Summary
Een muischirurgisch model om reperfusie (IR) -letsel in de linkerlong te creëren met behoud van ventilatie en het vermijden van hypoxie.
Abstract
Ischemie reperfusie (IR) letsel is vaak het gevolg van processen die een voorbijgaande periode van onderbroken bloedstroom met zich meebrengen. In de long maakt geïsoleerde IR de experimentele studie van dit specifieke proces mogelijk met voortgezette alveolaire beademing, waardoor de samengestelde schadelijke processen van hypoxie en atelectase worden vermeden. In de klinische context wordt longischemie reperfusieletsel (ook bekend als long IRI of LIRI) veroorzaakt door tal van processen, waaronder maar niet beperkt tot longembolie, gereanimeerd hemorragisch trauma en longtransplantatie. Er zijn momenteel beperkte effectieve behandelingsopties voor LIRI. Hier presenteren we een omkeerbaar chirurgisch model van long-IR met eerst orotracheale intubatie gevolgd door unilaterale linkerlongischemie en reperfusie met geconserveerde alveolaire ventilatie of gasuitwisseling. Muizen ondergaan een linker thoracotomie, waarbij de linker longslagader wordt blootgesteld, gevisualiseerd, geïsoleerd en gecomprimeerd met behulp van een omkeerbare slipknot. De chirurgische incisie wordt vervolgens gesloten tijdens de ischemische periode en het dier wordt gewekt en geëxtubeerd. Met de muis die spontaan ademt, wordt reperfusie tot stand gebracht door de slipknot rond de longslagader vrij te maken. Dit klinisch relevante overlevingsmodel maakt de evaluatie mogelijk van long-IR-letsel, de resolutiefase, stroomafwaartse effecten op de longfunctie, evenals twee-hit modellen met experimentele pneumonie. Hoewel technisch uitdagend, kan dit model in de loop van een paar weken tot maanden onder de knie worden gehouden met een uiteindelijke overleving of succespercentage van 80% -90%.
Introduction
Ischemie reperfusie (IR) letsel kan optreden wanneer de bloedstroom wordt hersteld naar een orgaan of weefselbed na een periode van onderbreking. In de longen kan IR geïsoleerd optreden of in combinatie met andere schadelijke processen zoals infectie, hypoxie, atelectase, volutrauma (van hoge getijdenvolumes tijdens mechanische beademing), barotrauma (hoge piek of aanhoudende druk tijdens mechanische ventilatie) of stomp (niet-penetrerend) longkneuzingsletsel 1,2,3 . Er blijven verschillende hiaten in onze kennis over de mechanismen van LIRI en de impact van gelijktijdige processen (bijvoorbeeld infectie) op LIRI-uitkomsten, en ook de behandelingsopties voor LIRI zijn beperkt. Een in vivo model van pure LIRI is nodig om de pathofysiologie van long-IR-letsel in isolatie te identificeren en om de bijdrage ervan aan elk multi-hit proces waarvan longletsel een onderdeel is, te bestuderen.
Murine lung IR-modellen kunnen worden gebruikt om de longspecifieke pathofysiologie van meerdere processen te bestuderen, waaronder longtransplantatie3, longembolie4 en longletsel na hemorragisch trauma met reanimatie5. Momenteel gebruikte modellen omvatten chirurgische longtransplantatie6, hilar clamping7, ex vivo longperfusie8 en geventileerde long IR9. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor een murine geventileerd long IR-model van steriel longletsel. Er zijn meerdere voordelen van deze aanpak (figuur 2), waaronder dat het minimale hypoxie en minimale atelectase induceert, en het is een overlevingschirurgiemodel dat langetermijnstudies mogelijk maakt.
Redenen om dit model van LIRI te kiezen boven andere modellen zoals de hilar clamping en ex vivo perfusiemodellen zijn de volgende: dit model minimaliseert de inflammatoire bijdragen van atelectase, mechanische ventilatie en hypoxie; het behoudt cyclische ventilatie; het onderhoudt een intact in vivo bloedsomloop immuunsysteem dat kan reageren op de IR-verwonding; en ten slotte, als overlevingsprocedure, maakt het de analyse op langere termijn mogelijk van de mechanismen van secundaire letselgeneratie (2-hitmodellen) en letseloplossing. Over het algemeen geloven we dat dit geventileerde long IR-model de "zuiverste" vorm van IR-letsel biedt die experimenteel kan worden bestudeerd.
