Summary
ניתוח נוזל סינוביאלי תחת מיקרוסקופ אור מועבר, מקוטב ומפוצה משמש להערכת האופי הדלקתי או הלא דלקתי של דגימה באמצעות צעדים פשוטים. זה שימושי במיוחד בדלקת מפרקים ניוונית כדי לזהות גבישי סידן ולזהות תת-קבוצה חמורה יותר של דלקת מפרקים ניוונית.
Abstract
ניתוח נוזל סינוביאלי (SF) חשוב באבחון דלקת מפרקים ניוונית (OA). מאפיינים מקרוסקופיים ומיקרוסקופיים, כולל ספירה כוללת ודיפרנציאלית של תאי דם לבנים (WBC), עוזרים להגדיר את האופי הלא דלקתי של SF, שהוא סימן ההיכר של OA. בחולים עם OA, WBC בדגימות SF בדרך כלל אינו עולה על 2000 תאים למיקרוליטר, ואחוז התאים הדלקתיים, כגון נויטרופילים, נמוך מאוד או נעדר. גבישי סידן שכיחים ב- SF שנאספו מחולי OA. למרות שתפקידם בפתוגנזה של OA נותר לא ברור, הם נקשרו לתהליך דלקתי קל ולהתקדמות מחלה חמורה יותר. לאחרונה, גבישי סידן תוארו הן בשלבים המוקדמים והן בשלבים המאוחרים של OA, מה שמצביע על כך שהם עשויים למלא תפקיד חיוני באבחון תת-קבוצות קליניות שונות של OA וטיפול תרופתי. המטרה הכוללת של ניתוח SF ב- OA היא כפולה: לוודא את הדרגה הלא דלקתית של SF ולהדגיש את נוכחותם של גבישי סידן.
Introduction
דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלת מפרקים כרונית מורכבת ורב-גורמית, עם שכיחות עולמית מאוגדת של 16% בנבדקים בני 15 ומעלה, ו-23% בנבדקים בני 40ומעלה. התחלואה ב-OA צפויה לעלות עקב הזדקנות האוכלוסייה ועלייה בגורמי סיכון, כגון השמנת יתר ותסמונת מטבולית2.
בין הבעיות העיקריות הקשורות ל- OA הם הקושי באבחון המחלה בשלביה המוקדמים והטיפולים הזמינים כיום המוגבלים לניהול כאב ותרופות סימפטומטיות איטיות (SYSADOAs) כגון גליקוזאמינוגליקנים. האבחנה של OA מבוססת על תסמינים קליניים וממצאי הדמיה. עם זאת, חוסר המתאם בין שתי ההערכות עלול לגרום לעיכוב של שנים באבחון OA ובהתחלת הטיפול2. OA מאופיין בתהליכים ניווניים ודלקת בדרגה נמוכה, אשר ניתן לחקור בקלות באמצעות ניתוח נוזל סינוביאלי (SF). SF הוא דיאליזה פלסמטית צמיגה עשירה בחומצה היאלורונית, המשמנת את חלל המפרק, מספקת חומרים מזינים וחמצן לסחוס ומסירה פסולת מטבולית. SF פועל גם כבולם זעזועים, ובכך מגן על המפרקים במהלך מתחומתח 3.
ניתוח SF הוא שיטה פשוטה ואמינה כי תמיד חייב להתבצע במהלך ההערכה הראשונית של חולים עם סימפטומים שריר ושלד ו השתפכות משותפת3. המלצות של המכללה האמריקאית לראומטולוגיה, האגודה הבריטית לראומטולוגיה ואחרים כוללות ניתוח SF בין בדיקות האבחון למחלות ראומטיות שיש לבצע בעיקר בהערכת דלקת מפרקים חריפה 4,5. ספירת לויקוציטים כוללת ודיפרנציאלית המתקבלת מניתוח SF מספקת תמונת מצב של התהליך הפתולוגי המתרחש במפרק, ובכך מסווגת את מידת הדלקת. זיהוי גבישים פתוגניים, כגון גבישי מונוסודיום אוראט (MSU) וסידן פירופוספט (CPP), תחת אור מקוטב, חיוני לאבחון וטיפול בדלקת מפרקים גבישית (למשל, שיגדון ופסאודוגאוט). יתר על כן, נוכחותם של מיקרואורגניזמים מצביעה על אבחנה של דלקת מפרקים ספיגה.
