Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generatie, high-throughput screening en biobanking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiale sferoïden

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64365
Automatic Translation
1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, *1, *1
1Utrecht Regenerative Medicine Center, Circulatory Health Laboratory, University Utrecht, Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Department of Physiology, Amsterdam University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Hier wordt een reeks protocollen gepresenteerd voor het genereren en cryopreservatie van cardiale sferoïden (CSs) uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten gekweekt in een multidimensionaal formaat met hoge doorvoer. Dit driedimensionale model functioneert als een robuust platform voor ziektemodellering, high-throughput screenings en behoudt zijn functionaliteit na cryopreservatie.

Abstract

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn van het grootste belang voor het modelleren en therapeutisch maken van menselijke hartaandoeningen. We hebben onlangs een kosteneffectieve strategie gepubliceerd voor de enorme uitbreiding van hiPSC-CMs in twee dimensies (2D). Twee belangrijke beperkingen zijn celonvolwassenheid en een gebrek aan driedimensionale (3D) opstelling en schaalbaarheid in high-throughput screening (HTS) platforms. Om deze beperkingen te overwinnen, vormen de uitgebreide cardiomyocyten een ideale celbron voor het genereren van 3D-hartcelkweek en weefselmanipulatietechnieken. De laatste heeft een groot potentieel op cardiovasculair gebied en biedt meer geavanceerde en fysiologisch relevante HTS. Hier beschrijven we een HTS-compatibele workflow met eenvoudige schaalbaarheid voor het genereren, onderhouden en optisch analyseren van cardiale sferoïden (CS's) in een 96-well-formaat. Deze kleine CS'en zijn essentieel om de leemte op te vullen die aanwezig is in de huidige in vitro ziektemodellen en/of generatie voor 3D tissue engineering platforms. De CSs vertonen een zeer gestructureerde morfologie, grootte en cellulaire samenstelling. Bovendien vertonen hiPSC-CMs gekweekt als CSs een verhoogde rijping en verschillende functionele kenmerken van het menselijk hart, zoals spontane calciumbehandeling en contractiele activiteit. Door automatisering van de volledige workflow, van het genereren van CSs tot functionele analyse, verhogen we de intra- en inter-batch reproduceerbaarheid, zoals aangetoond door high-throughput (HT) imaging en calcium handling analyse. Het beschreven protocol maakt het mogelijk om hartaandoeningen te modelleren en de effecten van geneesmiddelen / therapeuten op eencellig niveau binnen een complexe 3D-celomgeving te beoordelen in een volledig geautomatiseerde HTS-workflow. Bovendien beschrijft de studie een eenvoudige procedure voor langetermijnbehoud en biobanking van hele sferoïden, waardoor onderzoekers de mogelijkheid krijgen om functionele weefselopslag van de volgende generatie te creëren. HTS in combinatie met langdurige opslag zal aanzienlijk bijdragen aan translationeel onderzoek op een breed scala van gebieden, waaronder het ontdekken en testen van geneesmiddelen, regeneratieve geneeskunde en de ontwikkeling van gepersonaliseerde therapieën.

Introduction

De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) bood ongekende mogelijkheden om de menselijke ontwikkeling en ziekte op cellulair niveau te bestuderen. In het afgelopen decennium zijn met behulp van ontwikkelingslessen verschillende protocollen opgesteld om de efficiënte differentiatie van hiPSC's in cardiomyocyten (CMs)1,2,3,4 te waarborgen. hiPSC-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) kunnen dienen als een hulpmiddel voor het modelleren van genetisch overerfbare hart- en vaatziekten (CVD's), het testen van cardiale veiligheid voor nieuwe geneesmiddelen en cardiale regeneratieve strategieën 5,6,7,8. Ondanks de gerichte cardiale differentiatie van hiPSC's, blijven onbepaalde CM-nummers een uitdaging op hartgebied, omdat gerijpte hiPSC-CM's over het algemeen niet-proliferatief zijn en primaire menselijke cellen niet in grote hoeveelheden beschikbaar zijn.

Onlangs hebben we beschreven dat gelijktijdige Wnt-signaleringsactivering met een cultuur met lage celdichtheid resulteerde in een massale proliferatieve respons (tot 250-voudig) van hiPSC-CMs 9,10. Deze kosteneffectieve strategie voor de enorme uitbreiding van hiPSC-CMs via seriële passaging in kweekflesformaat vergemakkelijkt de standaardisatie en kwaliteitscontrole van grote aantallen functionele hiPSC-CMs. Bovendien, om de vraag naar grote partijen hiPSC-CMs van verschillende donoren bij te houden, is de biobanking van hiPSC-CMs beschreven10. Cardiomyocytenmonolagen die in deze standaardkweekschalen zijn gezaaid, zijn echter niet representatief voor de complexe 3D-structuur die in het hart aanwezig is. Bovendien is de onvolwassenheid van hiPSC-CMs een obstakel gebleven, waardoor het tekortschiet in het nabootsen van het biologische en fysiologische fenotype van de in vivo cardiovasculaire omgeving.

Er zijn nieuwe 3D in vitro modellen ontwikkeld waarbij hiPSC-CMs nauwer fysiologisch gedrag vertonen, zoals zelforganisatie 11,12, extracellulaire matrix (ECM) remodellering13, verbeterde rijping 14,15,16 en gesynchroniseerde contractie17,18,19 . 3D-modellen zijn gebruikt voor het ontdekken van geneesmiddelen, het testen van cardiotoxiciteit van geneesmiddelen, ziektemodellering, regeneratieve therapieën en zelfs de eerste klinische onderzoeken 20,21,22,23,24. Een van de meest gebruikte modellen is het op fibrine gebaseerde gemanipuleerde hartweefsel (EHT), dat een weefselachtige opstelling en cardiale contractiliteit vertoont13,17,25. Eerder toonden we aan dat EHTs gegenereerd uit uitgebreide hiPSC-CMs een vergelijkbare contractiliteit vertoonden als die van niet-uitgebreide hiPSC-CMs, wat een compromisloze cellulaire functionaliteit na expansie9 aantoonde. Hoewel de generatie van EHT's uit hiPSC-CMs goed is ingeburgerd, worden echter verdere ontwikkelingen verwacht met betrekking tot de oprichting van een HT-beoordelingsplatform. Hier zorgt de snelle generatie van grote aantallen zelfaggregerende cardiale sferoïden (CSs) in 96-well-formaat voor een verbetering van 3D-omstandigheden voor high-throughput screening (HTS) -doeleinden.