Andere publicaties hebben het gebruik van orotracheale intubatie van muizen beschreven om IT-injecties of installaties uit te voeren10,11, maar niet als uitgangspunt voor een overlevingsoperatie zoals in dit model. De plaatsing van een orotracheale buis maakt het mogelijk om longchirurgie uit te voeren door de instorting van de operatieve long mogelijk te maken. Het maakt ook de herflatie van de long aan het einde van de procedure mogelijk, wat van cruciaal belang is voor de pneumothorax en voor het vermogen van de muis om terug te keren naar spontane ventilatie aan het einde van de procedures. Ten slotte is het verwijderen van de beveiligde orotracheale buis een eenvoudige procedure die, in tegenstelling tot een invasieve tracheotomie, compatibel is met een overlevingsoperatie. Dit maakt onderzoek op langere termijn mogelijk dat gericht is op het begrijpen van de progressie en oplossing van LIRI en bijbehorende aandoeningen, evenals het creëren van chronische letselmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hieronder beschreven procedures en stappen zijn goedgekeurd door de institutional animal care and use committee (IACUC) van de University of California San Francisco. Elke muizenstam kan worden gebruikt, hoewel sommige stammen een robuustere ir-ontstekingsreactie van de longen hebben in vergelijking met andere12. Muizen die ongeveer 12-15 weken oud (30-40 g) of ouder zijn, verdragen en overleven de LONG IR-operatie beter dan jongere muizen. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen voor deze operaties worden gebruikt.
1. Muis Intubatie Protocol
- Anesthesie en voorbereiding op intubatie
- Veeg de buik van de muis af met een ethanoldoekje. Verdoof de muis met een intraperitoneale injectie van tribroomethanol (250-400 mg/kg). Beoordeel de juiste diepte van de anesthesie door het ontbreken van een pedaalonttrekkingsreflex. Plaats nu of later oogsmeerzalf (stap 2.1.4).
OPMERKING: Voor deze procedure biedt tribroomethanol (en etomidaat als alternatieve optie) een stabiel anesthetisch vlak zonder de hemodynamische omstandigheden te beïnvloeden die nodig zijn voor deze operatie. Dit verdovingsmiddel wordt slechts eenmaal gebruikt om het risico op peritoneale verklevingen te voorkomen. Isofluraan zou ook gebruikt kunnen worden, maar dat gebruiken we hier niet. De behandelaar is vrij om elk verdovingsrecept te gebruiken dat hij geschikt acht. - Plaats de verdoofde muis op een intubatiestandaard of plastic steun in rugligging, opgehangen door de bovenste snijtanden op lusvormige 4-0 hechtingen (zijde of andere) over twee steunankers.
- Om de muis geïmmobiliseerd te houden tijdens de intubatieprocedure, plakt u het onderste deel van de borst (of beide bovenste ledematen) losjes op het platform.
- Plaats het fiberoptische flexibele licht voorzichtig op de luchtpijp van de muis, iets onder de stembanden. Pas het verlichtingsniveau zo aan dat alleen een donker veld zichtbaar is wanneer u in de orofarynx van de muis kijkt, behalve rood licht dat van onder de stembanden komt, wat het doel voor de uiteindelijke plaatsing van de endotracheale buis aantoont. Merk op dat stembandbewegingen zichtbaar moeten zijn met het blote oog of, indien nodig, onder vergroting.
- Veeg de buik van de muis af met een ethanoldoekje. Verdoof de muis met een intraperitoneale injectie van tribroomethanol (250-400 mg/kg). Beoordeel de juiste diepte van de anesthesie door het ontbreken van een pedaalonttrekkingsreflex. Plaats nu of later oogsmeerzalf (stap 2.1.4).
- Intubatieprocedure
- Houd het pincet vast met de dominante hand en gebruik ze om de tong voorzichtig vast te pakken en uit de mondholte te trekken.
- Open de onderkaak met behulp van een tang die door de niet-dominante hand wordt vastgehouden en duw vervolgens de tang in het strottenhoofd om de epiglottis voorzichtig op te tillen. Laat op dit moment de tong los van het pincet.
- Zoek naar de stembanden. Ze moeten openen en sluiten volgens elke ademhaling. Houd de canule vast met de geleidingsdraad vooraf geladen en steek de punt van de draad door de stembanden.
- Wees heel voorzichtig om de draad niet te verplaatsen door een deel ervan vast te houden dat zich buiten de canule bevindt, maar net boven de stembanden, trek de canule terug en laat alleen de draad op zijn plaats met het distale uiteinde in de luchtpijp.