גבישי סידן שכיחים בדגימות שנאספו מחולים עם OA6. גבישי סידן פוספט בסיסיים (BCP) ו-CPP דווחו בכ-22% ו-23% מדגימות SF, בהתאמה, מחולים עם OA6. למרות שתפקידם נותר לא ברור, גבישים אלה נקשרו לצורות חמורות יותר של OA7 ונחשבים לאפיתופעה של התהליך הפתולוגי עצמו. גבישי סידן התגלו ב-100% מדגימות הרקמה של חולי OA שעברו החלפת ברך8. יתר על כן, הועלתה השערה כי גבישי סידן עשויים להיות מעורבים בפתוגנזה של OA בשל ההשפעות הדלקתיות שלהם, שהודגמו על ידי מספר מחקרים9 ותווך, לפחות בחלקו, על ידי NLRP3 inflammasome10.
לאחרונה, גבישי סידן תוארו הן בשלב מוקדם והן בשלבים מאוחרים6 של OA, מה שמצביע על כך שהם עשויים למלא תפקיד חיוני באבחון תת-קבוצות קליניות שונות של OA וטיפול תרופתי.
המטרה הכוללת של ניתוח SF היא כפולה: לקבוע את מידת הדלקת של SF ולאבחן דלקת מפרקים גבישית או ספטית על ידי זיהוי גבישים או מיקרואורגניזמים ספציפיים. זהו כלי שימושי, פשוט ואמין במיוחד באבחון OA, בשל דפוס לא דלקתי טיפוסי עם אחוז נמוך מאוד או היעדר נויטרופילים.
יתרונות על פני טכניקות חלופיות
ניתוח SF מורכב מהליכים פשוטים הכוללים ספירת לויקוציטים כוללת ודיפרנציאלית וחיפוש גבישי. ספירת תאים ידנית המבוצעת על ידי טכנאי מעבדה מומחים 3,11 נותרה תקן הזהב לניתוח ציטולוגי של נוזלי גוף סינוביאליים ואחרים. עם זאת, בשל מגבלת הזמן והשונות הבין-צופה והתוך-צופה של שיטה זו, מוני תאים אוטומטיים החליפו בהדרגה את הספירה הידנית במעבדות קליניות שגרתיות גדולות שבהן הותאמו מנתחי דם ושתן כדי לאפשר ניתוח SF11,12. עם זאת, ספירה ידנית מציגה כמה יתרונות בהגדרות ספציפיות: (1) באמבולטורי, כדי לקבל ערך WBC כולל ודיפרנציאלי בזמן; (2) לזהות סוגי תאים כגון תאים חד-גרעיניים ציטופגוציטיים (רייטר) או תאים לא המטופויטיים כגון סינוביוציטים, שמונים אוטומטיים אינם יכולים לזהות; (3) כאשר הדגימה קטנה מכדי שניתן יהיה לטפל בה על ידי המכשיר; (4) ליצור רישומי מעבדות מקומיים שיהיו נגישים בקלות למטרות מחקר. יתרון נוסף של ספירה ידנית הוא צביעה בלתי נתפסת, שיטה המאפשרת התמיינות של תאים במהירות רבה ומיד לאחר הכנת מגלשת זכוכית. לעומת זאת, כתמים מסורתיים, כגון הליכי רייט ומאי-גרינוולד-גימסה, דורשים מריחות SF מיובשות באוויר וזמן להכתים את התאים13. למרות שאינן מתאימות לניתוחים שגרתיים תלויי זמן, שיטות צביעה אלה חושפות אוכלוסיות תאים מפורטות יותר בדגימה, כולל אריתרוציטים, בזופילים, אאוזינופילים, לויקוציטים פולימורפוגרעיניים, לימפוציטים וטסיות דם.
