Summary
En detaljeret ny procedure for funktionel billeddannelse af vågne, hovedfikserede rotter er beskrevet.
Abstract
Anæstetika, der almindeligvis anvendes i præklinisk og grundlæggende videnskabelig forskning, har en depressiv indflydelse på hjernens metaboliske, neuronale og vaskulære funktioner og kan påvirke neurofysiologiske resultater negativt. Brugen af vågne dyr til forskningsundersøgelser er fordelagtig, men udgør den store udfordring at holde dyrene rolige og stationære for at minimere bevægelsesartefakter gennem dataindsamling. Vågen billeddannelse hos gnavere af mindre størrelse (f.eks. Mus) er meget almindelig, men forbliver ringe hos rotter, da rotter er større, stærkere og har en større tendens til at modsætte sig bevægelsesbegrænsninger og hovedfiksering over de lange varigheder, der kræves til billeddannelse. En ny model for neuroimaging af vågne, hovedfikserede rotter ved hjælp af tilpassede håndsyede slynger, 3D-printede hovedimplantater, hovedhætter og en hovedramme er beskrevet. Resultaterne opnået efter et enkelt forsøg med enkelt-whisker stimulering tyder på en stigning i intensiteten af det fremkaldte funktionelle respons. Erhvervelsen af den fremkaldte funktionelle respons fra vågne, hovedfikserede rotter er hurtigere end fra bedøvede rotter, pålidelig, reproducerbar og kan bruges til gentagne langsgående undersøgelser.
Introduction
De fleste af de grundlæggende, prækliniske og translationelle videnskabelige neuroimaging undersøgelser er erhvervet fra bedøvede dyr 1,2. Anæstetika letter eksperimentering, men påvirker kontinuerligt hjernens og kroppens stofskifte, blodtryk og puls3. Typen af bedøvelsesmiddel og varigheden og administrationsvejen tilføjer forvirrende variabler til datafortolkning, der kan bidrage til reproducerbarhed og translationelle fejl4. En stor flaskehals i vågne, hovedfikserede rotteneuroimaging undersøgelser er kravet om at holde rotten stille og rolig under hele forberedelses- og dataindsamlingsprocesserne. Små bevægelser producerer uberettigede bevægelsesartefakter, som kan påvirke dataanalyse og fortolkninger negativt.
En ny model af neuroimaging fra vågne, hovedfikserede rotter ved hjælp af tilpassede slynger, tredimensionelle (3D) printede hovedimplantater, hovedhætter og en hovedramme er blevet udtænkt, der giver flere fordele for nem eksperimentering. 3D-hovedimplantatet er let og dækker en lille del af kraniet, der er nødvendigt for transfiksering. De 3D-printede hovedimplantater og hætter er designet ved hjælp af CAD-software (Computer Aided Design). Protokollerne for whisker stimulation, dataindsamling, dataanalyse og resultater fra bedøvede rotter er blevet beskrevet detaljeret i tidligere arbejde 5,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer var i overensstemmelse med National Institute of Health retningslinjer og godkendt af University of California, Irvine Animal Care and Use Committee. Syv hanner og en hunrotte (Sprague-Dawley, vægt: 185-350 g) blev anvendt i denne undersøgelse. Efter undersøgelsens afslutning blev rotterne ofret ved hjælp af kuldioxid overdosis.
1. Design af forskellige komponenter
- Design af hovedimplantatet:
- Lav hovedimplantatet ved hjælp af CAD-software (figur 1C) og design det til at afbilde området bagved bregma og støder op til midterlinjen centreret på den somatosensoriske cortex. Sørg for, at hovedimplantatet dækker et område på 0,9 mm til 1,9 mm på kraniet væk fra billeddannelsesområdet.
- Brug kun tre skruer til at forankre hovedimplantatet på rottens kranium. Design alle skruehullerne, så de forbliver på den modsatte side af midterlinjen i den kontralaterale halvkugle af den afbildede halvkugle.
- Anbring en stang, udhulet indefra, i den øverste del af hovedimplantatet, så ledningerne kan fastgøre hovedhætten til hovedimplantatet som vist i figur 1D.
- Design af hovedhætten:
- Sørg for, at hovedhætten dækker billedområdet fuldstændigt og beskytter det mod enhver form for traume som vist i figur 1A, B. Tilføj en krumning til hovedhætten, så den flugter med hovedets form uden at forårsage vanskeligheder for dyrets daglige aktiviteter i de standard berigede bure.