- Voer op dit punt een tweede visualisatie van de stembanden uit om te bevestigen dat de distaalpunt van de draad door de verlichte stembanden en in de luchtpijp blijft en zich niet in de onverlichte slokdarm bevindt.
- Houd de draad buiten de mond met de gebogen tang in de linkerhand, gestabiliseerd tegen een hard oppervlak, en beweeg de 20G-katheter voorzichtig met tapevleugels over de draad.
- Zodra het distale uiteinde van de draad uit het achterste uiteinde van de 20G-katheter of endotracheale buis komt, houdt u dat uiteinde vast met de gebogen tang en brengt u de 20G-katheter soepel in de luchtpijp.
- Verwijder voorzichtig de draad van het distale uiteinde van de 20G-katheter met de gebogen tang zonder de plaatsing van de katheter te ontwrichten.
- Sluit de katheter kort aan op de ventilator voordat u deze vastzet om de juiste plaatsing in de luchtpijp en niet in de slokdarm te bevestigen. Bevestig tracheale plaatsing door observatie van mechanische ventilatie-afhankelijke bilaterale borstwandbewegingen en de afwezigheid van inflatie van de maag.
- Post-intubatie
- Koppel de katheter los van de ventilator. Bevestig de tapevleugels (bevestigd aan de katheter) door de onderlip van de muis met behulp van een 4-0 vicryl hechtdraad om de endotracheale buis (ETT) stevig aan de muis vast te zetten tijdens alle volgende procedures / manipulaties.
OPMERKING: Als alternatief kan zijdetape of andere tape worden gebruikt om de ETT vast te zetten, maar er moet voor worden gezorgd dat de ETT niet losraakt tijdens de verplaatsing van het dier van de intubatieslee naar het chirurgische oppervlak. - Verwijder de muis voorzichtig uit de intubatieslee. Sluit de katheter kort aan op de ventilatorset met een getijdenvolume van 0,2-0,225 ml en een ademhalingsfrequentie van 120-150 ademhalingen per minuut om de juiste tracheale plaatsing van de orotracheale buis te bevestigen en verbreek vervolgens de verbinding met de muis die spontaan door de orotracheale buis ademt.
- Laat het dier vanaf dit punt niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bij bewustzijn is gekomen om aan het einde van de procedure de strengale lighouding te behouden.
- Koppel de katheter los van de ventilator. Bevestig de tapevleugels (bevestigd aan de katheter) door de onderlip van de muis met behulp van een 4-0 vicryl hechtdraad om de endotracheale buis (ETT) stevig aan de muis vast te zetten tijdens alle volgende procedures / manipulaties.
2. Long ischemie en reperfusie (IR) chirurgie protocol
- Analgesie en voorbereiding van de chirurgische site
- Veeg de buik van de muis af met een ethanoldoekje en injecteer buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg) intraperitoneaal.
- Scheer het haar over het linker thoraxgebied tot aan het linker schouderblad. Verwijder overtollig geschoren haar met behulp van alcoholdoekjes.
OPMERKING: Stappen 2.1.1 en 2.1.2 kunnen ook vóór de intubatie worden uitgevoerd als er bezorgdheid bestaat over het losraken van de ETT wanneer deze met zijdetape is bevestigd. - Plaats de muis op een opwarmpad in een linker laterale of 3/4 gedraaide positie en sluit de tracheale buis op de ventilator aan met een getijdenvolume van 0,2-0,225 ml (~ 8 mg / kg) en een ademhalingsfrequentie van 120-150 ademhalingen per minuut. Gebruik geen extra zuurstof voor deze procedure.
- Breng oogsmeermiddel aan met een steriel wattenstaafje. Draai de muis naar 3/4 linkerkant naar boven en immobiliseer alle vier de ledematen en de staart met laboratoriumtape.
- Desinfecteer het geschoren huidgebied en de omliggende vacht met povidon-jodium en wacht tot de oplossing droog is. Bedek vervolgens het operatieveld met een steriele drape of doorzichtige plastic film en maak een rechthoekige opening in het gordijn of de plastic film voor het chirurgische veld.
- Chirurgische ingreep
- Bevestig het juiste niveau van anesthesie (geleverd door de toediening van tribroomethanol en buprenorfine zoals eerder beschreven) door de respons op teenknijpen te testen.
- Maak met een scherpe schaar en een grotere tang (smalle patroontang of iets dergelijks) een dwarsdoorsnede van 2 cm onder de inferieure hoek van de schoudervat in de linker laterale thorax. Gebruik de schaar en een fijnere tang (extra fijne graefe tang of iets dergelijks) om in de spierlaag te snijden en tot aan de ribben te ontleden.
