Summary
透射、偏振和补偿光学显微镜下的滑液分析用于通过简单的步骤评估样品的炎症或非炎症性质。在骨关节炎中，检测钙晶体和识别更严重的骨关节炎亚群特别有用。
Abstract
滑液 （SF） 分析对于诊断骨关节炎 （OA） 很重要。宏观和微观特征，包括总白细胞和分类白细胞 （WBC） 计数，有助于确定 SF 的非炎症性质，这是 OA 的标志。在OA患者中，SF样本中的WBC通常不超过每微升2000个细胞，并且炎症细胞（如中性粒细胞）的百分比非常低或不存在。钙晶体常见于从OA患者收集的SF。尽管它们在OA发病机制中的作用尚不清楚，但它们与轻度炎症过程和更严重的疾病进展有关。最近，钙晶体在OA的早期和晚期都有描述，表明它们可能在诊断OA的不同临床亚群和药物治疗中发挥重要作用。OA中SF分析的总体目标是双重的：确定SF的非炎症程度和突出钙晶体的存在。
Introduction
骨关节炎 （OA） 是一种复杂的多因素慢性关节疾病，估计 15 岁及以上受试者的全球综合患病率为 16%，40 岁及以上受试者的汇总患病率为 23%。由于人口老龄化和肥胖和代谢综合征等危险因素的增加，OA的发病率预计将增加2。
与OA相关的主要问题包括在早期阶段诊断疾病的困难，以及目前可用的治疗方法仅限于疼痛管理和症状性慢效药物（SYSADOA），如糖胺聚糖。骨关节炎的诊断基于临床症状和影像学表现。然而，两项评估之间缺乏相关性可能导致OA诊断和治疗开始延迟数年2。OA的特征是退行性过程和低度炎症，可以通过滑液（SF）分析 轻松 研究。SF是一种富含透明质酸的粘性血浆透析液，可润滑关节空间，为软骨提供营养和氧气，并清除代谢废物。SF还充当减震器，从而在应力和应变期间保护接头3。
SF分析是一种简单可靠的方法，在对有肌肉骨骼症状和关节积液的患者进行初始评估时必须始终进行3。美国风湿病学会、英国风湿病学会等的建议包括 SF 分析，包括风湿性疾病诊断测试，必须主要在评估急性单关节炎时进行4，5。从SF分析中获得的总白细胞计数和差异白细胞计数提供了关节中发生的病理过程的快照，从而对炎症程度进行分类。在偏振光下鉴定致病晶体，例如尿酸单钠 （MSU） 和焦磷酸钙 （CPP） 晶体，对于晶体性关节炎（例如痛风和假痛风）的诊断和治疗至关重要。此外，微生物的存在提示化脓性关节炎的诊断。
钙晶体在OA6患者采集的样本中很常见。据报道，在 OA6 患者的约 22% 和 23% 的 SF 样本中分别存在碱式磷酸钙 （BCP） 晶体和 CPP。虽然它们的作用尚不清楚，但这些晶体与更严重的OA7 形式有关，并且被认为是病理过程本身的附带现象。在接受膝关节置换术的OA患者的组织样本中100%检测到钙晶体8。此外，据推测，钙晶体可能因其炎症作用而参与OA的发病机制，几项研究9 证明了这一点，并且至少部分介导了NLRP3炎症小体10。
最近，钙晶体在OA的早期和晚期6中都有描述，表明它们可能在诊断OA 的不同临床亚群和药物治疗中发挥重要作用。
SF分析的总体目标是双重的：确定SF的炎症程度，并通过鉴定特定的晶体或微生物来诊断晶体或化脓性关节炎。它是诊断OA的一种特别有用，简单和可靠的工具，因为典型的非炎症模式，中性粒细胞的百分比非常低或没有。
相对于替代技术的优势
SF分析包括简单的程序，包括总白细胞计数和差异白细胞计数以及晶体搜索。由专业实验室技术人员进行的手动细胞计数3，11 仍然是滑液和其他体液细胞学分析的黄金标准。然而，由于该方法的时间限制以及观察者之间和观察者内部的可变性，自动细胞计数仪已逐渐取代大型常规临床实验室中的手动计数，其中血液和尿液分析仪已被调整为SF分析11，12。然而，手动计数在特定环境中具有一些优势：（1）在门诊中，按时获得总和差异WBC值;（2）识别自动计数器无法识别的细胞类型，例如噬细胞单核（Reiter）细胞或滑膜细胞等非造血细胞;（3）当样品太小而无法用仪器处理时;（4） 建立易于用于研究目的的本地实验室登记册。手动计数的另一个优点是活体上染色，这种方法可以在载玻片制备后立即非常快速地分化细胞。相比之下，传统的染色，如Wright和May-Grünwald-Giimsa程序，需要风干的SF涂片和时间来染色细胞13。虽然不适合时间敏感的常规分析，但这些染色方法揭示了样品中更详细的细胞群，包括红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、多形核白细胞、淋巴细胞和血小板。