לבסוף, ניתוח SF שגרתי עבור גבישים מבוצע בטכניקה פשוטה המבוססת על מיקרוסקופ אור מקוטב, המספק תוצאות מהירות14. שיטות חלופיות, כגון סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים, מניבות תוצאות מדויקות ורגישות יותר, אך השימוש בהן בפרקטיקה הקלינית היומיומית אינו אפשרי בשל עלויות גבוהות והכנת דגימה וניתוח גוזלים זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי תואם את הנחיות ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי פדובה. SF נאסף בהסכמת המטופל ממפרקי הברך של חולים שקיבלו ארתרוסנטזיס טיפולי לשיוף מפרקים בהצגתם הראשונית למרפאה או בתגובה להתלקחות דלקת פרקים. התוויות נגד להליך היו: קרישת דם, תרופות נוגדות קרישה, נגעים בעור, דרמטיטיס או צלוליטיס מעל המפרק. כל דגימות SF לא זוהו.
1. הכנת נוזל סינוביאלי
- העבירו את דגימות SF שנאספו במהלך ארתרוסנטזיס של מפרקיםנפוחים 15 לתוך צינור המכיל נוגדי קרישה (רצוי EDTA; ראו טבלת חומרים) ולצינור שני שאינו מכיל תוסף (איור 1).
- במקרים חשודים של זיהום, יש להעביר חלק מדגימת SF (~ 1 מ"ל) לבקבוקי תרבית לצורך בדיקה מיקרוביולוגית.
הערה: ניתן לחשוד בזיהום כתוצאה הן ממאפיינים קליניים (גידול חמור, דולר, קלור, functio laesa, ולעיתים חום) והן ממראה מקרוסקופי של SF (עכירות, צבע). במקרה זה, הרופא קובע ניתוח מיקרוביולוגי, המבוצע על ידי מעבדה מיקרוביולוגית. - בצע ניתוח SF (שלבים 2-5) ברגע שהדגימה נאספת.
2. בדיקה מקרוסקופית
הערה: הערכה מקרוסקופית של דגימות SF מורכבת מהערכות סובייקטיביות, איכותיות וכמותיות למחצה. אין סולמות סטנדרטיים ייחוס, ולא נעשה שימוש בדגימות בקרה.
- הוסף ביאורים לנפח SF המתבטא במיליליטרים. הגדירו את צבע הדגימה, שיכול לנוע בין צהוב בהיר לצהוב כהה. רשום את נוכחות הדם.
- הגדירו את מידת הבהירות על-ידי התבוננות בדגימה בתאורה האחורית וקביעת קלות הקריאה של דף מודפס דרך צינור הנוזל (איור 2A).
- להעריך את הצמיגות על ידי טפטוף הדגימה פיפטה חד פעמית. היווצרות מיתר או טיפה ארוכה מצביעה על צמיגות טובה או ירודה, בהתאמה (איור 2B).
- להעריך את נוכחותם של חומרים חלקיקיים, כולל שברי רקמות או פיברין, על ידי התבוננות בדגימה דרך הצינור ובתאורה האחורית.
3. בדיקה מיקרוסקופית
הערה: הניתוח המיקרוסקופי SF מורכב מבדיקה ציטולוגית, כולל ספירה כוללת ודיפרנציאלית של תאי דם לבנים (WBC) וחיפוש אחר גבישים.
- קבע את ספירת התאים הכוללת לפי השלבים הבאים.
- לקבוע את המספר הכולל של לויקוציטים ב- SF שנאסף בצינור EDTA באמצעות hemocytometer (ראה טבלה של חומרים).
- ציירו 0.5 μL של SF מצינור EDTA באמצעות פיפטה Malassez-Potain (סימון 0.5; ראו טבלת חומרים) (איור משלים 1). עם אותה פיפטה, ציירו 9.5 μL של תמיסה כחולה 0.1% מתילן (סימן 11). הדילול הסופי הוא פי 20.
- מערבבים את הפיפטה בהיפוך עדין, משליכים את הטיפות הראשונות ויוצקים את הנוזל הסינוביאלי + תמיסה כחולה מתילן לתא הספירה.
- ספור את התאים בשני ריבועים עוקבים מתוך תשעה, והכפל את המספר המתקבל ב- 100 (נוסחה פשוטה; תרשים משלים 2). אקספרס WBCs כמספר לויקוציטים למילימטר מעוקב.
