Summary
透過光、偏光顕微鏡、および補償光顕微鏡下での滑液分析は、サンプルの炎症性または非炎症性を簡単なステップで評価するために使用されます。変形性関節症において、カルシウム結晶を検出し、変形性関節症のより重篤なサブセットを特定することは特に有用である。
Abstract
滑液(SF)分析は、変形性関節症(OA)の診断に重要です。白血球(WBC)の総数および差次数を含む巨視的および微視的特徴は、OAの特徴であるSFの非炎症性を定義するのに役立ちます。OA患者では、SFサンプル中のWBCは通常、マイクロリットルあたり2000細胞を超えず、好中球などの炎症細胞の割合は非常に低いか存在しない。カルシウム結晶は、OA患者から採取されたSFにおいて頻繁に存在する。OAの病因におけるそれらの役割は不明のままであるが、それらは軽度の炎症過程およびより重篤な疾患進行と関連している。最近、カルシウム結晶はOAの初期段階と後期段階の両方で報告されており、OAおよび薬理学的治療のさまざまな臨床サブセットの診断に重要な役割を果たす可能性があることを示しています。OAにおけるSF分析の全体的な目標は、SFの非炎症度を確認することと、カルシウム結晶の存在を強調することの2つです。
Introduction
変形性関節症(OA)は複雑で多因子性の慢性関節疾患であり、15歳以上の被験者では16%、40歳以上の被験者では23%と推定されています1。高齢化や肥満やメタボリックシンドロームなどの危険因子の増加により、OAの発生率は増加すると予想されます2。
OAに関連する主な問題の中には、病気の初期段階での診断の難しさと、現在利用可能な治療法は、疼痛管理とグリコサミノグリカンなどの対症療法遅効薬(SYSADOA)に限定されています。OAの診断は、臨床症状と画像所見に基づいています。ただし、2つの評価の間に相関関係がないため、OA診断と治療開始が何年も遅れる可能性があります2。OAは、変性プロセスと軽度の炎症を特徴とし、滑液(SF)分析 によって 簡単に調査できます。SFは、ヒアルロン酸が豊富な粘性のある血漿透析液で、関節腔を滑らかにし、軟骨に栄養素と酸素を供給し、代謝老廃物を取り除きます。SFはショックアブソーバーとしても機能し、応力とひずみ3の間に関節を保護します。
SF分析はシンプルで信頼性の高い方法であり、筋骨格系症状と関節滲出液のある患者の初期評価中に常に実行する必要があります3。米国リウマチ学会、英国リウマチ学会などからの提言には、主に急性単関節炎の評価で行わなければならないリウマチ性疾患の診断検査の中にSF分析が含まれています4,5。SF分析から得られた総白血球数および差白血球数は、関節で起こる病理学的過程のスナップショットを提供し、したがって炎症の程度を分類する。偏光下での尿酸一ナトリウム(MSU)やピロリン酸カルシウム(CPP)結晶などの病原性結晶の同定は、結晶性関節炎(痛風や偽痛風など)の診断と治療に不可欠です。さらに、微生物の存在は敗血症性関節炎の診断を示唆しています。
カルシウム結晶は、OA6の患者から収集されたサンプルで頻繁に見られます。塩基性リン酸カルシウム(BCP)結晶とCPPは、OA6患者のSFサンプルのそれぞれ約22%と23%で報告されています。それらの役割は不明のままであるが、これらの結晶はより重篤な形態のOA7 と関連しており、病理学的過程自体のエピフェノメナと考えられている。カルシウム結晶は、膝関節置換術を受けているOA患者の組織サンプルの100%で検出されています8。さらに、カルシウム結晶は、いくつかの研究9 によって実証され、少なくとも部分的にNLRP3インフラマソーム10によって媒介される炎症作用のために、OAの病因に関与している可能性があるという仮説が立てられています。
最近では、カルシウム結晶がOAの初期段階と後期ステージ6 の両方で記載されており、OAおよび薬理学的治療のさまざまな臨床サブセットの診断に重要な役割を果たす可能性があることを示しています。
SF分析の全体的な目標は、SFの炎症度を決定することと、特定の結晶または微生物を特定することによって結晶または敗血症性関節炎を診断することです。これは、好中球の割合が非常に低いか存在しない典型的な非炎症パターンのために、OAの診断において特に有用で、シンプルで、信頼性の高いツールです。
代替技術に対する利点
