10 saat boyunca Metricide28 mikrop öldürücüye batırarak tüm cerrahi aletleri ve başlıkları (implantlar ve kapaklar) sterilize edin. Ameliyattan hemen önce aletleri steril suyla iyice durulayın.
- Sıçanı% 4 izofluran'a maruz bırakın ve daha sonra arka pençe sıkışma refleksi kalmayana kadar% 1 -% 2 izofluran'da tutun. Bu ameliyat, izofluran, sodyum pentobarbital ve ketamin-ksilazin gibi birçok anestezi türü altında gerçekleştirilebilir.
- Nefes almaya yardımcı olmak için mukoza sekresyonlarını azaltmak için kas içine atropin (0.05 mg / kg) enjekte edin.
- Sıçanın kafasını, gözlerin arasından kulakların arkasına kadar bir saç düzeltici kullanarak orta çizginin etrafında ortalanmış 5 mm tıraş edin.
- Kısmi oksijen doygunluğunu ve kalp atış hızını, sıçanın arka bacağına sabitlenmiş bir nabız oksimetresi ve kalp atış hızı monitörü probu ile izleyin.
- Sıçanın kafasını ve çevresini alternatif betadin turları ve% 70 alkollü mendillerle üç kez silin.
- Sıçanı stereotaksik bir sistemde sabitleyin.
- Sıçanın vücut sıcaklığını ölçmek için petrol jölesi ile yağlanmış bir rektal prob yerleştirin ve anestezik uygulamadan sonra hipotermiyi önlemek için ısıtma battaniyesinin geri bildirim sistemi aracılığıyla koruyun.
- Lokal anestezik lidokain hidroklorürü ameliyat bölgesinde deri altından 20 mg/ml, 0.07 mg/kg +/-0.2 vücut ağırlığı konsantrasyonunda uygulayın.
- Kurumayı önlemek için her iki göze de oftalmik merhem sürün.
- Ameliyat bölgesine deri altından% 2 lokal anestezik uygulayın.
- Dehidrasyonu önlemek ve ameliyat sırasında beslenme sağlamak için oda sıcaklığında deri altından 3 mL laktasyonlu zil çözeltisi enjekte edin.
5. Ameliyat
- Keskin cerrahi makas kullanarak cildin cerrahi bölge üzerindeki kısmını (orta hat ve başın merkezi etrafında ortalanmış 4 mm çapında) çıkarın. Başın temporal kısmında kulak ve göz arasındaki cildin bir kısmını (~ 2 mm çapında, sol somatosensoriyel korteks üzerinde) diseke edin ve çıkarın.
- Kafatasını açığa çıkarmak için bir neşter kullanarak altta yatan deri (perikraniyum) dokusunu çıkarın. Kafatasını sterilize pamuklu gazlı bez kullanarak temizleyin.
- Görüntüleme alanı için istenen boyutu ortaya çıkarmak için temporal kası geri çekin/rezeke edin [bu çalışma için 7,5 mm x 7,5 mm].
- Kafa implantı için kafatasını kontralateral yarımküre üzerinde açığa çıkarın. İmplantın sabitleme vidalarının yerini belirlemek için kafa implantını kafatasının üzerine yerleştirin, Şekil 2D-F'de gösterildiği gibi.
- Matkap ucu 1 ile Hindistan Mürekkebi kullanarak vidaları delmek için kafatasını işaretleyin. Vidalar için çapak deliklerini diş matkap ucu 3 kullanarak delin. Kafa implantını yerine vidalayın.
- Kafatasını steril gazlı bez kullanarak kurutun. Kafatasına yapıştırmak için kafa implantının etrafına ve altına ince bir doku yapıştırıcı tabakası uygulayın. Kafa implantını yerinde daha fazla desteklemek için bir diş çimentosu tabakası uygulayın ve çimentoyu 2-3 dakika kurumaya bırakın.
NOT: Diş çimentosuna ek olarak doku yapıştırıcısı kullanımı güçlü bir tutuş sağlar8. - Dental matkap ucu 3'ü kullanarak, kafatasının sol tarafında, bregmanın hemen arkasında ve orta hatta yanal olan 7,5 mm x 7,5 mm'lik bir alanı inceltin. Kafatasını Şekil 3A'da gösterildiği gibi ~ 50 μm'ye kadar inceltin.
