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Biochemistry

Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64340
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

Ici, un système bicouche lipidique soutenu par nanobar est développé pour fournir une membrane synthétique avec une courbure définie qui permet la caractérisation de protéines ayant une capacité de détection de courbure in vitro.

Abstract

La courbure de la membrane joue un rôle important dans divers processus essentiels des cellules, tels que la migration cellulaire, la division cellulaire et le trafic des vésicules. Il n’est pas seulement généré passivement par les activités cellulaires, mais régule également activement les interactions protéiques et est impliqué dans de nombreuses signaux intracellulaires. Ainsi, il est très utile d’examiner le rôle de la courbure de la membrane dans la régulation de la distribution et de la dynamique des protéines et des lipides. Récemment, de nombreuses techniques ont été développées pour étudier la relation entre la membrane courbe et la protéine in vitro. Par rapport aux techniques traditionnelles, la bicouche lipidique (SLB) nouvellement développée offre à la fois un débit élevé et une meilleure précision dans la génération de courbure de la membrane en formant une bicouche lipidique continue sur des réseaux à motifs de nanobarres avec une courbure membranaire prédéfinie et un contrôle plat local. La fluidité lipidique et la sensibilité des protéines aux membranes courbes peuvent être caractérisées quantitativement à l’aide de l’imagerie par microscopie à fluorescence. Ici, une procédure détaillée sur la façon de former un SLB sur des surfaces de verre fabriquées contenant des réseaux nanobar et la caractérisation des protéines sensibles à la courbure sur ces SLB sont introduites. En outre, les protocoles de réutilisation des nanopuces et de traitement d’images sont couverts. Au-delà du nanobar-SLB, ce protocole est facilement applicable à tous les types de copeaux de verre nanostructurés pour les études de détection de courbure.

Introduction

La courbure membranaire est un paramètre physique critique d’une cellule qui se produit dans une variété de processus cellulaires tels que la morphogenèse, la division cellulaire et la migration cellulaire1. Il est maintenant largement reconnu que la courbure de la membrane est au-delà d’un simple résultat d’événements cellulaires; Au lieu de cela, il est apparu comme un régulateur efficace des interactions protéiques et de la signalisation intracellulaire. Par exemple, plusieurs protéines impliquées dans l’endocytose médiée par la clathrine se lient préférentiellement à la membrane incurvée, entraînant la formation d’un point chaud pour l’endocytose2. Il existe de nombreuses causes différentes de déformation membranaire telles que l’attraction de la membrane par les forces du cytosquelette, la présence d’asymétrie lipidique avec des groupes de tête de différentes tailles, l’existence de protéines transmembranaires de forme conique, l’accumulation de protéines de formation de la membrane comme les protéines du domaine BAR (nommées d’après les protéines Bin, amphiphysine et Rvs), et l’insertion du domaine des hélices amphipathiques dans la membrane1 . Fait intéressant, ces protéines et lipides non seulement déforment la membrane, mais peuvent également détecter la courbure de la membrane et présenter une accumulation préférentielle1. Par conséquent, il est crucial d’étudier si et comment des membranes avec des courbures différentes modifient la distribution et la dynamique des protéines et des lipides qui leur sont attachés et les impacts potentiels sur les processus intracellulaires connexes.

De nombreuses techniques ont été développées pour analyser l’interaction entre la membrane incurvée et les protéines dans les cellules vivantes et les systèmes in vitro. Le système cellulaire vivant fournit un environnement cellulaire réel avec une riche diversité lipidique et une régulation dynamique de la signalisation des protéines 2,3,4,5,6,7. Cependant, un système aussi sophistiqué est difficile à étudier en raison des incertitudes et des fluctuations de l’environnement intracellulaire. Par conséquent, les essais in vitro utilisant une membrane artificielle composée d’espèces lipidiques connues et de protéines purifiées sont devenus de puissants systèmes de reconstitution pour caractériser la relation entre les protéines et les membranes courbes. Traditionnellement, des liposomes de différents diamètres sont générés par extrusion pour détecter les protéines sensibles à la courbure via soit un test de co-sédimentation utilisant la force centrifuge, soit un test de co-flottation avec un gradient de densité pour éviter l’agrégation des protéines 8,9. Cependant, la courbure des liposomes extrudés est limitée par la taille des pores disponibles du filtre à membrane utilisé dans l’extrudeuse10. Il a été prouvé que le test de courbure mono-liposomique (SLiC) surmonte cette limitation, dans lequel des liposomes de différents diamètres sont marqués par fluorescence et immobilisés sur la surface afin que la courbure puisse être marquée par l’intensité fluorescente11. Cependant, une forte variabilité de la composition lipidique a été observée dans les petites vésicules, ce qui affecte la précision de la mesure de la courbure12. Les expériences de traction d’attache fournissent une mesure plus précise de la courbure sur l’attache transitoire tirée des vésicules unilamellaires géantes (GUV) à l’aide d’une pince optique, où la courbure peut être bien contrôlée par la tension membranaire générée13,14. Cette méthode convient à l’étude des protéines de détection de courbure positive ou négative, mais elle est limitée par le débit de la génération de tubes10. Le test des tubes à membrane supportée (SMrT) permet la génération simultanée de plusieurs tubes à membrane qui sont extrudés à partir du même réservoir lipidique par des écoulements microfluidiques. Néanmoins, la courbure de la membrane varie intrinsèquement le long du nanotube, ce qui compromet la précision de la mesure de la courbure basée sur l’intensité de fluorescence15,16. En comparaison, l’utilisation de petites vésicules unilamellaires (VUS, diamètre <100 nm17) pour former une bicouche lipidique supportée (SLB) sur des surfaces contenant des topographies conçues a généré une membrane bicouche unique avec des courbures prédéterminées par nanofabrication ou nanomatériaux de haute précision18,19,20.