Over het algemeen is het voordeel van CSs als 3D-celcultuur hun hoge reproduceerbaarheid en schaalbaarheid. In het bijzonder kunnen CS'en in combinatie met robotische monsterverwerking de CS-cultuur, medicamenteuze behandeling en analyse met een hoog gehalte standaardiseren en automatiseren20. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om zeer zuivere en hoogwaardige CS'en te genereren, die efficiënt kunnen worden gecryopreserveerd en gescreend op hartfunctie door Ca2+ transiënte metingen uit te voeren met behulp van een optisch calciumacquisitie- en analysesysteem. Dit model biedt een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel om schermen met hoge doorvoer uit te voeren op honderden tot duizenden sferoïden17,18.

Protocol

OPMERKING: hiPSC-CMs die in deze studie werden gebruikt, werden gegenereerd volgens eerder beschreven hiPSC-kweek- en CM-differentiatieprotocollen26,27. Optioneel kunnen de hiPSC-CMs worden uitgebreid en gecryopreserveerd zoals onlangs gepubliceerd voordat het CS-protocol wordt gestart (sectie 4)10.

1. Bereiding van celkweekmedia, -oplossingen en -aliquots

  1. Basaal medium voorbereiden
    1. Breng penicilline-streptomycine en het medium (RPMI 1640) in evenwicht met kamertemperatuur (RT) en zorg ervoor dat het volledig is ontdooid. Meng 500 ml van het medium en 5 ml pen/streptokokken. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 8 weken; vóór gebruik in evenwicht brengen tot 37 °C.
  2. RPMI + B27 voorbereiden
    1. Breng het B27-supplement en het basale medium in evenwicht met RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig ontdooit. Meng 490 ml van het basale medium en 10 ml van het 50x B27-supplement. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken; vóór gebruik in evenwicht brengen tot 37 °C.
  3. HiPSC-CM re-plating media voorbereiden
    1. Voeg Rho-geassocieerde, coiled coil bevattende protein kinase (ROCK)-remmer (2 μM eindconcentratie) en 10% knockout serumvervanging (KSR) toe aan RPMI + B27-media. Voeg indien nodig ROCK-remmer rechtstreeks toe aan de RM-media. Bewaar geen cultuurmedia eenmaal aangevuld.
  4. Cm-ontdooimedia voorbereiden
    1. Voeg een 1:100 concentratie celoverlevingssupplement (bijv. Revitacell) en 20% KSR toe aan RPMI + B27 media en balanceer tot 37 °C voor gebruik.
  5. Rijpingssupplement voorbereiden
    1. De eerder beschreven rijpingsmedium formule28 bestaat uit: 3 mM glucose, 10 mM L-lactaat, 5 mg/ml vitamine B12, 0,82 mM biotine, 5 mM creatine monohydraat, 2 mM taurine, 2 mM L-carnitine, 0,5 mM ascorbinezuur, 1x NEAA, 0,5% (w/v) albumax, 1x B27 en 1% KOSR. Om een volle fles (500 ml) rijpingssupplement te bereiden, verwijdert u 65 ml uit een fles DMEM zonder glucose en vult u aan met 2,7 g glucose, 5,6 g L-lactaat, 0,025 mg vitamine B12, 1 mg biotine, 3,73 g creatinemonohydraat, 1,25 g taurine, 1,975 g L-carnitine, 0,7125 g ascorbinezuur, 50 ml NEAA, 12,5 g albumax en 5 ml penicilline-streptomycine.
    2. Filtreer door een steriele wegwerpfilterunit met een polyethersulfon (PES) membraan met een porie van 0,22 μm.
    3. Aliquot in 45 ml (om 500 ml rijpingsmedium te bereiden) of 4,5 ml (om 50 ml rijpingsmedium te bereiden). Bewaren bij 20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  6. Rijpingsmedia voorbereiden
    1. Evenwicht het B27-supplement, knock-out SR, penicilline-streptomycine, het rijpingssupplement28 en het DMEM-medium zonder glucose bij RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig ontdooit. Meng 435 ml van het DMEM geen glucosemedium met 10 ml van het 50x B27-supplement, 5 ml penicilline-streptomycine, 5 ml knock-out SR en 45 ml rijpingssupplement. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken; evenwicht bij 37 °C vóór gebruik.
  7. Bereid fluor helder medium
    1. Evenwicht penicilline-streptomycine en DMEM fluorobriet medium bij RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 500 ml van het DMEM fluorbriet medium met 5 ml penicilline-streptomycine. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand; evenwicht bij 37 °C vóór gebruik.
  8. Bereid de niet-ionische reinigingsmiddeloplossing
    1. Meng 20% w/v niet-ionisch wasmiddelpoeder (bijv. F-127) met PBS. Filtreer met een filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden; evenwichtig bij RT voor gebruik.
  9. Calciumkleurstof medium bereiden
    1. Meng de niet-ionische reinigingsmiddeloplossing (eindconcentratie van 0,04% v/v) en 0,1x van de calciumkleurstof (bijv. Cal520 AM) in een helder fluormedium. Voeg in een conische buis van 50 ml 10 μL Cal520 en 20 μL van de niet-ionische reinigingsmiddeloplossing toe. Meng tot het volledig is opgelost. Bewaar de oplossing in het donker voordat u deze aan de cellen toevoegt.

2. Voorbereiding van buffers

  1. Permeabilisatie- en blokkeringsbuffer voorbereiden: Deze buffer bevat 10 ml PBS, 5% wt/v BSA en 0,3% v/v Triton-X-100.
  2. Bereid de flowcytometriebuffer voor: Deze buffer bevat 50 ml PBS, 1% wt/v BSA en 0,3% v/v Triton-X-100.
  3. Flowcytometrie wasbuffer: Deze buffer bevat 50 ml PBS en 1% wt/v BSA.
  4. Spheroid washing buffer (SWB): Deze buffer bevat 1 ml Triton-X-100, 2 ml 10% (w/v in DPBS) SDS en 2 g BSA in 1 L PBS.
    OPMERKING: SWB kan maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
  5. Bereid de insluitoplossing (ES): Om 100 ml van de insluitoplossing te bereiden, mengt u 50 ml glycerol met 9,09 ml dH2O, 1 ml Tris-buffer (1 M, pH 8,0) en 200 μl EDTA (0,5 M). Voeg 22,7 g fructose toe en meng bij RT in het donker tot het is opgelost. Voeg indien helder 22,2 g fructose toe en meng tot het is opgelost. Voeg vervolgens 15 g ureum toe en meng tot het is opgelost (bewaren bij 4 °C in het donker).
  6. Pbt-buffer (PBS met Tween-20) voorbereiden. Deze buffer bevat PBS/Tween-20 (0,1% v/v). Voeg voor 1 L PBS 1 ml Tween-20 toe.

3. Bereiding van kleine moleculen

  1. Reconstitueer thiazovivine (ROCK-remmer) poeder in 10 mM aliquots van 50 μL in DMSO en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Bescherm tegen licht.
  2. Bereid 2,5 mM aliquots van 10 μL elk van Cal-520 AM in DMSO en bewaar ze bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Bescherm tegen licht.

