Summary
Os insetos têm uma faixa de temperatura ambiental ideal na qual eles procuram permanecer dentro, e muitos fatores externos e internos podem alterar essa preferência. Aqui, descrevemos um método econômico e simples para estudar a escolha da temperatura, que permite que os insetos exibam livremente seus comportamentos naturais.
Abstract
A maioria dos insetos e outros ectotérmicos têm uma janela de temperatura ideal relativamente estreita, e o desvio de seus ótimos pode ter efeitos significativos em sua aptidão, bem como em outras características. Consequentemente, muitos desses ectotérmicos buscam sua faixa de temperatura ideal. Embora as preferências de temperatura de mosquitos e outros insetos tenham sido bem estudadas, a configuração experimental tradicional é realizada usando um gradiente de temperatura em uma superfície de alumínio em um espaço altamente fechado. Em alguns casos, esse equipamento restringe muitos comportamentos naturais, como voar, o que pode ser importante na seleção de preferências.
O objetivo deste trabalho é observar a preferência dos insetos pela temperatura do ar utilizando um aparelho de duas câmaras com espaço suficiente para o voo. As duas câmaras consistem em incubadoras independentes com temperatura controlada, cada uma com uma grande abertura. As incubadoras são conectadas por essas aberturas usando uma ponte curta de acrílico. Dentro das incubadoras estão duas gaiolas de rede, ligadas através das aberturas e ponte, permitindo que os insetos voem livremente entre as diferentes condições. A ponte acrílica também atua como um gradiente de temperatura entre as duas incubadoras.
Devido à área espaçosa na gaiola e à fácil construção, este método pode ser usado para estudar qualquer pequeno ectotérmico e / ou qualquer manipulação que possa alterar a preferência de temperatura, incluindo manipulação de órgãos sensoriais, dieta, flora intestinal e presença endossimbionte nos níveis de biossegurança 1 ou 2 (BSL 1 ou 2). Além disso, o aparelho pode ser usado para o estudo da infecção por patógenos usando contenção adicional (por exemplo, dentro de um gabinete de biossegurança) na BSL 3.
Introduction
Os organismos podem viver e se reproduzir apenas dentro de sua faixa de tolerância térmica. Como a temperatura ambiental varia devido à mudança das estações e ao aquecimento global, as espécies devem se adaptar e responder de acordo para garantir sua sobrevivência. Isso inclui os ectotérmicos, em que a temperatura corporal está em equilíbrio com o ambiente1. Assim, cada inseto tem sua própria faixa de temperatura ambiental ideal que eles procuram permanecer dentrode 2.
A temperatura é um dos fatores importantes utilizados para predizer a distribuição e a amplitude dos insetos 3,4,5, observando-se as relações patógeno-inseto6,7 e o efeito de fatores externos na aptidão dos ectotérmicos, como sua vida adulta, fecundidade e taxa de alimentação 8,9.
Estudos anteriores investigaram a temperatura preferida de ectotérmicos com diferentes configurações. O mais comum é usar um grande bloco de alumínio com um banho de água resfriado ou aquecido10, um banho de gelo e elemento aquecedor programável11, placas frias e quentes12,13, placas reguladoras térmicas 14,15 ou um pacote de calor e bloco de gelo 16 em cada extremidade para criar um gradiente de temperatura. Além disso, outros estudos também utilizaram uma incubadora de gradiente de temperatura para estudar o crescimento de bactérias selecionadas 17 e montaram uma haste de alumínio em um dispositivo termoelétrico (aquecido e resfriado nas extremidades) para observar a preferência térmica de Drosophila melanogaster18,19.