הערה: נוסחה פשוטה: לויקוציטים (N/mm3) = מספר התאים שנספרו בשני ריבועים עוקבים x 100. - סווג את SF לפי המספר הכולל של WBCs בעקבות דוחות שפורסמו בעבר16,17 (טבלה 1).
- בצע ספירת תאים דיפרנציאלית.
- קבע את אחוז התאים הפולימורפוגרעיניים (PMN), מונוציטים ולימפוציטים באמצעות צביעה על-חיונית או מסורתית13,18.
- עבור צביעה על-חיונית, הניחו טיפה אחת קטנה של SF במרכז שקופית מוכנה לשימוש המצופה מראש בסגול קרסיל ובכחול מתילן (איור משלים 3; ראו טבלת חומרים).
- מכסים בכיסוי, ומניחים טיפה של שמן טבילה במיקרוסקופ.
- הכינו משטח SF מיובש באוויר לכתמים מסורתיים (פחות מתאים לניתוח שגרתי). שים טיפה קטנה של SF בסוף שקופית נקייה. באמצעות שקופית שנייה או החלקת כיסוי, פרוש אותה לאורך השקופית בתנועה קדימה. תנו למריחה להתייבש באוויר.
- מכתימים את הדגימה לפי נוהל מאי-גרינוולד-גימסהסטנדרטי 18.
- בדוק את השקופית מתחת למטרה טבילת שמן (1,000x).
- ספרו 100 תאים עוקבים והבחינו בין תאים פולימורפו-גרעיניים, מונוציטים ולימפוציטים (איור 3, איור משלים 4).
- בטא את המספר הכולל בכל קטגוריה באחוזים.
הערה: כדי להשיג תוצאות מדויקות, בדיקות ציטולוגיות חייבות להתבצע ברגע SF נאסף או בתוך 24-48 שעות של arthrocentesis כאשר מאוחסן כראוי (4 ° C).
4. זיהוי קריסטלים
- לקבוע את נוכחותם של גבישים פתולוגיים באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב מצויד מסנן מקטב נוסף ומפצה אדום19 (ראה טבלת חומרים).
- בצע הכנת שקופיות לזיהוי קריסטלים.
- נקו בזהירות שקופית זכוכית עם נייר אופטי או נייר רך טבול באתנול. החל טיפה קטנה של SF על מגלשת הזכוכית.
- מכסים בכיסוי ומניחים את המגלשה מתחת למיקרוסקופ.
- זהה את הגבישים.
- מקדו את השקופית מתחת למיקרוסקופ באמצעות מטרת הגדלה בהספק נמוך. בחן בזהירות את השקופית מתחת לשדה בהיר עם מטרה של 40x. הסתכלו פנימה והחוצה על התאים.
- זהה את הגבישים על פי גודלם וצורתם (למשל, רומבואידים, בצורת מחט, בצורת מוט).
- הכניסו את המסנן המקטב בין מקור האור לדגימה. סובבו את המקטב עד שהציר האופטי שלו מאונך לאנלייזר (ממוקם מעל המטרות) ליצירת רקע כהה.
- לאחר זיהוי גביש דו-צדדי, הכניסו את המפצה בין המקטב לדגימה והזיזו אותו במקביל או בניצב לציר האופטי של הגביש.
- התבוננו בצבע שהגביש מגלה (טבלה 2).
הערה: גבישי MSU מופיעים בצורת מחט, דו-צדדיים בהירים בשדה הכהה, ומציגים צבע צהוב/כתום כאשר צירם מקביל למפצה. לעומת זאת, הם כחולים כאשר הם ממוקמים בניצב (סימן שלילי) (טבלה 2; איור 4). גבישי CPP הם גבישים דמויי מוט או רומבואיד, דו-צדדיים חלשים תחת אור מקוטב, ומציגים צבע כחול או צהוב כאשר הם מיושרים במקביל או בניצב לציר המפצה (סימן חיובי), בהתאמה (טבלה 2; איור 5).
5. כתמים אדומים של אליזרין
- הכינו תמיסה של 2% אליזרין אדום S (pH 4.1-4.3), סננו את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, ואחסנו אותה הרחק מאור.
- להכנת השקופית, ערבבו טיפה של SF עם אותו נפח של תמיסה אדומה אליזרין (1:1) על שקופית נקייה. מכסים בכיסוי ובודקים בהגדלה של פי 400.
- זהו את הגבישים מתחת למיקרוסקופ.
הערה: הבדיקה חיובית כאשר משקעים בהירים בצבע אדום כהה נראים תחת אור משודר, עם צורה עגולה ושכבות קונצנטריות. תחת אור מקוטב הם נראים דו-צדדיים חזקים20 (איור 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מפרקים גדולים המושפעים על ידי OA הם לעתים קרובות נפוחים לייצר כמויות משמעותיות של SF, אשר מנוקזים באמצעות arthrocentesis15. המאפיינים המקרוסקופיים של SF המוערכים מיד לאחר arthrocentesis כוללים למעשה את הכמות, צבע, בהירות, צמיגות17. למרות הספציפיות הנמוכה שלהם, הם מספקים נתונים ראשוניים על מידת הדלקת. הצבע תלוי בתאיות SF ובמידת הפיצול של מקרומולקולות מטריצה חוץ-תאיות. SF שנאסף ממטופלים עם OA הוא צהוב בהיר, גוון שבדרך כלל קשור לדגימות לא דלקתיות, בעוד שצהוב כהה קשור להתפרצויות דלקתיות (איור 2). נוכחות של כמויות קטנות של דם בדגימה, למשל, עקב קרעים נימיים, גורמת לצבע כתום מעט. יש לשקול בזהירות השתפכות מדממת מכיוון שהיא עשויה להצביע על המרתרוזיס פוטנציאלי. בהירות היא סימן ההיכר של SF שנאסף מחולים עם OA. למעשה, SF לא דלקתי הוא עני בתאים, פסולת, חומצה היאלורונית ושברי פיברין, בניגוד למראה העכור של SF דלקתי (איור 2).
צמיגות מייצגת מדד דלקתי טוב מאחר שהיא קשורה לשלמות של מקרומולקולות מטריצה, בעיקר חומצה היאלורונית (איור 2). מולקולות אלה עוברות דה-פולימריזציה במהלך דלקת, וכתוצאה מכך SF צמיג פחות. בהתאם לשלב המחלה ולחומרתה, הצמיגות עשויה להישמר או להיות מופחתת מעט ב-OA.
מספר הלויקוציטים לעולם אינו עולה על 500-1,000 תאים/מ"מ3 ב-OA, והם בעיקר מונוציטים (איור משלים 5A) ותאים חד-גרעיניים אחרים כמו סינוביוציטים (איור משלים 5B). אחד הממצאים הרלוונטיים והשכיחים ביותר ב- OA SF נוגע לגבישי CPP ו- BCP. גבישי CPP מזוהים בקלות במיקרוסקופ אור מקוטב מפוצה (איור 5), בעוד שזיהוי גבישי BCP נעשה קשה יותר בשל גודלם התת-מיקרוסקופי (איור 6). למעשה, אורכו של גביש BCP בודד הוא פחות מ-1 מיקרומטר, ואף על פי שגבישים אלה יוצרים אגרגטים, הגושים מופיעים ככדוריות אמורפיות לא דו-צדדיות למראה. למרות שאינו ספציפי, צביעה אדומה חיובית של אליזרין חושפת בדרך כלל את נוכחותם של גבישי BCP.
בניגוד לפסאודוגאוט, שבו גבישי CPP הם רבים וקשורים לספירה גבוהה של לויקוציטים ותכונות קליניות דלקתיות, ב- OA, מספר גבישי CPP ב- SF נמוך מאוד ואינו קשור לתגובה הומורלית שונה. עם זאת, דגימות SF עם גבישי CPP או BCP מציגות רמות גבוהות יותר של ציטוקינים דלקתיים בהשוואה ל-OA ללא גבישים21. ללא קשר לספירת WBC, SFs עם גבישים קשורים גם לאחוזים מוגברים של תאי PMN5. מנקודת מבט קלינית, הקשר בין גבישי סידן ודלקת עשוי לעזור להגדיר תת-קבוצה מסוימת של חולים בסיכון מוגבר לפתח מחלה חמורה יותר.
איור 1: שאיפת מפרק של ברך נפוחה . (A) ארתרוסנטזיס מבוצעת לאחר חיטוי מדויק של העור בחומרים סטריליים. SF נאסף בצינורות (B) EDTA עבור ספירת תאים כוללת ו-(C) צינורות ללא תוספים עבור ספירת תאים דיפרנציאלית וחיפוש גבישים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מאפיינים של דגימות SF דלקתיות (משמאל) ולא דלקתיות (מימין). (A) צבע ובהירות של דגימות SF דלקתיות (משמאל) ולא דלקתיות (מימין). (B) צמיגות של SF לא דלקתי המוערכת באמצעות מבחן "מיתרים". העובד מעריך את אורך ה"חוט" שנוצר על ידי טיפה נופלת של SF ממזרק או פיפטה. הדגימה בתמונה מייצרת מחרוזת ארוכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תאי SF שנצפו בשקופית מוכתמת מראש . (A) קבוצה של תאים פולימורפו-גרעיניים (PMN) עם גרעינים מרובי אונות, ושני מונוציטים עם גרעיניהם המגושמים בצד הימני התחתון של התמונה. (B) תאי PMN ומונוציטים (M) עם תא חד-גרעיני ציטופהגוציטי (CPM) במרכז התמונה. שדה בהיר; הגדלה פי 1,000. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: גביש MSU תוך-תאי. הגביש יוצר צורת מחט טיפוסית המוצגת תחת (A) אור מקוטב משודר, (B) מקוטב ו-(C) מקוטב מפוצה (400x). החץ מציין את כיוון מסנן λ (מפצה), המקביל לציר הארוך של הגביש. בתצורה זו, הגביש נראה צהוב/כתום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: גביש CPP תוך-תאי. הגביש מוצג תחת (A) משודר, (B) מקוטב, ו-(C) אור מפוצה (400x). החץ מציין את כיוון מסנן λ (מפצה), המקביל לציר הארוך של הגביש. בתצורה זו, הגביש נראה כחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: חיוביות למבחן אדום אליזרין של SF מ-OA, פי 400. משקעים אדומים נראים תחת אור מועבר (פאנל שמאלי) ואור מקוטב (פאנל ימני), הגדלה פי 400. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: מידת הדלקת של SF על פי המספר הכולל של לויקוציטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: צבעים המוצגים על-ידי גבישי MSU ו-CPP תחת אור מקוטב מפוצה וסימנים של דו-צדדיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור משלים 1: פיפטות מדללות דם לפי Malassez-Potain עבור לויקוציטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: פריסת הרשת התאית עבור ספירת WBC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: שקופיות מוכתמות מראש ומוכנות לשימוש להערכה דיפרנציאלית מהירה וקלה של מורפולוגיית WBC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 4: צביעת מאי-גרינוולד-גימסה של כתם SF. גרגירים אאוזינופיליים נראים בבירור (חץ), הגדלה פי 1,000. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 5: מונוציטים וסינוביוציטים שנאספו מדגימת SF. (A) מונוציט מדגימת SF שנאספה מחולה עם דלקת מפרקים ניוונית (פי 1,000). (B) סינוביוציטים מדגימת SF שנאספה מחולה עם דלקת מפרקים ניוונית (פי 1,000). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב- OA, ניתוח SF מסייע להגדיר מאפייני מחלה באמצעות צעדים פשוטים: ספירת לויקוציטים כוללת ודיפרנציאלית וחיפוש גבישים, כולל CPP ו- BCP. יתר על כן, זיהוי של גבישי MSU עשוי להדגיש תחלואה נלווית חשובה.
למרות עלויות נמוכות וביצוע פשוט, רגישות הבדיקות ואמינות התוצאות עשויות להיפגע בשל אנליסטים חסרי ניסיון - בעיקר בכל הנוגע לזיהוי קריסטלים. הכשרה וניסיון של האנליטיקאי הם קריטיים בהבחנה בין הצורה והדו-צדדיות של גבישי CPP ו- MSU והתאמת צורתם למידת הבירפרינגנטיות שלהם. כמה מחקרים דיווחו על פערים בזיהוי גבישים בין מעבדות שונות; לפיכך, הכשרת טכנאי מעבדה חיונית להשגת תוצאות אמינות ועקביות14. זיהוי גבישים מושפע גם מפרשנות שגויה של חלקיקים דו-צדדיים שעלולים להתבלבל עבור גבישים פתוגניים. אלה עשויים לנבוע ממקורות חיצוניים (כלומר, אבק או סיבים) או עשויים להיות נוכחים בתוך חלל המפרק (כלומר, סטרואידים או שומנים). ניקוי יסודי של המגלשה יכול לפתור את הראשון, אבל האחרון ניתן להתגבר רק באמצעות הכשרה וניסיון14.
מגבלה נוספת של ניתוח SF נוגעת לשימוש בכתמים אדומים של אליזרין לזיהוי BCP. כאמור, אין מדובר במבחן ספציפי, ולכן יש לנקוט משנה זהירות בפרשנות התוצאות. האנליטיקאי חייב להיות מסוגל לזהות משקעים אדומים עם מורפולוגיה מוזרה (איור 11). טכניקות רגישות יותר, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), יכולות לשמש לזיהוי גבישי BCP, אך הן אינן משמשות בבדיקות שגרתיות של SF בפרקטיקה הקלינית היומיומית. חשוב לציין, הוכח כי תוצאות שהתקבלו עם צביעה אדומה alizarin להראות התאמה טובה, אם כי לא אופטימלית, עם אלה שהתקבלו על ידי SEM22, ובכך לשפר את הערך של הראשון.
נושא בולט נוסף שיש לקחת בחשבון נוגע למה לעשות כאשר arthrocentesis מניב כמויות קטנות מאוד של SF וכיצד לאחסן את הדגימה. כאשר אוספים רק כמה טיפות של SF ממפרקים קטנים, כגון מפרקים בין-קרפופלנגליים ושורש כף היד, מומלץ לשמור את החומר במזרק ולמרוח אותו ישירות על מגלשת זכוכית נקייה. באמצעות micropipette וכמה טריקים, ניתן להכין יותר משקופית אחת ולבצע ניתוח מלא. בפירוט, האנליטיקאי מצייר את ה- SF עם פיפטת הספירה מהשקופית שהוכנה לחיפוש גבישים ומכין את תא ההמציטומטר, בעוד שחלק מהמיקרוליטרים יכולים להיות שואפים עבור הצביעה העל-חיונית.
מבחינת האחסון, דגימות SF מתפרקות עם הזמן, והניתוח שלהן דורש הכנות חדשות כדי להשיג תוצאות אמינות. לחלופין, SF ניתן לשמר ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 24 שעות, ולא יאוחר מ 48 שעות, לבדיקה ציטולוגית. כדי למנוע גושי תאים וקרישת SF, יש לשים לב לאיסוף הדגימה בצינור EDTA אחד לפחות. דגימות SF קפואות המאוחסנות ב -20 °C לתקופה ארוכה יותר של זמן ניתן להשתמש רק לחיפוש גביש.
ניתוח SF הוא מבחן פתוגנומוני שאין לו תחליף בראומטולוגיה, בשל התועלת שלו, פשטות הביצוע והמחיר הסביר. האתגר העיקרי ליישומים עתידיים של ניתוח SF הוא אבחון מדויק יותר של מחלות ראומטיות. הדבר יתאפשר על ידי שילוב שיטה זו עם טכנולוגיות מתקדמות וחדשניות יותר23, מה שיאפשר לאפיין את הרכב SF ולזהות סמנים ביולוגיים מולקולריים ספציפיים ופרוטאומיקה באתר הדלקת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים אינם חושפים ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לפרופסור לאונרדו פונצי על חונכותו היקרה בתחום ניתוח נוזלים סינוביאליים ולבית החולים האוניברסיטאי פדובה על תמיכתו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red S | Merck | A5533 | For BCP crystal search |
| Burker chamber | Merck | BR718905 | For total white blood cell count |
| Cover glasses | Merck | C7931 | For microscopic examination |
| EDTA tubes | BD | 368861 | For SF collection |
| Glass slides | Merck | S8902 | For crystal search |
| Lambda filter (compensator) | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Malassez-Potain pipette | Artiglass | 54830000 | For dilution of synovial fluid |
| Methylene blue solution | Merck | 3978 | For total white blood cell count |
| Polarized microscope | Leica, Nikon, others | Depending on the model and company | For complete synovial fluid analysis |
| Polarizing lens | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Testsimplet | Waldeck | 14386 | Supravital staining for cell differentiation |
References
- Cui, A., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29, 100587 (2020).