4. Cardiale sferoïde generatie

OPMERKING: Voor grotere hoeveelheden CSs, zaad tot 1 miljoen CMs in een 6-well ultra-low attachment plaat met 2 ml hiPSC-CM re-plating media. Deze studie gebruikte minimaal 2.500 (2,5k CS) tot 20.000 (20k CS) hiPSC-CMs per put van een 96-well plaat.

  1. Bereid voor één plaat met 96 putten een celcultuur voor die minimaal 2 x 106 door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bevat)10.
  2. Wanneer de gekweekte hiPSC-CM's samenvloeiing bereiken, voegt u 0,1 ml / cm2 steriele hartloslatingsoplossing (bijv. Tryple) toe aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 15 min.
  3. Gebruik een pipet van 5 ml en dissocieer de cellen mechanisch door te spoelen met 2 ml warm basaal medium om een enkele celsuspensie te maken. Bevestig de loslating met een heldere veldmicroscoop (4x vergroting); Cellen zien er wit uit en hebben een ronde vorm.
  4. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 x g.
  5. Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 1 ml hiPSC-CM re-plating media.
  6. Gebruik een pipetpunt van 1.000 μL om de celpellet mechanisch te dissociëren. De oplossing lijkt homogeen na drie of vier mengsels. Tel de cellen. Breng de juiste hoeveelheid cellen in 100 μL van het re-plating medium over naar elke ultralage aanhechting met ronde bodem 96-putput.
  7. Plaats de plaat van CSs op een orbitale shaker bij 70 rpm in de incubator gedurende 24 uur. Stel de incubatorcondities in op 37 °C, 5% CO 2, 21% O2 en 90% vochtigheid.
  8. Zuig 50 μL medium uit elke put en voeg 100 μL RPMI + B27 medium per put toe gedurende de eerste 48 uur.
    OPMERKING: Houd altijd 50 μL van het medium in de 96-putplaat om onbedoelde aspiratie en sferoïde breuk te voorkomen.
  9. Zuig 100 μL van het medium uit elke put en voeg 100 μL van het rijpingsmedium per put toe. Houd de cellen in het rijpingsmedium en ververs het medium elke 2-3 dagen.

5. Cryopreservatie van CSs

OPMERKING: CS'en kunnen worden gecryopreserveerd voor langdurige opslag. Cryoreservatie kan worden uitgevoerd vanaf dag 3 na het genereren van CSs. CSs kunnen direct in de putten van een 96-well plaat of als een CS-suspensie in cryovialen worden gecryopreserveerd.

  1. Koel de plaat voor door de plaat 10 minuten op ijs te leggen.
  2. Centrifugeer de sferoïde plaat gedurende 3 minuten bij 70 x g.
  3. Verwijder het supernatant tot 50 μL overblijft en voeg 200 μL ijskoud hiPSC vriesmedium per put toe.
    OPMERKING: Houd de CS-suspensie op ijs voor de gehele duur van de procedure. In het geval van een 6-well plaat met sferoïden, vries één put in een 500 μL vriesmedium cryovial.
  4. Sluit de plaat af met plaatafdichtingsfolie.
    OPMERKING: De 96-putplaat moet worden opgeslagen in een polystyreendoos of, indien niet beschikbaar, kan een siliconen mal worden gemaakt zoals beschreven in stap 5.5.1.
  5. Om een gelijkmatige warmte-uitwisseling tussen de putplaat en de vriezer te garanderen, plaatst u de plaat voorzichtig in een polystyreendoos of in een siliconen mal.
    1. Om de siliconen mal voor te bereiden: Meng krachtig twee componenten van de siliciumelastomeerkit in een verhouding van 10: 1. De-bubbel de oplossing met behulp van een vacuümpomp gedurende 15-20 minuten. Giet vervolgens de oplossing in het onderste deel van de putplaat en de-bubbel met behulp van een vacuümpomp gedurende 10 minuten. Plaats de vorm in een oven en laat 8 uur uitharden bij 60 °C om een semi-flexibel elastomeer te verkrijgen dat van de plaat wordt gepeld.
  6. Vries de plaat bij -80 °C gedurende minimaal 4 uur in de polystyreendoos of de bereide siliconen mal.
  7. Breng de plaat over naar een tank met vloeibare stikstof of een vriezer van -150 °C voor langdurige opslag.

6. Ontdooien van hartsferoïden

OPMERKING: Ontdooi niet meer dan één plaat tegelijk om een snel ontdooiproces te garanderen.

  1. Bereid 20 ml voorverwarmd basaal medium van 37 °C in een conische buis van 50 ml.
  2. Verzamel de celplaat met CSs uit de vloeibare stikstof en plaats deze gedurende 15 minuten in de incubator. Stel de incubatorcondities in op 37 °C, 5% CO 2, 21% O2 en 90% vochtigheid.
  3. Verwijder het supernatant en de celkorrelresten en resuspensie elke put in een warm basaal medium. Gebruik 200 μL medium per put.
  4. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 70 x g.
  5. Herhaal stap 6.3 en 6.4.
  6. Verwijder het supernatant totdat de celkorrel overblijft en voeg 200 μL CM-ontdooimedium toe in elk putje.
  7. Plaats de plaat van CSs op een orbitale shaker bij 70 rpm in een incubator gedurende 24 uur. Stel de incubatorcondities in op 37 °C, 5% CO 2, 21% O2 en 90% vochtigheid.
  8. Zuig 50 μL van het medium uit elke put en voeg 100 μL RPMI + B27 medium per put toe gedurende de eerste 48 uur.
  9. Zuig 100 μL van het medium uit elke put en voeg 100 μL rijpingsmedium per put toe. Onderhoud de cellen in de rijpingsmedia en ververs het medium elke 2-3 dagen.

7. Beoordeling van intracellulaire Ca2+ transiënten

OPMERKING: CSs zijn in totaal 3 weken in cultuur; 2 weken voor het invriezen en 1 week na het ontdooien. De 'verse' controles zijn leeftijdsgematcht.