Ici, nous présentons un protocole pour la formation du SLB sur des surfaces de nanopuces fabriquées avec des réseaux nanobar et comment il peut être utilisé pour sonder la sensibilité à la courbure des protéines in vitro. Comme le montre la figure 1, le test comporte six composants essentiels : A) Nettoyage et assemblage de la puce avec une chambre microfluidique; B) Préparation de VUS avec une composition lipidique définie; C) Formation du SLB sur une nanopuce et liaison avec des protéines sensibles à la courbure; D) Imagerie et caractérisation des protéines sensibles au SLB et à la courbure sous microscopie à fluorescence; E) Nettoyage de la puce pour la réutiliser; F) Traitement d’images pour l’analyse quantitative de la capacité de détection de la courbure des protéines. Le protocole détaillé est décrit étape par étape ci-dessous.

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Protocol

1. Nettoyage de la nanopuce

  1. Placez la nanopuce dans un bécher de 10 mL avec le côté à motifs vers le haut.
    REMARQUE: Cette nanopuce de quartz a été fabriquée par lithographie par faisceau d’électrons comme décrit précédemment21. La géométrie et la disposition de la nanostructure sur la puce peuvent être conçues sur mesure. Les tailles des nanobarres de gradient utilisées ici sont de 2000 nm de longueur, 600 nm de hauteur et 100 à 1000 nm de largeur (pas à pas de 100 nm).
  2. Ajoutez soigneusement 1 mL d’acide sulfurique à 98% dans le bécher et assurez-vous que l’acide recouvre complètement l’avant et l’arrière de la puce.
    REMARQUE: L’acide sulfurique à 98% est extrêmement corrosif et peut causer une destruction rapide des tissus et de graves brûlures chimiques au contact de la peau ou des yeux. Utilisez-le dans la hotte avec une protection appropriée.
  3. Faites tourner lentement le bécher et ajoutez 200 μL de peroxyde d’hydrogène à 30% goutte à goutte jusqu’à ce que le bécher entier devienne chaud. S’assurer que l’acide sulfurique et le peroxyde d’hydrogène sont bien mélangés pour former une solution de piranha pour l’élimination des molécules organiques de la nanopuce17. Il existe d’autres techniques pour générer le SLB sur des surfaces hydrophiles propres, telles que l’exposition à la lumière UV et à l’ozone, comme décrit précédemment23.
    REMARQUE: La réaction est extrêmement exothermique et peut faire bouillir la solution, alors ajoutez du peroxyde d’hydrogène à l’acide sulfurique goutte à goutte et continuez à tourner.
  4. Placez le bécher dans un récipient en verre secondaire et gardez la nanopuce immergée dans la solution de piranha pendant la nuit pour nettoyer soigneusement les impuretés.
    REMARQUE: Placez le bécher dans la hotte sans aucun couvercle au cas où la réaction pourrait générer du gaz.
  5. Sortez le bécher et pipeter soigneusement la solution de piranha dans un récipient à déchets acides.
  6. Chargez 5 mL d’eau désionisée dans le bécher pour diluer l’acide résiduel et l’éliminer dans les déchets acides. Répétez cette étape cinq fois et utilisez 5 M NaOH pour neutraliser les déchets acides.
  7. Prenez la puce avec une pince à épiler et lavez avec un jet continu d’eau désionisée pour éliminer complètement l’acide résiduel. Sécher la puce avec de l’azote gazeux à 99,9% pour la formation de SLB22.

2. Génération de petites vésicules unilamellaires (VUS)

  1. Ajouter 100 μL de chloroforme dans un flacon ambré.
    REMARQUE: Le chloroforme est un liquide très volatil et incolore, et il peut être toxique s’il est inhalé ou avalé. Utilisez-le dans la hotte avec le masque et les gants.
  2. Dissoudre 500 μg du mélange lipidique dans le chloroforme. La composition du mélange lipidique utilisé ici est de 89,5% en mole de phosphatidylcholines d’œuf (PC), 10% en mole de phosphatidylsérine cérébrale (PS) et 0,5% en mole de Texas Red 1,2-dihexadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, sel de triéthylammonium (Texas Red DHPE).
  3. Sécher le mélange lipidique dans le flacon avec de l’azote gazeux à 99,9 % jusqu’à ce que le chloroforme soit volatilisé et que le mélange lipidique soit sec.
    REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans la hotte. Évitez les éclaboussures de liquide lors du brushing.
  4. Placez le mélange lipidique présent dans le flacon ambré sans couvercle dans le dessiccateur sous vide recouvert d’une feuille d’aluminium. Sécher ensuite l’échantillon sous vide avec une pompe pendant 3 h pour volatiliser complètement le chloroforme.
  5. Ajouter 250 μL de tampon de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le flacon. Vortex la solution jusqu’à ce qu’elle soit homogène.
    REMARQUE : Le tampon PBS est constitué de 150 mM de NaCl, sans calcium, magnésium et rouge de phénol ; le pH est ajusté à 7,2 pour fabriquer la bicouche lipidique PC et PS.
  6. Soniquer le mélange lipidique pendant 30 min à une fréquence de 50 kHz dans un sonicateur de bain. Ensuite, transférer le mélange lipidique dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et sceller avec un parafilm.
  7. Congeler le mélange lipidique dans de l’azote liquide pendant 20 s puis décongeler à 42 °C pendant 2 min au bain-marie. Répétez les cycles de gel-dégel 30 fois. Après cela, le mélange lipidique ressemble à un liquide clair.
    ATTENTION : L’azote liquide a un point d’ébullition d’environ −195,8 °C. Il peut causer des engelures ou des brûlures cryogéniques. Utilisez-le dans l’espace non confiné avec des gants d’isolation thermique.
  8. Rincez deux seringues étanches au gaz en verre et le connecteur de la mini-extrudeuse avec de l’éthanol, du chloroforme et du méthanol respectivement. Répétez la séquence de rinçage cinq fois pour prénettoyer l’appareil. Laissez-les dans la hotte jusqu’à ce que le solvant organique soit complètement volatilisé.
  9. Assemblez l’appareil de mini-extrudeuse et passez 500 μL de tampon PBS à travers le connecteur pour prémouiller l’appareil, puis jetez le tampon d’une autre seringue. Cette étape élimine les impuretés et facilite l’extrusion.
  10. Assembler l’appareil de mini-extrudeuse avec une membrane filtrante en polycarbonate de la taille d’un pore de 100 nm.
    REMARQUE: La taille des pores de la membrane filtrante détermine le diamètre des liposomes.
  11. Prenez 500 μL de tampon PBS avec l’une des seringues et poussez-le doucement à travers le filtre pour remplir la deuxième seringue vide à l’autre extrémité. Répétez l’extrusion trois fois pour vérifier la fuite de l’appareil et jetez le tampon de la deuxième seringue.
  12. Passez le mélange lipidique à travers la mini extrudeuse pour remplacer le tampon PBS. Ensuite, extrudez d’avant en arrière 20 fois pour former des VUS. Le caractère multilamellaire des vésicules peut être conservé avec un nombre insuffisant de temps d’extrusion, ce qui affectera la formation de SLB23.
  13. Récupérez les VUS de la deuxième seringue pour réduire la contamination par des particules plus grosses et transférez-les dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
    REMARQUE: Retirez la seringue directement du connecteur au cas où la seringue se détacherait.
  14. Enveloppez le tube avec du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment des lipides marqués par fluorescence et conservez-les à 4 °C. Habituellement, les VUS peuvent être stockés jusqu’à 7 jours.