- Cerrahi bölgeye topikal antibiyotik merhem uygulayın ve daha sonra Şekil 3B'de gösterildiği gibi inceltilmiş kafatasını korumak için ince bir silikon kauçuk tabakası ile örtün. Cerrahi bölgeyi Şekil 3C'de gösterildiği gibi baş kapağını kullanarak örtün. Şekil 3D, E'de gösterildiği gibi hem kafa implantından hem de kafa kapağından geçen iki küçük tel parçası ile yerine sabitleyin. Kafa kapağını ve kafatasını örtmek için silikon kauçuk uygulayın, böylece kafa kapağını Şekil 3F'de gösterildiği gibi sıçanın kafasında daha da stabilize edin.
NOT: Silikon kauçuk, inceltilmiş kafatasına ek koruma sağlar. - Ağrı ve inflamasyon yönetimi için sıçana deri altından flunixin meglumin (2.5 mg / kg) enjekte edin. Enfeksiyonu önlemek için, intraperitoneal olarak Enrosit antibiyotik enrofloksasin (22.7mg / ml, 10mg / kg +/-.01) enjekte edin.
- Bir ısınma battaniyesi ve bir ısı lambası ile vücut sıcaklığının korunmasına yardımcı olmak için sıçanı kurtarma odasına taşıyın. Sıçanı bilincini yeniden kazanana ve sternal yatışmayı koruyana kadar sürekli izleyin.
- Tamamen iyileştikten sonra sıçanı ayrı kafesine geri döndürün.
- Önümüzdeki 3 gün boyunca, inflamasyonu ve ağrıyı hafifletmek için flunixin ve buprenorfin uygulayın ve günde iki kez enfeksiyonu önlemek için enrosite uygulayın.
6. Uyanık görüntüleme
- Arka pençe sıkışma refleksi olmadığında sıçanı indüksiyon için% 4 izofluran ve bakım için% 1 ile uyuşturun. Deri altından asepromazin (0.3-0.5 mg / kg) enjekte edin.
NOT: Bu asepromazin konsantrasyonu hafif sedasyon seviyelerinin altındadır ve sadece görüntüleme işlemi boyunca sıçanların sakin kalmasına yardımcı olur. - Özelleştirilmiş Velcro şeritleri kullanarak, sıçanı eğitim prosedürleri sırasında kullanılan plastik tabakaya sabitleyin. Alt gövde kısmını bir emme pedi kullanarak sarın ve sıçanı sıkıca askıya yerleştirin.
- Silikon kauçuğu çıkarın. Sabitleme tellerini çıkararak kafa kapağını çıkarın. Kafa implantındaki kafa çerçevesini Şekil 2G'de gösterildiği gibi sabitleyin.
- Başlık çerçevesini Şekil 2H, I'de gösterildiği gibi kelepçelere kilitleyin.
- Gaz anestezisini çıkarın. Görüntüleme alanını tuzlu su 3x ile yıkayın ve ıslak gazlı bezle temizleyin. Görüntüleme alanını kurutun ve görüntüleme alanının etrafında petrol jölesi kullanarak bir kuyu açın. Kuyuyu sterilize edilmiş salinle doldurun ve bir cam slaytla örtün (Şekil 2E).
- Daha önce ayrıntılı olarak tartışılmış olan içsel sinyal optik görüntüleme, bıyık stimülasyon protokolü ve veri analizi ve sunumu için edinim prosedürlerine bakın 6,7.
- Deney boyunca, sıçanların gözlerini yumuşak bir bez veya gazlı bezle (isteğe bağlı) örterek daha da azaltılabilen ajitasyon ve huzursuzluk belirtileri için sıçanları izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anestezi uygulanan bir sıçanın tek bir çalışmasından elde edilen temsili optik görüntüleme sinyalleri ve uyanık bir sıçanın toplam yanıtı (toplanan 40 çalışmadan) gösterilmiştir (Şekil 4). Uyanık bir sıçanın tek bıyıklı stimülasyonu için sinyal yoğunluğu, anestezi uygulanan sıçandan daha yüksek bir eşikte görselleştirilebilir ve uyanık hayvandan daha güçlü bir sinyal gösterir. Sıçanların C2 bıyıkları, 1 s boyunca 5 Hz'de uyarılır ve fonksiyonel yanıt, taban çizgisine kıyasla kesirli bir değişiklik olarak görüntülenir. Daha koyu alanlar (negatif eşiğin altında) nöronal aktivitenin ana alanlarıdır ve parlak beyaz alanlar (pozitif eşiğin üstünde) stimülasyona oksijenli kan tepkisini gösterir9. Görüntüler, oklarla gösterildiği gibi, soldan sağa rostralden kaudal (C) ve yukarıdan aşağıya doğru medialden lateral (L) yöne olacak şekilde hizalanmıştır.
Şekil 1: Kafa başlığı, kafa implantı ve kafa çerçevesi. (A) Baş kapağı (üstten görünüm): Üstten görünümün yan tarafı, başı korumak için başın eğriliği boyunca hizalanacak eğriliği gösterir; İki içi boş dikdörtgen parça, metal tellerin kafa kapağından geçmesi içindir. (B) Kafa kapağı (alttan görünüm), kafa implantının üst çubuğuna sığacak şekilde daha geniş dikdörtgen kesimi ve tellerin implant boyunca hareket etmesi için iki dikey kesimi ve onları yerinde tutmak için kafa kapağını gösterir. (C) Ankraj vidaları için üç kesilmiş delikli kafa implantı. Ankraj vidalarının kafa implantı üzerindeki konumları, sıçanın kafasına göre ayarlanabilir. (D) Baş başlığı ve kafa implantı (yandan görünüm); Kafa implantının yandan görünümü, baş kapağını kafa implantına sabitlemek için telin geçmesine izin vermek için içeriden oyulmuş dikdörtgen çubuğu gösterir. (E-G) Kafa kapağına sabitlenmiş kafa implantının tek bir tel parçasından görünümü; Kafa implantının kafa kapağının içine nasıl takıldığını göstermek için alttan görünüm, yandan görünüm ve üstten görünüm. (H) Kafa çerçevesi, (I) kafa çerçevesine sabitlenmiş kafa implantı. Ölçekteki iki çizgi arasındaki mesafe (mavi dikdörtgenle gösterildiği gibi) 1 mm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Uyanık, başa sabitlenmiş görüntüleme için askılar, kafa implantı ve kafa çerçevesinin sabitlenmesi. (A,B) Sadece alt kısım veya her iki taraf için ağ malzemesi ile özelleştirilmiş askı; (C) Askı eğitimi sırasında Velcro şeritlerle sabitlenmiş plastik tabaka üzerine yerleştirilen sıçan; (D-F) kafa implantının kontralateral yarımkürenin üzerindeki bir sıçan kafatası üzerindeki üst ve yan görünümleri. Noktalı çizgiler görüntüleme alanını gösterir. Üst ve yan görünümler, baş implantını sabitleme vidasıyla kafatasına sabitlemek için üç deliği açıkça göstermektedir. (E) Yandan görünüm, sıçanlar görüntülenmediğinde baş kapağını kafa implantına sabitlemek için telin içinden geçtiği içi boş çubuğu gösterir. Kafa çerçevesinin bir bacağı, sıçan korteksinin görüntülenmesi için kafa implantının içi boş kısmından geçti. (G) Uyanık, kafası sabitlenmiş sıçanlar için kafa implantından geçen kafa çerçevesi. (H) Görüntüleme seansları sırasında uyanık, kafası sabitlenmiş sıçanların uyanık, başa sabitlenmiş görüntülemesi (I) için iki bacağı kenetlenmiş olarak kafa implantından geçen kafa çerçevesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kafa implantı yerleşimi. (A) Uyanık, başa sabitlenmiş görüntüleme için ince kafatası hazırlığı. (B) Sıçan kafatasına sabitlenmiş kafa implantı ve kauçuk silikonla kaplı ince kafatası görüntüleme alanı. (C) Kafa implantı üzerine yerleştirilen kafa başlığı. (D,E) Kafa kapağı, kaplamalı metal teller kullanılarak kafa implantına sabitlenmiştir. (F) Kafatasının sabitlenmesi ve korunmasında daha fazla destek için kauçuk-silikon ile kaplı kafa kapağı ve çevresindeki alan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: C2 bıyık stimülasyonlarının fonksiyonel tepkileri. (A) 1 s uyanık, kafa sabit sıçan görüntülemesi için 5 Hz C2 bıyık stimülasyonunun temsili tek deneme fonksiyonel yanıtı, her deneme 3 s ± 2 sn deneme aralığı ile 7 s sürer. Taban çizgisinden kesirli değişimin gri tonlamalı gösteriminin eşiği (-3,5 × 10−3 ila 3,5 × 