  1. Na 1 week kweek zijn de ontdooide CSs optimaal voor calciumverwerking van optische beeldvorming. Gebruik een calciumkleurstof (bijv. Cal520AM) om de opname en afgifte van Ca2+ uit de cellen te beoordelen.
  2. Behandel ze met 100 μL calciumkleurstofmedium per put en incubeer gedurende 60 minuten in de couveuse. Stel de incubatorcondities in op 37 °C, 5% CO 2, 21% O2 en 90% vochtigheid.
    OPMERKING: Cal520AM is lichtgevoelig. Voer alle laadprocedures en experimenten in het donker uit.
  3. Bereid het calciumacquisitie- en analysesysteem voor.
    1. Schakel de microscoop in en zorg ervoor dat de optie voor omgevingscontrole is ingeschakeld.
    2. Pas de afmetingen van de camera en het diafragma aan om het achtergrondgebied te minimaliseren.
      OPMERKING: Hier werd de Leica Thunder DMi8 microscoop gebruikt; Andere microscoopsystemen zijn ook van toepassing totdat ze een bemonsteringsfrequentie van meer dan 30 frames / seconde (FPS) mogelijk maken.
  4. Neem een video op met een consistente stroom van 2−10 pieken binnen 10 s en scan over de 96-putplaat, eerst naar links en vervolgens zigzaggend naar beneden om de hele plaat te bedekken. Meet het calciumsignaal met een 488 nm laser; Stel het contrast in op een zwarte achtergrond met een helder groen signaal tijdens de calciumafgifte.
  5. Na het verkrijgen van de Ca2+ transiënten, analyseert u de gegevens met de fluorescentiesporenanalysesoftware (bijv. CyteSeer, Vala Sciences) volgens de instructies van de fabrikant.

8. Flowcytometrieanalyses van gedissocieerde cardiale sferoïden

OPMERKING: In deze studie werd flowcytometrie gebruikt om de levensvatbaarheid van de CSs voor en na het ontdooiproces te bepalen.

  1. Verzamel de CSs in een conische buis van 15 ml met behulp van een pipet van 5 ml om sferoïde schade te voorkomen en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 70 x g. Zuig het supernatant aan en voeg 1 ml PBS toe.
  2. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g. Zuig het supernatant op en dissocieer de CSs door 1 ml hartloslatingsoplossing toe te voegen (bijv. Tryple). Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 15 min.
  3. Gebruik een pipet van 5 ml en dissocieer de cellen mechanisch door te spoelen met 2 ml basaal medium totdat afzonderlijke cellen kunnen worden gezien wanneer ze onder de microscoop worden waargenomen.
  4. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g.
  5. Zuig het supernatant aan en fixeer de CMs met 200 μL 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1x PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
  6. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g. Zuig het supernatant aan en voeg 1 ml PBS toe.
    OPMERKING: Pauzepunt: De vaste hiPSC-CMs kunnen tot 4 weken bij 4 °C worden bewaard.
  7. Breng de celsuspensie over in een FACS-buis en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g. Zuig het supernatant op en resuspensie 1 x 105 cellen in 50 μL van de permeabilisatiebuffer.
  8. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  9. Voer voor immunofluorescentie-flowcytometrieanalyse stappen 8.9.1-8.9.4 uit.
    1. Resuspendie van de cellen in de flowcytometriebuffer (50 μL) die het α-actinine-antilichaam bevat in een verdunning van 1:300. Resuspendeer in een andere FACS-buis 1 x 105 cellen in de flowcytometriebuffer (50 μL) met de respectieve isotypecontrole (bijv. FITC-muis IgM, κ-isotype [1:200 verdunning]). Resuspendeer op dezelfde manier 1 x 105 cellen in 50 μL flowcytometriebuffer voor negatieve controle.
    2. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    3. Voeg 2,5 ml flowcytometriebuffer toe en centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 4 °C op 200 x g ; Gooi het supernatant weg en herhaal deze wasstap twee keer.
    4. Resuspendeer de cellen in 50 μL flowcytometriebuffer met het secundaire-antilichaam geit-antimuis (1:300 verdunning).
      OPMERKING: Plaats de buis in het donker omdat de secundaire antilichaamoplossing lichtgevoelig is.
  10. Voor levensvatbaarheid controleren met propidiumjodide (PI), voeg 150 μL PI per monster (1:1.000) toe en incubeer gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Plaats de buis in het donker omdat de PI-oplossing lichtgevoelig is.
  11. Pas de poorten aan volgens de standaard gatingstrategie zoals weergegeven in aanvullende figuur 1 en analyseer de cellen met een flowcytometer.

9. Immunofluorescentiekleuring van hele 3D-sferoïden

OPMERKING: Dit protocol is gebaseerd op het protocol voor 3D-beeldvorming met hoge resolutie van hele organoïden bij immunofluorescente etikettering, dat eerder werd gepubliceerd29 en aangepast voor cardiale sferoïden. Tijdens de procedure kunnen alle pipetpunten en conische buizen worden gecoat met 1% wt/v BSA-PBS om te voorkomen dat de sferoïden aan kunststoffen blijven kleven. Om de materialen te coaten, duik je in de 1% BSA-PBS. Zorg ervoor dat u de sferoïden niet beschadigt door de pipet van 5 ml te gebruiken, waardoor mechanische verstoring wordt vermeden.

