Summary
Een gedetailleerde nieuwe procedure voor functionele beeldvorming van wakkere, op het hoofd gefixeerde ratten wordt beschreven.
Abstract
Anesthetica, vaak gebruikt in preklinisch en fundamenteel wetenschappelijk onderzoek, hebben een depressieve invloed op de metabole, neuronale en vasculaire functies van de hersenen en kunnen neurofysiologische resultaten nadelig beïnvloeden. Het gebruik van wakkere dieren voor onderzoeksstudies is voordelig, maar vormt de grootste uitdaging om de dieren kalm en stationair te houden om bewegingsartefacten tijdens het verzamelen van gegevens te minimaliseren. Wakkere beeldvorming bij kleinere knaagdieren (bijv. Muizen) komt heel vaak voor, maar blijft schaars bij ratten omdat ratten groter en sterker zijn en een grotere neiging hebben om zich te verzetten tegen bewegingsbeperkingen en hoofdfixatie gedurende de lange duur die nodig is voor beeldvorming. Een nieuw model van neuroimaging van wakkere, op het hoofd gefixeerde ratten met behulp van aangepaste handgenaaide stroppen, 3D-geprinte hoofdimplantaten, hoofdkappen en een hoofdframe wordt beschreven. De resultaten verkregen na een enkele studie van single-whisker stimulatie suggereren een toename van de intensiteit van de opgeroepen functionele respons. De verwerving van de opgeroepen functionele respons van wakkere, hoofdvaste ratten is sneller dan die van verdoofde ratten, betrouwbaar, reproduceerbaar en kan worden gebruikt voor herhaalde longitudinale studies.
Introduction
De meeste fundamentele, preklinische en translationele wetenschappelijke neuroimaging-onderzoeken worden verkregen van verdoofde dieren 1,2. Anesthetica vergemakkelijken experimenten, maar beïnvloeden voortdurend het metabolisme, de bloeddruk en de hartslag van de hersenen en het lichaam3. Het type anestheticum en de duur en wijze van toediening voegen verstorende variabelen toe aan de interpretatie van gegevens die kunnen bijdragen aan reproduceerbaarheid en translationele storingen4. Een belangrijk knelpunt van wakkere, hoofdvaste neuroimagingstudies bij ratten is de vereiste om de rat stationair en kalm te houden tijdens de voorbereidings- en gegevensverzamelingsprocessen. Kleine bewegingen produceren ongerechtvaardigde bewegingsartefacten, die een negatieve invloed kunnen hebben op gegevensanalyse en -interpretaties.
Een nieuw model van neuroimaging van wakkere, hoofdvaste ratten met behulp van aangepaste draagdoeken, driedimensionale (3D) geprinte hoofdimplantaten, hoofdkappen en een hoofdframe is bedacht dat verschillende voordelen biedt voor eenvoudig experimenteren. Het 3D-hoofdimplantaat is licht en bedekt een klein deel van de schedel dat nodig is voor transfixatie. De 3D-geprinte hoofdimplantaten en doppen zijn ontworpen met behulp van computer-aided design (CAD) software. De protocollen van snorharenstimulatie, data-acquisitie, data-analyse en resultaten van verdoofde ratten zijn in detail beschreven in eerder werk 5,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waren in overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health en goedgekeurd door de University of California, Irvine Animal Care and Use Committee. Zeven mannetjes en een vrouwelijke rat (Sprague-Dawley, gewicht: 185-350 g) werden gebruikt in deze studie. Na voltooiing van de studie werden de ratten geofferd met behulp van een overdosis koolstofdioxide.
1. Ontwerp van verschillende componenten
- Ontwerp van het hoofdimplantaat:
- Maak het hoofdimplantaat met behulp van CAD-software (figuur 1C) en ontwerp het om het gebied achter de bregma en grenzend aan de middellijn gecentreerd op de somatosensorische cortex in beeld te brengen. Zorg ervoor dat het hoofdimplantaat een gebied van 0,9 mm tot 1,9 mm op de schedel bedekt, weg van het beeldvormingsgebied.
- Gebruik slechts drie schroeven om het hoofdimplantaat op de schedel van de rat te verankeren. Ontwerp alle schroefgaten zo dat ze aan de andere kant van de middellijn in de contralaterale hemisfeer van de afgebeelde hemisfeer blijven.