- Hovedhættens inderside skæres i en bredere rektangulær form, så den øverste del af hovedimplantatet kan passe ind i den som vist i figur 1E. Vinkelret på dette rektangel skæres to andre rektangulære områder for at forankre hovedhætten til hovedimplantatet.
- Før en ledning gennem den øverste udhulede stang på hovedimplantatet til fastgørelse af hovedhætten på rottehovedet som vist i figur 1E-G. Før den anden ledning på samme måde.
BEMÆRK: Disse ledninger kan let fjernes ved hjælp af en tang eller tang. 3D-udskrivningsfilerne leveres (filformat: STL) som supplerende fil 1 og supplerende fil 2.
- Design af hovedrammen:
- Design hovedrammen på en sådan måde, at en skåret del kan bevæge sig gennem hovedimplantatets øverste stang og fastgøres ved hjælp af en klemme.
- Vinkl den anden afskårne del for at give ekstra styrke til at holde rottehovedet fast for at gøre den kontralaterale side fuldstændig tilgængelig til billeddannelse. Med henblik på denne undersøgelse skæres stålpladen med tinsnips for at fremstille hovedrammen (figur 1H, I).
BEMÆRK: Denne del kan også 3D-printes.
2. Grundlæggende rottetræning
- Lad rotter akklimatisere sig til vivariummiljøet i deres bure i 2-3 dage.
- Begynd at håndtere rotten i et stille rum. Åbn buret og få eksperimentatoren til at stikke hånden ind i buret nær rotten i 15-20 minutter for at lade rotten vænne sig.
- Når rotten viser ro ved ikke at blive forskrækket eller løbe væk fra eksperimentatorens hænder, skal du forsigtigt tage rotten op til håndtering. Håndter rotten i 30-45 min hver dag før slyngetræning.
3. Slynge træning
- Træn rotterne i mindst 2-3 dage i slyngerne før den kirurgiske implantation af hovedimplantatet og hovedhætten.
- Arranger sejlopsætningen som vist i figur 2A. Rengør sejlopsætningen med ethanolservietter.
BEMÆRK: Alle slynger er håndsyede og lavet af et netmateriale enten i bunden eller på begge sider som vist i figur 2A, B. - Til slyngetræning bedøves rotterne med 4% isofluran til induktion og 1% til vedligeholdelse, indtil der ikke er nogen bagpoteklemmerefleks.
- Under isofluranbedøvelse placeres rotterne på en fleksibel plastplade, der måler 20 cm x 8 cm (længde x bredde), hvor 10 cm x 8 cm af plastpladen er helt dækket med den blødere del af velcroen.
BEMÆRK: Bedøvelse af rotterne til slyngetræning er et valgfrit trin, der primært bruges til at reducere stress og angst. - I de første 2 dage af træningen puttes rotten tæt ind i en babysok (str. 0-3 måneder) med hovedet ud gennem et lille hul skåret i enden af sokken.
- Sæt et lille stykke absorberende pude rundt om underkropsdelen for at holde rotten tør og samle ekskrementer.
- Pak rotten ind i en åndbar bomuldsklud (størrelse: 25 cm x 25 cm). Placer rotten på et plastark, der har velcrostrimler limet på det.
- Fastgør rotten yderligere til plastpladen ved hjælp af 0,5 cm brede velcrostrimler i en afstand på 3-6 mm fra hinanden.
- Fastgør rotten i slyngen. Fjern gasbedøvelsen. Lad rotten komme sig efter gasbedøvelse i slyngen.
- Når rotten begynder at piske, skal du tilbyde et par dråber 10% saccharoseopløsning som belønning hvert 10.-15. minut.
- Tilfældigt præsentere rotten med de sensoriske stimuli, der vil blive brugt under billeddannelse (her whisker stimulering, hvert 15-25 minut) for at gøre det vant til sensoriske stimuli. Stimuler knurhårene manuelt med tilfældige intervaller.
- Træn rotten i sejlet i 1 time på dag 1, 2 timer på dag 2 og 3 timer på dag 3 som vist i figur 2C.
4. Prækirurgisk forberedelse
- Udskriv hovedimplantatet og hovedhætten ved hjælp af 3D-printeren (figur 1).
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter og hovedstykker (implantater og hætter) ved at nedsænke udstyret i Metricide28-bakteriedræbende middel i 10 timer. Skyl værktøjet grundigt med sterilt vand lige før operationen.