最后，使用基于偏振光显微镜的简单技术对晶体进行常规SF分析，该技术可提供快速结果14。替代方法，如扫描和电子显微镜，产生更准确和灵敏的结果，但由于成本高且耗时的样品制备和分析，它们在日常临床实践中的使用是不可行的。
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Protocol
本协议符合帕多瓦大学医院伦理委员会的指导方针。SF是在患者同意下从接受治疗性关节穿刺术的患者的膝关节中收集的，以便在他们首次到诊所就诊时或对关节炎发作做出反应。该手术的禁忌症是：凝血功能障碍，抗凝药物，皮肤病变，皮炎或关节上的蜂窝织炎。所有SF样品均已去识别化。
1.滑液准备
- 将肿胀关节15 关节穿刺术期间收集的SF样品转移到含有抗凝剂（最好是EDTA;参见 材料表）的管中，并转移到不含添加剂的第二管中（图1）。
- 在疑似感染病例中，无菌将部分SF样品（~1mL）转移到培养瓶中进行微生物检测。
注意：由于临床特征（严重肿瘤，多洛尔，卡路里，功能laesa，有时发热）和SF的宏观外观（浑浊，颜色），可以怀疑感染。在这种情况下，医生开出微生物分析，由微生物实验室进行。 - 收集样品后立即进行SF分析（步骤2-5）。
2. 宏观检查
注意：SF样品的宏观评估包括主观，定性和半定量评估。没有参考标准秤，也没有使用对照样品。
- 注释以毫升表示的SF体积。定义样本的颜色，范围可以从浅黄色到深黄色。记录血液的存在。
- 通过观察背光中的样品并确定通过流体管读取打印页面的难易程度来定义清晰度（图2A）。
- 通过从一次性移液器滴下样品来评估粘度。长串或液滴形成分别表示粘度良好或较差（图2B）。
- 通过观察试管和背光中的样品，评估颗粒材料（包括组织碎片或纤维蛋白）的存在。
3. 显微镜检查
注意：SF显微镜分析包括细胞学检查，包括总和分类白细胞（WBC）计数以及寻找晶体。
- 按照以下步骤确定总细胞计数。
- 使用血细胞计数器确定EDTA管中收集的SF中白细胞的总数（参见 材料表）。
- 使用 Malassez-Potain 移液管从 EDTA 管中吸取 0.5 μL SF（标记 0.5;参见 材料表）（补充图 1）。使用相同的移液器，吸取 9.5 μL 0.1% 亚甲蓝溶液（标记 11）。最终稀释度为20倍。
- 通过轻轻倒置混合移液器，丢弃第一滴，然后将滑液+亚甲蓝溶液倒入计数室中。
- 从九个中计算两个连续正方形中的单元格，然后将获得的数字乘以 100（简化公式; 补充图2）。将白细胞表示为每立方毫米的白细胞数量。
注意：简化公式：白细胞（N /mm 3）=两个连续平方中的计数细胞数x 100。 - 根据先前发表的报告16，17，根据 WBC的总数对SF进行分类（表1）。
- 执行差异细胞计数。
- 使用活体上或传统染色确定多形核 （PMN） 细胞、单核细胞和淋巴细胞的百分比13，18。
- 对于活体上染色，将一小滴SF放在预涂有甲酚紫和亚甲蓝的即用型载玻片的中心（补充图3;见 材料表）。
- 盖上盖玻片，并放置一滴显微镜浸油。
- 准备风干的SF涂片用于传统染色（不太适合常规分析）。在干净的幻灯片末端放一小滴SF。使用第二张载玻片或盖玻片，沿载玻片向前移动。让涂抹物风干。