SF分析は、総白血球数と差白血球数、結晶検索を含む簡単な手順で構成されています。専門の検査技師3,11によって行われる手動細胞カウントは、滑膜および他の体液の細胞学的分析のためのゴールドスタンダードであり続けています。ただし、この方法の時間のかかる制限と観察者間および観察者内の変動性により、自動セルカウンターは、血液および尿分析装置がSF分析を可能にするように適合された大規模な日常的な臨床検査室で手動カウントに徐々に取って代わりました11,12。それにもかかわらず、手動カウントは特定の設定でいくつかの利点を提示します:(1)外来では、時間通りに合計および差分WBC値を取得します。(2)細胞食性単核球(Reiter)細胞や滑膜細胞などの非造血細胞など、自動カウンターでは認識できない細胞型を特定すること。(3)サンプルが小さすぎて機器で処理できない場合。(4)研究目的で容易にアクセスできるローカルラボレジストリを作成すること。手動計数の別の利点は、スライドガラス調製後非常に迅速かつ即時に細胞の分化を可能にする方法であるインプラビタール染色が見られる。対照的に、ライトおよびMay-Grünwald-Giemsa手順などの従来の染色では、空気乾燥SF塗抹標本と細胞を染色する時間が必要です13。時間に敏感なルーチン分析には適していませんが、これらの染色法により、赤血球、好塩基球、好酸球、多形核白血球、リンパ球、血小板など、サンプル中のより詳細な細胞集団が明らかになります。
最後に、結晶の日常的なSF分析は、偏光顕微鏡に基づく簡単な技術を使用して実行され、迅速な結果が得られます14。走査型や電子顕微鏡などの代替法は、より正確で高感度な結果をもたらしますが、コストが高く、サンプルの調製と分析に時間がかかるため、日常の臨床現場での使用は現実的ではありません。
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Protocol
現在のプロトコルは、パドヴァ大学病院の倫理委員会のガイドラインに準拠しています。SFは、関節滲出液の治療的関節穿刺を受けている患者の膝関節から患者の同意を得て、クリニックへの最初の提示時または関節炎フレアに応答して収集されました。この手順に対する禁忌は、凝固障害、抗凝固薬、皮膚病変、皮膚炎、または関節を覆う蜂巣炎でした。全てのSF試料を非同定化した。
1.滑液製剤
- 腫れた関節15 の関節穿刺中に収集されたSFサンプルを、抗凝固剤(好ましくはEDTA; 材料表を参照)を含むチューブに移し、添加剤を含まない第2のチューブに移します(図1)。
- 感染が疑われる場合は、SFサンプルの一部(~1 mL)を微生物検査用の培養ボトルに無菌的に移します。
注:感染は、臨床的特徴(重度の腫瘍、ドロール、カロリー、機能性、および時には発熱)とSFの肉眼的外観(濁度、色)の両方の結果として疑われる可能性があります。この場合、医師は微生物学検査室によって行われる微生物学的分析を処方する。 - サンプルが収集されたらすぐにSF分析(ステップ2〜5)を実行します。
2.肉眼検査
注:SFサンプルの巨視的評価は、主観的、定性的、および半定量的評価で構成されています。参照標準スケールはなく、対照サンプルは使用されていません。
- SFボリュームをミリリットルで表して注釈を付けます。サンプルの色を淡黄色から濃い黄色まで定義します。血液の存在を記録します。
- バックライトでサンプルを観察し、流体チューブを通して印刷されたページを読みやすくすることで、明瞭度を定義します(図2A)。
- 使い捨てピペットからサンプルを滴下して粘度を評価します。長いストリングまたはドロップ形成は、それぞれ粘度の良し悪しを示します(図2B)。
- 組織片やフィブリンなどの粒子状物質の存在を、チューブを通して、バックライトでサンプルを観察することによって評価します。
3.顕微鏡検査
注:SF顕微鏡分析は、総白血球数および差白血球(WBC)数、および結晶の検索を含む細胞学的検査で構成されています。
- 以下の手順に従って、合計セル数を決定します。
- 血球計算盤を使用して、EDTAチューブに収集されたSF中の白血球の総数を決定します( 材料の表を参照)。
- マラセスポテンピペットを使用してEDTAチューブから0.5 μLのSFを引き出します(マーク0.5; 材料表を参照)(補足図1)。同じピペットで、9.5 μLの0.1%メチレンブルー溶液(マーク11)を吸引します。最終希釈率は20倍です。
- 穏やかな反転によってピペットを混合し、最初の滴を捨て、そして滑液+メチレンブルー溶液を計数チャンバーに注ぐ。
- 9つのうち2つの連続した正方形のセルを数え、得られた数に100を掛けます(簡略化された式; 補足図2)。WBCを立方ミリメートルあたりの白血球数として表します。
注:簡略化された式:白血球(N / mm3)=2つの連続した正方形でカウントされた細胞の数x 100。 - 以前に公開されたレポート16,17(表1)に続くWBCの総数に従ってSFを分類します。
- 差動セルカウントを実行します。
- 多形核(PMN)細胞、単球、およびリンパ球の割合を、超バイタル染色または従来の染色を使用して決定します13,18。
- 超バイタル染色の場合は、クレジルバイオレットとメチレンブルーでプレコーティングされたすぐに使用できるスライドの中央にSFを1滴ずつ置きます(補足図3; 材料表を参照)。
- カバーガラスで覆い、顕微鏡浸漬油を一滴入れます。
- 従来の染色用に風乾SF塗抹標本を準備します(日常的な分析にはあまり適していません)。きれいなスライドの最後にSFを少し落とします。2番目のスライドまたはカバーガラスを使用して、前方に動かしてスライドに沿って広げます。塗抹標本を風乾させます。
- 標準的なMay-Grünwald-Giemsa手順18に従ってサンプルを染色します。
- 油浸対物レンズ(1,000x)の下のスライドを確認します。
- 100個の連続した細胞を数え、多形核細胞、単球、およびリンパ球を区別します(図3、 補足図4)。
- 各カテゴリの合計数をパーセンテージで表します。
注意: 正確な結果を得るには、SFが収集されたらすぐに、または適切に保管された場合(24°C)は関節穿刺から48〜4時間以内に細胞学的検査を実施する必要があります。
4.結晶検出
- 追加の偏光フィルターと赤色補償器19 を備えた偏光顕微鏡を使用して病理学的結晶の存在を決定します( 材料表を参照)。
- 結晶検出のためのスライド準備を行います。
- スライドガラスを光学紙またはエタノールで吸収した柔らかい紙で慎重に洗浄します。スライドガラスにSFを少し垂らします。
- カバーガラスで覆い、スライドを顕微鏡の下に置きます。
- 結晶を特定します。
- 顕微鏡下でスライドの焦点を合わせ、低倍率の対物レンズを使用します。40倍の対物レンズを備えた明視野の下でスライドを注意深く調べます。セルの内側と外側を見てください。
- 結晶のサイズと形状(菱形、針形、棒形など)に従って結晶を識別します。
- 光源と試料の間に偏光フィルターを挿入します。偏光子の光軸がアナライザーに対して垂直になるまで回転させ(対物レンズの上に配置)、暗い背景を作成します。
- 複屈折結晶が特定されたら、偏光子と試料の間に補償器を挿入し、結晶の光軸に対して平行または垂直に動かします。
- 結晶によって明らかにされた色を観察します(表2)。
注:MSU結晶は針状に見え、暗視野では明るく複屈折し、軸が補償器と平行な場合は黄色/オレンジ色を示します。逆に、垂直(負の符号)に配置すると青色になります(表2; 図4)。CPP結晶は棒状または菱形の結晶で、偏光下では複屈折が弱く、補償器の軸に対して平行または垂直に整列すると青色または黄色を示します(正の符号)。 図5)。
5.アリザリンレッド染色
- アリザリンレッドS(pH 4.1-4.3)の2%溶液を調製し、0.22μmのフィルターで溶液をろ過し、光から離して保管します。
- スライドを準備するには、きれいなスライドでSFの滴を同量のアリザリンレッド溶液(1:1)と混合します。カバーガラスで覆い、400倍の倍率で調べます。
- 顕微鏡で結晶を特定します。
注意: 明るい暗赤色の沈殿物が透過光の下で、丸い形状と同心円状の層で見える場合、テストは陽性です。偏光下では、それらは強く複屈折20に見える(図6)。
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Representative Results
OAの影響を受けた大きな関節はしばしば腫れ、かなりの量のSFを生成し、関節穿刺 によって 排出されます15。関節穿刺直後に評価されるSFの巨視的特徴には、本質的に量、色、透明度、および粘度が含まれます17。それらの低い特異性にもかかわらず、それらは炎症の程度に関する予備データを提供する。色は、SF細胞性および細胞外マトリックス高分子の断片化の程度に依存する。OA患者から採取されたSFは淡黄色で、一般的に非炎症性サンプルに関連する色合いですが、濃い黄色は炎症性滲出液に関連しています(図2)。例えば、毛細血管破裂のためにサンプル中に少量の血液が存在すると、わずかにオレンジ色になります。血滲出液は潜在的な関節症を示す可能性があるため、慎重に検討する必要があります。クラリティは、OA患者から収集されたSFの特徴です。実際、非炎症性SFは、炎症性SFの濁った外観とは異なり、細胞、破片、ヒアルロン酸、およびフィブリンフラグメントが乏しいです(図2)。
粘度は、マトリックス高分子、主にヒアルロン酸の完全性に関連するため、良好な炎症指数を表します(図2)。これらの分子は炎症中に解重合し、粘性の低いSFをもたらします。 疾患の病期および重症度に応じて、粘度はOAで維持されるかまたはわずかに低下し得る。
白血球の数はOAで500〜1,000細胞/ mm3を超えることはなく、それらは主に単球(補足図5A)および滑膜細胞のような他の単核細胞(補足図5B)です。オープンアクセスSFで最も関連性が高く頻繁な発見の1つは、CPPおよびBCP結晶に関するものです。CPP結晶は補償偏光顕微鏡で容易に検出できますが(図5)、BCP結晶の同定は顕微鏡以下のサイズのためにより困難になります(図6)。実際、単一のBCP結晶の長さは1μm未満であり、これらの結晶は凝集体を形成しますが、塊は非複屈折のアモルファスに見える小球として現れます。非特異的ではあるが、陽性のアリザリンレッド染色は一般にBCP結晶の存在を明らかにする。
CPP結晶が多数あり、高い白血球数および炎症性臨床的特徴と関連している偽痛風とは対照的に、OAでは、SF中のCPP結晶の数は非常に少なく、体液性反応の変化とは関連していない。それにもかかわらず、CPPまたはBCP結晶を有するSF試料は、結晶を含まないOAと比較して、より高いレベルの炎症性サイトカインを示す21。WBC数に関係なく、結晶を有するSFは、PMN細胞の割合の増加とも関連しています5。臨床的観点から、カルシウム結晶と炎症の関係は、より重篤な疾患を発症するリスクが高い患者の特定のサブセットを定義するのに役立つ可能性があります。