- Hunter, D. J., Bierma-Zeinstra, S.
- Mandell, B. F. Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis. , Springer. Cham. (2022).
- Schmerling, R. H. Guidelines for the initial evaluation of the adult patient with acute musculoskeletal symptoms. Arthritis & Rheumatism. 39 (1), 1-8 (1996).
- Coakley, G., et al. RCGP and BSAC guidelines for management of the hot swollen joint in adults. Rheumatology. 45 (8), 1039-1041 (2006).
- Frallonardo, P., et al. Basic calcium phosphate and pyrophosphate crystals in early and late osteoarthritis: relationship with clinical indices and inflammation. Clinical Rheumatology. 37 (10), 2847-2853 (2018).
- Nalbant, S., et al. Synovial fluid features and their relations to osteoarthritis severity: new findings from sequential studies. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 50-54 (2003).
- Fuerst, M., et al. Calcification of articular cartilage in human osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 60 (9), 2694-2703 (2009).
- Campillo-Gimenez, L., et al. Inflammatory potential of four different phases of calcium pyrophosphate relies on NF-κB activation and MAPK pathways. Frontiers in Immunology. 9, 2248 (2018).
- Pazár, B. Basic calcium phosphate crystals induce monocyte/macrophage IL-1β secretion through the NLRP3 inflammasome in vitro. The Journal of Immunology. 186 (4), 2495-2502 (2011).
- Martín, M. J. A., et al. Automated cell count in body fluids: a review. Advances in Laboratory Medicine. 2, 149-161 (2021).
- Seghezzi,, et al. Optimization of cellular analysis of synovial fluids by optical microscopy and automated count using the Sysmex XN body fluid mode. Clinica Chimica Acta. 462, 41-48 (2016).
- Reginato, A. J., Maldonado, I., Reginato, A. M., Falasca, G. F., O'Connor, C. R. Supravital staining of synovial fluid with Testsimplets. Diagnostic Cytopathology. 8 (2), 147-152 (1992).
- Lumbreras, B., et al. Analysis for crystals in synovial fluid: training of the analysts results in high consistency. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (4), 612-615 (2005).
- Tieng, A., Franchin, G.
- Punzi, L., Oliviero, F. Arthrocentesis and synovial fluid analysis in clinical practice: value of sonography in difficult cases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1154 (1), 152-158 (2009).
- Schumacher, H. R., Reginato, A. J. Atlas of Synovial Fluid Analysis and Crystal Identification. , Lea & Febiger. Philadelphia. (1991).
- Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A. Detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
- Oliviero, F., Punzi, L. Basics of Polarized Light Microscopy. Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis. , Springer. Cham. 79-90 (2022).
- Paul, H., Reginato, A. J., Schumacher, H. R. Alizarin red S staining as a screening test to detect calcium compounds in synovial fluid. Arthritis & Rheumatism. 26 (2), 191-200 (1983).
- Favero, M., et al. Synovial fluid fetuin-A levels in patients affected by osteoarthritis with or without evidence of calcium crystals. Rheumatology. 58 (4), 729-730 (2019).
- Frallonardo, P., et al. Detection of calcium crystals in knee osteoarthritis synovial fluid: a comparison between polarized light and scanning electron microscopy. Journal of Clinical Rheumatology. 22 (7), 369-371 (2016).
- Peffers, M. J., Smagul, A., Anderson, J. R. Proteomic analysis of synovial fluid: current and potential uses to improve clinical outcomes. Expert Review of Proteomics. 16 (4), 287-302 (2019).
