Summary
يستخدم تحليل السائل الزليلي تحت المجهر الضوئي المرسل والمستقطب والمعوض لتقييم الطبيعة الالتهابية أو غير الالتهابية للعينة من خلال خطوات بسيطة. من المفيد بشكل خاص في هشاشة العظام الكشف عن بلورات الكالسيوم وتحديد مجموعة فرعية أكثر حدة من هشاشة العظام.
Abstract
تحليل السائل الزليلي (SF) مهم في تشخيص هشاشة العظام (OA). تساعد الميزات العيانية والمجهرية ، بما في ذلك عدد خلايا الدم البيضاء الكلية والتفاضلية (WBC) ، في تحديد الطبيعة غير الالتهابية ل SF ، والتي تعد سمة مميزة ل OA. في المرضى الذين يعانون من هشاشة العظام ، لا يتجاوز WBC في عينات SF عادة 2000 خلية لكل ميكرولتر ، والنسبة المئوية للخلايا الالتهابية ، مثل العدلات ، منخفضة جدا أو غائبة. بلورات الكالسيوم متكررة في SF التي تم جمعها من مرضى الزراعة العضوية. على الرغم من أن دورها في التسبب في هشاشة العظام لا يزال غير واضح ، فقد ارتبطت بعملية التهابية خفيفة وتطور مرض أكثر حدة. في الآونة الأخيرة ، تم وصف بلورات الكالسيوم في كل من المراحل المبكرة والمتأخرة من الزراعة العضوية ، مما يشير إلى أنها قد تلعب دورا حيويا في تشخيص مجموعات فرعية سريرية مختلفة من الزراعة العضوية والعلاج الدوائي. الهدف العام من تحليل SF في الزراعة العضوية ذو شقين: التأكد من الدرجة غير الالتهابية ل SF وتسليط الضوء على وجود بلورات الكالسيوم.
Introduction
هشاشة العظام (OA) هو مرض مزمن معقد ومتعدد العوامل في المفاصل ، مع انتشار عالمي مجمع يقدر ب 16٪ في الأشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين 15 وما فوق ، و 23٪ في الأشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين 40 وما فوق1. من المتوقع أن يزداد حدوث هشاشة العظام بسبب شيخوخة السكان وزيادة عوامل الخطر ، مثل السمنة ومتلازمة التمثيل الغذائي2.
من بين القضايا الرئيسية المرتبطة بهشاشة العظام صعوبة تشخيص المرض في مراحله المبكرة والعلاجات المتاحة حاليا التي تقتصر على إدارة الألم والأدوية بطيئة المفعول (SYSADOAs) مثل الجليكوزامينوجليكان. يعتمد تشخيص هشاشة العظام على الأعراض السريرية ونتائج التصوير. ومع ذلك ، فإن عدم وجود علاقة بين التقييمين يمكن أن يسبب سنوات من التأخير في تشخيص هشاشة العظام وبدء العلاج2. يتميز الزراعة العضوية بالعمليات التنكسية والالتهابات منخفضة الدرجة ، والتي يمكن التحقيق فيها بسهولة عن طريق تحليل السائل الزليلي (SF). SF عبارة عن غسيل بلازمي لزج غني بحمض الهيالورونيك ، الذي يشحم مساحة المفصل ، ويوفر العناصر الغذائية والأكسجين للغضروف ، ويزيل النفايات الأيضية. يعمل SF أيضا كممتص للصدمات ، وبالتالي يحمي المفاصل أثناء الإجهاد والإجهاد3.
تحليل SF هو طريقة بسيطة وموثوقة يجب إجراؤها دائما أثناء التقييم الأولي للمرضى الذين يعانون من أعراض الجهاز العضلي الهيكلي وانصباب المفاصل3. تشمل التوصيات الصادرة عن الكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم والجمعية البريطانية لأمراض الروماتيزم وغيرها تحليل SF بين الاختبارات التشخيصية للأمراض الروماتيزمية التي يجب إجراؤها بشكل أساسي في تقييم التهاب المفاصل الأحادي الحاد 4,5. توفر أعداد الكريات البيض الكلية والتفاضلية التي تم الحصول عليها من تحليل SF لقطة للعملية المرضية التي تحدث في المفصل ، وبالتالي تصنيف درجة الالتهاب. يعد تحديد البلورات المسببة للأمراض ، مثل بلورات اليورات أحادية الصوديوم (MSU) وبيروفوسفات الكالسيوم (CPP) ، تحت الضوء المستقطب ، أمرا حيويا في تشخيص وعلاج التهاب المفاصل البلوري (مثل النقرس والنقرس الكاذب). علاوة على ذلك ، يشير وجود الكائنات الحية الدقيقة إلى تشخيص التهاب المفاصل الإنتاني.