- Identificeer de tweede intercostale ruimte en houd de tweede rib vast met de extra fijne tang. Trek de rib omhoog en gebruik een steriel # 11 of # 12 (gebogen) scalpelblad (geen handvat nodig) om de pleurale ruimte te betreden door de intercostale spieren van de2e-3e ruimte te scheiden en te snijden. Overweeg het pauzeren van de ventilatie om letsel aan de linker longtop te verminderen.
- Plaats drie gesteriliseerde retractors. Gebruik het kleinste/smalste retractorcephalad langs de oriëntatie van de ribben, het middelgrote retractor links langs de2e rib en het grootste retractor rechts langs het oppervlak van de3e rib.
- Open de borst met langzame en progressieve terugtrekking met behulp van de elastische retractorkoorden. Stel de linker longslagader (PA) bloot en identificeer deze door de linker longtop weg te bewegen met een steriel wattenstaafje.
- Gebruik de microtang, ultrafijne tang in de rechterhand en PA- of vatverwijdende tang in de linkerhand om voorzichtig het veld bloot te leggen en te creëren waarin de linker PA en bronchus beide zichtbaar zijn.
- Pak met behulp van de PA-tang de linker PA op en trek voorzichtig maar stevig omhoog en cefalad om de transparante bronchus hieronder te visualiseren. Verhoog de vergroting op de dissectiemicroscoop (zie de apparatuurlijst voor meer details) op dit punt tot maximaal (2x).
OPMERKING: Steriliseer alle apparatuur voor gebruik. Bovendien, om de steriliteit te behouden, mogen alleen de uiteinden van chirurgische instrumenten het steriele chirurgische veld betreden. - Terwijl u de PA wegtrekt van de bronchus, passeert u voorzichtig de gesloten ultrafijne tang door de ruimte tussen de linker PA en bronchus. Gebruik vervolgens deze tang om een 7-0 of 8-0 vast te houden en te trekken prolene hechting door de ruimte tussen de linker longslagader (boven) en bronchus (onder).
- Omcirkel de linker PA door een slipknot te binden om een occlusie in de PA te creëren. Onderbreking van de bloedstroom kan eenvoudig onder de microscoop worden gevisualiseerd. Dit markeert het begin van de ischemische periode.
- Externaliseer het vrije uiteinde van de knoop via een ander toegangspunt in de voorste linker thorax met behulp van een 24G-28G naald en bevestig het uiteinde van de hechting met een klein stukje tape voor gemakkelijkere identificatie later.
- Blaas de long opnieuw op om zoveel mogelijk lucht uit de borstholte te verdrijven met behulp van een PEEP-klep / slang op de knaagdierventilator. Sluit vervolgens de ribbenkast met twee onderbroken 4-0 nylon hechtingen.
- Sluit de spier en de onderhuidse laag met een lopende 4-0 nylon hechting. Breng vervolgens twee of drie druppels topische bupivacaïne (0,5%) aan op de incisie. Gebruik een 4-0 nylon hechting om de huidlaag te sluiten met een lopende hechting.
- Postoperatieve zorg
- Wanneer de spontane ventilatie is hervat, koppelt u de endotracheale buis los van de ventilator en extubatubateert u de muis.
- Plaats de muis op het opwarmkussen om de lichaamstemperatuur te handhaven tijdens het vroege herstel na de anesthesie.
- Controleer de muis zorgvuldig terwijl u herstelt van algemene anesthesie. Trek de geëxternaliseerde slipknot voorzichtig aan het einde van de ischemische periode (30 min of 1 uur).
- Verplaats de muis van het opwarmkussen naar een kooi zodra deze tekenen van herstel heeft vertoond: zelfcorrectie en / of beweging.