- Udsæt rotten for 4% isofluran og hold derefter ved 1% -2% isofluran, indtil der ikke er nogen bagpote klemmerefleks. Denne operation kan udføres under mange typer anæstesi, såsom isofluran, natriumpentobarbital og ketamin-xylazin.
- Injicer atropin (0,05 mg/kg) intramuskulært for at reducere slimhindesekretioner for at hjælpe med vejrtrækning.
- Barber rottens hoved 5 mm centreret omkring midterlinjen ved hjælp af en hårtrimmer, der starter fra mellem øjnene til bagsiden af ørerne.
- Overvåg den delvise iltmætning og puls gennem et pulsoximeter og pulsmålersonde, der er fastgjort til rottens bagben.
- Tør rottens hoved og det omkringliggende område tre gange med skiftevis runder betadin og 70% alkoholservietter.
- Fastgør rotten i et stereotaksisk system.
- Indsæt en vaselin-smurt rektal sonde for at måle rottens kropstemperatur og opretholde den gennem varmetæppets feedbacksystem for at undgå hypotermi efter bedøvelsesadministration.
- Administrer lokalbedøvelsesmidlet lidokainhydrochlorid i en koncentration på 20 mg / ml, 0,07 mg / kg +/- 0,2 legemsvægt subkutant på det kirurgiske sted.
- Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre tørring.
- Administrer 2% lokalbedøvelse subkutant over det kirurgiske sted.
- Injicer 3 ml lakteret ringereopløsning ved stuetemperatur subkutant for at forhindre dehydrering og give næring under operationen.
5. Kirurgi
- Fjern den del af huden over det kirurgiske sted (4 mm diameter centreret omkring midterlinjen og midten af hovedet) ved hjælp af en skarp kirurgisk saks. Disseker og fjern en del af huden (~ 2 mm diameter, over venstre somatosensoriske cortex) mellem øret og øjet på den temporale del af hovedet.
- Fjern ved hjælp af en skalpel det underliggende hudvæv (pericranium) for at udsætte kraniet. Rengør kraniet ved hjælp af steriliseret bomuldsgasbind.
- Træk / resekter temporale muskler for at eksponere den ønskede størrelse for billeddannelsesområde [7,5 mm ved 7,5 mm for denne undersøgelse].
- Udsæt kraniet på den kontralaterale halvkugle for hovedimplantatet. Placer hovedimplantatet på kraniet for at fastslå placeringen af forankringsskruer til implantatet som vist i figur 2D-F.
- Marker kraniet til boring af skruerne ved hjælp af India Ink med bor 1. Bor grathullerne til skruerne ved hjælp af tandbor 3. Skru hovedimplantatet på plads.
- Tør kraniet ved hjælp af sterilt gasbind. Påfør et tyndt lag vævslim omkring og under hovedimplantatet for at lime det på kraniet. Påfør et lag tandcement for yderligere at støtte hovedimplantatet på plads, og lad cementen tørre i 2-3 min.
BEMÆRK: Brug af vævslim ud over tandcement sikrer et stærkt hold8. - Brug tandbor 3 til at tynde et område på 7,5 mm x 7,5 mm på venstre side af kraniet lige bagved bregma og lateralt til midterlinjen. Tynd kraniet til ~50 μm som vist i figur 3A.
- Påfør topisk antibiotisk salve over det kirurgiske sted og dæk det derefter med et tyndt lag silikonegummi for at beskytte det fortyndede kranium som vist i figur 3B. Dæk det kirurgiske sted ved hjælp af hovedhætten som vist i figur 3C. Fastgør det på plads med de to små stykker ledninger, der går gennem både hovedimplantatet og hovedhætten som vist i figur 3D, E. Påfør silikonegummi til at dække hovedhætten og kraniet for at stabilisere hovedhætten yderligere på rottens hoved som vist i figur 3F.
BEMÆRK: Siliciumgummi giver ekstra beskyttelse til fortyndet kranium. - Injicer rotten med flunixinmeglumin (2,5 mg/kg) subkutant for smerte- og inflammationsbehandling. For at forhindre infektion, injicere Enrosite antibiotikum enrofloxacin (22,7mg/ml, 10mg/kg +/-.01), intraperitonealt.
- Flyt rotten til genopretningskammeret for at hjælpe med at opretholde sin kropstemperatur med et varmetæppe og en varmelampe. Overvåg rotten kontinuerligt, indtil den genvinder bevidstheden og kan opretholde brystliggende.
- Sæt rotten tilbage i sit separate bur, når den er kommet sig helt.
