Summary
Здесь мы описываем новое, простое и недорогое устройство для успешного выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT) с использованием двумерной культуры клеток HeLa и вертепорфина в качестве фотосенсибилизатора.
Abstract
В этой статье описывается новое, простое и недорогое устройство для выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT), названное PhotoACT. Устройство было построено с использованием набора обычных программируемых светодиодов (LED), модуля жидкокристаллического дисплея (LCD) и датчика освещенности, подключенного к плате коммерческого микроконтроллера. Коробчатая конструкция прототипа была выполнена из древесноволокнистых плит средней плотности (MDF). Внутренний отсек может одновременно выделять четыре многоязычные микропластины клеточной культуры.
В качестве доказательства концепции мы изучили цитотоксический эффект фотосенсибилизатора (PS) вертепорфина против клеточной линии HeLa в двумерной (2D) культуре. Клетки HeLa обрабатывали повышением концентрации вертепорфина в течение 24 ч. Лекарственно-содержащую надпосадочную среду выбрасывали, адгезивные клетки промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и добавляли безмедикаментозную среду. В этом исследовании влияние вертепорфина на клетки изучали либо без воздействия света, либо после воздействия света в течение 1 ч с использованием красно-зелено-синих (RGB) значений 255, 255 и 255 (средняя плавность 49,1 ± 0,6 Дж/см2). Через 24 ч жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ).
Экспериментальные результаты показали, что воздействие на клетки, обработанные вертепорфином, на свет от устройства усиливает цитотоксический эффект препарата через механизм, опосредованный активными формами кислорода (АФК). Кроме того, использование прототипа, описанного в этой работе, было подтверждено путем сравнения результатов с коммерческим устройством PDT. Таким образом, этот прототип фотодинамической терапии на основе светодиодов представляет собой хорошую альтернативу для исследований ФДТ in vitro .
Introduction
Среди наиболее смертоносных неинфекционных заболеваний рак представляет собой ведущую глобальную причину преждевременной смерти. На его долю пришлось почти 10 миллионов смертей в 2020 году, что составляет примерно одну из шести смертей во всем мире1. Кроме того, явление множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) представляет собой огромную угрозу для общественного здравоохранения, поскольку утвержденные химиотерапевтические протоколы не достигают стадий ремиссии для этого клинического состояния2. Раковые клетки могут развивать устойчивость к химиотерапии через несколько механизмов; однако сверхэкспрессия некоторых АТФ-связывающих кассетных (АВС) транспортеров - АТФ-зависимых эффлюксных насосов - считается основной причиной развития МЛУ в микроокружении опухоли3. В дополнение к MDR, другие осложнения рака, такие как рецидив и метастазирование, усиливают настоятельную потребность в разработке и совершенствовании терапевтических подходов для преодоления этой онкологической проблемы.
Лечебное использование света практикуется на протяжениивеков 4, и фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой клинически одобренный терапевтический подход для солидных опухолей. ФДТ сочетает в себе введение фотосенсибилизатора (PS) с последующим световым облучением для генерации активных форм кислорода (АФК) для оказания селективной цитотоксичности в опухолевых клетках. Этот терапевтический подход превосходит обычные методы, включая хирургию, облучение и химиотерапию5; это минимально инвазивный метод, показывающий более низкую цитотоксичность в соединительных тканях6. Легкое применение и накопление PS непосредственно в опухоли или ее микросреде обеспечивают точное нацеливание и, следовательно, незначительные, нежелательные системные побочные эффекты7 и возможность повторного лечения на том же участке. Более того, стоимость ниже, чем у других подходов. Благодаря своим многообещающим особенностям ФДТ можно считать подходящим вариантом как для единичных, особенно в случае неоперабельных опухолей, так и для адъювантного лечения рака7, и представляет собой альтернативу МЛУ, связанной с химиотерапией 8,9.
Первый отчет, показывающий высокую объективную частоту ответа с использованием PDT, был описан в 1975 году на мышиной и крысиной модели10. С тех пор исследования проводились с использованием ФДТ с положительными исходами7 как in vivo, так и in vitro с линиями опухолевых клеток человека в 2D клеточной культуре11,12. Учитывая широкую применимость клинически одобренных PS, независимо от их специфических путей накопления и диапазонов длин волн пиков поглощения, общий процесс выглядит следующим образом: (i) поглощение PS, (ii) достижение пика концентрации PS в опухоли или ее микроокружении, (iii) применение света, (iv) взаимодействие PS-света, (v) передача энергии возбужденного состояния PS либо тканевому субстрату, либо окружающим молекулам кислорода, (vi) Производство АФК с участием синглетного кислорода или супероксидного аниона, (vii) гибель опухолевых клеток посредством, по существу, некроза или апоптоза (прямая смерть), аутофагии (цитопротекторный механизм), ишемии тканей (повреждение сосудов), иммунной модуляции или перекрытия этих механизмов7. На этом заключительном этапе активация конкретного пути гибели клеток зависит от многих факторов, таких как характеристики клеток, экспериментальный дизайн и, самое главное, внутриклеточная локализация PS и целенаправленное повреждение, связанное с ФДТ13.
Вертепорфин является PS второго поколения, одобренным регулирующими органами для клинического использования в Норвегии и Китае для лечения возрастной макулярной дегенерации7. Сообщалось, что после доставки дозы этот пролекарство частично накапливается в митохондриях14 и индуцирует фосфорилирование тирозина клеточного белка и фрагментацию ДНК, что приводит к апоптозу опухолевых клеток 15,16. После 24-часовой инкубации для интернализации вертепорфинов рекомендуется протокол PDT с использованием установки длины волны 690 нм для достижения эффективных уровней передачи электромагнитного излучения соседним молекулам 7,17.
Что касается источника света для PDT, классические диодные лазерные системы обычно дорогие, технически сложные, негабаритные и, следовательно, непортируемые18,19. Как следствие его одноволнового профиля, который также можно наблюдать в оборудовании PDT на основе светодиодов, потребность в независимых блоках для каждого применения фотосенсибилизатора делает использование диодных лазерных систем еще более сложным и экономически нецелесообразным20,21. Поэтому использование светодиодной техники считается наиболее перспективной альтернативой для решения не только затрат22 и вопросов технического обслуживания, но и для обеспечения высокой выходной мощности и менее вредной23 и более широкой осветительной способности 24,25,26,27.
Несмотря на потенциальный вклад, который светодиодное оборудование может предложить в эксперименты PDT28, большинство коммерческих вариантов по-прежнему имеют недостатки, такие как отсутствие портативности, высокая стоимость и сложные строительные проекты и эксплуатация29. Основная цель этой работы заключалась в том, чтобы предложить простой и надежный инструмент для анализа PDT in vitro . В этой статье описывается PhotoACT, собственное устройство PDT на основе светодиодов, которое является недорогим, удобным для пользователя и портативным. В качестве доказательства концепции показано, что это устройство усиливает цитотоксичность вертепорфина в модели 2D-культуры клеток и, следовательно, может быть использовано в качестве исследовательского инструмента в экспериментах PDT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем материалам, реагентам и программному обеспечению, используемым в этом протоколе.
1. Конструкция устройства
- Пила пилой древесноволокнистых плит средней плотности (МДФ) толщиной 3 мм для получения кусков с размерами, указанными на рисунке 1А.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте векторный файл (Дополнительный файл 1) для резки с числовым программным управлением (ЧПУ). - Постройте две коробки со следующими размерами (длина х ширина х высота): 330 мм x 235 мм x 225 мм для больших коробок и 300 мм x 220 мм x 150 м для меньших коробок (рисунок 1B).
- Просверлите заднюю часть большого ящика, чтобы установить разъем для разъема ствола. Просверлите верхнюю часть большей коробки и вставьте верхнюю и нижнюю части меньшей коробки, чтобы обеспечить проход для электрических кабелей (рисунок 1C).
- Покрасьте все внутренние поверхности черными чернилами, чтобы способствовать однородному светообразованию (рисунок 1D).
- Параллельно прикрепите три светодиодные ленты с 10 светодиодами каждая на верхней внутренней поверхности меньшей коробки (рисунок 1E).
- Установите датчик яркости в центре нижней внутренней поверхности меньшей коробки (рисунок 1F).
- Распечатайте структуру блока управления (рисунок 1G) с помощью файла 3D-печати (Дополнительный файл 2).
- Установите все компоненты (кнопку питания, потенциометры, сенсорную панель времени/запуска, светодиоды, датчик яркости, ЖК-дисплей, зуммер и блок питания) в порты платы управления ESP32, установленной внутри блока управления (рисунок 2).
- Загрузите программный код (Дополнительный файл 3, Дополнительный файл 4 и Дополнительный файл 5) и запустите тест, чтобы убедиться, что все соединения работают (рисунок 1H).
- Соберите коробки и закрепите их вместе, чтобы избежать зазоров и, следовательно, внешних световых помех и потерь излучаемого света. Прикрепите установленный блок управления к просверленной области в верхней части прототипа (рисунок 1I).
- Закрепите входную дверь из того же материала и размерами 330 мм х 225 мм (длина х ширина) на большую коробку с двумя небольшими петлями. Кроме того, прикрепите ленты на липучках боком к большей коробке, чтобы укрепить застежку прототипа (рисунок 1J). Установите ручку для манипулирования входной дверью оборудования.
- Прикрепите четыре резиновые ножки в нижней части прототипа, чтобы обеспечить большую стабильность во время операций (рисунок 1K).
2. Клеточные линии: выращивание, посев и обработка
- Химикалии
- Растворяют порфирин в диметилсульфоксиде (ДМСО) до достижения концентрации 100 мМ.
ВНИМАНИЕ: ДМСО необходимо осторожно манипулировать (обращение с использованием средств индивидуальной защиты и в проветриваемом помещении). Тщательно манипулируйте как запасами, так и разбавленными растворами, чтобы избежать чрезмерного воздействия света.
- Растворяют порфирин в диметилсульфоксиде (ДМСО) до достижения концентрации 100 мМ.
- Клеточные линии
- Культивируйте клеточную линию HeLa в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% гентамицином.
- Храните колбы для культивирования в инкубаторе культуры клеток с 5%CO2 при температуре 37 °C.
- Управляйте и осматривайте клетки до тех пор, пока они не достигнут 80-90% слияния.
- Процесс посева
- Выньте питательную среду из колбы.
- Вымойте монослой ячейки pBS.
- Отделяют сливающуюся культуру клеток с трипсином-ЭДТА (0,5%) 1x в течение 5 мин при 37 °C. Прекращают действие трипсина путем повторного использования клеток культуральной средой, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% гентамицином.
- Подсчитайте повторно суспендированные клетки с помощью гемоцитометра и посейте их в 96-луночную пластину со скоростью 2,0 × 104 клетки в лунку.
- Подготовьте две пластины для темных и светлых условий.
- Инкубируйте пластины в течение 24 ч для прикрепления клеток.
- Процесс лечения
- Снимите среду с обеих 96-луночных пластин.
- Обрабатывают клетки 100 мкл повышения концентрации вертепорфина (от 0,045 до 24 мкМ, последовательное разведение).
- Инкубируют клетки с лекарственной обработкой в течение 24 ч, чтобы обеспечить интернализацию вертепорфина.
- Через 24 ч отбросить среду, содержащую препарат, промыть монослой клеток ПБС (100 мкл) и добавить безмедикаментозную среду (100 мкл).
- Накройте одну микропластинку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от воздействия света, и инкубируйте ее в течение 24 часов. Эта пластина будет предоставлять управляющие данные для результатов PDT (темное состояние). Другая микропластинка будет использоваться в условиях освещения в устройстве.
3. Работа устройства
- Подключите устройство PDT к электрической розетке и включите его, нажав кнопку питания .
- Поместите другую микропластинку (световое состояние) в устройство PDT и закройте оборудование, скрепив входную дверь лентами на липучках.
- Используйте потенциометры для настройки конфигурации RGB (здесь эксперимент RGB 255, 255, 255 ) и установите цвет светового излучения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая комбинация RGB имеет определенный спектр излучения, который должен быть скорректирован для экспериментов с различными фотосенсибилизаторами и, следовательно, различными кривыми поглощения. - Нажмите сенсорную панель (+)/(-), чтобы настроить конфигурацию времени (здесь эксперимент 60 минут ) и установить продолжительность анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Временная конфигурация, в сочетании со значением излучения, будет определять плавность процесса - дозу света, применяемую в анализе. - Проверьте информацию о настройке на дисплее.
- Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать анализ. Убедитесь, что в начале анализа слышен зуммер с одним звуковым сигналом.
- В ходе эксперимента наблюдайте на дисплее информацию в режиме реального времени, такую как излучение и оставшееся время.
- Не открывайте входную дверь и не изменяйте конфигурацию во время анализа PDT.
- В конце анализа дождитесь четырехзвукового зуммера и электронной системы, чтобы выключить все светодиоды. Наблюдайте за готовым сообщением и конечным количеством затраченной энергии во время эксперимента на дисплее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечное значение флюенса вычисляется с помощью уравнения (1):
(1)
Где F равно Дж/см2 , а I равно мВт/см2 или мДж/с·см2. Значение излучения учитывает эффективность светодиодов (излучающего источника) и равномерно облученную область темной камеры (660см2) (уравнение [2]):
(2)
Теоретическое значение излучения отображается на дисплее прибора на протяжении всего анализа PDT. В конце операции используйте уравнение (3) для вычисления флюенса:
Флюенс (F) = интенсивность излучения (I, постоянное значение) × время работы (с) (3)
(1)
(2)4. Анализ жизнеспособности клеток
- После анализа ФДТ накройте микропластинку, которая подвергалась воздействию света, и инкубируйте в течение 24 ч.
- После инкубационного периода удаляют культуральную среду с обеих пластин, промывают монослой клеток ПБС (100 мкл) и добавляют раствор МТТ (0,5 мг/мл, 100 мкл). Инкубируйте обе пластины - темные и светлые условия - в течение 4 ч, чтобы обеспечить образование кристаллов формамазана.
- Осторожно удалите раствор МТТ и растворите фиолетовые кристаллы раствором ДМСО/этанола (1:1).
- После полного растворения кристаллов проводят измерение поглощения с помощью микропластичного считывателя при 595 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство может быть использовано в других важных экспериментах, таких как ROS-опосредованная гибель клеток, вызванная фотосенсибилизаторами после воздействия света с помощью проточной цитометрии30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Последнее устройство PDT, названное PhotoACT, включало темную камеру для выделения до четырех многолуночных микропластин, а его верхняя внутренняя поверхность была оснащена набором из 30 рассеянных светодиодов, запрограммированных на испускание различных спектров видимого света (рисунок 3 и дополнительный файл 6). Устройство было построено с использованием двух связанных коробок: внутренней коробки, спроектированной как темная камера для анализов PDT, и внешней коробки для покрытия внутренней камеры и удержания блока управления (рисунок 1B). Внутренняя коробка была окрашена в черный цвет (рисунок 1D) и состояла из ленточной модели LED RGB WS2812 (или WS281B) с 30 светодиодами и длиной 1 м (которая позже была разрезана на три части) и 9 Вт, которая вмещает встроенный процессор. Этот аппарат позволял более контролируемое использование и, следовательно, более точное цветоизлучение. 30 светодиодов были равномерно распределены по всей верхней внутренней поверхности камеры PDT тремя параллельными лентами по 10 светодиодов в каждой (рисунок 1E). Однородное падение света было установлено из-за низкой отражательной способности черных внутренних поверхностей и равномерного распределения конфигурации светодиодов. Датчик яркости TSL2561 также был встроен в нижний центр внутренней коробки для индикации падения света и служил инструментом контроля качества, гарантируя равномерность облучения внутри темной камеры (дополнительная таблица S1) и контролируя мощность светодиодной системы, которая, как известно, имеет определенное количество часов полезного срока службы (рисунок 1F). ). Внешняя коробка представляет собой структуру, которая покрывает внутреннюю коробку, состоящую из шести частей МДФ, окрашенных в серый цвет и вырезанных лазером для идеальной посадки (рисунки 1A, B). Блок управления был разработан с использованием онлайн-программного обеспечения31, напечатанного на 3D-принтере с полимолочной кислотой в виде одной детали с использованием 3D-принтера и окрашенного в серый цвет. Он содержит все электронные компоненты, включая дисплей, потенциометры, кнопки и зуммер (рисунок 1I и рисунок 2).
Для обеспечения независимой регулировки падения света была выбрана плата контроллера ESP32 для интеграции блока управления (рисунок 2). Эта конфигурация должна допускать интерфейс USB для программирования, Bluetooth, Wi-Fi, двухъядерный процессор, многочисленные порты и возможность связи с интегральной схемой (I2C), последовательным периферийным интерфейсом (SPI) и другими интерфейсами. Для работы системы была написана программа на языке Си через интегрированную среду разработки (IDE). Структура кода32 основана на FreeRTOS, бесплатной операционной системе реального времени, поддерживаемой платой контроллера ESP32. Указанная логика позволяет программировать независимые приложения, которые могут обрабатываться ESP32 в эшелонированном или параллельном подходах, что делает проект и его процессы обслуживания, улучшения и обновления гораздо более универсальными и безопасными.
Интерфейс между машиной и оператором удобен для пользователя и состоит из жидкокристаллического дисплея (LCD), потенциометров, кнопок и зуммера (рисунок 3 и дополнительный файл 6). Небольшой ЖК-дисплей размером 16 мм x 2 мм (колонны против линий) имел встроенный контроллер HD44780 с протоколом связи I2C, что обеспечивает простоту установки и универсальность передачи соответственно. Предварительная настройка включает в себя настройку RGB и времени оператором. Световая величина и цветовая конфигурация могут быть отрегулированы с помощью потенциометров, которые изменяют интенсивность (от 0 до 255) трех основных цветовых компонентов - RGB. Эти корректировки могут привести к образованию нескольких цветовых композиций, рассматриваемых в международной таблицецветов RGB 33. Каждая RGB композиция имеет определенную длину волны, которая должна быть скорректирована в соответствии с PS, используемым в эксперименте PDT; кривая поглощения PS и длина волны облучения должны перекрываться, чтобы фотоактивация происходила удовлетворительно (дополнительный рисунок S1). По ходу процесса на ЖК-дисплее можно получить доступ к рабочему состоянию с оставшимся временем и информацией о падении света.
В конце запрограммированного времени электронная система выключила все светодиоды, издала звуковое предупреждение и показала на дисплее общее количество энергии на площадь (Дж/см²), которое вычислялось путем умножения постоянного значения излучения на время работы в секундах. Эта цифровая модель представила широкий диапазон уровней обнаружения (пределы от 0,1 до 40 000+ люкс), интерфейс I2C и низкую интенсивность электрического тока (0,5 мА и 15 мкА в рабочем и резервном состоянии соответственно).