- 根据标准的May-Grünwald-Giimsa程序对样品进行染色18。
- 检查油浸物镜（1，000x）下的滑块。
- 计数100个连续细胞并区分多形核细胞，单核细胞和淋巴细胞（图3， 补充图4）。
- 以百分比表示每个类别中的总数。
注意：为了获得准确的结果，必须在收集SF后立即或在正确储存（4°C）的关节穿刺术后24-48小时内进行细胞学检查。
4. 晶体检测
- 使用配备有附加偏振滤光片和红色补偿器19 的偏振光显微镜确定病理晶体的存在（参见 材料表）。
- 进行玻片制备以进行晶体检测。
- 用光学纸或吸收乙醇的软纸仔细清洁载玻片。在载玻片上滴一小滴SF。
- 盖上盖玻片并将载玻片放在显微镜下。
- 识别晶体。
- 使用低倍放大镜将载玻片聚焦在显微镜下。用40倍物镜在明场下仔细检查载玻片。查看细胞内外。
- 根据晶体的大小和形状（例如菱形、针状、杆状）识别晶体。
- 在光源和标本之间插入偏振滤光片。旋转偏振片，直到其光轴垂直于分析仪（放置在物镜上方）以创建深色背景。
- 一旦确定了双折射晶体，将补偿器插入偏振器和试样之间，并将其平行或垂直于晶体的光轴移动。
- 观察晶体显示的颜色（表2）。
注意：MSU晶体在暗场中呈针状，明亮的双折射，当它们的轴平行于补偿器时显示黄色/橙色。相反，当垂直放置时，它们是蓝色的（负号）（表2; 图4）。CPP晶体是棒状或菱形晶体，在偏振光下弱双折射，当它们分别平行或垂直于补偿器轴线（正号）对齐时显示蓝色或黄色（表2; 图5）。
5.茜素红染色
- 制备2%的茜素红S（pH 4.1-4.3）溶液，通过0.22μm过滤器过滤溶液，并避光保存。
- 为了准备载玻片，在干净的载玻片上将一滴SF与相同体积的茜素红溶液（1：1）混合。盖上盖玻片，以400倍放大倍率检查。
- 在显微镜下识别晶体。
注意：当在透射光下可见明亮的深红色沉淀物时，测试呈阳性，呈圆形和同心层。在偏振光下，它们出现强烈的双折射20（图6）。
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Representative Results
受OA影响的大关节经常肿胀并产生大量的SF，这些SF通过关节穿刺术 引 流15。关节穿刺术后立即评估的SF的宏观特征主要包括数量，颜色，清晰度和粘度17。尽管它们的特异性低，但它们提供了关于炎症程度的初步数据。颜色取决于SF细胞和细胞外基质大分子的碎裂程度。从OA患者收集的SF为淡黄色，这种阴影通常与非炎症样本有关，而深黄色与炎性积液有关（图2）。例如，由于毛细血管破裂，样本中存在少量血液，导致略带橙色。必须仔细考虑血性积液，因为它们可能提示潜在的关节积血。清晰度是从OA患者身上收集SF的标志。事实上，与炎性SF的浑浊外观不同，非炎性SF在细胞，碎片，透明质酸和纤维蛋白碎片中较差（图2）。
粘度代表良好的炎症指数，因为它与基质大分子（主要是透明质酸）的完整性有关（图2）。这些分子在炎症期间解聚，导致SF粘度降低。 根据疾病阶段和严重程度，OA的粘度可能会保留或略有降低。
OA中白细胞的数量永远不会超过500-1，000个细胞/ mm3，并且它们主要是单核细胞（补充图5A）和其他单核细胞，如滑膜细胞（补充图5B）。OA SF中最相关和最常见的发现之一涉及CPP和BCP晶体。CPP晶体在补偿偏振光显微镜下很容易检测到（图5），而BCP晶体的鉴定由于其亚微观尺寸而变得更加困难（图6）。事实上，单个BCP晶体的长度小于1μm，尽管这些晶体形成聚集体，但团块显示为非双折射无定形小球。虽然是非特异性的，但茜素红染色阳性通常显示BCP晶体的存在。
与假痛风相反，其中CPP晶体数量众多，并且与高白细胞计数和炎症临床特征相关，在OA中，SF中CPP晶体的数量非常低，并且与任何改变的体液反应无关。然而，与没有晶体的OA相比，具有CPP或BCP晶体的SF样品显示出更高水平的炎性细胞因子21。无论白细胞计数如何，具有晶体的SF也与PMN细胞百分比增加有关5。从临床角度来看，钙晶体与炎症之间的关系可能有助于确定患更严重疾病风险增加的特定患者亚群。