  1. Verzamel de CSs in een 15 ml gecoate buis met een pipet van 5 ml. De sferoïden zijn zichtbaar voor het oog. Verzamel ~20-50 sferoïden per antilichaamcombinatie. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 70 x g en zuig het supernatant op.
  2. Resuspendien de sferoïden voorzichtig in 1 ml ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1x PBS met behulp van een gecoate punt van 1 ml.
  3. Fixeren bij 4 °C gedurende 45 min. Na 20 min, resuspensie de sferoïden voorzichtig met behulp van een gecoate 1 ml tip. Dit egaliseert de fixatie tussen alle sferoïden.
  4. Voeg 10 ml ijskoude PBS toe aan de buis en meng voorzichtig door de buis om te keren. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C en draai gedurende 3 minuten bij 70 x g naar beneden.
    OPMERKING: Vanaf deze stap is het coaten van tips en conische buizen over het algemeen niet nodig, omdat CSs na fixatie niet aan de tip blijven plakken.
  5. Blokkeer de CSs door de pellet opnieuw te suspenseren in ijskoud SWB (200 μL SWB per put) en breng de sferoïden over op een 24-well suspensiecultuurplaat.
    OPMERKING: CSs van één grote pellet kunnen over meerdere putten worden verdeeld om verschillende kleuringen uit te voeren. Gebruik ~20-50 CSs per antilichaamcombinatie.
  6. Incubeer bij 4 °C gedurende ten minste 15 minuten.
  7. Voeg 200 μL van de SWB toe in een lege put om als referentieput te dienen.
    OPMERKING: Voor de immunofluorescente kleuring kunnen 48- of 96-putplaten ook worden gebruikt om het gebruik van antilichamen te verminderen. De vlek- en wasresultaten kunnen echter worden verminderd door het kleinere volume per put.
  8. Laat de sferoïden op de bodem van de plaat bezinken door de plaat gedurende 5 minuten in een hoek van 45° te laten kantelen.
  9. Verwijder de SWB en laat de CSs in 200 μL van de SWB (gebruik de referentieput om het minimale volume van 200 μL te schatten).
  10. Voeg 200 μL van de SWB toe met de primaire antilichamen 2x geconcentreerd (bijv. ɑ-actinine [1:200] en Troponine T [1:200]) en incubeer 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen/schudden (40 rpm op een horizontale shaker).
  11. Voeg de volgende dag 1 ml van de SWB toe aan elk putje.
  12. Laat de sferoïden onderaan de plaat bezinken door de plaat gedurende 5 minuten in een hoek van 45° te laten staan.
  13. Verwijder de SWB en laat 200 μL in de plaat zitten. Voeg 1 ml SWB toe en was gedurende 2 uur met langzaam schommelen/schudden.
  14. Herhaal stap 9.12 en 9.13 nog tweemaal.
  15. Laat de CS'en aan de onderkant van de plaat bezinken door de plaat gedurende 5 minuten op 45° gekanteld te laten. Verwijder de SWB en laat 200 μL in elk putje achter
  16. Voeg 200 μL van de SWB toe met secundaire antilichamen, geconjugeerde antilichamen en kleurstoffen 2x geconcentreerd (bijv. DAPI [1 μg / ml], muis-AF488 [1:500], konijn-AF568 [1:500]), en incubeer 's nachts bij 4 °C in het donker, terwijl u langzaam schommelt / schudt.
  17. Herhaal stap 9.12 en 9.13 de volgende dag nog tweemaal.
  18. Breng de CSs voorzichtig over in een buis van 1,5 ml en draai gedurende 3 minuten op 70 x g .
  19. Verwijder zoveel mogelijk van de SWB door pipetteren zonder de CS'en te verstoren.
  20. Voeg de inbeddingsoplossing (ES; ten minste 50 μL, bij RT) toe met behulp van een tip van 200 μL waarvan het uiteinde is afgesneden en resuspensie voorzichtig om bubbelvorming te voorkomen en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
  21. Maak in de tussentijd een vierkante container op een glasplaat met nagellak of siliconenkit.
  22. Snijd het uiteinde van een tip van 200 μL af en breng de CSs in ES over naar het midden van de vierkante container.
  23. Leg er een vierkante dekplaat op. Om luchtbellen te verminderen, plaatst u eerst de ene kant van de coverslip, laat u de coverslip vervolgens langzaam van de ene kant naar de andere zakken totdat er geen ingesloten lucht onder het oppervlak is en laat u vervolgens de coverslip los.
  24. Duw zachtjes op alle randen van de coverslip om deze af te dichten op de nagellak of siliconenkit.
  25. Laat de dia een nacht staan bij RT. De volgende dag is de dia klaar voor beeldvorming.
    OPMERKING: Optische clearing door de ES kan kleine weefselkrimp veroorzaken. Dit kan echter geen invloed hebben op de algehele morfologie van de CS'en. De kleuringsprocedure kan hier worden gepauzeerd door de dia's te bewaren bij 4 °C (gedurende ten minste 1 week) of bij -20 °C (gedurende ten minste 6 maanden).

Representative Results

Het protocol in figuur 1A beschrijft het genereren van CSs uit eerder uitgebreide hiPSC-CMs. De CS'en krijgen een 3D-structuur op dag 1 na het zaaien in ultralage aanhechtingsplaten met ronde bodem en kunnen tot 6 weken worden gekweekt (figuur 1B). Zoals beoordeeld door immunofluorescentiekleuring, drukte de meerderheid van de cellen in 3 weken oude CSs sarcomerische eiwitten zoals α-actinine en troponine T uit en vertoonde een regelmatige sarcomeerorganisatie (figuur 1C). Voor de kwantificering van α-actininepositieve cellen werd flowcytometrie-analyse uitgevoerd. In overeenstemming met de immunofluorescentieresultaten toonden de flowcytometriegegevens vergelijkbare hoge niveaus van α-actinine in zowel dag 0 (76,9% ± 16,6%) als 3 weken oude CSs (71,1% ± 22,7%) (figuur 1D), wat wijst op een constante en zeer zuivere cellulaire samenstelling tijdens het kweken. Er was een verhoogde expressie van de cardiale genen voor junctions (GJA1, JPH2 en PKP2), desmosomen (DES) en mitochondriën (ATP5A) in hiPSC-CM afgeleide sferoïden (dag 42) versus hiPSC-CMs gekweekt in 2D gedurende 90 dagen (figuur 1E). De expressie van deze genen is een kenmerk van cel-cel interactie en rijping30.

Vervolgens werden de functionele eigenschappen van CS'en, namelijk slagsnelheid en Ca2+ handling, op verschillende tijdstippen beoordeeld (figuur 2). Calciumtransiënte parameters zoals stijgingstijd, piektijd, vervaltijd en calciumtransiënte duur (CTD90) werden geëvalueerd zoals aangegeven in figuur 2A, B. Het percentage verslaande CSs is vergelijkbaar in de eerste 3 weken na de generatie, maar daalde aanzienlijk in week 6 (Wk6) CSs (Figuur 2C). Het slagpercentage was aanzienlijk verminderd bij Wk3 in vergelijking met Wk1 en, vergelijkbaar met het percentage verslaande CS's, dramatisch gedaald bij Wk6 (Figuur 2D). Bij Wk6 werd CS-verslechtering waargenomen, wat de daling van zowel de slagsnelheid als het aantal kloppende CS'en kan verklaren. Meting van calciumtransiënte parameters wees op een significant hogere piekwaarde bij Wk2 (figuur 2E), terwijl de stijgingstijd, vervaltijd en CTD90 significant waren toegenomen bij Wk3 in vergelijking met Wk1 (figuur 2F-H ). Samen laten deze resultaten zien dat hiPSC-CM-afgeleide sferoïden functioneel optimaal zijn rond week 2 en 3 na generatie.

Figuur 3 toont het effect van de sferoïde grootte op de klopsnelheid en calciumbehandeling. CSs werden gegenereerd door 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 en 20 x 10 4 hiPSC-CMs in een put van een 96-well plaat te zaaien voor een totaal van 24 CSs / putten per conditie (figuur 3A). Zoals verwacht nam de sferoïde grootte toe naarmate het aantal gebruikte cellen toenam, variërend van 178 ± 36 μm tot 351 ± 65 μm (figuur 3A, rechterpaneel). Ca2+ transiënten werden gemeten in 3 weken oude CSs bij de vier verschillende zaaidichtheden (figuur 3B). Metingen van het verslaan van CSs gaven aan dat slechts ongeveer 50% van de kleinere size-CSs (2.5K- en 5K-CSs) werden geslagen, terwijl het percentage grotere size-beating CSs (10K- en 20K-CSs) significant hoger was (ongeveer 85%) (Figuur 3C). Een vergelijkbare slagsnelheid (ongeveer 28 bpm) werd getoond door 5K-, 10K- en 20K-CSs, wat significant hoger was in vergelijking met 2.5K-CSs (Figuur 3D). De piekwaarden van calciumbeelden waren vergelijkbaar in alle geteste omstandigheden (figuur 3E), maar de stijgingstijd (figuur 3F), de vervaltijd (figuur 3G) en CTD90 (figuur 3H) waren significant verhoogd in grotere cs's (10K- en 20K-CSs) in vergelijking met de kleinere (2,5K- en 5K-CSs). Samen tonen deze resultaten aan dat hiPSC-CM-afgeleide sferoïden optimaal zijn voor calciumbehandelingsscreening wanneer een zaaidichtheid tussen 10K- en 20K hiPSC-CMs / put wordt gebruikt.