No entanto, a metodologia alternativa aqui proposta tem vantagens significativas para certas aplicações de insetos. Em primeiro lugar, outras soluções exigem construção completa a partir do zero com materiais básicos, incluindo folhas de alumínio, construção de câmaras acrílicas para os insetos e, muitas vezes, uma configuração de câmera e software especializado; isso pode ser caro e demorado para configurar. Em segundo lugar, muitos aparelhos alternativos dependem de um gradiente de temperatura em uma superfície (em oposição à temperatura do ar). Consequentemente, a câmara em que os insetos são estudados é muitas vezes muito estreita (por exemplo, gradientes de 24 cm de comprimento com apenas 2 cm de largura e 1 cm de profundidade16), o que pode impedir comportamentos naturais, como o voo, que são essenciais para a mobilidade normal dos insetos e, portanto, imperativos na seleção de uma temperatura preferida. Alguns estudos medem a temperatura do ar; no entanto, a pontuação de escolha ainda envolve a contagem do número de mosquitos que pousam nos elementos Peltier, em oposição aos insetos que voam livremente nas gaiolas20.
Neste estudo, descrevemos uma configuração mais simples, que usa equipamentos padrão minimamente modificados e fornece aos insetos espaço suficiente para voar e navegar relativamente sem obstáculos em uma gaiola de manutenção de colônia de tamanho padrão. Além disso, em vez de depender de um gradiente, o protocolo utiliza duas seções de tamanho relativamente grande de temperatura interna consistente, permitindo o roaming natural dos insetos em sua temperatura preferida e uma pontuação binária simples. Assim, o aparato e o protocolo aqui descritos fornecem um meio simples e de baixo custo de estudar a preferência de temperatura do mosquito em um ambiente menos obstrutivo e mais realista.
O protocolo envolve a preparação dos insetos antes do experimento, seguido pela configuração do aparelho de duas câmaras. Outras etapas incluem a colocação de insetos no aparelho para permitir a escolha da temperatura e a pontuação dos resultados. Para uma ilustração do método aqui, escolhemos a temperatura ótima (criação padrão) dos insetos, 27 °C para o Aedes aegypti, 25 °C para Drosophila melanogaster, e uma temperatura repelente mais alta para ambas as espécies de insetos, 30 °C e 28 °C, respectivamente. Os insetos recebem 30 minutos para selecionar uma câmara preferida. Esse tempo foi considerado suficiente, e uma duração maior não alterou os resultados; no entanto, isso pode ser estendido dependendo da espécie/temperatura/outras variáveis, conforme necessário.
Protocol
NOTA: Este protocolo foi escrito para BSL 1 ou 2; para o trabalho BSL 3, execute todo o protocolo dentro de um gabinete de biossegurança classe 3 (porta-luvas).
1. Preparação de insetos
- Preparar duas gaiolas de mosquito vazias (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) com 12 cm de aberturas de manga (Figura 1). Antes de prosseguir com os experimentos, certifique-se de que não haja buracos ou outros danos às gaiolas do mosquito.
- Usando um aspirador mecânico (um simples cocô com uma câmara de coleta), transfira 30 insetos (por exemplo, mosquitos Aedes aegypti ; aqui, fêmeas 3-5 dias após a emergência foram usadas), para uma gaiola separada para facilitar o manuseio e descarte após o experimento.
NOTA: Um total de 30 insetos por experimento é sugerido, pois é fácil de gerenciar e contar sem um alto risco de fuga do mosquito. O número de insetos utilizados pode ser ajustado para se adequar ao objetivo do experimento.
2. Configuração do aparelho de duas câmaras
- Ajuste as incubadoras para as temperaturas desejadas, de acordo com as instruções do fabricante da incubadora.
- Permita que as incubadoras aqueçam e se estabilizem nas temperaturas específicas, o que é de <30 min para temperaturas na faixa de 25-30 °C. Verifique a temperatura do ar na incubadora com uma sonda de temperatura, para garantir que a incubadora esteja configurada para a temperatura pretendida.
- Coloque uma gaiola de mosquito vazia em cada incubadora (Figura 2A).