10−3). (B) Anestezi uygulanmış (sodyum pentobarbital) bir sıçanın 1 sn'si için 5 Hz C2 bıyık stimülasyonunun temsili tek deneme fonksiyonel yanıtı. Taban çizgisinden kesirli değişimin gri tonlamalı gösteriminin eşiği (-2,5 × 10−4 ila 2,5 × 10−4). Uyanık, kafası sabitlenmiş sıçanın fonksiyonel yanıtı, anestezi uygulanan sıçanınkinden 140 kat daha güçlüdür. Her kare 0,5 sn'lik bir karedir. Görüntüler, soldan sağa rostralden kaudal'a ve yukarıdan aşağıya okların gösterdiği gibi medialden yanal yöne olacak şekilde hizalanır. Daha koyu alanlar (negatif eşiğin altında) nöronal aktivitenin ana alanlarıdır ve parlak beyaz alanlar (pozitif eşiğin üstünde) stimülasyona oksijenli kan tepkisini gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Kısaltmalar: C = kaudal; L = yanal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Kafa implantı için 3D baskı dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: Kafa kapağı için 3D baskı dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uyanık, kafası sabit sıçan görüntülemenin kullanılması, kolaylık ve özelleştirme açısından birçok avantaj sunar. Özel olarak tasarlanmış askılar, sıçanların nefes alabilen ağ malzemesinden sarılmasına izin vererek, hayvanları uzun süre kapalı, plastik kısıtlama odalarına kapatma ihtiyacını ortadan kaldırır10,11. Sıçanlar, sıçanlarda hafif sedasyon seviyelerinin (1.0-2.5 mg / kg) altında çok düşük dozda asepromazin kullanılarak ardışık görüntüleme seanslarının uzun süreleri boyunca sakin ve stressiz tutulur12. Sıçanı sabit tutmak ve görüntüleme seansları sırasında hareket artefaktlarını daha da ortadan kaldırmak için Velcro şeritleri kullanılır. Velcro şeritler, uzun saatler boyunca gereksiz vücut daralmasını önlemek için birbirinden 3-6 mm uzağa yerleştirilir. Sıçanlar, hazırlık ve veri toplama sırasında askılarında sakin ve rahat dinlenmelerini sağlamak için genç yaşta askılarla eğitilir ve alışkanlık haline getirilir. Ön sonuçlara dayanarak, yaklaşık 150-175 g ağırlığındaki genç sıçanların eğitilmesi yaşlı sıçanlardan daha kolay ve hızlıdır.
Sıçan kafasındaki kafa implantı sadece 0.174 g ağırlığındadır ve çıkarılabilir kafa kapağı 1.483 g ağırlığındadır. Kafa implantı, bir yarımkürede 0,5 cm ila 1,5 cm'lik bir alanı kaplar ve diğer yarımkürenin nörogörüntüleme için tam erişilebilirliğini sağlar. Kafa kapağının boyutu, cerrahi bölgenin tam olarak kaplanmasını sağlar. Kafa implantının ve kafa başlığının ağırlıkları hareketliliği ve günlük aktiviteleri engellemiyor gibi görünmektedir ve sıçanlar standart kafeslerde bir araya getirilebilir. Bu baş ve vücut kısıtlama yöntemini kullanarak, sıçanlar uzunlamasına çalışmalar için farklı günlerde her seferinde 2-3 saat boyunca görüntülenebilir. Bu kurulum kullanılarak tek bir sıçan üzerinde en az 3 aya kadar çoklu görüntüleme seansları gerçekleştirilebilir. Kafa implantını ve kafa kapağını 3D yazdırmak toplam 25 dakika sürer. Parçalar, kemirgenin boyutuna bağlı olarak kolayca özelleştirilebilir ve ayrıca farelerde kullanılmak üzere özelleştirilebilir. Sıçanların farklılaştırılmasını gerektiren çalışmalar için, farklı renkler ve malzemeler kolay tanımlama sağlayabilir. Ek olarak, kapağın üst kısmı, kolay tanımlama için semboller, sayılar veya harfler eklemek üzere özelleştirilebilir.
Başarılı implantasyon ve görüntüleme için birkaç önemli adım vardır, bunlardan en önemlisi sıçanların eğitimi ve alışkanlığıdır. Sıçanlara, görüntüleme sonuçlarını etkileyebilecek ilişkisel öğrenme potansiyelini en aza indirmek için rastgele duyusal uyaranlar sunulur. Enfeksiyonu önlemek için cerrahi ve tüm cerrahi aletlerin steril olması gerekir ve lokal antibiyotik kullanımı zorunludur. Görüntülemenin başlangıcında asepromazin kullanımı, görüntüleme seansları sırasında gereksiz hareketlerden kaçınmak için hayvanları sakin ve sessiz tutmak için önemlidir. Sıçanın kafatasının uygun fiksasyon için kuru olması gerekir ve biriken diş çimentosu tabakasının, kafa kapağının kafa implantına sığması için yeterince ince olması gerekir.
Bu çalışma için, görüntüleme alanı somatosensoriyel korteks üzerinde merkezlenmiştir. İnceltilmiş alan yaklaşık 7.5 mm x 7.5 mm ölçülerindedir, bu da mevcut çalışmada görüntülenebilecek alanın genişliğidir. Ancak gerektiğinde görüntülenen alan 11 mm x 11 mm'ye çıkarılabilir. Bu tasarımın bir diğer avantajı, korteksin eğriliğine rağmen inceltilmiş alanın tamamının görüntülenmesine izin vermesidir.
Daha önce bildirilen kafa implantları, kafa implantını sıçanın kafasına sabitlemek için yaklaşık 7-12 ankraj vidası gerektirir13,14. Bu, inceltilmiş kafatası hazırlığı yoluyla daha büyük bir alanın görüntülenmesini engeller. Başka bir sabitleme yöntemi, bir reçine malzemesinin kafa vidaları kullanılarak geniş bir alana sabitlenmesini gerektirir ve bu da kafatasını görüntüleme için erişilemez hale getirir14. MRG kullanılarak sıçanların uyanık görüntülenmesi, hayvanların silindirik tüplerde hareketsiz hale getirilmesini gerektirir ve bu da görüntüleme deneyimlerini hayvanlar için stresli hale getirir11,15. Diğer bazı kurulumlarda, kafa implantı kafadan dışarı çıkıntı yapar ve standart kafeslerde dolaşabilir16,17. Kafa implantı ve kafa kapağı, kronik görüntüleme için cam slaytların sabitlenmesini ve ince kafatasının düzleştirilmesini ortadan kaldırır18,19. Kafa implantının büyüklüğü ve baş kapağında eğrilik kullanımı, diğer kronik işlemlerde olduğu gibi standart kafeslerde de değişiklik yapma ihtiyacını ortadan kaldırmaktadır18,19. Farelerde kafa implantları daha kolaydır, çünkü sıçanlarda mümkün olmayan sadece tek bir somun ve vida konfigürasyonu kullanılır, çünkü sıçanlar çok daha güçlü ve sabit tutulması daha zordur20.
Kafa implantının sınırlaması, küçük boyutuna rağmen, implantın vidalar kullanılarak kafatasına sabitlenmesini gerektirmesidir. Kafa implantı, hayvanın kafasını sabit tutmak için gereklidir, ancak tüm sıçan beyninin görüntülenmesini sınırlar. Bununla birlikte, bu kafa implantının kullanılmasının bir avantajı, intrinsik sinyal optik görüntüleme, doppler optik koherens tomografi ve lazer benek görüntüleme gibi çeşitli nörogörüntüleme modaliteleri kullanılarak uyarılmış duyusal stimülasyon için daha geniş bir alanı görüntülemek için kullanılabilmesidir.
Uyanık, başa sabitlenmiş sıçanların içsel sinyallerine dayanan kortikal fonksiyonel gösterimler, aynı bıyık stimülasyon protokolünü kullanan anestezi altındaki sıçanlardan daha yoğun olma eğilimindedir. Uyarılmış içsel sinyal yanıtının gücünde benzer bir artış uyanık maymunlarda bildirilmiştir21,22. Doğal habitat23 gibi daha zorlu ortamlar için kafa implantı ve kafa başlığı tasarımını geliştirmek için mevcut çalışmalar devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha ve Amirsoheil Zareh'e sıçanların eğitimi ve sapanların hazırlanması sırasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Finansman Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH, Hibe Numarası: NS119852) ve Leducq Vakfı (Hibe Numarası: 15CVD02) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