図1:腫れた膝の関節吸引 。 (A)関節穿刺は、滅菌材料で皮膚を正確に消毒した後に行われます。SFは、(B)総細胞数のためにEDTAチューブに、および(C)差動細胞数および結晶検索のために無添加チューブに収集されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:炎症性(左)および非炎症性(右)SFサンプルの特性 。 (A)炎症性(左)および非炎症性(右)SFサンプルの色と透明度。(B)「ストリング」試験を通じて評価された非炎症性SFの粘度。ラボラトリーは、注射器またはピペットからのSFの落下滴によって形成される「ひも」の長さを評価します。図のサンプルでは、長い文字列が生成されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:予め染色したスライドで観察されたSF細胞 。 (A)画像の右下に嵩高い核を持つ多葉核と2つの単球を持つ多形核(PMN)細胞のグループ。(B)画像の中央に細胞貪食性単核球(CPM)を有するPMN細胞および単球(M)。明視野;倍率1,000倍。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞内MSU結晶。 結晶は、(A)透過偏光、(B)偏光、および(C)補償偏光(400倍)の下に示す典型的な針形状を形成します。矢印はλフィルタ(補償器)の向きを示しており、これは結晶の長軸に平行である。この構成では、結晶は黄色/オレンジ色に見えます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:細胞内CPP結晶。 結晶は、(A)透過光、(B)偏光光、および(C)補償光(400倍)の下に表示されます。矢印はλフィルタ(補償器)の向きを示しており、これは結晶の長軸に平行である。この構成では、結晶は青色で表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:OAからのSFのアリザリンレッドテストに対する陽性率、400倍。 赤色の沈殿物は、透過光(左パネル)および偏光(右パネル)、400倍の倍率で見ることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:白血球の総数によるSFの炎症の程度。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:補償偏光下でMSUおよびCPP結晶が示す色と複屈折の兆候。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:白血球のマラセス・ポテンによる血液希釈ピペット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:WBCカウントのチャンバーグリッドのレイアウト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:迅速かつ容易なWBC形態評価のための、事前に染色された、すぐに使用できるスライド。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:SF塗抹標本のメイ-グリュンヴァルト-ギムザ染色。 好酸球性顆粒は、1,000倍の倍率ではっきりと見えます(矢印)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:SFサンプルから採取した単球および滑膜細胞。 (A)変形性関節症の患者から採取したSFサンプルからの単球(1,000倍)。(B)変形性関節症の患者から採取したSFサンプルからの滑膜細胞(1,000倍)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
OAでは、SF分析は、総白血球数と差白血球数、CPPやBCPなどの結晶の検索という簡単なステップで疾患の特徴を定義するのに役立ちます。さらに、MSU結晶の検出は、重要な併存疾患を浮き彫りにする可能性があります。
低コストで簡単な実行にもかかわらず、主に結晶の同定に関連するため、経験の浅いアナリストのために、テストの感度と結果の信頼性が影響を受ける可能性があります。分析者のトレーニングと経験は、CPPとMSU結晶の形状と複屈折を区別し、それらの形状を複屈折の程度に一致させる上で重要です。いくつかの研究では、異なる実験室間の結晶同定の不一致が報告されています。したがって、信頼性の高い一貫した結果を得るには、検査技師のトレーニングが不可欠です14。結晶の同定は、病原性結晶と混同される可能性のある複屈折粒子の誤った解釈によっても影響を受けます。これらは、外部源(すなわち、ほこりまたは繊維)に由来するか、または関節腔内に存在し得る(すなわち、コルチコステロイドまたは脂質)。スライドを徹底的にクリーニングすることで前者を解決できますが、後者はトレーニングと経験によってのみ克服できます14。