В качестве доказательства концепции устройство использовали для усиления цитотоксического эффекта вертепорфина в культуре клеток 2D HeLa после светового воздействия 1 ч (49,1 ± 0,6 Дж/см2). Как показано на рисунке 4A, значение GI50 составляло 3,1 мкМ для состояния света и 13,8 мкМ для темного состояния. Таким образом, 4,4-кратный сдвиг при сравнении условий подтвердил использование вертепорфина в качестве PS и применимость PhotoACT к анализам PDT. Чтобы подтвердить использование прототипа, описанного в этой работе, коммерческое устройство PDT использовалось в тех же экспериментальных условиях, включая PS, клетки и флюенс, и результаты сравнивались. Как показано на фиг.4В, оба устройства фотоактивировали вертепорфин в равной степени, усиливая цитотоксический эффект. Эти результаты подтвердили применимость этого в домашнем устройстве PDT (рисунок 4A, B). Наконец, ROS-опосредованная гибель клеток, вызванная вертепорфином после воздействия света, была подтверждена проточной цитометрией с использованием анализа DCFDA (рисунок 4C,D).
Рисунок 1: Инструкции по сборке и сборке PhotoACT. Подробная иллюстрация конструкции, сверления, покраски, монтажа и аксессуаров компонентов в устройстве. На панели показано пошаговое руководство по сборке устройства. Аббревиатура: LED = светодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Конструкция блока управления и электронные инструкции по установке. Увеличенный чертеж взорванного блока управления и подробная схема электронных соединений на портах платы контроллера ESP32 с соединениями и компонентами, используемыми в прототипе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Представление PhotoACT. Сборочный чертеж конструкции конечного изделия с спецификацией материалов, маркировкой воздушных шаров и детальным видом верхних внутренних светодиодов. Рисунок позволяет идентифицировать детали и узлы прототипа. Сокращения: МДФ = ДВП средней плотности; LED = светодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Фототоксичность in vitro генерации вертепорфина и АФК. (А,В) Анализ жизнеспособности клеток выполнен с использованием метода МТТ: проведены анализы для оценки цитотоксического профиля фотосенсибилизатора вертепорфина при различных концентрациях. Клетки HeLa обрабатывали в течение 24 ч различными концентрациями вертепорфина (0,045-24 мкМ), подвергали воздействию света (PhotoACT (A) или коммерческое оборудование PDT (B)) или темным условиям, а затем подвергали анализу MTT. Оба условия показали снижение жизнеспособности клеток при более высоких концентрациях вертепорфина, но световое воздействие, полученное из анализов ФДТ, усиливало цитотоксический профиль PS, что подразумевает, что ФДТ усиливает цитотоксичность вертепорфина. Кривые жизнеспособности были установлены с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6. (С,Г) Клетки HeLa обрабатывали в течение 24 ч низкими и высокими концентрациями вертепорфина (0,187 мкМ и 6 мкМ), а затем подвергали воздействию света (PhotoACT) или темных условий. Внутриклеточные уровни АФК измеряли после облучения проточной цитометрией с использованием зонда DCFDA (инкубация в течение 30 мин при 1 мкМ). Сдвиг вправо среди гистограмм подразумевал более высокую интенсивность флуоресценции из-за более высокого внутриклеточного накопления DCF и, следовательно, более высоких уровней АФК. Результаты не показали соответствующей разницы в уровнях АФК в темном состоянии (С), но показали увеличение дозы-ответа уровней АФК после фотоактивации вертепорфина (D). Сокращения: ROS = активные формы кислорода; DCF = 2',7'-дихлорфлуоресцеин; DCFDA = 2',7'-дихлоргидрофлуоресцеин диацетат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Блок-схема принятия решения устройства: предварительная настройка и устранение неполадок при работе. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Перекрытие между кривой поглощения вертепорфина и спектром излучения светодиодов устройства. Спектр поглощения вертепорфина с его удельными пиками поглощения (x,y') и спектр излучения светодиодов RGB 255, 255, 255-белого цвета (3,700K-5,000K CCT), используемый для фотоактивации фотосенсибилизатора (x,y''). Перекрытие между различными пиками поглощения вертепорфина и белым излучающим светом подтверждает фотоактивацию фотосенсибилизатора, что также было подтверждено биологическими результатами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица S1: Испытания на однородность облучения. Мгновенная светимость (люмен), измеряемая датчиком яркости в разных точках облученной области. Представленные результаты не показывают выразительных вариаций, которые свидетельствуют о равномерном облучении прибора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 1: Векторный файл для резки. Чертежный (DWG) файл для резки плиты МДФ. Файл должен использоваться для резки с числовым программным управлением (ЧПУ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Файл 3D-печати элементов управления устройством. Файл стереолитографии (STL) для 3D-печати блока управления устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3: Программный код C. Программный код, разработанный на языке Си для конфигурирования блока управления оборудованием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 4: Программный код INO. Программный код, разработанный на языке INO для конфигурирования блока управления оборудованием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 5: Инструкции по компиляции. Файл Markdown (MD) "READ ME" с дополнительными инструкциями по компиляции программного кода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 6: Проектная модель устройства. Предварительный просмотр файла трехмерной модели стандарта для обмена данными о продукте (STEP) для общей визуализации прототипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Окончательное устройство PhotoACT было удобно строить с коммерчески доступными недорогими компонентами общей стоимостью менее 50 долларов. Дополнительные преимущества включают в себя низкие требования к техническому обслуживанию, способность облучать несколько типов культуральных пластин, одновременное использование до четырех единиц на анализ, малый вес (2 кг) / размер (44 см3), который обеспечивает портативность, точное и воспроизводимое облучение (данные не показаны), а также удобный и простой интерфейс настройки, который не требует подключения к компьютерам или другим машинам.
Некоторые критические этапы как строительных, так и эксплуатационных протоколов привели к возможностям улучшения концепции проекта. Поскольку камера PDT требует однородного светового излучения и последовательного измерения энергии, внутренние и внешние коробки были герметизированы, чтобы избежать как внешних световых помех, так и потерь излучаемого света. Дополнительные ленты на липучках были закреплены боком на фронтальной двери, чтобы усилить закрытие камеры и обеспечить непрерывные эксперименты. На блоке управления был установлен репрезентативный светодиод для сертификации требуемой конфигурации RGB, указывающий цвет и интенсивность излучаемого света во время анализа. Наконец, программный код претерпел несколько обновлений для уточнения мгновенных измерений плотности и окончательных количеств оценок энергии, подтверждая воспроизводимость и математическую согласованность. Некоторые другие важные детали, требующие дополнительного внимания, включают: (i) однородное распределение светодиодов и центральное расположение датчика яркости для получения репрезентативных и сбалансированных результатов, (ii) установку всех компонентов в соответствии с электронной диаграммой (рисунок 2) и программным кодом (дополнительный файл 3, дополнительный файл 4 и дополнительный файл 5). ) для обеспечения правильной работы и (iii) настройки (сохраняя ту же конфигурацию RGB и времени) перед запуском эксперимента для обеспечения согласованности репликаций с надежными результатами. Хотя система RGB предоставляет несколько видимых цветовых композиций с определенными длинами волн, эксперименты с невидимым светом потребуют специальных обновлений протокола. Блок-схема принятия решений представлена на рисунке 5 , чтобы обеспечить систематический подход к решению проблем для поиска и исправления проблем или ошибок во время операции.
Разработанный для удовлетворения потребностей экспериментов in vitro с подтвержденными результатами, полученными с терапевтической активацией вертепорфина для индуцирования цитотоксичности в клетках 2D HeLa (рисунок 4), PhotoACT может быть рекомендован для университетов, школ, отраслей промышленности и других исследовательских центров. Это устройство должно распространить преимущества ФДТ на научные исследования, изучающие механизм действия фотосенсибилизаторов и их клиническое применение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Артура Энрике Гомеса де Оливейру и Лукаса Джулиана Круза Гомеса за помощь в съемочном процессе. Этот проект был поддержан Бразильским исследовательским советом (CNPq, номера грантов 400953/2016-1-404286/2021-6) и Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Это исследование было также частично профинансировано Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A.
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R.
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