- Alimente as mangas da gaiola através do orifício frontal da incubadora. Prepare uma tampa aberta (aba) com fita adesiva e coloque-a sobre o orifício no tubo de acrílico (Figura 2B).
- Insira o tubo de acrílico na manga de uma gaiola em cima do orifício da incubadora. O diâmetro do tubo é maior do que o orifício na frente das incubadoras, de modo que ele cobre completamente o furo.
- Aperte a malha da manga ao redor do tubo com um elástico ou um cabo reutilizável (Figura 2C). Certifique-se de que o tubo de acrílico não está solto e pendurado entre as incubadoras; se for, puxe as mangas da gaiola para remover o excesso de material entre a gaiola e o elástico.
- Coloque ambas as incubadoras de frente uma para a outra e repita as etapas 2.5 e 2.6 com a manga da outra incubadora. Ambas as gaiolas estão agora firmemente ligadas através do tubo de acrílico (Figura 2D).
3. Inserção do mosquito
- Abra a aba de fita adesiva para a inserção do mosquito. Coloque um funil no orifício. Esvazie os insetos no funil que foi colocado no tubo de acrílico.
NOTA: Se desejar/exigir: para mosquitos, use uma caneta de CO2 para nocautear todos os mosquitos antes de colocá-los no funil21; para Drosophila, use gelo para derrubar insetos22. - Remova o funil e cubra o orifício no tubo com a aba da fita adesiva. Deixe por 30 minutos para os insetos selecionarem a câmara preferida.
NOTA: Se CO2 ou gelo foi usado, bata levemente na ponte do tubo para acordar os insetos após alguns minutos.
4. Contagem de mosquitos
- Após 30 min, observe visualmente e anote quantos insetos foram encontrados na ponte (o tubo de acrílico).
- Toque / sopre os insetos na ponte para ambos os lados da incubadora. Registro para deduzir do número total de insetos mais tarde.
NOTA: Nocautear todos os 30 insetos do aparelho liberando CO 2 na ponte (use CO2 para todos os insetos, pois o gelo não derrubará insetos nas gaiolas). Além disso, tome nota do número de insetos na ponte que voam para ambos os lados da incubadora. - Aperte e feche as mangas do tubo de acrílico em ambos os lados, prenda rapidamente com um nó para fechar as gaiolas e certifique-se de que o elástico ainda esteja intacto para evitar que os insetos escapem.
- Remova as gaiolas da incubadora e conte visualmente os insetos em cada gaiola (deduza o número de insetos da ponte, se necessário).
- Repita o passo 4.4 com a outra gaiola. Certifique-se de que os números das duas incubadoras e da ponte somem 30 (ou o número de insetos usados, se diferente).
- Se os números não somarem o número total de insetos usados na etapa 1.2, procure os insetos restantes na manga da gaiola.
5. Replicação
- Ao realizar experimentos, certifique-se de levar em conta possíveis vieses externos, como direção da luz, cheiros ambientes, etc. Por exemplo, invertendo as gaiolas, a orientação da incubadora e as combinações entre as replicações.
Representative Results
Para testar a eficácia e a efetividade dessa configuração experimental, 30 mosquitos foram testados com a mesma temperatura em ambas as incubadoras em quatro repetições (Figura 3). Quando ambas as câmaras foram ajustadas para a temperatura ótima do mosquito de 27 °C, não houve diferença significativa entre a preferência da câmara (P = 0,342; Teste de postos assinados de Wilcoxon). No entanto, quando uma câmara foi ajustada para a temperatura ótima atraente de 27 °C e a outra câmara para uma temperatura sub-ótima de 30 °C, os mosquitos demonstraram consistentemente preferência ativa em relação ao seu ótimo (P = 0,029; Teste de postos assinados de Wilcoxon; valor médio de 78,2% e 21,8% para 27 °C e 30 °C, respectivamente). Também testamos usando Drosophila para determinar a aplicabilidade com outro modelo de ectotérmico e resultados semelhantes foram observados.
Uniformidade da temperatura dentro das gaiolas
A Figura 4 mostra a uniformidade térmica do aparelho de duas câmaras. Uma vez montados, os dois lados foram ajustados para 27 °C e 30 °C e deixados equilibrar de acordo com as instruções aqui dadas. Todas as partes da incubadora e da ponte estão a 0,4 °C da temperatura central, exceto (consistentemente) para um canto. Observe que o canto inferior esquerdo da frente (visto de frente) é um ponto quente consistente a 27 °C e 30 °C. Isso provavelmente se deve ao fato de a eletrônica dos controles da incubadora estar situada logo abaixo dessa seção da incubadora, em vez das manipulações realizadas; portanto, é provável que seja específico do modelo de incubadora. Isso demonstra que a manipulação e a adição à incubadora têm efeito mínimo na uniformidade da temperatura. Além disso, a temperatura da ponte era intermediária entre as duas câmaras, garantindo que os insetos não fossem confrontados com um cavado de temperatura pelo qual eles teriam que voar.
Figura 1: Descrição da gaiola do mosquito. Gaiola do mosquito (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) com aberturas de manga de 12 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens e diagrama do aparelho durante a instalação . (A) Gaiola de insetos vazia colocada na incubadora. (B) Tubo acrílico com uma tampa aberta (aba) feita de fita adesiva. (C) Vista lateral da configuração com um diagrama esquemático. A malha da manga foi apertada ao redor do tubo de acrílico com um elástico. Para esses experimentos, foram utilizados mosquitos Ae. aegypti fêmeas de 3-5 dias de idade, acasalados. (D) Configuração completa. Duas incubadoras de frente uma para a outra são conectadas por um tubo de acrílico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Preferência de temperatura em insetos. O aparelho de duas câmaras foi montado de acordo com as instruções. Os insetos foram inseridos de acordo com o protocolo e deixados por 30 min para selecionar sua câmara preferida (temperatura) e, em seguida, contados. Os pontos pretos representam replicações individuais e o azul representa a média. (A) Ambas as incubadoras foram ajustadas para a mesma temperatura (27 °C) e a preferência de temperatura do Ae. aegypti foi observada. (B) As incubadoras foram ajustadas para diferentes temperaturas (27 °C vs. 30 °C) e a preferência de temperatura de Ae. Aegypti foi observado. (C) As incubadoras foram ajustadas para diferentes temperaturas (25 °C vs. 28 °C) e a preferência de temperatura de D. melanogaster foi observada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Uniformidade da temperatura dentro das câmaras e da ponte. Conforme descrito, duas incubadoras, duas gaiolas e a ponte foram montadas de acordo com as instruções. A temperatura foi ajustada para 27 °C em ambas as incubadoras e 30 °C no centro. Uma sonda de temperatura foi usada para medir a temperatura no centro da gaiola, em todos os oito cantos da incubadora e no interior da ponte. As temperaturas medidas são mostradas aqui. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O estudo descreve um novo método para observar a preferência de temperatura em mosquitos. Neste método, os mosquitos são liberados em um tubo que é conectado a duas incubadoras com temperaturas controláveis de forma independente. Desta forma, os mosquitos podem escolher livremente entre duas temperaturas sem interromper seus comportamentos naturais e o mecanismo de expressar essa escolha (por exemplo, voar).
Nosso primeiro experimento representativo utilizou a temperatura ótima do mosquito de 27 °C em ambas as câmaras. Durante as repetições deste experimento, observou-se que os mosquitos estavam voando livremente entre ambas as gaiolas durante os 30 minutos e, em todas as repetições, havia números quase iguais em cada uma das duas câmaras. Isso confirmou a intenção experimental de permitir que os mosquitos escolhessem livremente entre gaiolas enquanto exibiam seus comportamentos naturais (voar). Por outro lado, o segundo experimento representativo utilizou a temperatura ótima atraente de 27 °C em uma câmara e uma temperatura sub-ótima e, portanto, repelente de 30 °C na segunda câmara. Como esperado, os mosquitos selecionaram consistentemente a câmara de temperatura ideal com alta significância, mesmo quando trocamos as incubadoras para evitar viés.
Também testamos a configuração de um inseto diferente, D. melanogaster (moscas da fruta), representando outro organismo modelo de ectotérmico. Uma câmara foi ajustada para a temperatura ótima de D. melanogaster, 25 °C, e a outra foi ajustada para 3 °C mais alta, 28 °C. Semelhante aos mosquitos, as moscas da fruta também favoreceram sua temperatura ideal e evitaram a câmara mais quente. Isso demonstra que o protocolo é adequado para uma variedade de ectotérmicos.
Descrição das etapas críticas no protocolo
A principal etapa crítica do protocolo é o manejo de insetos, pois gera a possibilidade de fuga de insetos. Isso pode ser evitado determinando que não há furos grandes o suficiente para escapar nas gaiolas usadas, que os elásticos/abraçadeiras usados para prender as mangas de malha à ponte são apertados e que a tampa para o orifício de inserção de insetos na ponte está firmemente presa e selada.
Também é crucial garantir que os insetos não escapem antes ou depois do experimento, particularmente quando os insetos são necessários para experimentação a jusante ou pontos de tempo posteriores para várias escolhas de temperatura. Isso pode ser feito anestesiando os insetos antes de colocá-los na ponte de acrílico (usando gelo para Drosophila e CO 2 para mosquitos) e liberando CO2 na ponte para derrubar os insetos após os experimentos, antes de calcular. O uso de CO2 é ideal para mosquitos, pois não afetará os resultados comportamentais21. Nas moscas, a exposição ao CO2 pode alterar o seu comportamento de voo23, pelo que se recomenda a utilização de gelo22.
A contagem de insetos também é um passo crítico, para garantir que o número de insetos seja igual antes e depois do experimento para obter resultados precisos. Para fazer isso, recomendamos o uso de uma caneta de CO2 uma vez que o experimento esteja concluído para derrubar os insetos que estão localizados na ponte. Isso ajudará a mover os insetos para ambos os lados da câmara, reduzindo assim o número de fugitivos. Destaca-se também no protocolo que os insetos podem ser capturados nas mangas das gaiolas durante a separação da gaiola; portanto, certifique-se de que eles sejam verificados minuciosamente durante a contagem.
Possíveis modificações e solução de problemas da técnica
A principal dificuldade com esta técnica é a malha flexível das mangas da gaiola, resultando em lacunas ou esconderijos e, portanto, fuga ou armadilha de insetos. Existem algumas modificações potenciais, se necessário, para melhorar a técnica. Sugerimos o uso de dois ou mais elásticos para garantir que a ponte seja fixada adequadamente entre as câmaras sem deixar qualquer espaço potencial para os insetos (a malha solta cria um esconderijo para os insetos). Aconselhamos também um cuidado especial para puxar a manga de malha esticada, conforme descrito no passo 2.6, ao montar o aparelho.
Incubadoras de fator de forma pequeno geralmente são aquecidas apenas (ou seja, não têm resfriamento ativo), como foi o caso das incubadoras usadas aqui. Consequentemente, o uso de temperaturas ao redor ou abaixo da temperatura ambiente exigirá que o experimento seja realizado em uma câmara fria para garantir que as temperaturas definidas para as incubadoras sejam tão baixas quanto desejado.
Além disso, essa configuração também pode ser usada para a BSL 3, onde um gabinete de biossegurança de classe três (porta-luvas) é necessário. Nesse caso, o porta-luvas precisa ser grande o suficiente para caber em todo o aparelho. O experimento descrito neste protocolo é ideal para experimentos em um porta-luvas porque tudo o que é necessário estará contido dentro do porta-luvas e, o mais importante, a possibilidade de insetos escaparem é mínima.
Finalmente, há espaço suficiente nas incubadoras para adicionar luz externa ou uma fonte de umidade sem afetar os insetos nas gaiolas. Dependendo da espécie de inseto ou do projeto experimental, uma lâmpada LED com 1 cm de espessura pode ser facilmente colocada no topo da gaiola dentro de uma ou ambas as incubadoras. Fornecer luz a ambos e oferecer uma escolha de temperatura pode ser um protocolo mais realista para alguns projetos experimentais fotossensíveis, ou apenas fornecer luz (ou umidade) para uma câmara é uma possível modificação no protocolo para avaliar a escolha de luz / umidade.
Vantagens desta técnica no contexto de ensaios de preferência de temperatura de dupla escolha
O método aqui descrito apresenta uma alternativa ao método tradicional de gradiente de temperatura descrito em estudos anteriores10,13,14,16. Na maioria desses estudos, um grande bloco horizontal de alumínio com um gradiente térmico é usado, enquanto o mecanismo de geração desse gradiente varia, incluindo blocos de aquecimento / resfriamento, banhos de água, etc. Nesses casos, o gradiente de temperatura é produzido na superfície do bloco de alumínio (em vez da temperatura do ar em uma gaiola). Consequentemente, a maioria (mas não todas) as técnicas alternativas restringem a capacidade de voo dos insetos mais do que este protocolo. Aqui, os insetos podem voar relativamente livremente entre as gaiolas, permitindo uma expressão mais realista de comportamentos naturais na escolha. Seria até possível ampliar esse aparato experimental usando gaiolas e incubadoras maiores, por exemplo, para insetos maiores.
Além da vantagem do comportamento natural, também demonstramos uma uniformidade de temperatura muito alta dentro das duas câmaras, permitindo uma pontuação simples e uma seleção clara de duas grandes câmaras de temperatura única. O uso de um projeto binário de câmara grande como este pode reduzir o ruído nos dados, onde, por exemplo, em um aparelho de gradiente, qualquer movimento incidental dos insetos alterará a posição no gradiente e, portanto, sua preferência de temperatura percebida.
A técnica descrita aqui também é muito simples e de baixo custo. Essa técnica não necessita de aparelhos extras para definir as temperaturas (ou seja, banho-maria 10 e/ou placa quente 11,12,13,14,15), nenhum equipamento especializado além de um tubo acrílico cortado e furos perfurados, e nenhuma câmera 18,19 ou software sofisticado 19 para análise. Tais componentes usados em outras técnicas podem ser caros e / ou exigir conhecimentos e testes significativos para iniciar experimentos.
Essa técnica também pode ser replicada com diferentes dispositivos que utilizam baterias se não houver fonte de alimentação externa, tornando o sistema ideal para a realização de experimentos em campo. Além disso, o mesmo aparelho poderia ser ligeiramente modificado para estudar outras situações de preferência de escolha binária, como claro versus escuro, alta / baixa umidade, etc., seja em laboratório ou em campo.
O aparelho de tamanho normal no protocolo é significativamente menor do que as configurações de gradiente de temperatura, permitindo um ajuste mais fácil dentro de um porta-luvas BSL 3, conforme descrito acima. Além disso, os insetos são mais fáceis de conter, pois podem ser derrubados com CO2 no final do experimento, e as gaiolas podem ser rapidamente seladas novamente após a separação da ponte. Essas vantagens de contenção são ideais para o trabalho BSL 3.
No entanto, reconhecemos que nosso aparelho só permite uma decisão binária em vez de uma livre escolha ao longo de um gradiente, o que, dependendo da aplicação, pode exigir corridas adicionais para identificar temperaturas ideais.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
A AHR reconhece o apoio financeiro de Majlis Amanah Rakyat (MARA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
| Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
| Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
| Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
| Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
| Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
| Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
| Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
| Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |
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