- Na de periode van reperfusie (1 uur of 3 uur), euthanaseer het dier en verzamel bloed door hartpunctie en longweefsel voor verdere analyse. Verzamel voor 1 uur reperfusie plasma voor ELISA, weefsel voor RNA en eiwitanalyse; voor 3 uur reperfusie, verzamel bovendien weefsel voor histologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ontsteking gegenereerd door eenzijdig geventileerd steriel longisch ischemie reperfusie (IR) letsel: Na 1 uur ischemie zagen we verhoogde niveaus van cytokines in het serum en in het longweefsel door zowel ELISA als qRT-PCR die piekten op 1 uur na reperfusie en snel terugkeerden naar baseline binnen 12-24 uur na reperfusie13. Voor monsters verzameld op 3 uur na reperfusie, zagen we intense neutrofiele infiltratie in het linker longweefsel en merkten op dat de intensiteit van de ontsteking afhankelijk was van de gebruikte muizenstam (figuur 1). Met name de ontsteking die wordt gegenereerd in afwezigheid van een naast elkaar bestaand of volgend infectieus proces verdwijnt geleidelijk en de longen keren terug naar hun normale longarchitectuur (door histopathologie) met efferocytose of uitgang van neutrofielen uit de gewonde longen binnen 12-24 uur na reperfusie13. Van belang is dat we milde maar detecteerbare ontsteking hebben waargenomen, die grotendeels neutrofiel was en ook werd waargenomen in de niet-operatieve rechterlong, waarvan we veronderstellen dat dit te wijten is aan hyperperfusieletsel14.
Weefselmonsterverzameling voor dit long IR-model is niet anders dan die voor andere long IR-modellen: bloed kan worden verzameld voor plasmabereiding via hartpunctie of IVC-cannulatie; longweefsel kan worden geoogst voor eiwit- of RNA-bereiding en vervolgens voor verdere analyse door western blot, ELISA of qPCR.
Figuur 1: Histologie van longsecties bij wildtype muizen van twee verschillende stammen. (A) C3H en (B) C57BL/6 muizen. Beide muizenstammen kregen 1 uur ischemie en 3 uur reperfusie, en het weefsel wordt getoond bij 10x vergroting. De vergroting van 40x wordt weergegeven in de inzet. Neutrofiele infiltratie werd waargenomen in beide stammen, waarbij de C3H-stam duidelijk grotere ontstekingsniveaus vertoonde in vergelijking met C57BL/6 zoals eerder gemeld12. Schaalbalk is 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van de voor- en nadelen (blauwe tekst) van de drie meest gebruikte muisexperimentele long IR-letselmodellen (LIRI). Deze vergelijking benadrukt de keuze van geventileerde long IR (beschreven in dit manuscript) als het ideale model voor het bestuderen van pure long IR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van het geventileerde long IR-model ontwikkeld door Dodd-o et al.9. Dit model heeft geholpen bij het identificeren van moleculaire routes die betrokken zijn bij het genereren en oplossen van ontstekingen van long IR in isolatie 14,15,16,17, long IR in combinatie met co-bestaande infectie18, en long IR in relatie tot de darm-longas en de bijdrage van het darmmicrobioom 13,18,19 . Hoewel technisch uitdagender, maakt het huidige model de evaluatie van long-IR mogelijk zonder de samengestelde effecten van onderbroken cyclische longinflatie en hypoxie. Het minimaliseert ook de periode van blootstelling aan mechanische beademing, in tegenstelling tot het ex vivo perfusiemodel, dat zelf kan leiden tot longletsel20.
Beperkingen van de methode: Hoewel de muizenpijp zo taps toeloopt dat positieve eind expiratoire druk (PEEP) uitzetting van de longen mogelijk maakt en een goede pasvorm biedt voor de ETT, zijn longmechanica en flow-volume lusmetingen mogelijk niet mogelijk met deze versie van omkeerbare orotracheale intubatie. Deze longfysiologiemetingen kunnen een tracheotomie vereisen, die, in tegenstelling tot deze methode, onverenigbaar is met een overlevingslongoperatie. Reversibele orotracheale intubatie wordt goed verdragen door muizen, en zelfs bij afwezigheid van paralytica is er zeer weinig muis-ventilator asynchronie op voorwaarde dat de minuutventilatie (MV = getijdenvolume x ademhalingsfrequentie) voldoende hoog genoeg is om de natuurlijke CO 2-aangedreven aandrijving door de ademhaling over te voorkomen (d.w.z. net voorbij de apneu-drempel).
Er zijn verschillende overwegingen met betrekking tot het ischemie-reperfusie (IR) gedeelte van deze procedure. Ten eerste moet de IR-procedure worden uitgevoerd met zo min mogelijk fysiek trauma aan de long. We raden aan om de mechanische ventilatie te pauzeren en de muis spontaan te laten ademen bij het betreden van de thoracale holte. De negatieve drukventilatie, samen met het vastpakken van de tweede of derde rib door de chirurg en deze weg te trekken van de long terwijl hij voorzichtig de borst binnengaat met een # 11 scalpelblad, vermindert de kans op letsel aan de long met het scalpel. Als alternatief hebben we ontdekt dat het gebruik van een # 12 gebogen scalpelblad, zo gepositioneerd dat de curve naar boven is gericht, een zorgvuldigere toegang tot de thoracale holte mogelijk maakt, waardoor mogelijk letsel aan het onderliggende linker longtopoppervlak wordt verminderd. Bovendien is de verbinding tussen de linker PA en de bronchus minder veilig dichter bij het hilum, waardoor de doorgang van de ultrafijne tang tussen deze twee structuren hier gemakkelijker wordt.