SF分析の別の制限は、BCP同定のためのアリザリンレッド染色の使用に関するものである。前述のように、これは特定のテストではないため、結果を解釈するときは注意が必要です。分析者は、独特の形態を持つ赤い沈殿物を認識できなければなりません(図11)。走査型電子顕微鏡(SEM)などのより感度の高い技術を使用してBCP結晶を同定できますが、日常の臨床診療におけるSFの日常的な検査では使用されません。重要なことに、アリザリンレッド染色で得られた結果は、最適ではないがSEM22によって得られた結果との良好な一致を示し、したがって前者の価値を高めることが示されている。
関節穿刺でSFが非常に少量である場合の対処方法と、サンプルの保存方法に関して考慮すべきもう1つの顕著な問題。中手指節関節や手首などの小さな関節から数滴のSFしか採取しない場合は、材料をシリンジに入れ、清潔なスライドガラスに直接広げることをお勧めします。マイクロピペットといくつかのトリックを使用して、複数のスライドを準備し、完全な分析を実行することが可能です。詳細には、分析者は結晶探索用に準備されたスライドから計数ピペットでSFを引き出し、血球計算盤チャンバーを準備しますが、いくつかのマイクロリットルは超バイタル染色のために吸引することができます。
保管に関する限り、SFサンプルは時間の経過とともに劣化し、それらの分析には信頼できる結果を得るための新鮮な準備が必要です。あるいは、SFを4°Cで保存し、24時間以内、遅くとも48時間以内に細胞学的検査に使用することもできます。細胞の凝集とSF凝固を避けるために、少なくとも1つのEDTAチューブで検体を収集するように注意する必要があります。-20°Cで長期間保存された凍結SFサンプルは、結晶検索にのみ使用できます。
SF分析は、その有用性、実行の単純さ、および手頃な価格のために、リウマチ学におけるかけがえのない病理学的検査です。SF分析の将来のアプリケーションの主な課題は、リウマチ性疾患のより正確な診断です。これは、この方法をより高度で革新的な技術と統合することによって可能になり23、SF組成を特徴付け、炎症部位で特定の分子バイオマーカーおよびプロテオミクスを同定することを可能にする。
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Disclosures
すべての著者は利益相反を開示していません。
Acknowledgments
著者らは、滑液分析の分野での貴重なメンターシップに対してレオナルド・プンジ教授に感謝し、パドヴァ大学病院はその支援に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alizarin red S | Merck | A5533 | For BCP crystal search |
| Burker chamber | Merck | BR718905 | For total white blood cell count |
| Cover glasses | Merck | C7931 | For microscopic examination |
| EDTA tubes | BD | 368861 | For SF collection |
| Glass slides | Merck | S8902 | For crystal search |
| Lambda filter (compensator) | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Malassez-Potain pipette | Artiglass | 54830000 | For dilution of synovial fluid |
| Methylene blue solution | Merck | 3978 | For total white blood cell count |
| Polarized microscope | Leica, Nikon, others | Depending on the model and company | For complete synovial fluid analysis |
| Polarizing lens | Any | Refer to microscope company | For crystal identification |
| Testsimplet | Waldeck | 14386 | Supravital staining for cell differentiation |
References
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