3. Formation du SLB sur une nanopuce

  1. Retirez soigneusement la nanopuce nettoyée de l’eau désionisée avec une pince à épiler et séchez-la avec 99,9% d’azote gazeux.
  2. Effectuer le nettoyage de surface de la nanopuce avec un traitement plasma à l’air pendant 1 h.
  3. Assemblez la nanopuce dans une chambre de polydiméthylsiloxane (PDMS), composée de deux morceaux de PDMS-un PDMS intermédiaire et d’un PDMS supérieur (Figure 1A). Le PDMS moyen est mince (~0,5 mm) avec une grande ouverture de forme ovale au centre pour assurer une exposition suffisante au motif nanobar. Le PDMS supérieur est épais (~ 4,0 mm) avec deux petits trous dans la grande ouverture ovale comme entrée et sortie pour la manipulation des liquides.
    1. Placez la puce sur une surface propre avec le motif vers le haut.
    2. Couvrez délicatement le PDMS central avec la puce et assurez-vous que l’ensemble du motif est exposé à la zone centrale de la grande ouverture ovale dans le PDMS central.
    3. Couvrez le PDMS supérieur avec le PDMS du milieu et gardez ses deux petits trous dans la région du grand trou ovale du PDMS du milieu. Ensuite, la chambre PDMS est assemblée.
      REMARQUE: PDMS est le polymère organique à base de silicium le plus largement utilisé. Il est biocompatible, transparent et déformable pour être conçu comme une forme personnalisée pour l’assemblage de puces et l’imagerie au microscope. Plus important encore, il peut être collé de manière covalente à une autre couche PDMS ou à un verre étroitement après le traitement au plasma, ce qui le rend approprié comme chambre pour préparer le SLB. Cette étape garantit que chaque couche de PDMS est bien ajustée pour éviter les lacunes et les fuites.
  4. Chargez les VUS dans la chambre PDMS à partir de l’un des deux petits trous dans le PDMS supérieur avec une pipette et incuber pendant 15 minutes à température ambiante pour former le SLB.
  5. Pipeter doucement le tampon PBS dans la chambre PDMS d’un côté du petit trou et retirer les déchets avec un coton-tige de l’autre trou pour laver les VUS non liés. Acquérir ensuite le SLB formé sur la nanopuce (la qualité du SLB est testée par récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) comme indiqué à l’étape 4.4 et discuté dans la section des résultats représentatifs).
    REMARQUE: Lors de la pipetage du tampon PBS dans la chambre, l’embout de la pipette doit être plein du tampon et en contact avec la surface du liquide pour éviter l’injection de bulles.

4. Imagerie du SLB et de la liaison à la protéine de détection de courbure sur la nanopuce

REMARQUE: Cette section dépendra du système de microscope disponible pour l’expérience. Ici, une ligne directrice générale sur la façon d’effectuer l’imagerie sera décrite. Les réglages détaillés peuvent être modifiés entre les différentes configurations de microscope.