图1：肿胀膝盖的关节抽吸 。 （A）关节穿刺术是在用无菌材料对皮肤进行准确消毒后进行的。SF收集在（B）EDTA管中用于总细胞计数，（C）无添加管中用于差异细胞计数和晶体搜索。 请点击此处查看此图的大图。
图2：炎症（左）和非炎症（右）SF样品的特征。 （A）炎症（左）和非炎症（右）SF样品的颜色和清晰度。（B）通过“字符串”测试评估的非炎症SF的粘度。实验室评估由注射器或移液器中落下的SF液滴形成的“绳子”的长度。图片中的示例生成一个长字符串。请点击此处查看此图的大图。
图 3：在预染色载玻片中观察到的 SF 细胞。 （A）一组具有多叶细胞核和两个单核细胞的多形核（PMN）细胞，其庞大的细胞核位于图像的右下方。（B）PMN细胞和单核细胞（M），图像中心有一个噬细胞（CPM）细胞。明场;1，000 倍放大倍率。 请点击此处查看此图的大图。
图4：细胞内MSU晶体。 晶体形成典型的针状形状，如（A）透射光，（B）偏振光和（C）补偿偏振光（400x）所示。箭头表示 λ 滤波器（补偿器）的方向，它平行于晶体的长轴。在这种配置中，晶体呈现黄色/橙色。 请点击此处查看此图的大图。
图5：细胞内CPP晶体。 晶体显示在（A）透射光，（B）偏振光和（C）补偿光（400x）下。箭头表示 λ 滤波器（补偿器）的方向，它平行于晶体的长轴。在这种配置中，晶体显示为蓝色。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：来自 OA 的 SF 的茜素红测试阳性，400x。 在透射光（左图）和偏振光（右图）下可见红色沉淀物，400倍放大倍率。 请点击此处查看此图的大图。
表1：根据白细胞总数的SF炎症程度。请按此下载此表格。
表2：MSU和CPP晶体在补偿偏振光和双折射迹象下表现出的颜色。请按此下载此表格。
补充图1：根据Malassez-Potain对白细胞的血液稀释移液器。请点击此处下载此文件。
补充图2：白细胞计数腔室网格的布局。请点击此处下载此文件。
补充图3：预染色的即用型载玻片，用于快速简便的分类WBC形态评估。请点击此处下载此文件。
补充图4：SF涂片的May-Grünwald-Giimsa染色。 嗜酸性粒细胞清晰可见（箭头），放大倍数为1，000倍。 请点击此处下载此文件。
补充图5：从SF样品中收集的单核细胞和滑膜细胞。 （A）从骨关节炎患者收集的SF样本中的单核细胞（1，000x）。（B）从骨关节炎患者收集的SF样本中的滑膜细胞（1，000x）。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在OA中，SF分析通过简单的步骤帮助确定疾病特征：白细胞总数和差异白细胞计数以及搜索晶体，包括CPP和BCP。此外，MSU 晶体的检测可能突出重要的合并症。
尽管成本低且执行简单，但由于分析师经验不足，测试的敏感性和结果的可靠性可能会受到影响 - 主要是因为它与晶体鉴定有关。分析师的培训和经验对于区分CPP和MSU晶体的形状和双折射以及将其形状与其双折射程度相匹配至关重要。一些研究报告了不同实验室之间的晶体鉴定差异;因此，培训实验室技术人员对于获得可靠和一致的结果至关重要14.晶体鉴定也受到双折射粒子的误解的影响，这些双折射粒子可能与致病晶体混淆。这些可能来自外部来源（即灰尘或纤维），也可能存在于关节腔内（即皮质类固醇或脂质）。彻底清洁载玻片可以解决前者，但后者只能通过培训和经验来克服14.