De volgende kritieke stap is het isoleren van de linker PA van de bronchus eronder om de PA te omringen met een hechtingsband. Het is essentieel dat deze stap zorgvuldig wordt uitgevoerd om trauma aan de longtop te voorkomen. We raden aan om de thoracale kooi zo cephalad mogelijk te betreden om de hoeveelheid linkerlong te minimaliseren die moet worden verplaatst of ingetrokken om toegang te krijgen tot de PA en bronchus. Elk deel van de long dat stomp trauma oploopt, moet worden uitgesloten van evaluatie voor geïsoleerd IR-letsel. Vaak wordt de top van de linkerlong weggesneden bij het verzamelen van de longen voor de uiteindelijke analyse van steriel long IR-letsel. Letsel van de top van de long kan tijdens de operatie worden gevisualiseerd vanwege de aanwezigheid van puncta van bloeding of bloederige verkleuring.
Tussen de PA en de bronchus hieronder bestaat een bindweefsellaag die moet worden doorbroken om de slagader met de hechting te omringen. Leren hoeveel spanning is toegestaan tijdens het vastpakken en naar boven trekken van de linker PA (d.w.z. naar de thoracale kooi en weg van de bronchus), met behulp van het niet-gekartelde, niet-beschadigende vat dat platte fijne tangen in de linkerhand grijpt, is een belangrijke eerste stap om onder de knie te krijgen. De linker PA kan een verrassende hoeveelheid spanning verdragen en strekken als deze naar boven wordt getrokken. We vinden het nuttig om de vergroting van het gezichtsveld maximaal te vergroten en de focus aan te passen, zodat de potentiële ruimte (een witte lijn van bindweefsel die de PA aan de bronchus hecht) duidelijk en scherp kan worden gevisualiseerd, samen met de ultrafijne tang (gehouden in de rechterhand). Om het veld scherp te houden, is het belangrijk om de linkerhand op het chirurgische oppervlak te stabiliseren terwijl de linker PA omhoog en weg van de bronchus wordt getrokken. De ultrafijne tang kan dan worden doorgegeven in de ruimte tussen de twee structuren. De gesloten uiteinden moeten gemakkelijk passeren zonder echte weerstand, en eenmaal gezien aan de andere kant van de linker PA, kunnen de uiteinden voorzichtig worden geopend om verder ruimte te creëren voor de doorgang van het hechtmateriaal. Het is van cruciaal belang dat dit wordt uitgevoerd met behulp van volledig onbeschadigde ultrafijne tangen, die snel kunnen worden bepaald door een steriel alcoholdoekje door de gesloten uiteinden te trekken om te observeren of de uiteinden aan het materiaal scheuren. Schadetips kunnen ook worden geïdentificeerd door de tang te openen en te sluiten onder maximale vergroting van de chirurgische microscoop.
Het is gemakkelijk om schade te detecteren die optreedt aan de linker PA of linker hoofdbronchus terwijl ze proberen ze te scheiden. Schade aan de linker PA resulteert in overstroming van het gezichtsveld met bloed en kan resulteren in een niet-herstelbare operatie als de schade een gat in de PA zelf creëert. Met name zijn er oppervlaktemicroscopische bloedvaten op de PA die gewond kunnen raken tijdens de ultrafijne tangbeweging en mogelijk kunnen worden beheerd door een droog steriel wattenstaafje over het veld te plaatsen om het bloed dat verschijnt te absorberen. Als het bloeden stopt, kan de procedure worden hervat. Schade aan de linker hoofdbronchus is altijd een niet-herstelbare situatie, omdat er geen eenvoudige of snelle manier is om luchtwegschade te herstellen.
De stap van het scheiden van de PA van de onderliggende bronchus kan in eerste instantie worden beoefend op een dode muis zonder de druk van de tijd of de afleiding van hartactiviteit en de beweging die het veroorzaakt. Bovendien zorgt de stasis van bloed in de linker PA ervoor dat het gemakkelijker kan worden gevisualiseerd (dik en mollig vat), en toch in staat is om te worden opgepikt door de niet-verwondende platte PA-tang. Het vermogen om schade in de linker bronchus te detecteren is nog steeds mogelijk, omdat de ventilatie van de linkerlong kan worden gebruikt om te beoordelen op de aanwezigheid van een intacte geleidende luchtweg naar de linkerlong. Deze oefensituatie kan ook worden gebruikt om de creatie van de slipknot te perfectioneren.