  1. Configurez la microscopie confocale à balayage laser à l’aide d’un objectif d’huile 100x (N.A.1.4). Ouvrez le logiciel ZEN pour sélectionner la puissance laser d’excitation qui peut exciter la fluorescence du lipide et de la protéine. Choisissez le mode d’acquisition > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
  2. Ajustez la mise au point avec le bouton de mise au point pour localiser les nanobarres sur la puce jusqu’à ce que les bords nanobar soient nets sous le canal lipidique.
  3. Définissez les paramètres de balayage comme ci-dessous pour obtenir une image de contrôle du canal lipidique avant d’ajouter une protéine : Taille de trame = 512 px x 512 px (512 pixels x 512 pixels, une taille de pixel de 124 nm), Bits par pixel = 16 (profondeur de 16 bits), Vitesse de numérisation = 5 et Moyenne = 4 (mode de moyenne de quatre fois/ligne).
  4. Effectuer le test FRAP en blanchissant la bicouche lipidique marquée par fluorescence sur une seule zone nanobar aléatoire.
    1. Cochez les cases Régions d’expérimentation et Blanchiment . Dessinez une zone circulaire de 5 μm de diamètre qui peut inclure la nanobarre entière au centre (la taille nanobar est de 2 μm) et ajoutez-la aux régions expérimentales. Entrez les paramètres d’imagerie time-lapse comme exemple suivant : choisissez Vitesse de numérisation = 9 et Moyenne = 1. Choisissez Série chronologique > Durée = 100 cycles et Intervalle = 2 s. Entrez les paramètres de blanchiment comme exemple suivant : cochez la case Démarrer après # images et choisissez trois images.
    2. Cochez les cases laser qui exécutent FRAP et modifiez l’alimentation à 100,0 %. Cliquez sur Démarrer l’expérience pour l’expérience FRAP.
      REMARQUE: FRAP est une méthode courante pour caractériser la mobilité des molécules cellulaires. Si le SLB a une bonne fluidité, la fluorescence dans la zone blanchie se rétablira progressivement à mesure que les fluorophores blanchis diffusent et que les fluorophores non blanchis d’autres zones diffusent à l’intérieur.
  5. Chargez la solution protéique dans la chambre PDMS et incuber pendant 5 min à température ambiante pour permettre la liaison de la protéine sur le SLB.
    NOTE: Les protéines utilisées dans la figure 2G,H pour démontrer la composition lipidique facilitent la liaison des protéines sur les SLB courbés nanobar sont 74 μM GFP et 79 μM GFP-His. Ces deux protéines sont des protéines de fluorescence verte sans ou avec His-tag. Les protéines utilisées pour l’étude de détection de la courbure dans les figures 4 et 5 sont 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 et 16 μM FBAR+IDRFBP17. Ces trois protéines sont les domaines de FBP17, qui est une protéine BAR typique qui est intuitivement supposée à la fois comme générateurs de courbure et capteurs. Chaque volume de protéines est de 20 μL.
  6. Refocalisez les nanobarres et répétez l’étape 4.3 pour prendre des images des canaux lipidiques et protéiques pour la détection de la courbure des protéines.
  7. Répétez l’étape 4.4 pour effectuer le test FRAP sur les canaux lipidiques et protéiques et effectuer une imagerie accélérée pour caractériser la mobilité de la protéine de détection de courbure.

5. Réutilisation de la nanopuce

  1. Prenez la nanopuce avec une pince à épiler et détachez-la soigneusement de la chambre PDMS dans un bécher de 50 ml rempli d’eau désionisée.
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. Empêchez les pincettes de toucher la nanostructure et ne forcez pas la puce à se séparer pour éviter les fissures.
  2. Lavez soigneusement la nanopuce avec de l’éthanol anhydre pour éliminer les résidus organiques fixés à la surface.
    REMARQUE: Utilisez du papier de soie propre pour éliminer l’eau sur la surface avant de laver avec de l’éthanol anhydre.
    ATTENTION : L’éthanol anhydre est un produit chimique très volatil et légèrement dangereux. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Utilisez-le dans la hotte avec le masque et les gants.
  3. Lavez soigneusement la puce avec beaucoup d’eau désionisée pour éliminer l’éthanol résiduel. Ensuite, séchez la puce avec 99,9% d’azote gazeux.
    NOTE: Il est important d’éliminer toute trace d’éthanol sur la puce avant de passer à l’étape suivante car l’acide piranha peut réagir violemment avec le solvant organique et peut provoquer des explosions.
  4. Placez la puce dans un bécher propre de 10 mL avec le côté du motif vers le haut et nettoyez la puce avec une solution de piranha pour la réutilisation qui suit les mêmes étapes que le « nettoyage de la nanopuce ».

6. Quantification de l’image

  1. Faire pivoter les images acquises par un microscope de sorte que le réseau nanobar soit en position verticale pour une analyse ultérieure dans le logiciel Fidji.
  2. Utilisez un code MATLAB personnalisé « c_pillarmask_averaging » pour localiser la nanobarre individuelle par un masque carré (51 pixels x 51 pixels) à la fois dans le canal lipidique et le canal protéique.
    REMARQUE: Ce code MATLAB est spécialement conçu pour la nanopuce. Il peut être obtenu sur GitHub via le lien: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. Soustrayez les signaux d’arrière-plan de chaque image avec les trois ROI (5 pixels x 5 pixels) aux coins de l’image par la fonction maillage dans le code MATLAB 'BarGra_avg'. Cette opération vise à corriger les bruits de fond inégaux potentiels causés par la configuration du microscope ou le nivellement de la puce sur la scène du microscope.
  4. Générez les images moyennes des nanobarres de même taille à l’aide du code MATLAB « BarGra_avg », où chaque point est la moyenne des valeurs à ce point dans tous les masques carrés nanobarres individuels. Générez des tracés de surface 3D des images moyennes dans le logiciel Fidji pour montrer intuitivement la distribution moyenne du signal autour des nanobarres. Choisissez Analyze > Surface Plot > Input 100 pour Polygon Multiplier, puis cochez les cases Shade, Draw Axis (Axe de dessin) et Smooth (Lisse).
  5. Segmentez chaque nanobarre en trois zones, qui comprennent deux zones d’extrémité nanobar et une zone de centre nanobarre pour extraire leurs intensités de fluorescence respectivement par le code MATLAB « avg_nanobar_quantification ». Les tailles des ROI nanobar sont ajustées en fonction de la dimension des nanobarres à l’aide du fichier 'position'.
  6. Divisez les intensités protéiques par les intensités lipidiques extraites du code MATLAB 'avg_nanobar_quantification' à l’extrémité de la barre pour obtenir la densité nanobar-extrémité qui exclut l’effet de surface.
  7. Tracez la densité d’extrémité nanobar avec différentes concentrations dans GraphPad Prism pour obtenir la courbe de liaison. Ouvrez le menu Analyser . Choisissez Régression non linéaire (ajustement de la courbe) > Liaison - Saturation > Liaison spécifique avec fonction de pente de Hill pour ajuster la courbe à l’équation de Hill, puis calculez la valeur du coefficient KD et Hill.
  8. Les intensités lipidiques et protéiques sont normalisées à leurs intensités correspondantes au centre nanobarres de 600 nm acquis dans la même image à l’aide du code MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  9. Utilisez les neuf pixels les plus brillants d’intensités protéiques normalisées à la zone d’extrémité nanobar divisée par la zone centrale de la barre pour quantifier la détection de la courbure des protéines avec des nanobarres de même taille, la valeur est appelée « rapport de bout en bout ». Utilisez le rapport de l’intensité protéique normalisée pour normaliser l’intensité lipidique afin de quantifier la plage de détection de la courbure des protéines avec des nanobarres de différentes tailles, la valeur est appelée « Densité nanobar-extrémité normalisée ». Ces valeurs sont calculées par le code MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  10. Chargez l’image de la pile FRAP dans le logiciel Fidji. Choisissez la zone FRAP et générez un retour sur investissement. Choisissez la fonction Plus > Multi mesures pour mesurer l’intensité de la zone FRAP pour chaque fois. Tracez l’intensité dans GraphPad Prism pour générer la courbe de récupération FRAP.