SF分析的另一个局限性涉及使用茜素红染色进行BCP鉴定。如前所述，这不是一个特定的测试，因此在解释结果时必须谨慎。分析人员必须能够识别具有特殊形态的红色沉淀物（图11）。更灵敏的技术，如扫描电子显微镜（SEM），可用于识别BCP晶体，但它们不用于日常临床实践中SF的常规检查。重要的是，已经表明，用茜素红染色获得的结果显示出与SEM22获得的结果良好（尽管不是最佳的）一致性，从而增强了前者的价值。
另一个需要考虑的突出问题是，当关节穿刺术产生非常少量的SF时该怎么做以及如何储存样本。当仅从小关节（例如腕间和掌指关节以及手腕）收集几滴SF时，建议将材料保存在注射器中并将其直接铺在干净的载玻片上。使用微量移液器和一些技巧，可以准备多个载玻片并进行完整的分析。详细地说，分析人员使用计数移液管从准备用于晶体搜索的载玻片中抽取SF，并准备血细胞计数器室，而可以吸出一些微升用于活体上染色。
就储存而言，SF样品会随着时间的推移而降解，其分析需要新的制备才能获得可靠的结果。或者，SF可以在4°C下保存，并在24小时内使用，不迟于48小时用于细胞学检查。为避免细胞结块和SF凝血，必须注意将标本收集在至少一个EDTA管中。在-20°C下储存较长时间的冷冻SF样品只能用于晶体搜索。
SF分析是风湿病学中不可替代的病理学测试，因为它具有实用性，执行简单性和可负担性。SF分析未来应用的主要挑战是更准确地诊断风湿性疾病。通过将该方法与更先进和创新的技术相结合，这将成为可能23，从而可以表征SF组成并鉴定炎症部位的特定分子生物标志物和蛋白质组学。
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Disclosures
所有作者均未披露任何利益冲突。
Acknowledgments
作者希望感谢Leonardo Punzi教授在滑液分析领域的宝贵指导以及帕多瓦大学医院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red S | Merck | A5533 | For BCP crystal search |
| Burker chamber | Merck | BR718905 | For total white blood cell count |
| Cover glasses | Merck | C7931 | For microscopic examination |
| EDTA tubes | BD | 368861 | For SF collection |
| Glass slides | Merck | S8902 | For crystal search |
| Lambda filter (compensator) | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Malassez-Potain pipette | Artiglass | 54830000 | For dilution of synovial fluid |
| Methylene blue solution | Merck | 3978 | For total white blood cell count |
| Polarized microscope | Leica, Nikon, others | Depending on the model and company | For complete synovial fluid analysis |
| Polarizing lens | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Testsimplet | Waldeck | 14386 | Supravital staining for cell differentiation |
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