- I de næste 3 dage administreres flunixin og buprenorphin for at lindre betændelse og smerte og enrosit for at forhindre infektion to gange dagligt.
6. Vågn op billeddannelse
- Bedøv rotten med 4% isofluran til induktion og 1% til vedligeholdelse, når der ikke er nogen bagpoteklemmerefleks. Injicer acepromazin (0,3-0,5 mg/kg) subkutant.
BEMÆRK: Denne koncentration af acepromazin er under milde sedationsniveauer og hjælper kun med at holde rotterne rolige under hele billeddannelsesprocessen. - Brug tilpassede strimler af velcro til at fastgøre rotten på plastarket, der bruges under træningsprocedurerne. Pak den nederste kropsdel ind med en absorptionspude og læg rotten tæt i slyngen.
- Fjern siliciumgummiet. Fjern hovedhætten ved at fjerne fikseringsledningerne. Fastgør hovedrammen i hovedimplantatet som vist i figur 2G.
- Hovedrammen låses i klemmer som vist i figur 2H, I.
- Fjern gasbedøvelse. Skyl billedområdet med saltvand 3x og rengør med vådt gaze. Tør billeddannelsesområdet og lav en brønd ved hjælp af vaselin omkring billeddannelsesområdet. Fyld brønden med steriliseret saltvand og dæk med et glasglas (figur 2E).
- Se erhvervelsesprocedurerne for optisk billeddannelse af iboende signal, whiskerstimuleringsprotokollen og dataanalyse og præsentation, som tidligere er blevet diskuteret detaljeret 6,7.
- Under hele eksperimentet skal du overvåge rotterne for tegn på agitation og rastløshed, hvilket kan reduceres yderligere ved at dække rotternes øjne med en blød klud eller gasbind (valgfrit).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De repræsentative optiske billeddannelsessignaler fra et enkelt forsøg med en bedøvet rotte og den opsummerede respons (af 40 indsamlede forsøg) fra en vågen rotte er vist (figur 4). Signalintensiteten for enkeltknurhårstimulering af en vågen rotte kan visualiseres ved en højere tærskel end for den bedøvede rotte, hvilket viser et stærkere signal fra det vågne dyr. C2-knurhårene fra rotter stimuleres ved 5 Hz i 1 s, og den funktionelle respons vises som en brøkdel i forhold til basislinjen. De mørkere områder (under den negative tærskel) er de vigtigste områder af neuronal aktivitet, og de lyse hvide områder (over den positive tærskel) viser det iltede blodrespons på stimulering9. Billederne er justeret, så fra venstre mod højre er fra rostral til kaudal (C) og fra top til bund er den mediale til laterale (L) retning, som vist med pilene.
Figur 1: Hovedhætte, hovedimplantat og hovedramme. (A) Hovedhætten (set ovenfra): Siden af det øverste billede viser krumningen for at justere langs hovedets krumning for at beskytte hovedet; De to udhulede rektangulære dele er til metaltrådene til at passere gennem hovedhætten. (B) Hovedhætten (set nederst) viser det bredere rektangulære snit, så det passer ind i hovedimplantatets øverste bjælke, og de to vinkelrette snit, så ledningerne kan bevæge sig gennem implantatet, og hovedhætten skal holdes på plads. (C) Hovedimplantat med de tre afskårne huller til forankringsskruerne. Forankringsskruernes positioner på hovedimplantatet kan justeres i henhold til rottens hoved. D) Hovedhætte og hovedimplantat (set fra siden) Set fra siden af hovedimplantatet ses den rektangulære stang udhulet indefra for at lade ledningen passere igennem for at forankre hovedhætten til hovedimplantatet. (E-G) Udsigt over hovedimplantatet forankret i hovedhætten gennem et trådstykke; set nedefra, set fra siden og set ovenfra for at vise, hvordan hovedimplantatet er monteret inde i hovedhætten. (H) Hovedramme, (I) hovedimplantat forankret i hovedrammen. Afstanden mellem to linjer på skalaen (som vist med det blå rektangel) er 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Slynger, hovedimplantat og fiksering af hovedrammen til vågen, hovedfast billeddannelse. (A,B) Tilpasset sejl med netmateriale kun til enten bunden eller begge sider; C) rotte anbragt på plastpladen, fastgjort med velcrostrimler, under slyngetræning (D-F) set fra toppen og siden af hovedimplantatet på et rottekranium over den kontralaterale halvkugle. Stiplede linjer viser billedområdet. Top- og sidevisningerne viser tydeligt de tre huller til fastgørelse af hovedimplantatet til kraniet med forankringsskruen. (E) Set fra siden ses den hule bjælke, gennem hvilken ledningen passerer for at forankre hovedhætten til hovedimplantatet, når rotterne ikke er afbildet. Det ene ben af hovedrammen passerede gennem den hule