بلورات الكالسيوم متكررة في العينات التي تم جمعها من المرضى الذين يعانون من OA6. تم الإبلاغ عن بلورات فوسفات الكالسيوم الأساسية (BCP) و CPP في حوالي 22٪ و 23٪ من عينات SF ، على التوالي ، من المرضى الذين يعانون من OA6. على الرغم من أن دورها لا يزال غير واضح ، فقد ارتبطت هذه البلورات بأشكال أكثر حدة من OA7 وتعتبر ظاهرة عرضية للعملية المرضية نفسها. تم الكشف عن بلورات الكالسيوم في 100٪ من عينات الأنسجة من مرضى الزراعة العضوية الذين يخضعون لاستبدال الركبة8. علاوة على ذلك ، تم افتراض أن بلورات الكالسيوم قد تكون متورطة في التسبب في هشاشة العظام بسبب آثارها الالتهابية ، والتي أظهرتها العديد من الدراسات9 وتوسطت ، جزئيا على الأقل ، التهاب NLRP310.
في الآونة الأخيرة ، تم وصف بلورات الكالسيوم في كل من المراحل المبكرةوالمتأخرة 6 من الزراعة العضوية ، مما يشير إلى أنها قد تلعب دورا حيويا في تشخيص مجموعات فرعية سريرية مختلفة من الزراعة العضوية والعلاج الدوائي.
الهدف العام من تحليل SF ذو شقين: تحديد درجة التهاب SF وتشخيص التهاب المفاصل البلوري أو الإنتاني عن طريق تحديد بلورات أو كائنات دقيقة معينة. إنها أداة مفيدة وبسيطة وموثوقة بشكل خاص في تشخيص هشاشة العظام ، بسبب النمط غير الالتهابي النموذجي مع نسبة منخفضة جدا أو غياب العدلات.
مزايا على التقنيات البديلة
يتكون تحليل SF من إجراءات بسيطة تشمل تعداد الكريات البيض الكلي والتفاضلي والبحث البلوري. لا يزال العد اليدوي للخلايا الذي يقوم به فنيو المختبراتالخبراء 3,11 هو المعيار الذهبي للتحليل الخلوي للسوائل الزليلية وسوائل الجسم الأخرى. ومع ذلك ، نظرا للقيود التي تستغرق وقتا طويلا والتباين بين المراقبين وأثناءهم لهذه الطريقة ، حلت عدادات الخلايا الآلية تدريجيا محل العد اليدوي في المختبرات السريرية الروتينية الكبيرة حيث تم تكييف أجهزة تحليل الدم والبول لتمكين تحليل SF11,12. ومع ذلك ، يقدم العد اليدوي بعض المزايا في إعدادات محددة: (1) في الإسعافية ، للحصول على قيمة WBC الإجمالية والتفاضلية في الوقت المحدد ؛ (2) لتحديد أنواع الخلايا مثل الخلايا أحادية النواة الخلوية (Reiter) أو الخلايا غير المكونة للدم مثل الخلايا الزليلية ، التي لا تستطيع العدادات الآلية التعرف عليها ؛ (3) عندما تكون العينة صغيرة جدا بحيث لا يمكن معالجتها بواسطة الأداة ؛ (4) إنشاء سجلات مختبرية محلية يسهل الوصول إليها لأغراض البحث. ميزة أخرى للعد اليدوي هي تلطيخ inupravital ، وهي طريقة تسمح بتمايز الخلايا بسرعة كبيرة ومباشرة بعد إعداد الشريحة الزجاجية. على النقيض من ذلك ، تتطلب البقع التقليدية ، مثل إجراءات رايت وماي-جرونوالد-جيمسا ، مسحات SF المجففة بالهواء ووقتا لتلطيخ الخلايا13. على الرغم من أنها غير مناسبة للتحليلات الروتينية الحساسة للوقت ، إلا أن طرق التلوين هذه تكشف عن مجموعات خلايا أكثر تفصيلا في العينة ، بما في ذلك كريات الدم الحمراء ، والخلايا القاعدية ، والحمضات ، والكريات البيض متعددة الأشكال النووية ، والخلايا الليمفاوية ، والصفائح الدموية.