Vervolgens evalueerden we de impact van cryopreservatie op de levensvatbaarheid en functie van CS. Vóór de analyse werden ontdooide CSs gedurende 1 week in cultuur gehouden (figuur 4A). Zoals blijkt uit zowel flowcytometrie (figuur 4B) als calceïne-AM (figuur 4C) cel levensvatbaarheidstests, had cryopreservatie geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen binnen de CSs. Bovendien vertoonden ontdooide CSs vergelijkbare expressieniveaus van sarcomerische eiwitten in vergelijking met de verse leeftijdsgematchte CSs (figuur 4D). Deze gegevens geven aan dat CSs efficiënt kunnen worden gecryopreserveerd voor daaropvolgende hartfunctieanalyse en high-throughput screening.

Ten slotte werden de klopactiviteit en Ca2+ handling gemeten in zowel verse als gecryopreserveerde CSs (figuur 5). Het percentage kloppende CSs werd gemeten op verschillende tijdstippen na het ontdooien, respectievelijk na 2, 5 en 7 dagen. Terwijl de meeste verse CSs in de loop van de tijd klopactiviteit vertoonden, hadden de gecryopreserveerde CSs duidelijk tot 1 week kweken nodig om hun kloppende activiteit te herstellen (figuur 5B). Er was geen significante verandering in de slagsnelheid van ontdooide CSs versus vers; er werd echter geen spontane klopactiviteit waargenomen in sommige bevroren CSs (figuur 5C). Hoewel de piekwaarden significant waren verlaagd in bevroren/ontdooide CSs in vergelijking met vers (figuur 5D), werden er geen significante veranderingen waargenomen in stijgingstijd, vervaltijd en de CTD90 van bevroren/ontdooide CSs in vergelijking met verse (figuur 5E-G). Deze gegevens geven aan dat het na het ontdooien belangrijk is om de CS'en minstens 1 week in de couveuse te laten herstellen voordat de klopactiviteit en Ca2+ van voorbijgaande aard worden gemeten.

Samen tonen deze resultaten aan dat cryopreservatie van hiPSC-CM-afgeleide sferoïden de levensvatbaarheid van cardiomyocyten, de sarcomerische structuur en hun functionele kenmerken zoals spontane klopactiviteit en calciumbehandeling behoudt. HiPSC-CM-afgeleide sferoïden vormen dus een geschikt model om de cardiale elektrofysiologie in vitro nauwkeurig samen te vatten.