del af hovedimplantatet til billeddannelse af rottebarken. (G) Hovedramme gennem hovedimplantatet til vågne, hovedfikserede rotter. (H) Hovedrammen gennem hovedimplantatet med dets to ben fastspændt til vågen, hovedfikseret billeddannelse (I) af vågne, hovedfikserede rotter under billeddannelsessessionerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Placering af hovedimplantat. (A) Det tynde kraniepræparat til vågen, hovedfikseret billeddannelse. (B) Hovedimplantat fastgjort på rottekraniet og det tynde kraniebilledområde dækket med gummisilikonen. (C) Hovedhætte placeret på hovedimplantatet. (D,E) Hovedhætte forankret til hovedimplantatet ved hjælp af coatede metaltråde. (F) Hovedhætten og det omgivende område dækket med gummisilikone for yderligere støtte til fiksering og beskyttelse af kraniet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Funktionelle reaktioner af C2 whisker stimulationer. (A) En repræsentativ funktionel respons i et enkelt forsøg af en 5 Hz C2 whisker stimulation for 1 s vågen, hovedfikseret rottebilleddannelse, hvor hvert forsøg varede i 7 s med et interval mellem forsøg på 3 s ± 2 s. Tærsklen for gråtonerepræsentation af brøkændring fra baseline (-3,5 × 10-3 til 3,5 × 10-3). (B) En repræsentativ funktionel respons fra et enkelt forsøg af en 5 Hz C2 whisker stimulation i 1 s af en bedøvet (natriumpentobarbital) rotte. Tærsklen for gråtonerepræsentation af fraktioneret ændring fra baseline (-2,5 × 10-4 til 2,5 × 10-4). Den vågne, hovedfikserede rottes funktionelle respons er 140 gange stærkere end den bedøvede rottes. Hver ramme er en 0,5 s ramme. Billederne er justeret, så fra venstre mod højre er fra rostral til kaudal og fra top til bund er fra medial til lateral retning som vist med pilene. De mørkere områder (under den negative tærskel) er de vigtigste områder af neuronal aktivitet, og de lyse hvide områder (over den positive tærskel) viser det iltede blodrespons på stimulering. Skalabjælke = 1 mm. Forkortelser: C = kaudal; L = lateral. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: 3D-udskrivningsfil til hovedimplantatet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: 3D-udskrivningsfil til hovedhætten. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af vågen, hovedfikseret rottebilleddannelse giver mange fordele med hensyn til lethed og tilpasning. De specialdesignede sejl gør det muligt at pakke rotterne ind i åndbart netmateriale, hvilket eliminerer behovet for at indeslutte dyr i lukkede plastfastholdelseskamre i længere tid10,11. Rotter holdes rolige og stressfri under hele den lange varighed af successive billeddannelsessessioner ved hjælp af en meget lav dosis acepromazin under niveauerne for mild sedation hos rotter (1,0-2,5 mg / kg)12. For at holde rotten stabil og yderligere eliminere bevægelsesartefakter under billeddannelsessessionerne anvendes velcrostrimler. Velcrostrimlerne er placeret 3-6 mm fra hinanden for at undgå unødvendig kropsindsnævring i lange timer. Rotterne trænes og vænnes med slynger i en ung alder for at sikre, at de forbliver rolige og komfortable i deres slynger under forberedelse og dataindsamling. Baseret på de foreløbige resultater er unge rotter, der vejer omkring 150-175 g, lettere og hurtigere at træne end ældre rotter.
Hovedimplantatet på rottehovedet vejer kun 0,174 g, og den aftagelige hovedhætte vejer 1,483 g. Hovedimplantatet dækker et område på 0,5 cm til 1,5 cm på den ene halvkugle, hvilket giver fuldstændig adgang til den anden halvkugle til neurobilleddannelse. Hovedhættens størrelse sikrer fuld dækning af det kirurgiske sted. Hovedimplantatets og hovedhættens vægt synes ikke at hindre mobiliteten og de daglige aktiviteter, og rotterne kan anbringes sammen i standardbure. Ved hjælp af denne hoved- og kropsfastholdelsesmetode kan rotterne afbildes i 2-3 timer hver gang på forskellige dage til langsgående undersøgelser. Flere billedbehandlingssessioner kan udføres på en enkelt rotte i mindst op til 3 måneder ved hjælp af denne opsætning. Det tager i alt 25 minutter at 3D-printe hovedimplantatet og hovedhætten. Delene kan let tilpasses afhængigt af gnaverens størrelse og kan også tilpasses til brug i mus. For undersøgelser, der kræver differentiering af rotterne, kan forskellige farver og materialer give nem identifikation. Derudover kan den øverste del af hætten tilpasses til at tilføje symboler, tal eller bogstaver for nem identifikation.
Der er flere vigtige trin for vellykket implantation og billeddannelse, hvoraf det vigtigste er træning og tilvænning af rotterne. Rotterne præsenteres tilfældigt for sensoriske stimuli for at minimere potentialet for associativ læring, hvilket kan påvirke billeddannelsesresultaterne. Operationen og alle kirurgiske instrumenter skal være sterile for at forhindre infektion, og brugen af lokale antibiotika er afgørende. Brugen af acepromazin i starten af billeddannelsen er vigtig for at holde dyrene rolige og rolige for at undgå unødvendige bevægelser under billeddannelsen. Rottens kranium skal være tørt for korrekt fiksering, og laget af deponeret tandcement skal være tyndt nok til, at hovedhætten passer ind i hovedimplantatet.
For den aktuelle undersøgelse var billedområdet centreret om den somatosensoriske cortex. Det tynde område måler ca. 7,5 mm x 7,5 mm, hvilket er omfanget af det område, der kan afbildes i den aktuelle undersøgelse. Det afbildede område kan dog øges til 11 mm x 11 mm, hvis det er nødvendigt. En anden fordel ved dette design er, at det tillader billeddannelse af hele det tynde område på trods af cortexens krumning.
Tidligere rapporterede hovedimplantater kræver næsten 7-12 forankringsskruer for at fastgøre hovedimplantatet på rottens hoved13,14. Dette udelukker billeddannelse af et større område gennem tynd kranieforberedelse. En anden fikseringsmetode kræver fiksering af et harpiksmateriale over et stort område ved hjælp af hovedskruer, hvilket gør kraniet utilgængeligt til billeddannelse14. Den vågne billeddannelse af rotter ved hjælp af MR kræver immobilisering af dyr i cylindriske rør, hvilket gør billeddannelsesoplevelserne stressende for dyrene11,15. I nogle andre opsætninger stikker hovedimplantatet ud af hovedet og kan blive viklet ind i standardbure16,17. Hovedimplantatet og hovedhætten eliminerer brugen af fiksering af glasglas og fladning af det tynde kranium til kronisk billeddannelse18,19. Hovedimplantatets størrelse og brugen af krumning på hovedhætten eliminerer behovet for at foretage ændringer i standardburene som ved andre kroniske procedurer18,19. Hovedimplantaterne i mus er lettere, fordi der kun anvendes en enkelt møtrik og skruekonfiguration, hvilket ikke er muligt hos rotter, da rotter er meget stærkere og sværere at holde stabile20.
Begrænsningen af hovedimplantatet er, at det på trods af dets lille størrelse kræver forankring af implantatet til kraniet ved hjælp af skruer. Hovedimplantatet er nødvendigt for at holde dyrets hoved stabilt, men begrænser billeddannelsen af hele rottehjernen. En fordel ved at bruge dette hovedimplantat er imidlertid, at det kan bruges til at afbilde et bredere område til fremkaldt sensorisk stimulering ved hjælp af forskellige neuroimaging modaliteter såsom intrinsic signal optisk billeddannelse, doppler optisk kohærenstomografi og laser speckle billeddannelse.
De kortikale funktionelle repræsentationer baseret på iboende signaler fra vågne, hovedfikserede rotter har tendens til at være stærkere i intensitet end hos bedøvede rotter, der bruger den samme whisker-stimuleringsprotokol. En lignende stigning i styrken af fremkaldt indre signalrespons er blevet rapporteret hos vågne aber21,22. Der arbejdes i øjeblikket på at forbedre hovedimplantatet og hovedhættedesignet til mere udfordrende miljøer såsom det naturalistiske habitat23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi anerkender Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha og Amirsoheil Zareh for deres hjælp under træning af rotterne og forberedelse af slyngerne. Finansieringen blev ydet af National Institutes of Health (NIH, tilskudsnummer: NS119852) og Leducq Foundation (tilskudsnummer: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