Er is een eindige duur van occlusie, waarna spontane reperfusie na verwijdering van de slipknot niet gegarandeerd is. In pilotstudies gebeurt dit ergens tussen de 6 en 10 uur. Daarnaast vindt reperfusie minder direct na verwijdering van de slipknot plaats. Naarmate de ischemische periode zich uitstrekt, vereist reperfusie manipulatie van de PA na slipknot-verwijdering om de bloedstroom te herstellen.
Deze volgende observaties zijn verkregen van vijf co-auteurs van dit artikel die hun collectieve ervaring vertegenwoordigen in het leren, perfectioneren, oplossen van problemen en het verbeteren van deze procedure tijdens de periode dat ze dit muischirurgisch model uitvoerden en zijn samengevat in de onderstaande punten:
Gemiddeld duurde het 1-3 maanden om deze chirurgische ingreep onder de knie te krijgen. Een proceduralist schatte dat er ongeveer 50 operaties nodig zijn om gemakkelijk te worden met de verschillende procedures.
Het slagingspercentage aan het begin van het uitvoeren van de procedure was 20% -40%. Na het regelmatig en vertrouwd uitvoeren van de procedure, steeg het slagingspercentage tot 80% -90%.
Het moeilijkste deel van de operatie was unaniem het passeren van de ultrafijne tang tussen de linker PA en de linker bronchus, en vervolgens de daaropvolgende opname van het hechtmonofilament met de tang en het passeren ervan tussen de twee structuren.
Fouten tijdens de passage van het monofilament tussen de PA en de linker hoofdstam bronchus kunnen leiden tot een onverkoopbare operatie met catastrofale bloedingen van de linker PA of onomkeerbaar letsel aan de linker hoofdbronchus.
Het maximale aantal operaties dat haalbaar was in 1 enkele dag werd geschat op 10 (bij ongeveer 35-45 min / operatie), terwijl het ideale aantal voor procedureel comfort en chirurgisch succes vijf of zes was.
Andere diverse tips en suggesties zijn:
Vermijd overtollige cafeïne voordat u aan de chirurgische dag begint om een stabiele handpositie te behouden.
Verhoog de vergroting op de microscoop tot maximaal tijdens het deel van de procedure wanneer de hechting wordt doorgegeven tussen de linker PA en de linker hoofdbronchus.
Gebruik zachte en geleidelijke/incrementele bewegingen bij het oprukken van de Dumont-tang om ruimte te creëren tussen de linker PA en de linker hoofdbronchus.
Stabiliseer de handen op het chirurgische oppervlak bij het uitvoeren van alle kritieke stappen.
Zorg ervoor dat de ademhalingsfrequentie op de ventilator hoog genoeg is om spontane ademhalingen te voorkomen, vooral tijdens de belangrijkste / kritieke delen van de procedure (hechting tussen de linker PA en de linker hoofdbronchus).
Een rustige en ongestoorde omgeving om de operaties uit te voeren is essentieel om gefocust en ongestoord te blijven.
Figuur 2 vergelijkt dit model met alternatieve modellen van long IR-letsel. Dit model van geventileerde longischemie reperfusie biedt de voordelen van het minimaliseren van atelectase, hypoxie en mechanische ventilatie. Belangrijk is dat het als overlevingsoperatie compatibel is met tweede verwondingsmodellen (bijv. Experimentele pneumoniemodellen) en analyse van de oplossing van letsel.