- Plaats een staaf, van binnenuit uitgehold, in het bovenste deel van het hoofdimplantaat om draden in staat te stellen de hoofdkap aan het hoofdimplantaat te bevestigen, zoals weergegeven in figuur 1D.
- Ontwerp van de hoofdkap:
- Zorg ervoor dat de hoofdkap het beeldvormingsgebied volledig bedekt en beschermt tegen elke vorm van trauma zoals weergegeven in figuur 1A, B. Voeg een kromming toe aan de hoofdkap, zodat deze is afgestemd op de vorm van het hoofd zonder de dagelijkse activiteiten van het dier in de standaard verrijkte kooien te verstoren.
- Snijd de binnenkant van de hoofdkap in een bredere rechthoekige vorm, zodat het bovenste deel van het hoofdimplantaat erin past, zoals weergegeven in figuur 1E. Haaks op deze rechthoek snijdt u twee andere rechthoekige gebieden om de hoofdkap aan het hoofdimplantaat te verankeren.
- Haal één draad door de bovenste uitgeholde staaf van het hoofdimplantaat voor bevestiging van het hoofdkapje op de rattenkop zoals weergegeven in figuur 1E-G. Passeer de tweede draad op dezelfde manier.
OPMERKING: Deze draden kunnen eenvoudig worden verwijderd met een tang of tang. De 3D-afdrukbestanden worden geleverd (bestandsindeling: STL) als aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2.
- Ontwerp van het hoofdframe:
- Ontwerp het hoofdframe zo dat een gesneden deel door de bovenste balk van het hoofdimplantaat kan bewegen en met een klem wordt bevestigd.
- Hoek het andere gesneden deel om extra sterkte te bieden om de rattenkop vast te houden om de contralaterale kant volledig toegankelijk te maken voor beeldvorming. Snijd voor dit onderzoek de stalen plaat met tinsnippers om het kopframe te produceren (figuur 1H, I).
OPMERKING: Dit onderdeel kan ook 3D-geprint worden.
2. Initiële rattenopleiding
- Laat ratten 2-3 dagen wennen aan de vivariumomgeving in hun kooien.
- Begin met het hanteren van de rat in een rustige kamer. Open de kooi en laat de experimentator zijn hand gedurende 15-20 minuten in de kooi bij de rat leggen om de rat te laten wennen.
- Zodra de rat kalmte vertoont door niet te schrikken of weg te rennen van de handen van de experimentator, pak je de rat voorzichtig op voor hantering. Behandel de rat elke dag 30-45 minuten voordat je gaat slingeren.
3. Sling training
- Train de ratten gedurende ten minste 2-3 dagen in de draagdoeken vóór de chirurgische implantatie van het hoofdimplantaat en het hoofdkapje.
- Rangschik de slingopstelling zoals weergegeven in figuur 2A. Reinig de sling setup met behulp van ethanoldoekjes.
OPMERKING: Alle stroppen zijn met de hand genaaid en gemaakt van een netmateriaal aan de onderkant of aan beide zijden, zoals weergegeven in figuur 2A, B. - Voor slingtraining, verdoven de ratten met behulp van 4% isofluraan voor inductie en 1% voor onderhoud totdat er geen achterpoot knijpreflex is.
- Plaats de ratten onder isofluraananesthesie op een flexibele plastic plaat van 20 cm x 8 cm (lengte x breedte), waarbij 10 cm x 8 cm van de plastic plaat volledig is bedekt met het zachtere deel van het klittenband.
OPMERKING: Het verdoven van de ratten voor draagdoektraining is een optionele stap, voornamelijk gebruikt om stress en angst te verminderen. - Leg de rat de eerste 2 dagen van de training knus in een babysok (maat 0-3 maanden) met het hoofd naar buiten door een klein gaatje dat aan het einde van de sok is ingesneden.
- Wikkel een klein stukje absorberend kussen rond het onderlichaam om de rat droog te houden en uitwerpselen te verzamelen.
- Wikkel de rat in een ademende katoenen doek (afmeting: 25 cm x 25 cm). Plaats de rat op een plastic vel waar klittenbandstrips op zijn gelijmd.