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Representative Results

La conception nanobar est recommandée pour sonder les protéines de détection de courbure positive, qui contient un demi-cercle à chaque extrémité avec une courbure définie par la largeur nanobar et un contrôle de courbure plate/nulle localement au centre (Figure 2A, B). La formation réussie du SLB sur les nanobarres entraîne une distribution uniforme des signaux de marqueurs lipidiques sur toute la surface nanobaraire, comme le montre la figure 2C. Les signaux de plusieurs nanobarres peuvent être combinés en faisant la moyenne des images nanobars individuelles (Figure 2D) afin de minimiser les variations aléatoires entre différentes nanobarres. Une étude antérieure de microscopie électronique a montré que la membrane plasmique cellulaire formait un revêtement conforme autour de l’ensemble des nanostructures24. Par conséquent, on pense que la bicouche lipidique synthétique se fixe également étroitement à la surface de la nanostructure, ce qui donne des lignes limitées par diffraction sur la nanobarre de 200 nm, comme observé à la figure 4E. En outre, la fluidité de la membrane sur le SLB incurvé nanobar peut également être caractérisée par le test FRAP, où le signal fluorescent sur une seule nanobarre peut être blanchi individuellement pour la caractérisation de la fluidité membranaire (Figure 2E,F).

La formation du SLB sur les nanobarres nécessite la génération de VUS de la même manière que la formation du SLB sur les surfaces planes, comme indiqué précédemment17. La composition lipidique des SUV détermine la chimie de surface du SLB incurvé nanobar qui peut être modifié pour le marquage de la membrane et différents mécanismes de liaison aux protéines. Par exemple, le Texas Red DHPE peut être ajouté en ~0,5 mol% dans les SUV afin que l’enrichissement de la surface de la membrane sur les nanobarres puisse être facilement imagé par microscopie à fluorescence (Figure 2C). Outre la visualisation, la composition des lipides peut également être modifiée pour faciliter la liaison aux protéines sur les SLB incurvés nanobar. Par exemple, pour faciliter l’ancrage des protéines marquées par His, l’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA) peut être amené au SLB sur les nanobarres en incorporant du 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) acide iminodiacétique) succinyl] (sel de nickel) (18:1 DGS-NTA(Ni)) dans les VUS (~1 mol%)25. Sans ce groupe fonctionnel sur les lipides, la protéine de fluorescence verte (GFP) ne peut pas se lier au SLB avec PS chargé négativement, ce qui entraîne un trou en forme de barre plus foncé à chaque emplacement nanobar en raison de l’épuisement volumétrique des signaux GFP dans la solution (Figure 2G). En comparaison, en ajoutant 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) dans le SLB, le GFP marqué His-tag peut fortement s’ancrer sur la membrane pour suivre clairement la forme SLB incurvée par des nanobarres (Figure 2H). La diffusion lipidique n’a pas montré de différence détectable lors de la liaison aux protéines, comme l’a sondé le test FRAP (figure supplémentaire 1). Il convient de noter que la mesure FRAP est basée uniquement sur l’intensité du DHPE rouge texan à 0,5 mol% dans le SLB, qui peut ne pas représenter le 1 mol% DGS-NTA(Ni) utilisé pour la liaison de la protéine His-tag. En outre, les lipides chargés tels que le PS peuvent améliorer la liaison aux protéines par interaction électrostatique26, tandis que les lipides de signalisation tels que le phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP2) peuvent également être intégrés dans les VUS pour faciliter la liaison à des protéines spécifiques (par exemple, FCHo2, pour lequel PIP2 est jugé essentiel pour sa détection de courbure membranaire27).

La qualité de la formation de SLB en termes d’uniformité de surface et de fluidité de la membrane est essentielle pour sonder la capacité de détection de la courbure des protéines sur les nanobars. Il existe trois problèmes typiques qui peuvent compromettre l’uniformité et la fluidité du SLB. L’une est la fixation des VUS excédentaires sur le SLB en raison d’un lavage inefficace qui génère du puncta à la fois sur les nanobarres et sur la membrane plate entre les nanobarres (Figure 3A, B). Il affecte de manière significative la quantification de la liaison aux protéines sur les surfaces courbes ou planes sur les nanobarres pour l’évaluation de la détection de courbure. Un autre problème est l’introduction inattendue de bulles d’air à l’intérieur de la chambre PDMS pendant l’étape de lavage, ce qui peut détruire le SLB le long de la trajectoire de l’interface air-liquide et laisser des caractéristiques semblables à des rayures facilement identifiables avec des signaux lipidiques extrêmement faibles sur la surface nanobar (Figure 3C, D). De plus, les substrats nanobars mal nettoyés laissent des résidus chimiques répartis aléatoirement à la surface qui empêchent l’adsorption lipidique pour la formation de SLB. Elle conduit à la génération de défauts membranaires qui peuvent ou non être au-dessus de la résolution optique pour la visualisation microscopique (Figure 3E). Cependant, la fluidité de la membrane sera affectée de manière sensible par la formation de défauts membranaires28, de sorte que le test FRAP peut être utilisé pour vérifier la propreté de la surface (figure 3F,G).

Pour démontrer la caractérisation de la protéine de détection de courbure à l’aide d’un réseau nanobar, le domaine F-BAR typique est comparé à une région intrinsèquement désordonnée récemment identifiée dans FBP17 (IDRFBP17). F-BAR est marqué par fluorescence avec des colorants ester de tétrafluorophényle Alexa Fluor 488 tandis que IDRFBP17 est marqué avec Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. Comme le montre la figure 4A, les deux domaines protéiques montrent une accumulation accrue sur des nanobarres individuelles recouvertes de SLB d’une largeur de 300 nm. Ici, le SLB contient 10% de PS pour améliorer électrostatiquement la liaison aux protéines. La capacité de détection de la courbure de la protéine peut être identifiée par l’enrichissement préférentiel aux extrémités nanobar incurvées avec une intensité fluorescente plus élevée que les signaux aux centres nanobars plats, ce qui est plus évident après une moyenne d’image de plus de 100 nanobars (Figure 4B). La capacité de détection de la courbure peut être réfléchie quantitativement en calculant le rapport de bout en bout à centre sur chaque nanobar (c’est-à-dire l’intensité de fluorescence à l’extrémité nanobar par rapport au centre nanobar). Comme le montre la figure 4C, les deux protéines ont un rapport extrémité-centre plus élevé que les lipides, qui est d’environ 1. En comparant l’IDR FBP17 et le F-BAR, on peut voir que le rapport extrémité/centre plus élevé de l’IDRFBP17 (1,385 ±0,011, moyenne ± SEM) indique une détection de courbure plus forte que F-BAR (1,144 ± 0,004, moyenne ± SEM).

Pour examiner la gamme de courbures qui peuvent être détectées par les protéines, le SLB est généré sur des réseaux nanobars avec des largeurs de gradient de 200 nm à 600 nm (Figure 4D) où les lipides ont montré un revêtement homogène sur des nanobarres de différentes tailles (Figure 4E). Trois protéines (IDR FBP17, F-BAR et F-BAR + IDRFBP17) sont incubées sur le réseau nanobar gradient, et toutes ont montré une accumulation préférentielle aux sites membranaires incurvés à l’extrémité nanobar lorsque la courbure a diminué en dessous de 400 nm de diamètre (Figure 4E, F). Parmi ces trois domaines protéiques, IDRFBP17 donne la densité nanobar-extrémité la plus élevée, indiquant sa plus forte capacité de détection de courbure, tandis que F-BAR montre la valeur la plus faible (Figure 4F). En outre, la courbe de liaison de la protéine de détection de courbure peut également être tracée en augmentant progressivement la concentration en protéines (Figure 4G), ce qui montre que IDRFBP17 a une forte capacité de détection de courbure coopérative. En ajustant ses courbes de liaison à l’équation de Hill, le KD se trouve dans la gamme μM (0,6 ± 0,1 μM) et le coefficient de Hill (H) est compris entre 2 et 3, suggérant une liaison ultrasensible de IDRFBP17 aux courbures membranaires induites par les nanobar. Plus la courbure est nette, plus la capacité de liaison à l’équilibre est élevée.

La diffusion membranaire dynamique et l’association membranaire des protéines de détection de courbure autour des sites SLB en forme de nanobar peuvent également être étudiées par FRAP. Par rapport à la récupération rapide des signaux lipidiques sur les nanobarres (Figure 5A,E), le F-BAR n’a pas pu récupérer en 2 minutes (Figure 5B,E), ce qui suggère une diminution significative de la mobilité membranaire et de la dynamique d’association aux sites membranaires courbes. Étonnamment, différent du comportement de F-BAR, LE SIGNAL IDR FBP17 a montré une récupération évidente dans le même laps de temps (Figure 5C, E), indiquant la nature dynamique de l’IDRFBP17 accumulé au niveau des membranes courbes. Cependant, après avoir éliminé l’IDR FBP17 non lié dans la solution, la même récupération dans le canal IDRFBP17 n’a pas pu être observée comme auparavant (Figure 5D,E). Il indique que la récupération est dominée par l’échange avec les molécules IDRFBP17 contenant une solution et moins par la diffusion latérale des molécules liées à la membrane.

Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que ce système nanobar-SLB est un outil puissant pour caractériser in vitro les protéines de détection de la courbure membranaire.

Figure 1
Figure 1 : Illustration du système nanobar-SLB. (A) La chambre PDMS se compose des couches supérieure et intermédiaire sur lesquelles la nanopuce nettoyée est assemblée. (B) Les VUS étiquetés Texas Red DHPE avec des détails zoomés. (C) Le modèle intact du système nanobar-SLB et de la zone de zoom avant montre que le SLB se forme sur des nanobarres avec une seule couche uniforme de la bicouche lipidique. (D) Processus d’imagerie et de caractérisation sous microscopie confocale à balayage laser. (E) Nettoyage de la nanopuce en vue d’une réutilisation ultérieure. (F) Traitement d’imagerie pour la quantification de la détection de la courbure des protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Formation du SLB incurvé sur les nanobarres avec liaison aux protéines. (A) Image MEB d’une nanobarre individuelle. (B) Représentation schématique du système nanobar-SLB. (C) Images fluorescentes du SLB marquées avec Texas Red DHPE sur la nanopuce. (D) Image moyenne de la distribution SLB sur nanobarres (en haut) et tracé de surface 3D de l’image moyenne (en bas). Cette figure a été modifiée à partir de Su et al.22 et reproduite avec permission. (E) Imagerie accélérée du SLB FRAP sur la nanobare. La région de blanchiment est indiquée par un cercle pointillé jaune. (F) Diagramme normalisé de l’intensité nanobar par mesure FRAP. (G) La représentation schématique de la GFP ne peut pas se lier au SLB avec 10 mol% de PS chargé négativement (à gauche) et une image représentative correspondante à droite. (H) Représentation schématique de l’étiquette His-étiquetée GFP liée au SLB avec 1 mol% DGS-NTA(Ni) (à gauche) et une image représentative correspondante à droite. Barres d’échelle: 2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Problèmes typiques qui compromettent la qualité du SLB. (A) Schéma de la préparation du SLB sans lavage efficace. (B) Image représentative de la liaison SLB avec les SUV excédentaires. Les flèches jaunes montrent les puncta qui sont des VUS en excès sur la surface SLB. C) Schéma de préparation du SLB avec injection de bulles d’air. (D) Image représentative du SLB détruit par la trajectoire de l’interface air-liquide. La flèche jaune indique le SLB incomplet sur le substrat. (E) Schéma de la préparation du SLB avec des substrats nanobar non nettoyés. La zone de zoom avant montre une bicouche lipidique discontinue en raison des résidus de surface empêchant l’adsorption des lipides. (F) Imagerie accélérée de l’analyse FRAP SLB sur des substrats nanobars non nettoyés. La région de blanchiment est indiquée par un cercle pointillé jaune. (G) Diagramme normalisé de l’intensité nanobar par mesure FRAP. Barres d’échelle: 2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Caractérisation de la détection de la courbure des protéines par le système nanobar-SLB. (A) Les images fluorescentes de F-BAR (à gauche) et IDRFBP17 (à droite) s’accumulent sur des nanobarres revêtues de SLB (10% PS et 90% PC). Barre d’échelle : 2 μm. (B) Les images moyennes de F-BAR (en haut à gauche) et IDRFBP17 (en bas à gauche) s’accumulent sur des nanobarres et des tracés de surface 3D correspondants (en haut à droite et en bas à droite, respectivement). Barre d’échelle: 2 μm. (C) Rapport de bout en bout de l’intensité de fluorescence de la bicouche lipidique, F-BAR et IDRFBP17 autour de la nanobarre de largeur de 300 nm. Un test t de Welch a été effectué pour l’analyse statistique. p < 0,0001. (n = 3) (D) Image MEB de réseaux nanobars à gradient d’une largeur de 200 nm à 600 nm. Barre d’échelle: 5 μm. (E) Annotation de la construction des protéines (en haut), images moyennes de la bicouche lipidique, IDR FBP17, F-BAR et F-BAR + IDRFBP17 sur des nanobarres de gradient avec une largeur allant de 200 nm à 600 nm (milieu) et des profils d’intensité le long des nanobarres de chaque image moyenne (en bas). Barre d’échelle: 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR et F-BAR + IDRFBP17 densité nanobar normalisée quantifiée avec différentes largeurs de nanobarres respectivement. Chaque donnée est représentée par la moyenne ± SEM (n ≥ 60). (G) La courbe de liaison de l’IDRFBP17 correspond à l’équation de Hill. Chaque donnée est représentée par la moyenne ± SEM (n = 3). Cette figure a été modifiée à partir de Su et al.22 et reproduite avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : La dynamique de liaison membranaire des protéines de détection de courbure autour de la nanobarre. (A-D) L’imagerie accélérée de la bicouche lipidique (A), F-BAR (B), IDR FBP17 (C) et IDRFBP17 a délavé (D) l’analyse FRAP sur la nanobar. La région de blanchiment est indiquée par un cercle pointillé rouge. Barre d’échelle: 5 μm. (E) Diagramme d’intensité nanobar normalisé par mesure FRAP. Cette figure a été modifiée à partir de Su et al.22 et reproduite avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Diffusion membranaire avant et après l’ajout de protéines. (A) Imagerie accélérée du test FRAP sur la bicouche lipidique POPC avec 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni) et 0,5 mol% Texas Red DHPE autour de la nanobarre avant (en haut) et après (en bas) l’ajout de la protéine GFP-He. La région de blanchiment est indiquée par un cercle pointillé jaune. (B) Diagramme normalisé de l’intensité nanobar par mesure FRAP. Barres d’échelle: 2 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le système nanobar-SLB décrit ici offre une combinaison unique des avantages de plusieurs tests in vitro existants. Il révèle efficacement la liaison préférentielle des protéines aux membranes très incurvées comme le test de flottaison ou de sédimentation des liposomes, mais nécessite beaucoup moins d’échantillons et offre une courbure plus précisément définie sur des nanobarres individuelles 8,29. Il offre également une large gamme de courbures contrôlées avec précision pour une comparaison simultanée comme le test SLiC, avec moins de préoccupation concernant le changement de composition lipidique dans différentes courbures et les changements morphologiques ou de courbure indétectables avec des tailles inférieures à la limite de diffraction de la lumière, car le SLB est mobile et couvre en permanence toutes les tailles de nanobarres30 . Nanobar-SLB permet également l’observation des comportements dynamiques des protéines sur la membrane incurvée en tant que tests de traction de l’attache, mais non limité par le débit de génération de tubes et l’expérience dans la manipulation de piégeage optique13. Bien que le test SMrT génère des tubes à membrane à haut débit, la courbure de la membrane varie le long du nanotube, ce qui rend plus difficile l’étude de la sensibilité à la courbure des protéines16. Plus intéressant encore, par rapport à d’autres systèmes basés sur le substrat à motifs18,19,20,27, le nanobar-SLB fournit un centre de barre plat à côté de la courbure définie à l’extrémité de la barre, ce qui sert efficacement de contrôle local de la courbure nulle pour minimiser l’impact des variations de densité de surface sur l’analyse quantitative. La possibilité de personnaliser les combinaisons de courbures à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons à haute résolution peut générer non seulement des contrôles locaux de courbure nulle, mais aussi des courbures positives et négatives, comme démontré précédemment dans des études sur cellules vivantes2.

Il existe des limites potentielles à noter lors de l’utilisation de cette méthode. Tout d’abord, la nanofabrication sur puce est une procédure relativement complexe, avec des installations de salle blanche et un équipement spécialisé nécessaire (en particulier, un émetteur E-beam). Ce coût élevé nous a amenés à réutiliser la puce; il en résulte un temps plus long passé à nettoyer la surface de la puce et à assembler la puce avec PDMS par rapport à une utilisation unique. La disponibilité de la nanopuce est un autre type de limitation. Un mauvais fonctionnement lors de l’utilisation de la puce, par exemple face à la surface vers le banc, peut provoquer une attrition de la nanostructure, en particulier pour les structures à rapport d’aspect élevé. De plus, la bicouche lipidique formée sur le substrat est une membrane continue; La tension peut facilement se propager partout. Pour les études qui nécessitent une manipulation de la tension de la membrane, des techniques telles que l’attache tirée des GUV via le système de micropipettes attaché fournissent des solutions plus pratiques10.

Pour obtenir des résultats optimaux, les étapes suivantes sont également essentielles. (i) La taille des vésicules est critique pour la formation de SLB31,32. La littérature antérieure montre une propension plus élevée à fusionner pour des vésicules de plus petite taille (< 90 nm) par rapport à une plus grande taille à l’aide d’une microbalance à cristaux de quartz avec test de dissipation (QCM-D)32. Ainsi, par rapport à des LUV de 300 nm, les diamètres de ~50 nm seront plus faciles pour la formation de SLB. Compte tenu de ce problème, au moins 20 fois dans les étapes de gel-dégel et d’extrusion sont nécessaires pour former des VUS homogènes pour la formation de SLB. Le test FRAP est également nécessaire dans chaque expérience pour valider la mobilité de la membrane. ii) Pendant la préparation du SUV, tout l’équipement doit être maintenu propre pour éviter la contamination de petites particules ressemblant à de la poussière. Surtout pour la mini-extrudeuse, les aiguilles sont facilement obstruées dans un environnement sale. iii) Pour préparer des VUS de bonne qualité, le chloroforme contenu dans le mélange lipidique doit être complètement éliminé pour éviter de détruire les vésicules lipidiques. (iv) Le nettoyage au plasma de la puce doit être effectué fraîchement avant la formation du SLB afin d’assurer une surface hautement hydrophile pour une rupture efficace du SUV afin de former une bicouche continue. Une exposition prolongée dans l’environnement après un traitement au plasma peut entraîner une liaison non spécifique de particules de poussière ou de résidus organiques à la surface de la puce, compromettant ainsi l’hydrophilie de la surface. (v) Pour assembler la chambre PDMS pour la formation de SLB et l’incubation de protéines, la propreté et la planéité de chaque pièce PDMS sont importantes pour assurer une bonne étanchéité du canal fluidique. Toute fuite de la chambre peut provoquer le dessèchement du SLB ou modifier la concentration en protéines. (vi) Le réglage de la mise au point par imagerie est essentiel pour assurer une mesure cohérente de l’intensité, car la hauteur de la nanobarre (600 nm) est comparable à la profondeur focale de la microscopie confocale à balayage laser sur l’axez 33. La mise au point doit être réajustée chaque fois que le tableau se déplace horizontalement pour maintenir la netteté des bords nanobar dans les images.

Surtout, le système nanobar-SLB présenté ici fournit une méthode puissante pour étudier les protéines de détection de courbure membranaire. Divers paramètres affectant l’interaction protéique avec la membrane courbe peuvent être étudiés quantitativement à travers une gamme de courbures, tels que les domaines sensibles à la courbure (par exemple, domaine BAR et hélice amphiphile) de la protéine 8,30, la composition lipidique (par exemple, PS et PIP2) de la membrane27,34, le pH, la force ionique et la température de l’environnement35,36 , ainsi que l’interaction protéine-protéine pour la formation de complexes (par exemple, CHMP2B et CHMP2A pourraient contribuer différemment aux processus de remodelage membranaire catalysés par ESCRT-III)37,38. Des études dynamiques peuvent également être menées à l’aide du système nanobar-SLB pour sonder la cinétique de liaison membranaire 11, la diffusion ou l’assemblage des protéines membranaires39, ainsi que les réactions enzymatiques 40 ou la séparation de phase comportementale13,41,42. De plus, la bicouche lipidique artificielle est généralement considérée comme symétrique avec chaque monocouche lipidique contenant la même composition lipidique, qui est assez différente de la membrane cellulaire vivante43. L’induction d’une bicouche d’asymétrie pour mieux imiter la membrane plasmique peut être obtenue en modifiant le matériau de la surface, l’état tampon, la composition lipidique ou la température44,45,46,47. Il est très utile de vérifier si une bicouche asymétrique peut être formée sur le système nanobar-SLB pour étudier le comportement des protéines sur la membrane incurvée, ce qui mérite d’être étudié plus avant.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n’avoir aucun intérêt financier concurrent dans ce travail.

Acknowledgments

Nous remercions le Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) et le Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) de l’Université technologique de Nanyang (NTU) pour leur soutien à la fabrication de nanostructures et à l’imagerie SEM, la plate-forme de production de protéines (PPP) de l’École des sciences biologiques NTU pour la purification des protéines et l’École de génie chimique et biomédical NTU pour le microscope confocal. Ce travail est financé par le ministère de l’Éducation de Singapour (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 et MOE-T2EP30220-0009), l’Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) soutenu par un financement du MOE dans le cadre du programme Research Centres of Excellence (W. Zhao), la Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), la NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU pour la bourse de recherche (X. Miao), et China Scholarship Council pour la bourse de recherche (J. Wu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biochimie numéro 189 réseau nanobar courbure membranaire protéine de détection de courbure bicouche lipidique supportée essai in vitro
Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in <em>vitro</em> de protéines de détection de courbure membranaire
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Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A… More

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).

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