Concluderend hebben we een overlevingsoperatie beschreven waarbij long-ischemie-reperfusieletsel ontstaat waarvan we geloven dat het waardevol inzicht kan bieden in de mechanismen en cellulaire paden die betrokken zijn bij pure IR-schade in de long.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door afdelingsondersteuning van de afdeling Anesthesie en Perioperatieve Zorg, University of California San Francisco en San Francisco General Hospital, evenals door een NIH R01-prijs (aan AP): 1R01HL146753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fiber Optic Light Pipe | Cole-Parmer | UX-41720-65 | Fiberoptic light pipe |
| Fiber Optic Light Source | AmScope | SKU: CL-HL250-B | Light source for fiberoptic lights |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific, Inc. | No.5-1450 | Bead Sterilizer |
| Heating Pad | AIMS | 14-370-223 | Alternative option |
| Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) | WAHL home products | SKU 09854-600B | To remove mouse hair on surgical site |
| Microscope | Nikon | SMZ-10 | Other newer options available at the company website |
| MiniVent Ventilator | Havard Apparatus | Model 845 | Mouse ventilator |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | Clean tools that been used in operation |
| Warming Pad | Kent Scientific | RT-0501 | To keep mouse warm while recovering from surgery |
| Weighing Scale | Cole-Parmer | UX-11003-41 | Weighing scale |
| Surgery Tools | |||
| 4-0 Silk Suture | Ethicon | 683G | For closing muscle layer |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Industry | EP8734H | Using for making a slip knot of left pulmonary artery |
| Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) | Aspen Surgical | 372611 | For entering thoracic cavity (option 1) |
| Bard-Parker (12) Scalpel | Aspen Surgical | 372612 | For entering thoracic cavity (option 2) |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | Muscle/rib holding forceps |
| Magnetic Fixator Retraction System | FST | 1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08) |
Small Animal Retraction System |
| Monoject Standard Hypodermic Needle | COVIDIEN | 05-561-20 | For medication delivery IP |
| Narrow Pattern Forceps | FST | 11002-12 | Skin level forceps |
| Needle holder/Needle driver | FST | 12565-14 | for holding needles |
| Needles | BD | 305110 | 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too) |
| PA/Vessel Dilating forceps | FST | 00125-11 | To hold PA; non-damaging gripper |
| Scissors | FST | 14060-09 | Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery |
| Ultra Fine Dumont micro forceps | FST | 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) | For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus |
| Reagents | |||
| 0.25% Bupivacaine | Hospira, Inc. | 0409-1159-02 | Topical analgesic used during surgical wound closure |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg. |
| Buprenorphine | Covetrus North America | 59122 | Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg |
| Eye Lubricant | BAUSCH+LOMB | Soothe Lubricant Eye Ointment | Relieves dryness of the eye |
| Povidone-Iodine 10% Solution | MEDLINE INDUSTRIES INC | SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) | Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery |
| Materials | |||
| Alcohol Swab | BD brand | BD 326895 | for sterilzing area of injection and surgery |
| Plastic film | KIRKLAND | Stretch-Tite premium | Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective) |
| Rodent Surgical Drapes | Stoelting | 50981 | Sterile field or drape for surgical field |
| Sterile Cotton Tipped Application | Pwi-Wnaps | 703033 | used for applying eye lubricant |
| Top Sponges | Dukal Corporaton | Reorder # 5360 | Stopping bleeding from skin/muscle |
References
- Shen, H., Kreisel, D., Goldstein, D. R.
- Fiser, S. M., et al. Lung transplant reperfusion injury involves pulmonary macrophages and circulating leukocytes in a biphasic response. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 121 (6), 1069-1075 (2001).
- Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), 93121 (2017).
- Miao, R., Liu, J., Wang, J. Overview of mouse pulmonary embolism models. Drug Discovery Today: Disease Models. 7 (3-4), 77-82 (2010).
- Mira, J. C., et al. Mouse injury model of polytrauma and shock. Methods in Molecular Biology. 1717, 1-15 (2018).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: Tricks of the trade. The Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Faraday, N., Pearse, D. B. Effect of ischemia and reperfusion without airway occlusion on vascular barrier function in the in vivo mouse lung. Journal of Applied Physiology. 95 (5), 1971-1978 (2003).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Welsh-Servinsky, L. E., Tankersley, C. G., Pearse, D. B. Strain-specific differences in sensitivity to ischemia-reperfusion lung injury in mice. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1590-1595 (2006).
- Prakash, A., et al. Lung ischemia reperfusion (IR) is a sterile inflammatory process influenced by commensal microbiota in mice. Shock. 44 (3), 272-279 (2015).
- Prakash, A., et al. Alveolar macrophages and toll-like receptor 4 mediate ventilated lung ischemia reperfusion injury in mice. Anesthesiology. 117 (4), 822-835 (2012).
- Dodd-o, J. M., et al. The role of natriuretic peptide receptor-A signaling in unilateral lung ischemia-reperfusion injury in the intact mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (4), 714-723 (2008).
- Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).
- Tian, X., et al. NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice. Frontiers in Immunology. 8, 1337 (2017).
- Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Frontiers in Microbiology. 10, 159 (2019).
- Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids' immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).
- Dodd-o, J. M., et al. Interactive effects of mechanical ventilation and kidney health on lung function in an in vivo mouse model. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (1), 3-11 (2009).