أخيرا ، يتم إجراء تحليل SF الروتيني للبلورات باستخدام تقنية بسيطة تعتمد على المجهر الضوئي المستقطب ، والتي توفر نتائج سريعة14. تسفر الطرق البديلة ، مثل المسح والمجهر الإلكتروني ، عن نتائج أكثر دقة وحساسية ، لكن استخدامها في الممارسة السريرية اليومية غير ممكن بسبب ارتفاع التكاليف وإعداد العينات وتحليلها الذي يستغرق وقتا طويلا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتوافق البروتوكول الحالي مع المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة بادوفا. تم جمع SF بموافقة المريض من مفاصل الركبة للمرضى الذين يتلقون بزل المفصل العلاجي لانصباب المفاصل عند تقديمهم الأولي إلى العيادة أو استجابة لتوهج التهاب المفاصل. كانت موانع الإجراء: اعتلال التخثر ، الأدوية المضادة للتخثر ، الآفات الجلدية ، التهاب الجلد ، أو التهاب النسيج الخلوي الذي يغطي المفصل. تم تحديد جميع عينات SF.
1. إعداد السائل الزليلي
- نقل عينات SF التي تم جمعها أثناء بزل المفاصل المتورمة15 إلى أنبوب يحتوي على مضادات التخثر (يفضل EDTA ؛ انظر جدول المواد) وإلى أنبوب ثان لا يحتوي على مادة مضافة (الشكل 1).
- في الحالات المشتبه في إصابتها بالعدوى ، قم بنقل جزء من عينة SF (~ 1 مل) إلى زجاجات المزرعة للاختبار الميكروبيولوجي.
ملاحظة: يمكن الاشتباه في الإصابة نتيجة لكل من السمات السريرية (الورم الشديد ، الدولور ، السعرات الحرارية ، functio laesa ، وفي بعض الأحيان الحمى) والمظهر العياني ل SF (التعكر ، اللون). في هذه الحالة ، يصف الطبيب تحليلا ميكروبيولوجيا ، يتم إجراؤه بواسطة مختبر علم الأحياء الدقيقة. - قم بإجراء تحليل SF (الخطوات 2-5) بمجرد جمع العينة.
2. الفحص العياني
ملاحظة: يتكون التقييم العياني لعينات SF من تقييمات ذاتية ونوعية وشبه كمية. لا توجد مقاييس قياسية مرجعية ، ولا يتم استخدام عينات تحكم.
- قم بالتعليق على حجم SF معبرا عنه بالملليلتر. حدد لون العينة ، والتي يمكن أن تتراوح من شاحب إلى أصفر غامق. سجل وجود الدم.
- حدد درجة الوضوح من خلال مراقبة العينة في الإضاءة الخلفية وتحديد سهولة قراءة الصفحة المطبوعة من خلال أنبوب السائل (الشكل 2 أ).
- قم بتقييم اللزوجة عن طريق تقطير العينة من ماصة يمكن التخلص منها. يشير تكوين الخيط الطويل أو السقوط إلى اللزوجة الجيدة أو الضعيفة ، على التوالي (الشكل 2 ب).
- تقييم وجود المواد الجسيمية ، بما في ذلك شظايا الأنسجة أو الفيبرين ، من خلال مراقبة العينة من خلال الأنبوب وفي الإضاءة الخلفية.
3. الفحص المجهري
ملاحظة: يتكون التحليل المجهري SF من الفحص الخلوي ، بما في ذلك تعداد خلايا الدم البيضاء الكلية والتفاضلية (WBC) والبحث عن البلورات.
- حدد إجمالي عدد الخلايا باتباع الخطوات أدناه.
- تحديد العدد الإجمالي للكريات البيض في SF التي تم جمعها في أنبوب EDTA باستخدام مقياس الدم (انظر جدول المواد).
- ارسم 0.5 ميكرولتر من SF من أنبوب EDTA باستخدام ماصة Malassez-Potain (العلامة 0.5 ؛ انظر جدول المواد) (الشكل التكميلي 1). باستخدام نفس الماصة ، ارسم 9.5 ميكرولتر من محلول الميثيلين الأزرق 0.1٪ (العلامة 11). التخفيف النهائي هو 20 ضعفا.
- امزج الماصة عن طريق الانعكاس اللطيف ، وتخلص من القطرات الأولى ، واسكب السائل الزليلي + محلول الميثيلين الأزرق في غرفة العد.
- احسب الخلايا في مربعين متتاليين من أصل تسعة ، واضرب الرقم الذي تم الحصول عليه في 100 (صيغة مبسطة ؛ الشكل التكميلي 2). التعبير عن كرات الدم البيضاء كعدد كريات الدم البيضاء لكل ملليمتر مكعب.
ملاحظة: الصيغة المبسطة: الكريات البيض (N / mm3) = عدد الخلايا المحسوبة في مربعين متتاليين × 100. - تصنيف SF وفقا للعدد الإجمالي ل WBCs بعد التقارير المنشورة سابقا16,17 (الجدول 1).
- إجراء عدد الخلايا التفاضلية.
- تحديد النسبة المئوية للخلايا متعددة الأشكال (PMN) ، وحيدات ، والخلايا الليمفاوية باستخدام تلطيخ فوق حيوي أو تقليدي13,18.
- بالنسبة للتلوين فوق الحيوي ، ضع قطرة صغيرة واحدة من SF في وسط شريحة جاهزة للاستخدام مغلفة مسبقا بالبنفسج الكريسيل والأزرق الميثيلين (الشكل التكميلي 3 ؛ انظر جدول المواد).
- قم بتغطيتها بغطاء ، وضع قطرة من زيت الغمر المجهري.
- تحضير مسحة SF المجففة بالهواء للتلطيخ التقليدي (أقل ملاءمة للتحليل الروتيني). ضع قطرة صغيرة من SF في نهاية شريحة نظيفة. باستخدام شريحة ثانية أو قسيمة غطاء ، انشرها على طول الشريحة بحركة أمامية. دع اللطاخة تجف في الهواء.
- قم بتلطيخ العينة وفقا لإجراء May-Grünwald-Giemsa القياسي18.
- افحص الشريحة تحت هدف الغمر بالزيت (1000x).
- عد 100 خلية متتالية وميز بين الخلايا متعددة الأشكال النووية والوحيدات والخلايا الليمفاوية (الشكل 3 ، الشكل التكميلي 4).
- عبر عن العدد الإجمالي في كل فئة كنسبة مئوية.
ملاحظة: للحصول على نتائج دقيقة ، يجب إجراء الفحوصات الخلوية بمجرد جمع SF أو في غضون 24-48 ساعة من بزل المفصل عند تخزينها بشكل صحيح (4 درجات مئوية).
4. كشف الكريستال
- تحديد وجود بلورات مرضية باستخدام مجهر ضوئي مستقطب مجهز بمرشح استقطاب إضافي ومعوض أحمر19 (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد الشرائح للكشف عن البلورات.
- قم بتنظيف شريحة زجاجية بعناية باستخدام ورق بصري أو ورق ناعم مشرب بالإيثانول. ضع قطرة صغيرة من SF على الشريحة الزجاجية.
- غطيها بغطاء وضع الشريحة تحت المجهر.
- التعرف على البلورات.
- ركز الشريحة تحت المجهر باستخدام هدف تكبير منخفض الطاقة. افحص بعناية الشريحة تحت حقل مشرق بهدف 40x. انظر داخل وخارج الخلايا.
- حدد البلورات وفقا لحجمها وشكلها (على سبيل المثال ، معينية ، على شكل إبرة ، على شكل قضيب).
- أدخل مرشح الاستقطاب بين مصدر الضوء والعينة. قم بتدوير المستقطب حتى يصبح محوره البصري عموديا على المحلل (الموضوعة فوق الأهداف) لإنشاء خلفية داكنة.
- بمجرد تحديد بلورة ثنائية الانكسار ، أدخل المعوض بين المستقطب والعينة وحركه موازيا أو عموديا على المحور الأصلي للبلورة.
- لاحظ اللون الذي كشفت عنه البلورة (الجدول 2).
ملاحظة: تظهر بلورات جامعة ولاية ميشيغان على شكل إبرة ، وتنكسر بشكل مشرق في الحقل المظلم ، وتعرض لونا أصفر / برتقاليا عندما يكون محورها موازيا للمعوض. على العكس من ذلك ، فهي زرقاء عند وضعها عموديا (علامة سلبية) (الجدول 2 ؛ الشكل 4). بلورات CPP عبارة عن بلورات تشبه القضيب أو المعين ، وتنكسر بشكل ضعيف تحت الضوء المستقطب ، وتعرض لونا أزرق أو أصفر عندما تكون محاذاة متوازية أو عمودية على محور المعوض (علامة موجبة) ، على التوالي (الجدول 2 ؛ الشكل 5).
5. تلطيخ أحمر أليزارين
- تحضير محلول 2 ٪ من Alizarin Red S (درجة الحموضة 4.1-4.3) ، وتصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، وتخزينه بعيدا عن الضوء.
- لتحضير الشريحة ، امزج قطرة من SF بنفس الحجم من محلول الأليزارين الأحمر (1: 1) على شريحة نظيفة. قم بتغطيتها بغطاء وافحصها عند تكبير 400x.
- تحديد البلورات تحت المجهر.
ملاحظة: يكون الاختبار إيجابيا عندما تكون الرواسب الحمراء الداكنة الساطعة مرئية تحت الضوء المرسل ، مع شكل دائري وطبقات متحدة المركز. تحت الضوء المستقطب ، تظهر بقوة ثنائية الانكسار20 (الشكل 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
غالبا ما تتورم المفاصل الكبيرة المتأثرة بهشاشة العظام وتنتج كميات كبيرة من SF ، والتي يتم تصريفها عن طريق بزل المفصل15. تشمل الخصائص العيانية ل SF التي تم تقييمها مباشرة بعد بزل المفصل بشكل أساسي الكمية واللون والوضوح واللزوجة17. على الرغم من خصوصيتها المنخفضة ، فإنها توفر بيانات أولية عن درجة الالتهاب. يعتمد اللون على خلوية SF ودرجة تجزئة جزيئات المصفوفة خارج الخلية. SF الذي تم جمعه من المرضى الذين يعانون من هشاشة العظام أصفر باهت ، وهو ظل يرتبط عموما بالعينات غير الالتهابية ، في حين يرتبط الأصفر الداكن بالانصباب الالتهابي (الشكل 2). يؤدي وجود كميات صغيرة من الدم في العينة ، على سبيل المثال ، بسبب تمزق الشعيرات الدموية ، إلى اللون البرتقالي قليلا. يجب النظر بعناية في الانصباب الدموي لأنها قد تشير إلى احتمال الإصابة بالتهاب المفاصل. الوضوح هو السمة المميزة ل SF التي تم جمعها من المرضى الذين يعانون من هشاشة العظام. في الواقع ، SF غير الالتهابي ضعيف في الخلايا والحطام وحمض الهيالورونيك وشظايا الفيبرين ، على عكس المظهر العكر لالتهاب SF (الشكل 2).
تمثل اللزوجة مؤشرا التهابيا جيدا لأنها ترتبط بسلامة جزيئات المصفوفة الكبيرة ، وخاصة حمض الهيالورونيك (الشكل 2). هذه الجزيئات تتبلمر أثناء الالتهاب ، مما يؤدي إلى SF أقل لزوجة. اعتمادا على مرحلة المرض وشدته ، يمكن الحفاظ على اللزوجة أو تقليلها قليلا في الزراعة العضوية.
لا يتجاوز عدد الكريات البيض أبدا 500-1000 خلية / مم3 في الزراعة العضوية ، وهي في الغالب وحيدات (الشكل التكميلي 5 أ) وخلايا أحادية النواة أخرى مثل الخلايا الزليلية (الشكل التكميلي 5 ب). واحدة من النتائج الأكثر صلة وتكرارا في الزراعة العضوية SF تتعلق بلورات CPP و BCP. يتم اكتشاف بلورات CPP بسهولة تحت المجهر الضوئي المستقطب المعوض (الشكل 5) ، في حين أن تحديد بلورات BCP يصبح أكثر صعوبة بسبب حجمها تحت المجهري (الشكل 6). في الواقع ، يبلغ طول بلورة BCP الواحدة أقل من 1 ميكرومتر ، وعلى الرغم من أن هذه البلورات تشكل مجاميع ، إلا أن الكتل تظهر على شكل كريات غير متبلورة غير متبلورة. على الرغم من أنه غير محدد ، إلا أن تلطيخ أحمر أليزارين الإيجابي يكشف عموما عن وجود بلورات BCP.
على عكس النقرس الكاذب ، حيث تكون بلورات CPP عديدة وترتبط بارتفاع عدد كريات الدم البيضاء والسمات السريرية الالتهابية ، في الزراعة العضوية ، يكون عدد بلورات CPP في SF منخفضا جدا ولا يرتبط بأي استجابة خلطية متغيرة. ومع ذلك ، فإن عينات SF مع بلورات CPP أو BCP تظهر مستويات أعلى من السيتوكينات الالتهابية عند مقارنتها ب OA بدون بلورات21. بغض النظر عن عدد كرات الدم البيضاء ، ترتبط SFs ذات البلورات أيضا بزيادة النسب المئوية لخلايا PMN5. من وجهة نظر سريرية ، قد تساعد العلاقة بين بلورات الكالسيوم والالتهاب في تحديد مجموعة فرعية معينة من المرضى المعرضين لخطر متزايد للإصابة بمرض أكثر حدة.
الشكل 1: شفط مفصل الركبة المتورمة . (أ) يتم إجراء بزل المفصل بعد تطهير دقيق للجلد بمواد معقمة. يتم جمع SF في (B) أنابيب EDTA لإجمالي عدد الخلايا و (C) أنابيب غير مضافة لعدد الخلايا التفاضلية والبحث البلوري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خصائص عينات SF الالتهابية (اليسرى) وغير الالتهابية (اليمنى). (أ) لون ووضوح عينات SF الالتهابية (اليسرى) وغير الالتهابية (اليمنى). (ب) لزوجة SF غير الالتهابية التي تم تقييمها من خلال اختبار "الخيط". يقوم المختبر بتقييم طول "الخيط" الذي يتكون من انخفاض ساقط من SF من حقنة أو ماصة. تنتج العينة في الصورة خيطا طويلا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خلايا SF التي لوحظت في شريحة ملطخة مسبقا. أ: مجموعة من الخلايا متعددة الأشكال النووية (PMN) ذات نوى متعددة الفصوص، وخليتان وحيدتان مع نواتهما الضخمة في الجانب الأيمن السفلي من الصورة. (ب) خلايا PMN والوحيدات (M) مع خلية وحيدة النواة (CPM) في وسط الصورة. حقل مشرق تكبير 1000x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بلورة جامعة ولاية ميشيغان داخل الخلايا. تشكل البلورة شكل إبرة نموذجي موضح تحت (A) مرسل ، (B) مستقطب ، و (C) تعويض الضوء المستقطب (400x). يشير السهم إلى اتجاه مرشح λ (المعوض) ، الموازي للمحور الطويل للبلورة. في هذا التكوين ، تظهر البلورة صفراء / برتقالية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: بلورة CPP داخل الخلايا. تظهر البلورة تحت (A) المرسلة ، (B) المستقطبة ، و (C) الضوء المعوض (400x). يشير السهم إلى اتجاه مرشح λ (المعوض) ، الموازي للمحور الطويل للبلورة. في هذا التكوين ، تظهر البلورة باللون الأزرق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الإيجابية لاختبار أحمر الأليزارين ل SF من الزراعة العضوية ، 400x. الرواسب الحمراء مرئية تحت الضوء المرسل (اللوحة اليسرى) والضوء المستقطب (اللوحة اليمنى) ، تكبير 400x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: درجة التهاب SF وفقا للعدد الإجمالي للكريات البيض. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: الألوان التي تعرضها بلورات جامعة ولاية ميشيغان و CPP تحت الضوء المستقطب المعوض وعلامات الانكسار. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الشكل التكميلي 1: الماصات المخففة للدم وفقا ل Malassez-Potain للكريات البيض. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: تخطيط شبكة الغرفة لعدد كرات الدم البيضاء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: شرائح ملطخة مسبقا وجاهزة للاستخدام لتقييم مورفولوجيا WBC التفاضلي السريع والسهل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: تلطيخ May-Grünwald-Giemsa لطاخة SF. حبيبات اليوزينيات مرئية بوضوح (السهم) ، تكبير 1000x. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 5: الخلايا الوحيدة والخلايا الزليلية التي تم جمعها من عينة SF. (أ) وحيدات من عينة SF تم جمعها من مريض مصاب بالفصال العظمي (1000x). (ب) الخلايا المتشابكة من عينة SF تم جمعها من مريض مصاب بالفصال العظمي (1000x). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الزراعة العضوية ، يساعد تحليل SF في تحديد خصائص المرض من خلال خطوات بسيطة: تعداد الكريات البيض الكلي والتفاضلي والبحث عن البلورات ، بما في ذلك CPP و BCP. علاوة على ذلك ، قد يسلط اكتشاف بلورات جامعة ولاية ميشيغان الضوء على الأمراض المصاحبة المهمة.
على الرغم من التكاليف المنخفضة والتنفيذ البسيط ، قد تتأثر حساسية الاختبارات وموثوقية النتائج بسبب المحللين عديمي الخبرة - خاصة فيما يتعلق بتحديد البلورة. يعد تدريب وخبرة المحلل أمرا بالغ الأهمية في التمييز بين شكل وانعكاس بلورات CPP و MSU ومطابقة شكلها مع درجة الانكسار. وقد أبلغت بعض الدراسات عن وجود تناقضات في تحديد البلورات بين المختبرات المختلفة. وبالتالي ، فإن تدريب فنيي المختبرات ضروري للحصول على نتائج موثوقة ومتسقة14. يتأثر التعرف على البلورات أيضا بالتفسير الخاطئ للجسيمات ثنائية الانكسار التي قد يتم الخلط بينها وبين البلورات المسببة للأمراض. قد تنبع هذه من مصادر خارجية (أي الغبار أو الألياف) أو قد تكون موجودة داخل تجويف المفصل (أي الكورتيكوستيرويدات أو الدهون). يمكن أن يؤدي التنظيف الشامل للشريحة إلى حل المشكلة الأولى ، ولكن لا يمكن التغلب على الأخيرة إلا من خلال التدريب والخبرة14.
هناك قيد آخر لتحليل SF يتعلق باستخدام تلطيخ أحمر أليزارين لتحديد BCP. كما ذكرنا سابقا ، هذا ليس اختبارا محددا ، وبالتالي يجب توخي الحذر عند تفسير النتائج. يجب أن يكون المحلل قادرا على التعرف على الرواسب الحمراء بمورفولوجيا غريبة (الشكل 11). يمكن استخدام تقنيات أكثر حساسية ، مثل المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ، لتحديد بلورات BCP ، لكنها لا تستخدم في الفحوصات الروتينية ل SF في الممارسة السريرية اليومية. الأهم من ذلك ، فقد ثبت أن النتائج التي تم الحصول عليها مع تلطيخ أحمر أليزارين تظهر توافقا جيدا ، وإن لم يكن مثاليا ، مع تلك التي تم الحصول عليها بواسطة SEM22 ، وبالتالي تعزيز قيمة السابق.
هناك قضية بارزة أخرى يجب مراعاتها فيما يتعلق بما يجب فعله عندما ينتج عن بزل المفصل كميات صغيرة جدا من SF وكيفية تخزين العينة. عندما يتم جمع بضع قطرات فقط من SF من المفاصل الصغيرة ، مثل المفاصل بين المفاصل والمشط والمعصم ، يوصى بالاحتفاظ بالمادة في المحقنة ونشرها مباشرة على شريحة زجاجية نظيفة. باستخدام micropipette وبعض الحيل ، من الممكن إعداد أكثر من شريحة واحدة وإجراء تحليل كامل. بالتفصيل ، يرسم المحلل SF مع ماصة العد من الشريحة المعدة للبحث عن الكريستال ويعد غرفة مقياس الدم ، في حين يمكن استنشاق بعض الميكرولتر للتلطيخ فوق الحيوي.
بقدر ما يتعلق الأمر بالتخزين ، تتحلل عينات SF بمرور الوقت ، ويتطلب تحليلها استعدادات جديدة للحصول على نتائج موثوقة. بدلا من ذلك ، يمكن الحفاظ على SF عند 4 درجات مئوية واستخدامه في غضون 24 ساعة ، وفي موعد لا يتجاوز 48 ساعة ، للفحص الخلوي. لتجنب تكتل الخلايا وتخثر SF ، يجب الانتباه إلى جمع العينة في أنبوب EDTA واحد على الأقل. يمكن استخدام عينات SF المجمدة المخزنة في -20 درجة مئوية لفترة أطول من الوقت فقط للبحث عن الكريستال.
تحليل SF هو اختبار مرضي لا يمكن الاستغناء عنه في أمراض الروماتيزم ، نظرا لفائدته وبساطة التنفيذ والقدرة على تحمل التكاليف. التحدي الرئيسي للتطبيقات المستقبلية لتحليل SF هو تشخيص أكثر دقة للأمراض الروماتيزمية. سيكون هذا ممكنا من خلال دمج هذه الطريقة مع تقنيات أكثر تقدما وابتكارا23 ، مما يجعل من الممكن توصيف تكوين SF وتحديد المؤشرات الحيوية الجزيئية المحددة والبروتينات في موقع الالتهاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يكشف جميع المؤلفين عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور ليوناردو بونزي على إرشاده الثمين في مجال تحليل السائل الزليلي ومستشفى جامعة بادوفا لدعمه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red S | Merck | A5533 | For BCP crystal search |
| Burker chamber | Merck | BR718905 | For total white blood cell count |
| Cover glasses | Merck | C7931 | For microscopic examination |
| EDTA tubes | BD | 368861 | For SF collection |
| Glass slides | Merck | S8902 | For crystal search |
| Lambda filter (compensator) | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Malassez-Potain pipette | Artiglass | 54830000 | For dilution of synovial fluid |
| Methylene blue solution | Merck | 3978 | For total white blood cell count |
| Polarized microscope | Leica, Nikon, others | Depending on the model and company | For complete synovial fluid analysis |
| Polarizing lens | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Testsimplet | Waldeck | 14386 | Supravital staining for cell differentiation |
References
- Cui, A., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29, 100587 (2020).
- Hunter, D. J., Bierma-Zeinstra, S.
- Mandell, B. F. Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis. , Springer. Cham. (2022).
- Schmerling, R. H. Guidelines for the initial evaluation of the adult patient with acute musculoskeletal symptoms. Arthritis & Rheumatism. 39 (1), 1-8 (1996).
- Coakley, G., et al. RCGP and BSAC guidelines for management of the hot swollen joint in adults. Rheumatology. 45 (8), 1039-1041 (2006).
- Frallonardo, P., et al. Basic calcium phosphate and pyrophosphate crystals in early and late osteoarthritis: relationship with clinical indices and inflammation. Clinical Rheumatology. 37 (10), 2847-2853 (2018).
- Nalbant, S., et al. Synovial fluid features and their relations to osteoarthritis severity: new findings from sequential studies. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 50-54 (2003).
- Fuerst, M., et al. Calcification of articular cartilage in human osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 60 (9), 2694-2703 (2009).
- Campillo-Gimenez, L., et al. Inflammatory potential of four different phases of calcium pyrophosphate relies on NF-κB activation and MAPK pathways. Frontiers in Immunology. 9, 2248 (2018).
- Pazár, B. Basic calcium phosphate crystals induce monocyte/macrophage IL-1β secretion through the NLRP3 inflammasome in vitro. The Journal of Immunology. 186 (4), 2495-2502 (2011).
- Martín, M. J. A., et al. Automated cell count in body fluids: a review. Advances in Laboratory Medicine. 2, 149-161 (2021).
- Seghezzi,, et al. Optimization of cellular analysis of synovial fluids by optical microscopy and automated count using the Sysmex XN body fluid mode. Clinica Chimica Acta. 462, 41-48 (2016).
- Reginato, A. J., Maldonado, I., Reginato, A. M., Falasca, G. F., O'Connor, C. R. Supravital staining of synovial fluid with Testsimplets. Diagnostic Cytopathology. 8 (2), 147-152 (1992).
- Lumbreras, B., et al. Analysis for crystals in synovial fluid: training of the analysts results in high consistency. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (4), 612-615 (2005).
- Tieng, A., Franchin, G.
- Punzi, L., Oliviero, F. Arthrocentesis and synovial fluid analysis in clinical practice: value of sonography in difficult cases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1154 (1), 152-158 (2009).
- Schumacher, H. R., Reginato, A. J. Atlas of Synovial Fluid Analysis and Crystal Identification. , Lea & Febiger. Philadelphia. (1991).
- Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A. Detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
- Oliviero, F., Punzi, L. Basics of Polarized Light Microscopy. Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis. , Springer. Cham. 79-90 (2022).
- Paul, H., Reginato, A. J., Schumacher, H. R. Alizarin red S staining as a screening test to detect calcium compounds in synovial fluid. Arthritis & Rheumatism. 26 (2), 191-200 (1983).
- Favero, M., et al. Synovial fluid fetuin-A levels in patients affected by osteoarthritis with or without evidence of calcium crystals. Rheumatology. 58 (4), 729-730 (2019).
- Frallonardo, P., et al. Detection of calcium crystals in knee osteoarthritis synovial fluid: a comparison between polarized light and scanning electron microscopy. Journal of Clinical Rheumatology. 22 (7), 369-371 (2016).
- Peffers, M. J., Smagul, A., Anderson, J. R. Proteomic analysis of synovial fluid: current and potential uses to improve clinical outcomes. Expert Review of Proteomics. 16 (4), 287-302 (2019).