Figure 1
Figuur 1: Generatie van cardiale sferoïden. (A) Schematische weergave van op Wnt gebaseerde gerichte cardiale differentiatie, de daaropvolgende uitbreiding van hiPSC-CMs en het genereren van CSs. Gemaakt met biorender.com. (B) Bright-field beelden op verschillende tijdstippen van CS kweek. Schaalbalk, 200 μm. Wk staat voor week. (C) Representatieve immunofluorescentiebeelden voor cardiale sarcomerische eiwitten α-actinine en troponine T in 3 weken oude CSs. Immunofluorescentie: Hoechst (blauw), α-actinine (groen) en troponine T (rood). Schaalbalk, 200 μm. De ingezoomde samengevoegde afbeelding aan de rechterkant toont de sarcomeerorganisatie. Schaalbalk, 50 μm. (D) Flowcytometriekwantificering van α-actininepositieve cellen vóór (dag 0) en 3 weken na de vorming van CSs. (n = 14-23 per aandoening. (E) RT-qPCR uitgevoerd op hiPSC-CMs gekweekt gedurende 90 dagen (2D) en sferoïde monsters gekweekt gedurende 42 dagen om expressieniveaus vast te stellen van verschillende hartgenen gerelateerd aan celverbindingen, intermediaire filamenten en mitochondriën. (n = 1-3 batches). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. NS (niet-significant) zoals berekend door een ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Slagsnelheid en calciumbehandeling in CSs op verschillende weken na generatie. (A) Voorbeelden van calciumtransiënte parameters berekend door het Vala sciences analysealgoritme in Cyteseer Software. (B) Representatieve calciumtransiënte sporen en time-lapse-beelden van de CSs op verschillende tijdstippen (weken) na de generatie. Schaalbalk, 200 μm. (C) De kwantificering van het tijdsverloop van spontane klopactiviteit wordt uitgedrukt als het percentage kloppende CS'en. (D) Slagsnelheid van CSs tijdens kweektijd. (E-H) Kwantificering van de calciumtransiënten met piekwaarde, stijgingstijd, vervaltijd en CTD90. De getoonde gegevens zijn gemiddeld ± SD. Biologische replicaties = drie, technische replicaties = respectievelijk 38, 50, 66 en 7. *p < 0,05, ****p < 0,001; eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc multiple-vergelijkingstest. Afkortingen; CTD = calcium voorbijgaande duur, Wk = week, CSs = menselijke cardiale sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Slagsnelheid en calciumbehandeling in CSs gegenereerd met behulp van verschillende celzaaidichtheden. (A) Bright-field imaging (links) en groottemetingen (rechts) van CSs gegenereerd met behulp van verschillende aantallen hiPSC-CMs. Schaalbalk, 200 μm. (B) Representatieve calciumtransiënte sporen en time-lapse beelden van de 2.5K-20K-CSs. (C,D) Slagpercentage en slagpercentage van 2.5K-20K-CSs. (E-H) Piekwaarde, stijgtijd, vervaltijd en CTD90 in 2.5K-20K-CSs. De gegevens zijn gemiddeld ± SD. Biologische replicaties = drie, technische replicaties = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc multiple-vergelijkingstest. Afkortingen: CTD = calcium transient duration, Wk = week, k = x 1.000 cellen, CSs = cardiale sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. Effect van cryopreservatie op de levensvatbaarheid en structuur van cardiale sferoïden. (A) Schematische weergave van CS-generatie, daaropvolgende biobanking en ontdooiing. (B) Levensvatbaarheidstest van flowcytometriecellen in zowel verse als gecryopreserveerde CSs. Als positieve controle werd een behandeling met 10% Triton-X-oplossing gedurende 5 minuten gebruikt. (n = 4 per voorwaarde). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. * ***p < 0,001; eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc multiple-vergelijkingstest. (C) Calceïne-AM cel levensvatbaarheidstest in verse versus ontdooide CSs na 7 dagen kweken (n = 15-17 per aandoening, ** **p < 0,001, door gepaarde t-test; schaalbalk, 200 μm). (D) Representatieve bright-field (links) en immunofluorescentiekleuring voor α-actinine en troponine T-expressie in verse en ontdooide CSs. Immunofluorescentie: Hoechst (blauw), α-actinine (groen) en troponine T (rood). De samengevoegde afbeeldingen aan de rechterkant tonen sarcomeerstrepen in de CSs. Schaalbalk, 50 μm. Afkortingen: X = ontdooidag naar keuze, PI = propidiumjodide, Cal-AM = calceïne-AM, EthD-I = Ethidium Homodimeer I. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Calciumtransiënten in verse versus ontdooide CSs. (A) Representatieve calciumtransiënte sporen en time-lapse beelden van de CSs vóór cryopreservatie en 1 week na ontdooiing. (B) Klopppercentage verse en bevroren/ontdooide hartsferoïden. Balken vertegenwoordigen individuele experimenten. (C) Kloppsnelheid van verse en bevroren/ontdooide hartsferoïden. (D-G) Kwantificering van calciumtransiënte parameters: piekwaarde, stijgingstijd, vervaltijd en CTD90. De gegevens zijn gemiddeld ± SD. *p < 0,05, ****p < 0,001; eenrichtingsverkeer ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc multiple-vergelijkingstest. Afkortingen; CTD = calcium voorbijgaande duur, CSs = cardiale sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Representatieve gatingstrategieën voor flowcytometrie-analyse. (A) Representatieve gatingstrategie voor α-actininepositieve hiPSC-CMs in een zuivere populatie versus negatieve controle en isotypecontrole. Het aantal α-actinine positief geanalyseerde cellen is 25 x 105. Afkortingen; SSC = side scatter, PI+ = propidiumjodide positief. (B) Representatieve gatingstrategie voor de levensvatbaarheidsanalyse in zowel verse, ontdooide, de positieve controle (Triton-X) als de negatieve controle (niet-gekleurd). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De ontdekking van cardiale geneesmiddelen wordt belemmerd door een afhankelijkheid van niet-menselijke dierlijke en cellulaire modellen met onvoldoende doorvoer en fysiologische betrouwbaarheid om nauwkeurig uitlezingen uit te voeren. hiPSC-CM-biologie in combinatie met HT-instrumentatie en fysiologische sondes heeft het potentieel om menselijke modellen opnieuw te introduceren in de vroegste stadia van hartziektemodellering en medicijnontdekking. We hebben een 3D-methode voor het genereren van hartweefsel ontwikkeld die hoogwaardige en functionele CS's produceert voor een optimaal platform voor het modelleren van hartziekten en het screenen van geneesmiddelen. Bovendien maakt het combineren van de sferoïde technologie in 3D-bioreactorsystemen voor industriële EV-productie een noodzakelijke stap mogelijk in de richting van de klinische vertaling van EV-gebaseerde therapie. De hier beschreven methode is gebaseerd op verschillende cruciale factoren en is een variant van bestaande protocollen 9,10,28,29. Deze methoden omvatten: 1) het genereren van 3D-weefselconstructies, 2) het optimale celnummer en de timing vóór de screening, 3) het verbeteren van de gevoeligheid en hoge doorvoercapaciteit van instrumenten, en 4) het kunnen bevriezen van de sferoïden vóór elke functionele analyse. In tegenstelling tot eerder beschreven protocollen, beschrijft het voorgestelde protocol de generatie van maximaal 1.500 sferoïden per dag en de geschiktheid voor HTS. Conventionele analyse van honderd verbindingen over 6 x 0,5 logdoses voor 10 replicaties met behulp van bestaande 96-well calciumbeeldvormingssystemen of 24-well multiplexed engineered hartweefsels vereisen ongeveer 500 miljoen tot 3 miljard hiPSC-CMs31,32. De voorgestelde toepassing maakt hartscreenings minder duur en tijdeffectief in vergelijking met de conventionele systemen, omdat de 96-putplaten slechts 10% van de zaaidichtheid nodig hadden in vergelijking met de beschreven methode. Bovendien maakt het genereren van sferoïden door zelfaggregatie in ultralage bevestigingsplaten, in vergelijking met eerdere protocollen, zoals de hanging-drop-methode, hoogwaardige geautomatiseerde beeldvorming van afzonderlijke microtissues mogelijk33.

Dit kleine 3D-model bootst het biologische en fysiologische fenotype van de in vivo cardiovasculaire omgeving na. Zoals eerder aangetoond, nemen calciumtransiënten dramatisch toe in 3D-hartweefselconstructies in vergelijking met 2D-monolaagse celculturen34.

Vervolgens ontdekten we dat de zaaidichtheid en de juiste kweektijd ook kritische factoren zijn voor een succesvolle CS-screening. De dichtheden van 10K-20K hiPSC-CMs per sferoïde en screening tussen week 2-3 na generatie waren optimaal, terwijl te kleine of te oude sferoïden een verstoorde calciumbehandeling vertonen (figuur 2 en figuur 3). Daarom is het van belang om de zaaidichtheden zo consistent mogelijk te houden, omdat de grootte de functionele parameters beïnvloedt. Hoewel deze optische methode goede resultaten oplevert voor levende 3D-culturen als geheel weefsel, is het verkrijgen van gegevens binnen grotere sferoïden op (sub-)cellulair niveau een uitdaging zonder te vertrouwen op tijdrovende histologische methoden. Onlangs zijn verschillende benaderingen gepubliceerd die "optisch clearing" gebruiken, wat de verwerving van hele 3D-sferoïden mogelijk maakt met de mogelijkheid voor eencellige kwantificering van markers. Hier hebben we een 3-daags protocol aangepast van CS-oogst naar beeldanalyse, dat is geoptimaliseerd voor 3D-beeldvorming met behulp van confocale microscopie29 (figuur 1C en figuur 4D).