- Bevestig de rat verder aan de plastic plaat met behulp van 0,5 cm brede klittenbandstrips op een afstand van 3-6 mm van elkaar.
- Zet de rat vast in de draagdoek. Verwijder de gasanesthesie. Laat de rat herstellen van gasanesthesie in de draagdoek.
- Wanneer de rat begint te kloppen, bied dan elke 10-15 minuten een paar druppels 10% sucrose-oplossing aan als beloning.
- Presenteer de rat willekeurig met de sensorische stimuli die tijdens de beeldvorming zullen worden gebruikt (hier snorharenstimulatie, elke 15-25 minuten) om hem te laten wennen aan sensorische stimuli. Stimuleer de snorharen handmatig met willekeurige tussenpozen.
- Train de rat in de draagdoek gedurende 1 uur op dag 1, 2 uur op dag 2 en 3 uur op dag 3 zoals weergegeven in figuur 2C.
4. Prechirurgische voorbereiding
- Print het hoofdimplantaat en de hoofdkap met de 3D-printer (figuur 1).
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten en hoofddeksels (implantaten en doppen) door de apparatuur gedurende 10 uur onder te dompelen in het Metricide28 kiemdodend middel. Spoel gereedschappen grondig af met steriel water vlak voor de operatie.
- Stel de rat bloot aan 4% isofluraan en houd vervolgens op 1% -2% isofluraan totdat er geen achterpootknijpreflex is. Deze operatie kan worden uitgevoerd onder vele soorten anesthesie, zoals isofluraan, natriumpentobarbital en ketamine-xylazine.
- Injecteer atropine (0,05 mg/kg) intramusculair om slijmafscheidingen te verminderen om te helpen bij de ademhaling.
- Scheer de kop van de rat 5 mm gecentreerd rond de middellijn met behulp van een haartrimmer die begint tussen de ogen tot de achterkant van de oren.
- Controleer de gedeeltelijke zuurstofverzadiging en hartslag via een pulsoximeter en hartslagmetersonde die aan de achterpoot van de rat zijn bevestigd.
- Veeg de kop van de rat en de omgeving drie keer af met afwisselende rondes betadine en 70% alcoholdoekjes.
- Bevestig de rat in een stereotaxisch systeem.
- Plaats een met vaseline gesmeerde rectale sonde om de lichaamstemperatuur van de rat te meten en deze door het feedbacksysteem van de verwarmingsdeken te houden om onderkoeling na toediening van verdoving te voorkomen.
- Dien lokaal verdovingsmiddel lidocaïnehydrochloride toe in een concentratie van 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 lichaamsgewicht subcutaan op de operatieplaats.
- Breng oogheelkundige zalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Dien 2% lokaal verdovingsmiddel subcutaan toe over de operatieplaats.
- Injecteer 3 ml ringeroplossing met lactatie bij kamertemperatuur subcutaan om uitdroging te voorkomen en voeding te geven tijdens de operatie.
5. Operatie
- Verwijder het deel van de huid over de operatieplaats (4 mm diameter gecentreerd rond de middellijn en het midden van het hoofd) met een scherpe chirurgische schaar. Ontleed en verwijder een deel van de huid (~ 2 mm diameter, over de linker somatosensorische cortex) tussen het oor en het oog op het tijdelijke deel van het hoofd.
- Verwijder met behulp van een scalpel het onderliggende huidweefsel (pericranium) om de schedel bloot te leggen. Reinig de schedel met gesteriliseerd katoenen gaas.
- Retract/reseceer temporale spier om de gewenste grootte voor het beeldvormingsgebied bloot te leggen [7,5 mm bij 7,5 mm voor dit onderzoek].
- Leg de schedel bloot op de contralaterale hemisfeer voor het hoofdimplantaat. Plaats het hoofdimplantaat op de schedel om de locatie van de verankeringsschroeven voor het implantaat te bepalen, zoals weergegeven in figuur 2D-F.
- Markeer de schedel voor het boren van de schroeven met India Ink met boor 1. Boor de braamgaten voor de schroeven met behulp van tandboor 3. Schroef het hoofdimplantaat op zijn plaats.
- Droog de schedel met steriel gaas. Breng een dunne laag weefsellijm aan rond en onder het hoofdimplantaat om het op de schedel te lijmen. Breng een laag tandcement aan om het hoofdimplantaat verder op zijn plaats te ondersteunen en laat het cement 2-3 minuten drogen.
OPMERKING: Het gebruik van weefsellijm naast tandcement zorgt voor een sterke hold8. - Met behulp van tandboor 3, dun een gebied van 7,5 mm x 7,5 mm aan de linkerkant van de schedel net achter de bregma en lateraal naar de middellijn. Dun de schedel uit tot ~50 μm zoals weergegeven in figuur 3A.
- Breng actuele antibiotische zalf aan op de operatieplaats en bedek deze vervolgens met een dunne laag siliconenrubber om de verdunde schedel te beschermen, zoals weergegeven in figuur 3B. Bedek de operatieplaats met behulp van de hoofdkap zoals weergegeven in figuur 3C. Bevestig het op zijn plaats met de twee kleine stukjes draden die door zowel het hoofdimplantaat als het hoofdkapje gaan, zoals weergegeven in figuur 3D, E. Breng siliconenrubber aan om de hoofdkap en schedel te bedekken om de hoofdkap verder op het hoofd van de rat te stabiliseren, zoals weergegeven in figuur 3F.
OPMERKING: Siliconenrubber biedt extra bescherming aan verdunde schedels. - Injecteer de rat subcutaan met flunixine meglumine (2,5 mg/kg) voor pijn- en ontstekingsbeheersing. Om infectie te voorkomen, injecteer enrosiet antibioticum enrofloxacine (22,7 mg / ml, 10 mg / kg +/-.01), intraperitoneaal.
- Verplaats de rat naar de herstelkamer om zijn lichaamstemperatuur te handhaven met een verwarmende deken en een warmtelamp. Controleer de rat continu totdat hij weer bij bewustzijn komt en sternale lighouding kan behouden.
- Breng de rat terug naar zijn aparte kooi zodra hij volledig is hersteld.
- Dien de komende 3 dagen flunixine en buprenorfine toe om ontsteking en pijn te verlichten en enrosite om infectie tweemaal daags te voorkomen.
6. Wakkere beeldvorming
- Verdoof de rat met 4% isofluraan voor inductie en 1% voor onderhoud wanneer er geen knijpreflex van de achterpoot is. Injecteer acepromazine (0,3-0,5 mg/kg) subcutaan.
OPMERKING: Deze concentratie van acepromazine ligt onder milde sedatieniveaus en helpt alleen de ratten kalm te houden tijdens het beeldvormingsproces. - Bevestig de rat met behulp van aangepaste stroken klittenband op de plastic plaat die tijdens de trainingsprocedures wordt gebruikt. Wikkel het onderste lichaamsdeel met een absorptiekussen en plaats de rat goed in de draagdoek.
- Verwijder het siliconenrubber. Verwijder de dop door de bevestigingsdraden te verwijderen. Bevestig het hoofdframe in het hoofdimplantaat zoals weergegeven in figuur 2G.
- Vergrendel het hoofdframe in klemmen zoals weergegeven in figuur 2H, I.
- Verwijder gasanesthesie. Spoel het beeldgebied 3x met zoutoplossing en reinig met nat gaas. Droog het beeldvormingsgebied en maak een put, met behulp van vaseline, rond het beeldvormingsgebied. Vul de put met gesteriliseerde zoutoplossing en dek af met een glasplaat (figuur 2E).
- Raadpleeg de acquisitieprocedures voor optische beeldvorming van intrinsieke signalen, het whisker-stimulatieprotocol en gegevensanalyse en -presentatie, die eerder in detail zijn besproken 6,7.
- Controleer tijdens het experiment de ratten op tekenen van agitatie en rusteloosheid, die verder kunnen worden verminderd door de ogen van de ratten te bedekken met een zachte doek of gaas (optioneel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve optische beeldvormingssignalen van een enkele proef met een verdoofde rat en de opgetelde respons (van 40 verzamelde onderzoeken) van een wakkere rat worden getoond (figuur 4). De signaalintensiteit voor single-whisker stimulatie van een wakkere rat kan worden gevisualiseerd op een hogere drempel dan voor de verdoofde rat, met een sterker signaal van het wakkere dier. De C2-snorharen van ratten worden gestimuleerd bij 5 Hz gedurende 1 s en de functionele respons wordt weergegeven als een fractionele verandering ten opzichte van de basislijn. De donkere gebieden (onder de negatieve drempel) zijn de belangrijkste gebieden van neuronale activiteit en de helderwitte gebieden (boven de positieve drempel) tonen de zuurstofrijke bloedrespons op stimulatie9. De afbeeldingen zijn zo uitgelijnd dat van links naar rechts van rostrale naar caudale (C) en van boven naar beneden de mediale naar laterale (L) richting is, zoals aangegeven door de pijlen.
Figuur 1: Hoofdkap, hoofdimplantaat en hoofdframe. (A) De hoofdkap (bovenaanzicht): de zijkant van het bovenaanzicht toont de kromming die langs de kromming van het hoofd moet worden uitgelijnd om het hoofd te beschermen; De twee uitgeholde rechthoekige delen zijn voor de metalen draden om door de hoofdkap te gaan. (B) Hoofdkap (onderaanzicht) toont de bredere rechthoekige snede die in de bovenste balk van het hoofdimplantaat past en de twee loodrechte sneden voor de draden om door het implantaat te bewegen en de hoofdkap om ze op hun plaats te houden. (C) Hoofdimplantaat met de drie gesneden gaten voor de verankeringsschroeven. De posities van de verankeringsschroeven op het hoofdimplantaat kunnen worden aangepast aan de kop van de rat. D) hoofdkap en hoofdimplantaat (zijaanzicht); Het zijaanzicht van het hoofdimplantaat toont de rechthoekige staaf die van binnenuit is uitgehold om de draad door te laten om de hoofdkap aan het hoofdimplantaat te verankeren. (E-G) Zicht op het hoofdimplantaat verankerd in de hoofdkap door één draadstuk; Onderaanzicht, zijaanzicht en bovenaanzicht om te laten zien hoe het hoofdimplantaat in de hoofdkap is aangebracht. (H) Hoofdframe, (I) hoofdimplantaat verankerd in het hoofdframe. De afstand tussen twee lijnen op de schaal (zoals aangegeven door de blauwe rechthoek) is 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hijsbanden, hoofdimplantaat en fixatie van het hoofdframe voor wakkere, hoofdvaste beeldvorming. (A,B) Aangepaste sling met gaasmateriaal voor alleen de bodem of beide zijden; C) rat die tijdens de training van de strop op de met klittenband bevestigde kunststofplaat wordt geplaatst; (D-F) boven- en zijaanzichten van het hoofdimplantaat op een rattenschedel boven de contralaterale hemisfeer. Stippellijnen geven het beeldgebied aan. De boven- en zijaanzichten tonen duidelijk de drie gaten om het hoofdimplantaat met de verankeringsschroef aan de schedel te bevestigen. (E) Het zijaanzicht toont de holle staaf waar de draad doorheen gaat om de hoofdkap aan het hoofdimplantaat te verankeren wanneer de ratten niet zijn afgebeeld. Eén poot van het hoofdframe ging door het holle deel van het hoofdimplantaat voor het in beeld brengen van de cortex van de rat. (G) Hoofdframe door het hoofdimplantaat voor wakkere, op het hoofd gefixeerde ratten. (H) Het hoofdframe door het hoofdimplantaat met zijn twee poten geklemd voor wakkere, hoofdvaste beeldvorming (I) van wakkere, hoofdvaste ratten tijdens de beeldvormingssessies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Plaatsing van het hoofdimplantaat. (A) Het dunne schedelpreparaat voor wakkere, hoofdvaste beeldvorming. (B) Hoofdimplantaat bevestigd op de schedel van de rat en het gebied van de beeldvorming van de dunne schedel bedekt met de rubberen siliconen. (C) Hoofdkap geplaatst op het hoofdimplantaat. (D,E) Hoofdkap verankerd aan het hoofdimplantaat met behulp van gecoate metalen draden. (F) De hoofdkap en het omliggende gebied bedekt met rubber-siliconen voor verdere ondersteuning bij de fixatie en bescherming van de schedel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Functionele reacties van C2 whisker stimulaties. (A) Een representatieve functionele respons van een 5 Hz C2 whisker stimulatie voor 1 s wakkere, head-fixed rat imaging, waarbij elke proef 7 s duurde met een interval tussen de studies van 3 s ± 2 s. De drempel van grijswaardenweergave van fractionele verandering ten opzichte van baseline (−3,5 × 10−3 tot 3,5 × 10−3). (B) Een representatieve functionele respons van één enkel onderzoek van een 5 Hz C2 snorharenstimulatie gedurende 1 s van een verdoofde (natriumpentobarbitale) rat. De drempel van grijswaardenweergave van fractionele verandering ten opzichte van baseline (−2,5 × 10−4 tot 2,5 × 10−4). De functionele respons van de wakkere, met het hoofd gefixeerde rat is 140 keer sterker dan die van de verdoofde rat. Elk frame is een 0,5 s frame. De beelden zijn zo uitgelijnd dat van links naar rechts van rostral naar caudaal is en van boven naar beneden van de mediale naar laterale richting zoals aangegeven door de pijlen. De donkere gebieden (onder de negatieve drempel) zijn de belangrijkste gebieden van neuronale activiteit, en de helderwitte gebieden (boven de positieve drempel) tonen de zuurstofrijke bloedrespons op stimulatie. Schaalbalk = 1 mm. Afkortingen: C = caudaal; L = lateraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: 3D-printbestand voor het hoofdimplantaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: 3D-printbestand voor de hoofdkap. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van wakkere, hoofdvaste rattenbeeldvorming biedt veel voordelen op het gebied van gemak en maatwerk. Met de speciaal ontworpen stroppen kunnen de ratten door ademend netmateriaal worden gewikkeld, waardoor het niet nodig is om dieren gedurende langere tijd in gesloten, plastic fixatiekamers te sluiten10,11. Ratten worden kalm en stressvrij gehouden gedurende de lange duur van opeenvolgende beeldvormingssessies met behulp van een zeer lage dosis acepromazine onder de niveaus van milde sedatie bij ratten (1,0-2,5 mg / kg)12. Om de rat stabiel te houden en bewegingsartefacten verder te elimineren tijdens de beeldvormingssessies, worden klittenbandstrips gebruikt. De klittenbandstrips worden op 3-6 mm van elkaar geplaatst om onnodige lichaamsvernauwing gedurende lange uren te voorkomen. De ratten worden op jonge leeftijd getraind en gewend aan stroppen om ervoor te zorgen dat ze kalm en comfortabel blijven rusten in hun draagdoeken tijdens de voorbereiding en gegevensverzameling. Op basis van de voorlopige resultaten zijn jonge ratten met een gewicht van ongeveer 150-175 g gemakkelijker en sneller te trainen dan oudere ratten.
Het hoofdimplantaat op de rattenkop weegt slechts 0,174 g en de afneembare kopkap weegt 1,483 g. Het hoofdimplantaat beslaat een gebied van 0,5 cm tot 1,5 cm op één hemisfeer, waardoor volledige toegankelijkheid van de andere hemisfeer mogelijk is voor neuroimaging. De grootte van de hoofdkap zorgt voor een volledige dekking van de operatieplaats. De gewichten van het hoofdimplantaat en de hoofdkap lijken de mobiliteit en dagelijkse activiteiten niet te belemmeren en de ratten kunnen samen in standaardkooien worden gehuisvest. Met behulp van deze hoofd- en lichaamsfixatiemethode kunnen de ratten gedurende 2-3 uur telkens op verschillende dagen in beeld worden gebracht voor longitudinaal onderzoek. Meerdere beeldvormingssessies kunnen worden uitgevoerd op een enkele rat gedurende ten minste 3 maanden met behulp van deze opstelling. Het duurt in totaal 25 minuten om het hoofdimplantaat en de hoofdkap te 3D-printen. De onderdelen zijn eenvoudig aan te passen, afhankelijk van de grootte van het knaagdier en kunnen ook worden aangepast om te worden gebruikt in muizen. Voor studies die differentiatie van de ratten vereisen, kunnen verschillende kleuren en materialen een eenvoudige identificatie bieden. Bovendien kan het bovenste deel van de dop worden aangepast om symbolen, cijfers of letters toe te voegen voor eenvoudige identificatie.
Er zijn verschillende belangrijke stappen voor succesvolle implantatie en beeldvorming, waarvan de belangrijkste de training en gewenning van de ratten is. De ratten krijgen willekeurig sensorische stimuli om het potentieel voor associatief leren te minimaliseren, wat de beeldvormingsresultaten kan beïnvloeden. De operatie en alle chirurgische instrumenten moeten steriel zijn om infectie te voorkomen en het gebruik van lokale antibiotica is noodzakelijk. Het gebruik van acepromazine aan het begin van de beeldvorming is belangrijk om de dieren kalm en stil te houden om onnodige bewegingen tijdens de beeldvormingssessies te voorkomen. De schedel van de rat moet droog zijn voor een goede fixatie en de laag afgezette tandcement moet dun genoeg zijn om de hoofdkap in het hoofdimplantaat te laten passen.
Voor de huidige studie was het beeldvormingsgebied gecentreerd op de somatosensorische cortex. Het verdunde gebied meet ongeveer 7,5 mm x 7,5 mm, wat de omvang is van het gebied dat in het huidige onderzoek kan worden afgebeeld. Het afgebeelde gebied kan echter indien nodig worden vergroot tot 11 mm x 11 mm. Een ander voordeel van dit ontwerp is dat het beeldvorming van het hele verdunde gebied mogelijk maakt, ondanks de kromming van de cortex.
Eerder gemelde hoofdimplantaten vereisen bijna 7-12 verankeringsschroeven om het hoofdimplantaat op het hoofd van de rat te bevestigen13,14. Dit sluit de beeldvorming van een groter gebied door middel van verdund schedelpreparaat uit. Een andere fixatiemethode vereist de fixatie van een harsmateriaal over een groot gebied met behulp van kopschroeven, waardoor de schedel ontoegankelijk wordt voor beeldvorming14. De wakkere beeldvorming van ratten met behulp van MRI vereist immobilisatie van dieren in cilindrische buizen, waardoor de beeldvormingservaringen stressvol zijn voor de dieren11,15. In sommige andere opstellingen steekt het hoofdimplantaat uit het hoofd en kan het verstrikt raken in standaardkooien16,17. Het hoofdimplantaat en de hoofdkap elimineren het gebruik van fixatie van glasglaasjes en afplatting van de dunne schedel voor chronische beeldvorming18,19. De grootte van het hoofdimplantaat en het gebruik van kromming op de hoofdkap elimineren de noodzaak om wijzigingen aan te brengen in de standaardkooien zoals bij andere chronische procedures18,19. De hoofdimplantaten bij muizen zijn gemakkelijker omdat slechts een enkele moer- en schroefconfiguratie wordt gebruikt, wat niet mogelijk is bij ratten, omdat ratten veel sterker zijn en moeilijker stabiel te houdenzijn 20.
De beperking van het hoofdimplantaat is dat het, ondanks zijn kleine formaat, verankering van het implantaat aan de schedel vereist met behulp van schroeven. Het hoofdimplantaat is nodig om het hoofd van het dier stabiel te houden, maar beperkt de beeldvorming van het hele rattenbrein. Een voordeel van het gebruik van dit hoofdimplantaat is echter dat het kan worden gebruikt om een groter gebied in beeld te brengen voor opgeroepen sensorische stimulatie met behulp van verschillende neuroimaging-modaliteiten zoals intrinsieke signaal optische beeldvorming, doppler optische coherentietomografie en laser speckle imaging.
De corticale functionele representaties op basis van intrinsieke signalen van wakkere, hoofdvaste ratten hebben de neiging om sterker in intensiteit te zijn dan bij verdoofde ratten die hetzelfde snorharenstimulatieprotocol gebruiken. Een vergelijkbare toename van de sterkte van de opgewekte intrinsieke signaalrespons is gemeld bij wakkere apen21,22. Momenteel wordt gewerkt aan het verbeteren van het hoofdimplantaat en het ontwerp van de hoofdkap voor meer uitdagende omgevingen zoals de naturalistische habitat23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We erkennen Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha en Amirsoheil Zareh voor hun hulp tijdens het trainen van de ratten en de voorbereiding van de slings. Financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH, Grant Number: NS119852) en Leducq Foundation (Grant Number: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