Ten slotte, met de toename van 3D-hartweefseltoepassingen en commerciële toepassingen, stijgt de vraag naar langdurige opslag en patiëntspecifieke biobanking van verschillende donoren. Cryopreservatie is een effectieve strategie om HTS-platen te genereren uit meerdere batches in de loop van de tijd. Het invriezen van hiPSC-CMs is eerder beschreven en verschilt niet van andere gekweekte celtypen 10,35,36. Onlangs zijn benaderingen voor het bevriezen van platen met 2D-cellen beschreven37. Hier vonden we dat de PSC-cryopreservatiekit de meest optimale conditie is in vergelijking met drie andere (gegevens niet getoond) en gebruikten we dit medium voor het efficiënt invriezen van sferoïden. Na cryopreservatie blijft de levensvatbaarheid hoog (figuur 4B,C), maar de elektrofysiologische eigenschappen van CSs worden aangetast en een periode van incubatie na ontdooien is vereist. Inderdaad, 1 week na het ontdooien vertoonden CSs spontane klopactiviteit en calciumbehandeling. Er is echter beschreven dat verse en teruggewonnen hiPSC-CM's niet altijd identieke moleculaire en fysiologische eigenschappen vertonen38. Met deze beperking moet rekening worden gehouden wanneer gecryopreserveerde hiPSC-CM's worden gebruikt voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde cardiale uitlezingen. Bovendien, hoewel we het aantal cellen per sferoïde en de optimale timing van de calciumtransiënte beeldvorming effectief moduleren, kunnen de cardiale sferoïden worden verbeterd door hiPSC-afgeleide cardiomyocytcellen te mengen met endotheelcellen, fibroblasten, celcelverbindingen en extracellulaire matrices, zoals chitosan, collageen IV, fibronectine, matrigel of laminine, waarbij de in vivo cardiale omgeving wordt nagebootst39, 40. Over het algemeen stellen we een stapsgewijs protocol voor om efficiënt CS'en te genereren die geschikt zijn voor downstream-toepassingen zoals ziektemodellering en HT-medicijnscreening.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen graag VALA-wetenschappen erkennen voor het Cyteseer-softwarepakket en de optimalisatie van de geautomatiseerde 3D-calciumanalyse. We willen de subsidiesteun van de stichting PLN (RM) erkennen. P.A.D. en F.S. worden ondersteund door CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. wordt ondersteund door H2020-EVICARE (#725229) van de European Research Council (ERC). J.W.B. wordt ondersteund door het UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship en CVON-Dosis young talent grant; Hartstichting Nederland (CVON-Dosis 2014-40). N.C. wordt ondersteund door het Zwaartekrachtprogramma "Materials Driven Regeneration" van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (RegmedXB #024.003.013) en de Marie Skłodowska-Curie Acties (Subsidieovereenkomst RESCUE #801540). V.S.-P. wordt ondersteund door het Alliance Fund (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. wordt ondersteund door het door de EU gefinancierde project BRAVE (H2020, ID:874827)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 wells suspenion plate  Corning  3738
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate Corning CLS3474-24EA
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibody Sigma-Aldrich A7811 Dilution: 1:200
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932) Abcam ab45932 Dilution: 1:200
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich A8960
B-27 supplement  Thermo Fisher Scientific 17504-044
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Bovine serum albumin fraction V (BSA) Roche 10735086001
Cal-520, AM  Abcam ab171868
Confocal microscope Leica  DMi8 
Confocal microscope software  Leica  Las X
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Creatine monohydrate  Sigma-Aldrich C3630
DAPI  Thermo Fisher Scientific D3571 Concentration: 1 µg/mL
DMEM no glucose  Thermo Fisher Scientific 11966025
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Fructose  Sigma-Aldrich 76050771.05
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glycerol Boom 76050771.05
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A11011 Dilution: 1:500
Horizontal shaker IKA 4003000
Human induced pluripotent stem cell lines (Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank) CVI-273 (control 1)
Human induced pluripotent stem cell lines Germany  141 (control 2) 144 (control 3)
Hydrochloric acid (HCl)  Ajax Firechem 265.2.5L-PL 10 M stock solution, corrosive
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotype BD 556652
KnockOut Serum Replacement  Thermo Fisher Scientific 10828 Protect from light
L-carnitine Sigma-Aldrich C0283
Myocyte calcium and contractility system Leica  Thunder, DMi8
Non essential amino acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6 Santa Cruz SC281692 Hazardous
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin/streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140
PES Membrane Vacuum Filter system Corning  431097
PI/RNase Staining Solution Invitrogen F10797 Dilution: 1:1000
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific A2644601
RevitaCell Thermo Fisher Scientific A2644501
RPMI 1640 medium  Thermo Fisher Scientific 11875
Silicone Elastomer Kit SYLGARD 184
Sodium dodecyl sulfate solution (10%) Sigma-Aldrich 71736
Sodium L-Lactate Sigma-Aldrich 71718
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Tris Fisher  Scientific  11486631
Triton X-100 Merck X100-1L Hazardous
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
TrypLE Select Enzyme (10x) Thermo Fisher Scientific A1217701
Tween-20  Sigma-Aldrich P1379
Urea  Sigma-Aldrich 51456
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V6629
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Tocris  1254 Protect from light

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burridge, P. W., et al. Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  4. Paige, S. L., et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).
  5. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  6. Ahmed, R. E., et al. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).
  7. Liu, C., et al. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76, 103813 (2022).
  8. Musunuru, K., et al. Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).
  9. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  10. Maas, R. G. C., et al. Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).
  11. Tremblay, C., et al. A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).
  12. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).
  13. Goldfracht, I., et al. Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications. Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).
  14. Fleischer, S., et al. Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup. Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).
  15. Branco, M. A., et al. Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture. Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).
  16. Ergir, E., et al. Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture. bioRxiv. , (2022).
  17. Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).
  18. Kofron, C. M., et al. A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues. Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).
  19. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  20. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  21. Tenreiro, M. F., et al. Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).
  22. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).
  23. McDermott-Roe, C., et al. Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).
  24. National Library of Medicine (U.S.). Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure. National Library of Medicine. , Identifier NCT04396899 (2020).
  25. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  26. Oh, J. G., et al. Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization. Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).
  27. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  28. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  29. van Ineveld, R. L., et al. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
  30. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: New phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  31. Ding, B., et al. Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro. Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).
  32. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).
  33. Amaral, R. L. F., et al. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
  34. Daily, N. J., et al. Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture. Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).
  35. Preininger, M. K., et al. Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).
  36. Kim, Y. Y., et al. Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition. Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).
  37. Daily, M. I., et al. Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation. Cryobiology. 93, 62-69 (2020).
  38. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  39. Yeh, H. -Y., et al. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  40. Scalise, M., et al. From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).

Tags

Bio-engineering Nummer 193
Generatie, high-throughput screening en biobanking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiale sferoïden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maas, R. G. C., Beekink, T.,… More

Maas, R. G. C., Beekink, T., Chirico, N., Snijders Blok, C. J. B., Dokter, I., Sampaio-Pinto, V., van Mil, A., Doevendans, P. A., Buikema, J. W., Sluijter, J. P. G., Stillitano, F. Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids. J. Vis. Exp. (193), e64365, doi:10.3791/64365 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter