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Bioengineering

स्केलेबल 3 डी इंजीनियर मांसपेशी ऊतकों में प्रीक्लिनिकल ड्रग परीक्षण

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64399
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Curi Bio Inc.
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल 3 डी इंजीनियर कार्डियक और कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों को उत्पन्न करने के तरीके प्रदान करता है और प्रीक्लिनिकल ड्रग स्क्रीनिंग तौर-तरीकों में उनके उपयोग का वर्णन करता है। वर्णित विधियां समानांतर में 24 ऊतकों के एक साथ मूल्यांकन की सुविधा के लिए एक चुंबकीय संवेदन प्रणाली का उपयोग करती हैं।

Abstract

विट्रो में स्वस्थ और रोग की स्थिति का सटीक मॉडलिंग नई उपचार रणनीतियों और चिकित्सीय के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। हृदय और कंकाल की मांसपेशियों की बीमारियों के लिए, सिकुड़ा हुआ बल और कैनेटीक्स मांसपेशियों के कार्य का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण मैट्रिक्स का गठन करते हैं। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से इंजीनियर मांसपेशी ऊतकों (ईएमटी) को उत्पन्न करने के लिए नए और बेहतर तरीकों ने इन विट्रो रोग मॉडलिंग को सिकुड़ा हुआ ऊतकों के लिए अधिक विश्वसनीय बना दिया है; हालांकि, निलंबित सेल संस्कृतियों से ऊतकों को फिर से बनाना और उनकी सिकुड़न को मापना चुनौतीपूर्ण है। ऐसी तकनीकें अक्सर उच्च विफलता दर से ग्रस्त होती हैं और जटिल इंस्ट्रूमेंटेशन और अनुकूलित डेटा विश्लेषण दिनचर्या की आवश्यकता होती है। एक नया प्लेटफ़ॉर्म और डिवाइस जो लेबल-मुक्त, अत्यधिक-समानांतर और स्वचालन-अनुकूल अनुबंध परख के साथ संयोजन में 3 डी ईएमटी का उपयोग करता है, इन बाधाओं में से कई को दरकिनार करता है। मंच लगभग किसी भी सेल स्रोत का उपयोग करके 3 डी ईएमटी के आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निर्माण को सक्षम बनाता है। ऊतक संकुचन को तब एक उपकरण के माध्यम से मापा जाता है जो जटिल सॉफ्टवेयर विश्लेषण दिनचर्या की आवश्यकता के बिना एक साथ 24 ऊतकों को मापता है। उपकरण बल में माइक्रोन्यूटन परिवर्तनों को मज़बूती से माप सकता है, जिससे सिकुड़ा हुआ उत्पादन पर दवा या चिकित्सीय के प्रभाव को मापने के लिए खुराक-निर्भर यौगिक स्क्रीनिंग की अनुमति मिलती है। इस उपकरण के साथ बनाए गए इंजीनियर ऊतक पूरी तरह कार्यात्मक होते हैं, विद्युत उत्तेजना पर ट्विच और टेटनिक संकुचन उत्पन्न करते हैं, और हफ्तों या महीनों में संस्कृति में अनुदैर्ध्य रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। यहां, हम ज्ञात विषाक्त पदार्थों के साथ तीव्र और पुरानी खुराक के तहत कार्डियक मांसपेशी ईएमटी से डेटा दिखाते हैं, जिसमें एक दवा (बीएमएस -986094) शामिल है जिसे अप्रत्याशित कार्डियोटॉक्सिसिटी के कारण रोगी की मृत्यु के बाद नैदानिक परीक्षणों से खींचा गया था। मायोसिन अवरोधक के साथ उपचार के जवाब में इंजीनियर ऊतकों में परिवर्तित कंकाल की मांसपेशी समारोह भी प्रस्तुत किया गया है। यह मंच शोधकर्ता को न्यूनतम अतिरिक्त प्रशिक्षण या कौशल की आवश्यकता के साथ जटिल, सूचना-समृद्ध बायोइंजीनियर्ड मॉडल सिस्टम को उनके दवा खोज वर्कफ़्लो में एकीकृत करने में सक्षम बनाता है।

Introduction

प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) मॉडल तेजी से चिकित्सीय खोज और विकास के लिए प्रीक्लिनिकल पाइपलाइन में प्रमुख खिलाड़ी बन रहे हैं, साथ ही बुनियादी जैविक अनुसंधान और रोग मॉडलिंग 1,2,3,4,5। आईपीएससी से प्राप्त हृदय और कंकाल की मांसपेशी जैसे सिकुड़ा हुआ ऊतक मानव इन विट्रो अध्ययनों की भविष्यवाणी शक्ति में सुधार करने की बड़ी क्षमता रखते हैं क्योंकि मांसपेशियों के सिकुड़ा हुआ बल और कैनेटीक्स का प्रत्यक्ष मूल्यांकन समग्र ऊतक समारोह 4,6,7,8 का अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक मैट्रिक्स हैं। आमतौर पर, सिकुड़ा हुआ बल का माप या तो अप्रत्यक्ष रूप से सब्सट्रेट विक्षेपण 9,10 के ऑप्टिकल ट्रैकिंग द्वारा या सीधे बल ट्रांसड्यूसर 4,11,12 से कोशिकाओं / ऊतकों के लगाव द्वारा प्राप्त किया गया है। ये विधियां, सटीक होने के बावजूद, स्वाभाविक रूप से कम-थ्रूपुट हैं और आमतौर पर डेटा एकत्र करने और विश्लेषण करने के लिए अत्यधिक कुशल ऑपरेटरों की आवश्यकता होती है।

पिछले काम से पता चला है कि चुंबकीय क्षेत्र संवेदन इन बाधाओं को दरकिनार करता है और कई ऊतक संरचनाओंमें एक साथ इंजीनियर मांसपेशी समारोह का आकलन करने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है। मंतर्रे (मैग्नेटोमेट्रिक एनालाइजर फॉर ईएनजीनियर्ड टिशू एरे) 3 डी कॉन्ट्रैक्टिलिटी प्लेटफॉर्म इस तकनीक पर एक उपकरण का उपयोग करके बनाता है जो अत्यधिक समानांतर तरीके से इंजीनियर मांसपेशियों के ऊतकों की सिकुड़न को मापने में सक्षम है जो उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग14 के साथ 3 डी सेलुलर मॉडल की जटिलता का लाभ उठाता है। मंच एक मानक सेल-कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर या बाहर कार्डियक और कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों में सिकुड़ा हुआ कार्य की लेबल-मुक्त, मात्रात्मक, वास्तविक समय की निगरानी को सक्षम बनाता है, जिससे ऑप्टिकल-आधारित सिकुड़ा हुआ इमेजिंग और विश्लेषण की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। यह तकनीक स्वस्थ और रोगग्रस्त सेल लाइनों की सीधी तुलना की सुविधा प्रदान करती है और सिकुड़ा हुआ ऊतकों पर दवा के प्रभाव को मापने में सक्षम बनाती है, नए और मौजूदा चिकित्सीय यौगिकों के लिए मात्रात्मक, इन विट्रो, सुरक्षा और प्रभावकारिता डेटा स्थापित करती है।

इंजीनियर किए गए 3 डी मांसपेशी ऊतकों को दो पदों के बीच अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से मनतारे उपभोग्य, 24-वेल कास्टिंग प्लेट (चित्रा 1) का उपयोग करके बनाया जा सकता है। एक पोस्ट कठोर है, जबकि दूसरी पोस्ट लचीली है और इसमें एक छोटा चुंबक है। जब ऊतक निर्माण सिकुड़ता है, तो यह लचीली पोस्ट और एम्बेडेड चुंबक को विस्थापित करता है। ईएमटी प्लेट को उपकरण के भीतर तैनात किया जाता है, और विस्थापन के बाद प्लेट धारक के नीचे सर्किट बोर्ड पर चुंबकीय सेंसर की एक सरणी के माध्यम से मापा जाता है। चुंबकीय क्षेत्र में मापा परिवर्तन ों को गणितीय एल्गोरिथ्म का उपयोग करके पूर्ण सिकुड़ा हुआ बल में परिवर्तित किया जाता है। उपकरण संकुचन आवृत्ति, वेग और क्षय समय सहित सेल प्रकार (ओं) की कार्यात्मक क्षमता और परिपक्वता के बारे में विस्तृत जानकारी के संग्रह को सक्षम करने के लिए तेजी से डेटा नमूना दरों को नियोजित करता है। ये कार्यात्मक माप चुंबकीय संवेदन मंच के साथ या पारंपरिक ऑप्टिकल विधियों का उपयोग करके व्यक्तिगत रूप से और क्रमिक रूप से सभी 24 कुओं में प्राप्त किए जा सकते हैं।

यह अध्ययन एक फाइब्रिन-आधारित हाइड्रोगेल में 3 डी कंकाल की मांसपेशी और कार्डियक माइक्रोटिश्यूज इंजीनियरिंग के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करता है। एक संक्षिप्त, 80 मिनट की प्रतिक्रिया के दौरान, थ्रोम्बिन फाइब्रिनोजेन के फाइब्रिन में रूपांतरण को उत्प्रेरित करता है, जिससे निलंबित संस्कृति 15 में मांसपेशियों की कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक मचान प्रदान कियाजाता है। स्ट्रोमल कोशिकाएं मैट्रिक्स को फिर से तैयार करने में मदद करती हैं और ऊतक सिकुड़ा हुआ हो जाते हैं क्योंकि मांसपेशियों की कोशिकाएं हाइड्रोगेल के भीतर एक सिंकेटियम बनाती हैं। इन ऊतकों की सिकुड़न का विश्लेषण चुंबकीय संवेदन दृष्टिकोण का उपयोग करके किया गया था, यौगिक जोखिम से पहले और बाद में, खुराक-प्रतिक्रिया दवा अध्ययनों में उपयोग के लिए इस पद्धति को मान्य किया गया था। एक स्वस्थ दाता बायोप्सी से प्राथमिक मानव मायोब्लास्ट्स को विक्रेता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया और 2 डी में सुसंस्कृत किया गया। 3 डी ऊतकों को बनाने के लिए पर्याप्त सेल संख्या उत्पन्न करने के लिए तीन मार्गों के माध्यम से कंकाल की मांसपेशी वृद्धि माध्यम का उपयोग करके कोशिकाओं का विस्तार किया गया था। स्ट्रोमल कोशिकाओं और एचआईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स को 3 दिनों के लिए विक्रेता के प्रोटोकॉल के अनुसार सुसंस्कृत किया गया था ताकि ऊतकों में कोशिकाओं को डालने से पहले क्रायोप्रिजर्वेशन से वसूली की अनुमति मिल सके। प्रतिनिधि परिणाम उन डेटा सेटों के प्रकारों को दर्शाते हुए प्रदान किए जाते हैं जिन्हें चुंबकीय संवेदन मंच का उपयोग करके एकत्र किया जा सकता है। इन विधियों का उपयोग करके इंजीनियर ऊतकों की पीढ़ी से जुड़े सामान्य नुकसान को भी संबोधित किया जाता है।

Protocol

1. सेल संस्कृति प्रोटोकॉल

  1. प्राथमिक मानव मायोब्लास्ट संस्कृति
    1. बर्फ पर डीएमईएम /एफ 12 माध्यम के 8 एमएल में 1: 100 के अनुपात में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) को पतला करें।
    2. एक टी 175 फ्लास्क पर 8 एमएल ईसीएम समाधान लागू करें और सेल सीडिंग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, लेकिन 24 घंटे से अधिक नहीं। सुनिश्चित करें कि ईसीएम समाधान पूरे फ्लास्क तल को कवर करता है।
    3. कंकाल की मांसपेशियों के विकास माध्यम का 5 एमएल एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तक।
    4. कोशिकाओं की जमी हुई शीशी (5.0 x 105 मायोब्लास्ट्स) को 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पिघलाएं या जब तक कि बर्फ पिघल न जाए। शीशी को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में स्थानांतरित करें।
    5. पी 1000 का उपयोग करके कोशिकाओं को एलिकोट किए गए माध्यम में स्थानांतरित करें। ट्राइट्यूरेट न करें। 3 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सुपरनैटेंट को एस्पिरेटेड करें और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करके विकास माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. ईसीएम-लेपित फ्लास्क को 15 एमएल डीपीबीएस के साथ धोएं। एस्पिरेट डीपीबीएस, और फिर फ्लास्क में विकास माध्यम के 30 एमएल जोड़ें।
    8. कोशिकाओं में विकास माध्यम के 4 एमएल जोड़ें, मिलाएं, और सेल निलंबन को टी -175 फ्लास्क में वितरित करें। सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 35 एमएल है। फ्लास्क सतह पर कोशिकाओं के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए फ्लास्क को 5-6 बार बाईं और दाईं ओर धीरे से बाईं और दाईं ओर स्लाइड करें, इसके बाद 5-6 बार आगे और पीछे।
    9. टी -175 फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए या जब तक वे 70% से अधिक कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंचते हैं, और फिर कोशिकाओं को पारित करते हैं।
  2. प्राथमिक मानव मायोब्लास्ट्स को पास करना
    1. बर्फ पर डीएमईएम /एफ 12 माध्यम के 30 एमएल में 1: 100 के अनुपात में ईसीएम को पतला करें।
    2. तीन टी 225 फ्लास्क पर ईसीएम समाधान के 10 एमएल लागू करें और सेल सीडिंग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, लेकिन 24 घंटे से अधिक नहीं। सुनिश्चित करें कि ईसीएम समाधान पूरे फ्लास्क तल को कवर करता है।
    3. कोशिकाओं को 15 एमएल डीपीबीएस के साथ धोएं। विक्रेता के प्रोटोकॉल के अनुसार एस्पिरेट करें और पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें।
    4. एक बार जब कोशिकाओं को उठा लिया जाता है, तो विक्रेता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रतिक्रिया को रोकें और कोशिकाओं को शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र करें। 3 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. सुपरनैटेंट को एस्पिरेटेड करें और एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करके विकास माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    6. ईसीएम लेपित फ्लास्क को 15 एमएल डीपीबीएस के साथ धोएं। एस्पिरेट डीपीबीएस, और फिर प्रत्येक टी 225 फ्लास्क में 40 एमएल विकास माध्यम जोड़ें।
    7. सेल निलंबन में विकास माध्यम के 14 एमएल जोड़ें, मिलाएं, और प्रत्येक टी 225 फ्लास्क में सेल निलंबन के 5 एमएल वितरित करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक फ्लास्क में कुल मात्रा 45 एमएल है। फ्लास्क को काम की सतह के साथ धीरे से बाईं और दाईं ओर 5-6 बार स्लाइड करें, इसके बाद 5-6 बार आगे और पीछे करें ताकि वितरण सुनिश्चित हो सके।
    8. फ्लास्क को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें।
    9. कल्चर कोशिकाएं 2-3 दिनों के लिए या जब तक वे 70% से अधिक संपर्क तक नहीं पहुंचती हैं, और फिर पारित होती हैं। कोशिकाओं को प्रत्येक मार्ग पर 1: 3 या 1: 4 पर विभाजित करें और 3 x 103 और 1 x 104 कोशिकाओं / सेमी 2 के बीच बीजदें।
  3. HIPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट संस्कृति
    1. बर्फ पर डीएमईएम /एफ 12 माध्यम के 12 एमएल में 1: 60 के अनुपात में ईसीएम को पतला करें।
    2. दो 6-वेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं पर ईसीएम समाधान का 1 एमएल लागू करें और सेल सीडिंग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, लेकिन 24 घंटे से अधिक नहीं।
    3. कार्डियोमायोसाइट्स की एक जमी हुई शीशी को 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पिघलाएं या जब तक बर्फ पिघल न जाए।
    4. शीशी को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और इसे बीएससी में स्थानांतरित करें।
    5. पिघली हुई कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करें।
    6. किसी भी शेष कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) चढ़ाना माध्यम के 1 एमएल के साथ खाली क्रायोवियल को कुल्ला करें।
    7. धीरे-धीरे 90 सेकंड के दौरान कोशिकाओं की शंक्वाकार ट्यूब में 1 एमएल कुल्ला मीडिया ड्रॉपवाइज (हर 5 सेकंड में एक बूंद) वितरित करें। धीमी मीडिया जोड़ के दौरान कोशिकाओं को मिलाने के लिए ट्यूब को लगातार घुमाएं।
    8. धीरे-धीरे कोशिकाओं के 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्लेटिंग माध्यम के 8 एमएल जोड़ें।
    9. सभी मीडिया को वितरित करने के बाद, कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाने के लिए धीरे-धीरे 3 बार ऊपर और नीचे करें। हेमसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    10. 3 मिनट के लिए 300 x g पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    11. कोशिकाओं को छर्रों से भरने के बाद, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
    12. प्लेटिंग माध्यम के 1 एमएल को ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करें और धीरे-धीरे 3-5 बार ऊपर और नीचे करके गोली को धीरे-धीरे तोड़ दें। कोशिकाओं को एक अतिरिक्त चढ़ाना माध्यम के साथ पुन: निलंबित करें।
    13. प्लेटिंग माध्यम के 2 एमएल में6 वेल प्लेट के प्रति कुएं 2-4 x 10 6 कोशिकाओं के बीच बीज।
    14. ईसीएम-लेपित 6-वेल प्लेटों को डीपीबीएस (2 एमएल / वेल) के साथ धोएं।
    15. पिपेट 6 वेल प्लेट के प्रति कुएं में 2 एमएल सेल सस्पेंशन। प्लेट सतहों पर कोशिकाओं के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए प्लेटों को धीरे-धीरे बाईं और दाईं ओर बाईं और दाईं ओर 5-6 बार स्थानांतरित करें।
    16. प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें।
    17. कोशिकाओं की सभी शीशियों को पिघलाने के लिए चरण 1.3.3-1.3.16 दोहराएं।
    18. प्लेटिंग के बाद अगले दिन रखरखाव माध्यम के 3-5 एमएल (सेल लाइन और घनत्व के आधार पर) में बदलें, और फिर हर दूसरे दिन माध्यम बदलें। 3 डी ऊतकों में कास्टिंग से पहले 3-4 दिनों के लिए कल्चर कोशिकाएं।
  4. स्ट्रोमल सेल संस्कृति
    1. टी 175 फ्लास्क पर ईसीएम समाधान के 30 एमएल लागू करें और सेल सीडिंग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, लेकिन 24 घंटे से अधिक नहीं।
    2. स्ट्रोमल सेल माध्यम के 5 एमएल को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में विभाजित करें।
    3. स्ट्रोमल कोशिकाओं की जमी हुई शीशी को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए पानी के स्नान में पिघलाएं या जब तक बर्फ पिघल न जाए।
    4. शीशी को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और इसे बीएससी में स्थानांतरित करें।
    5. शीशी में पिघली हुई कोशिकाओं में धीरे-धीरे स्ट्रोमल सेल माध्यम के 1 एमएल जोड़ने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करें।
    6. सेल निलंबन को शीशी से शंक्वाकार ट्यूब में शेष पिघलने वाले मीडिया में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को मिलाने के लिए 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। पिपेल को 3 बार ऊपर और नीचे करें।
    7. हेमसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाओं को नीचे न घुमाएं।
    8. ईसीएम-लेपित टी 175 फ्लास्क को 15 एमएल डीपीबीएस के साथ धोएं।
    9. स्ट्रोमल कोशिकाओं को फ्लास्क में 3-4 x 103 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर स्थानांतरित करें। फ्लास्क सतह पर कोशिकाओं के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए फ्लास्क को 5-6 बार बाईं और दाईं ओर धीरे से बाईं और दाईं ओर स्लाइड करें, इसके बाद 5-6 बार आगे और पीछे।
    10. 45 एमएल गर्म स्ट्रोमल सेल माध्यम के साथ अगले दिन मीडिया बदलें। 3 डी ऊतकों में कास्टिंग से पहले 3-4 दिनों के लिए कोशिकाओं को कल्चर करें।

2. सामग्री तैयारी

  1. फाइब्रिनोजेन
    नोट: फाइब्रिनोजेन का पुनर्गठन करते समय, फाइब्रिनोजेन पाउडर की सतह क्षेत्र की मात्रा को अधिकतम करने का ध्यान रखें। इस प्रोटोकॉल में, उपयोग किए जा रहे कंटेनर के आकार के लिए उपयोग किए जाने वाले डिल्यूएंट की मात्रा को अनुकूलित किया गया था, यानी, डिश के निचले हिस्से को कवर करने के लिए बस पर्याप्त डिल्यूएंट का उपयोग किया गया था। उदाहरण के लिए, 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के बजाय 100 मिमी डिश में पीबीएस के 10 एमएल पर फाइब्रिनोजेन की परत 0.5 ग्राम। डिल्यूएंट के सतह क्षेत्र की मात्रा को अधिकतम करने से फाइब्रिनोजेन को पुनर्गठित करने और प्रोटीन के संभावित झुरमुट को कम करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा कम हो जाएगी।
    1. पुनर्गठन
      1. पीबीएस के 10 एमएल को 100 मिमी सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें और सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      2. गर्म पीबीएस की पूरी सतह पर फाइब्रिनोजेन पाउडर की 0.5 ग्राम परत करें और फाइब्रिनोजेन पूरी तरह से घुलने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इसमें 2 घंटे से अधिक समय नहीं लगना चाहिए। घुलने वाले पाउडर को धीरे से घुमाया जा सकता है, लेकिन डिश को सख्ती से न हिलाएं।
    2. बाँझ निस्पंदन
      1. एक बार जब पाउडर पूरी तरह से घुल जाता है, तो घोल को 100 μm फ़िल्टर के माध्यम से चलाएं और इसे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें ताकि गेल्ड फाइब्रिनोजेन के किसी भी झुरमुट को हटाया जा सके।
      2. फ़िल्टर किए गए घोल को 0.2 μm फ़िल्टर के साथ कैप किए गए 10 mL सिरिंज में डालें। फ़िल्टर के माध्यम से समाधान को धक्का दें और इसे एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। सभी 10 एमएल समाधान को निष्फल करने के लिए फ़िल्टर को एक से अधिक बार बदलने की आवश्यकता हो सकती है।
      3. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बाँझ फाइब्रिनोजेन के 300 एमएल एलकोट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बर्फ पर या आवश्यकतानुसार 4 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट को पिघलाएं। बार-बार जमने/पिघलने से बचें।
  2. थ्रोम्बिन
    1. 100 यू / एमएल थ्रोम्बिन स्टॉक समाधान बनाने के लिए सीधे थ्रोम्बिन (1 केयू) की एक शीशी में पीबीएस के 6 एमएल और डीआईएच2ओ के 4 एमएल जोड़ें।
    2. 0.2 μm फ़िल्टर, एलिकोट के साथ फ़िल्टर करें, और 1.5 mL प्लास्टिक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में -20 °C पर स्टोर करें क्योंकि थ्रोम्बिन ग्लास में सोखता है। बार-बार जमने/पिघलने से बचें।
  3. पॉली (एथिलीनिमाइन) समाधान (पीईआई)
    चेतावनी: पीईआई विषाक्त है। निर्माता द्वारा निर्दिष्ट उपयुक्त पीपीई का उपयोग करें।
    नोट: पीईआई को 50% डब्ल्यू / वी समाधान के रूप में आपूर्ति की जाती है। यह अत्यधिक चिपचिपा है और पिपेट करना मुश्किल है। सीधे 50% w/v समाधान के बजाय 10% स्टॉक समाधान से 0.1% समाधान बनाएं।
    1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 50% डब्ल्यू / वी पीईआई समाधान के 5 एमएल मापें।
    2. 20 mL diH2O जोड़ें और 10% स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए मिलाएं। इस अत्यधिक केंद्रित स्टॉक समाधान को बाँझ फ़िल्टर नहीं किया जा सकता है।
    3. सेल कल्चर के लिए 0.1% समाधान बनाने के लिए, 500 एमएल फिल्टर फ्लास्क का उपयोग करके 495 एमएल डीआईएच2ओ में 10% स्टॉक का 5 एमएल जोड़ें और आरटी में 1 सप्ताह से अधिक समय तक स्टोर करें।
  4. ग्लूटारल्डिहाइड
    सावधानी: ग्लूटार्ल्डिहाइड विषाक्त है। निर्माता द्वारा निर्दिष्ट उपयुक्त पीपीई का उपयोग करें।
    1. ग्लूटारल्डिहाइड को 25% समाधान के रूप में आपूर्ति की जाती है। 0.01% समाधान बनाने के लिए, 99.6 एमएल डीआईएच2ओ बाँझ फ़िल्टर में 40 μL जोड़ें और 1 सप्ताह से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. पोस्ट तैयारी
    1. एक बाँझ संस्कृति हुड के अंदर उपभोग्य ऊतक कास्टिंग किट रखें। कास्टिंग किट में एक ढक्कन, एक पोस्ट जाली होती है जिसमें 24 जोड़े पोस्ट होते हैं (24-वेल प्लेट के प्रति कुएं में एक जोड़ी पोस्ट), और एक विशेष 24-वेल प्लेट बॉटम होता है जिसमें 24 कास्टिंग कुएं होते हैं। प्रत्येक कास्टिंग वेल में सेल / हाइड्रोगेल घटकों को पकड़ने के लिए कुएं के तल में एक खाई होती है और उन्हें ट्यूब के आकार के ऊतक में ढाला जाता है जैसा कि हाइड्रोगेल पॉलीमराइज्ड होता है (चित्रा 1 बी)।
    2. 0.1% पीईआई समाधान के 1.5 एमएल / वेल के साथ 24-वेल प्लेट के कुओं को भरें और प्लेट में पोस्ट रखें ताकि पदों की प्रत्येक जोड़ी की युक्तियां जलमग्न हो जाएं। पीईआई पदों पर एक सकारात्मक चार्ज जमा करेगा ताकि हाइड्रोगेल में प्रोटीन ऊतक कास्टिंग के दौरान पदों से मजबूती से जुड़ जाए।
    3. बाँझडीआईएच 2ओ के 2 एमएल /वेल के साथ दूसरी 24-वेल प्लेट के कुओं को भरें और पदों को स्थानांतरित करें। इसे 1 मिनट के लिए छोड़ दें।
    4. तीसरी 24-वेल प्लेट में, कुओं को 1.5 एमएल / कुएं के साथ 0.01% ग्लूटारल्डिहाइड (जीए) भरें और पदों को स्थानांतरित करें। इसे 30 मिनट के लिए बैठने दें। जीए पीईआई से पदों के लिए सकारात्मक शुल्क तय करेगा।
    5. जबकि पोस्ट ग्लूटारैल्डिहाइड में बैठते हैं, डीआईएच2ओ कुओं को एस्पिरेट करें, बाँझ डीआईएच 2 ओ के2एमएल / वेल से धोएं, एस्पिरेट करें, और बाँझ डीआईएच 2 ओ के 2 एमएल /वेलके साथ फिर से भरें। कुल्ला करने के बजाय एक ताजा, 24-अच्छी प्लेट का उपयोग किया जा सकता है।
    6. जब 30 मिनट समाप्त हो जाता है, तो पदों को बाँझ diH 2 O के2mL/कुएं में स्थानांतरित करें। इसे 1 मिनट के लिए छोड़ दें।
    7. डीआईएच2ओ को एस्पिरेट करें और बाँझ डीआईएच 2 ओ का एक और 2 एमएल /वेलजोड़ें। इसे 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
    8. पदों को सूखने के लिए 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें (लगभग 15 मिनट)।
    9. सूखने के बाद, कास्टिंग किट को फिर से इकट्ठा करें। ढक्कन और प्लेट को एक साथ सील करने के लिए किनारों को पैराफिल्म करें, और फिर सेल सीडिंग से पहले 72 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबे समय तक भंडारण समय संभव है लेकिन परीक्षण नहीं किया गया है।

3. ऊतक कास्टिंग प्रोटोकॉल

  1. कास्टिंग प्लेट की तैयारी
    1. ऊतक कास्टिंग किट को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्री-चिल करें।
    2. बर्फ की एक बाल्टी को बीएससी में स्थानांतरित करें। बर्फ पर, 50 μL थ्रोम्बिन समाधान (थ्रोम्बिन स्टॉक का 3 μL + EMT माध्यम का 47 μL) प्रति अच्छी तरह से तैयार करें।
      नोट: ईएमटी माध्यम पर विवरण के लिए चरण 3.2.1 देखें।
    3. रेफ्रिजरेटर से ठंडा कास्टिंग किट निकालें और इसे सेल कल्चर हुड के अंदर ठंडे ब्लॉक या बर्फ पर रखें। कास्टिंग प्लेट को बर्फ पर सपाट रखें और पोस्ट जाली को कास्टिंग प्लेट से एक नई, बाँझ 24-वेल प्लेट में ले जाएं।
    4. कास्टिंग प्लेट के प्रत्येक पूर्व-ठंडा कुएं में थ्रोम्बिन समाधान का 50 μL पिपेट।
    5. किट को फिर से इकट्ठा करें और ऊतक कास्टिंग के लिए आवश्यक होने तक इसे रेफ्रिजरेटर में वापस कर दें। कुओं के अलावा थ्रोम्बिन के 3 घंटे के भीतर ऊतकों को डालें।
  2. सेल की तैयारी
    1. ईएमटी बेस माध्यम तैयार करें, बाँझ फ़िल्टर करें, और बर्फ पर छोड़ दें।
      नोट: यदि सेल-विशिष्ट कास्टिंग माध्यम में एफबीएस होता है, तो हीट-इनएक्टिवेटेड एफबीएस का उपयोग करें क्योंकि यह फाइब्रिनोजेन के साथ बातचीत कर सकता है और समय से पहले पोलीमराइजेशन का कारण बन सकता है।
      1. कार्डियक ईएमटी माध्यम तैयार करें: आरपीएमआई माध्यम के 500 एमएल, बी 27 के 10 एमएल और एमिनोकैप्रोइक एसिड के 2.5 ग्राम जोड़ें। (वैकल्पिक) 10 एमएम रॉक अवरोधक जोड़ें (केवल ऊतकों को ढालने के लिए उपयोग किए जाने वाले ईएमटी माध्यम में जोड़ें और पूरे 500 एमएल वॉल्यूम को नहीं)।
      2. कंकाल ईएमटी माध्यम तैयार करें: प्राथमिक ईएमटी के लिए एफ 10 माध्यम के 50 एमएल और एमिनोकैप्रोइक एसिड (एसीए) के 0.25 ग्राम और आईपीएससी-व्युत्पन्न ईएमटी के लिए 0.1 ग्राम एसीए जोड़ें।
    2. सेल कल्चर ग्रेड पृथक्करण अभिकर्मक को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। पृथक्करण अभिकर्मक को पतला करने के लिए ईएमटी माध्यम की एक समान मात्रा को गर्म करें।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि उपयोग किया गया प्रोटीज पूरी तरह से निष्क्रिय है। सक्रिय प्रोटीज 3 डी ऊतक गठन और पालन के बाद हस्तक्षेप करेगा।
    3. पीबीएस के साथ कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) को धोएं। 6-वेल प्लेट के लिए 2 एमएल / अच्छी तरह से उपयोग करें। 100 मिमी डिश, टी 175 फ्लास्क और टी 225 फ्लास्क के लिए क्रमशः 6 एमएल, 15 एमएल और 15 एमएल का उपयोग करें।
    4. कोशिकाओं को उठाने के लिए गर्म सेल कल्चर ग्रेड पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या कोशिकाओं के उठने तक इनक्यूबेट करें। कार्डियक संस्कृतियों के लिए, 10x पृथक्करण अभिकर्मक का उपयोग करें। स्ट्रोमल कोशिकाओं और कंकाल की मांसपेशी मायोब्लास्ट्स के लिए, 1x पृथक्करण अभिकर्मक का उपयोग करें। 6-वेल प्लेट के लिए 1 एमएल / वेल, 100 मिमी डिश के लिए 3 एमएल, टी 175 फ्लास्क के लिए 8 एमएल और टी 225 फ्लास्क के लिए 10 एमएल का उपयोग करें।
    5. प्लेट के किनारे टैप करके हर 2-3 मिनट में संस्कृतियों की जांच करें।
    6. एक बार जब कोशिकाएं उठ जाती हैं, तो उन्हें 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और एकल-सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए पी 1000 पिपेट के साथ ट्राइट्यूरेट करें।
    7. शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ने के लिए एक अतिरिक्त ईएमटी माध्यम के साथ प्लेट या फ्लास्क को धोएं। 6-वेल प्लेट के लिए ईएमटी माध्यम के 1 एमएल / वेल का उपयोग करें, 100 मिमी डिश के लिए 2 एमएल, टी 175 फ्लास्क के लिए 5 एमएल और टी 225 फ्लास्क के लिए 5 एमएल।
    8. एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को ट्राइट्यूरेट करें।
    9. पृथक्करण प्रक्रिया को समाप्त करने के लिए ईएमटी माध्यम जोड़ें, और फिर सेल गणना के लिए सेल निलंबन के नमूने लें। 6-वेल प्लेट के लिए 1 एमएल / वेल, 100 मिमी डिश के लिए 3 एमएल, टी 175 फ्लास्क के लिए 8 एमएल और टी 225 फ्लास्क के लिए 10 एमएल का उपयोग करें।
    10. कोशिकाओं को 4 मिनट के लिए 200 x g पर घुमाएं। एक हेमसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके सेल गणना करें, जबकि निलंबन सेंट्रीफ्यूज किए जाते हैं।
    11. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और अवशिष्ट पृथक्करण अभिकर्मक को हटाने के लिए ईएमटी बेस माध्यम के 5 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    12. 4 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और उचित घनत्व पर सेल निलंबन तैयार करें।
    13. ईएमटी माध्यम14,16 में 10% -20% ईसीएम प्रोटीन के अतिरिक्त 3 डी कंकाल की मांसपेशी ईएमटी की दीर्घायु और कार्य बढ़ाएं।
    14. बीज स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और उनके स्ट्रोमल कोशिकाएं क्रमशः 5 x 105 कोशिकाओं और 7.5 x 104 कोशिकाओं प्रति ऊतक निर्माण पर होती हैं। कंकाल की मांसपेशी मायोब्लास्ट्स को प्रति ऊतक निर्माण 7.5 x 105 कोशिकाओं पर बीज दें।
    15. हृदय के ऊतक
      1. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और ईएमटी माध्यम में 2.5 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल के घनत्व पर स्ट्रोमल कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और उन्हें बर्फ पर रखें। प्रति ईएमटी इस निलंबन के 30 μL का उपयोग करें।
      2. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और ईएमटी माध्यम में 8.3 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल के घनत्व पर सीएम को फिर से निलंबित करें और उन्हें बर्फ पर रखें। प्रति ईएमटी इस निलंबन के 60 μL का उपयोग करें।
    16. कंकाल की मांसपेशियों के ऊतक
      1. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और ईएमटी माध्यम में 8.3 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल के घनत्व पर कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और उन्हें बर्फ पर रखें। प्रति ईएमटी इस निलंबन के 90 μL का उपयोग करें।
    17. ऊतकों की वांछित संख्या बनाने के लिए आवश्यक प्रत्येक सेल समाधान की मात्रा की गणना करें (उदाहरण के लिए, तैयार सीएम के 60 μL और तैयार स्ट्रोमल कोशिकाओं के 30 μL या प्रति EMT कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के 90 μL)।
    18. पिपेट 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं की गणना की गई मात्रा को निर्धारित करता है।
    19. सेल सस्पेंशन में प्रति ईएमटी 10 μL फाइब्रिनोजेन जोड़ें और इसे बर्फ पर रखें।
    20. प्रति ईएमटी कुल अभिकर्मकों और सेल वॉल्यूम: सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ईएमटी में 90 μL कोशिकाएं, फाइब्रिनोजेन का 10 μL और थ्रोम्बिन समाधान का 50 μL है।
  3. ऊतक कास्टिंग
    1. ऊतक कास्टिंग किट को सेल कल्चर हुड में स्थानांतरित करें और ढक्कन को हटा दें (लचीली और कठोर पोस्ट युक्त पोस्ट जाली कास्टिंग प्लेट पर रहना चाहिए; चित्र 1 बी)। कास्टिंग प्लेट को बर्फ पर सपाट बिछाने वाली पोस्ट जाली के साथ रखें।
    2. फाइब्रिनोजेन मिश्रण को मिलाएं और पी 200 पिपेट के साथ 100 μL खींचें।
    3. 50 μL थ्रोम्बिन घोल के साथ तैयार कुओं में मिश्रण का 100 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाने के लिए 5 बार ट्राइट्यूरेट करें। पिपेट को पहले स्टॉप से आगे न धकेलें और किसी भी बुलबुले बनाने से बचने के लिए ट्राइट्यूरेशन के बाद टिप को हटा दें।
    4. इस स्तर पर, और जब तक पोस्ट जाली कास्टिंग प्लेट (चरण 3.3.10) से उठाने के लिए तैयार नहीं होती है, तब तक जाली का कोई भी आंदोलन ऊतक के दीर्घकालिक लगाव से समझौता कर सकता है। जाली के किसी भी आंदोलन से बचने के लिए एक हाथ की पॉइंटर उंगली और अंगूठे का उपयोग करके जाली और कास्टिंग अच्छी तरह से प्लेट दोनों को एक साथ पकड़ें।
    5. प्रत्येक ऊतक के लिए एक ताजा पी 200 टिप के साथ दोहराएं जब तक कि सभी ऊतक ों को कास्ट न किया जाए। प्रत्येक ऊतक को डालने से पहले 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन मिलाएं क्योंकि कोशिकाएं जल्दी से व्यवस्थित होती हैं।
    6. सावधानीपूर्वक बीज युक्त किट को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करें कि जाली को स्थानांतरित न करें। सीडिंग के बाद जाली के आंदोलन के परिणामस्वरूप कास्टिंग कुओं से ऊतकों को स्थानांतरित करने में सफलता कम हो सकती है। सेल प्रकार की परवाह किए बिना, 80 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यह हाइड्रोगेल के पोलीमराइजेशन को शुरू करेगा और प्रोटीन को पदों से जुड़ने की अनुमति देगा।
    7. इस बीच, हृदय के ऊतकों के लिए ईएमटी माध्यम के 2 एमएल / वेल के साथ एक ताजा 24-वेल प्लेट तैयार करें। यदि वांछित हो तो ईएमटी माध्यम में 10 एमएम रॉक अवरोधक जोड़ा जा सकता है। माध्यम को गर्म करने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    8. प्राथमिक कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के लिए 5 ग्राम / एल एमिनोकैप्रोइक एसिड (0.2 मिमी बाँझ फ़िल्टर) या आईपीएससी-व्युत्पन्न ईएमटी के लिए 2 ग्राम / एल एसीए युक्त विकास माध्यम के 2 एमएल / वेल तैयार करें। माध्यम को गर्म करने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. इनक्यूबेशन के बाद, धीरे से कास्टिंग कुओं के किनारे पर ईएमटी माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और सेल प्रकार की परवाह किए बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यह हाइड्रोजेल को कास्टिंग के किनारों से अच्छी तरह से हटा देगा और ऊतक के आसान हस्तांतरण की अनुमति देगा।
    10. 10 मिनट के बाद, पोस्ट जाली को सावधानीपूर्वक उठाएं और ऊतकों को कास्टिंग प्लेट से मध्यम के साथ तैयार 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें (चित्रा 1 सी)। ऊतकों के साथ प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें।
  4. अनुरक्षण
    1. 24 घंटे के बाद, कास्ट ऊतकों को ईएमटी मीडिया के 2 एमएल / वेल के साथ एक ताजा 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें (रॉक अवरोधक के बिना यदि इसे शामिल किया गया था) और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के लिए, मायोब्लास्ट संलयन को बढ़ावा देने के लिए विकास माध्यम को भेदभाव माध्यम में स्विच करें।
    2. हृदय के ऊतकों को हर 2-3 दिनों में ईएमटी माध्यम के 2 एमएल / वेल के साथ ताजा कुओं में स्थानांतरित करें।
    3. कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों को हर 2-3 दिनों में 5 ग्राम / एल एमिनोकैप्रोइक एसिड (0.2 मिमी बाँझ फ़िल्टर) युक्त 2 एमएल / वेल भेदभाव माध्यम के साथ ताजा कुओं में स्थानांतरित करें। आईपीएससी-व्युत्पन्न ऊतकों के लिए 2 ग्राम / एल एसीए का उपयोग करें।
    4. मध्यम परिवर्तनों में सहायता के लिए, 3 डी ऊतकों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए एक ही प्लेट में माध्यम को बदलने के बजाय पोस्ट जाली को एक ताजा 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। ईएमटी माध्यम के साथ एक दूसरी 24-वेल प्लेट तैयार करें और ऊतकों को ताजा माध्यम में स्थानांतरित करें। अगले माध्यम परिवर्तन के लिए उपयोग करने के लिए सक्रिय संस्कृति के साथ प्लेट को पुराने माध्यम के साथ रखें। संस्कृति अवधि के दौरान दो प्लेटों के बीच पोस्ट जाली को आगे और पीछे स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के लिए एक ताजा प्लेट का उपयोग करें।
    5. ईएमटी संकुचन को या तो पोस्ट विक्षेपण (चित्रा 1 डी) या चुंबकीय संवेदन हार्डवेयर13,14 के ऑप्टिकल ट्रैकिंग के माध्यम से मापें। संस्कृति में 3-4 दिनों के बाद हृदय के ऊतक अनायास धड़कना शुरू कर देते हैं। कंकाल की मांसपेशियों के ऊतक आमतौर पर संस्कृति में 7 दिनों के बाद विद्युत क्षेत्र उत्तेजना के साथ सिकुड़ा हुआ होता है।

Representative Results

कोशिकाओं को 2-पोस्ट उपभोग्य प्लेट (चित्रा 1) में इंजीनियर मांसपेशियों के ऊतकों में डाला गया था। सफल ईएमटी समान दिखाई देंगे, और मैट्रिक्स को पदों (चित्रा 2 ए) के बीच समान रूप से वितरित किया जाएगा। मैट्रिक्स को दोनों पदों के चारों ओर लपेटना चाहिए, ऊतक के लिए समकक्ष लंगर बिंदुओं का उत्पादन करना चाहिए। कास्टिंग में विफलताएं इस विधि के साथ दुर्लभ हैं और आमतौर पर दृश्य निरीक्षण के साथ स्पष्ट होती हैं। असफल ईएमटी उत्पादन विनाशकारी विफलताओं से हो सकता है, जैसे कि पोस्ट (चित्रा 2 बी) से ऊतक अलगाव से लेकर अधिक सूक्ष्म संरचनात्मक दोष, जैसे हवा के बुलबुले और पदों के लिए ढीला लगाव (चित्रा 2 सी, डी)। मामूली खामियों वाले ऊतक अभी भी व्यवहार्य हो सकते हैं, लेकिन इन ऊतकों के डेटा की सावधानीपूर्वक जांच की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह समझौता न किए गए ईएमटी के बराबर है। उदाहरण के लिए, ईएमटी के भीतर हवा के बुलबुले को निचोड़ा जा सकता है क्योंकि ऊतक समय के साथ कॉम्पैक्ट होता है, जिससे सिकुड़ा हुआ कमियों के बिना पूरी तरह कार्यात्मक निर्माण होता है। इन ऊतकों का मूल्यांकन केस-बाय-केस आधार पर किया जाना चाहिए, हालांकि, हवा के बुलबुले का स्थान कार्यात्मक वसूली को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, पोस्ट पर उत्पन्न हवा के बुलबुले, ऊतक लगाव को प्रभावित कर सकते हैं, जो पोस्ट के दीर्घकालिक पालन में बाधा डाल सकता है।

ऊतक पहले 24 घंटे के भीतर कॉम्पैक्ट होना शुरू करते हैं क्योंकि कोशिकाएं हाइड्रोगेल के भीतर मैट्रिक्स को फिर से तैयार करती हैं (चित्रा 3)। संघनन एक क्रमिक प्रक्रिया है और आमतौर पर संस्कृति के पहले 2-4 हफ्तों में आगे बढ़ती है। कुल मिलाकर, ऊतक संघनन तकनीकी और जैविक प्रतिकृति (चित्रा 4) के बीच सुसंगत है। कुछ सेल लाइनों के लिए मैट्रिक्स को दूसरों की तुलना में अधिक कॉम्पैक्ट करना सामान्य है क्योंकि ऊतक समय के साथ परिपक्व होते हैं। एक निर्माण के भीतर मायोजेनिक कोशिकाओं का प्रतिशत ईएमटी संघनन की दर और समग्र डिग्री को प्रभावित करता है। इंजीनियर ऊतकों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए हृदय और कंकाल की मांसपेशी कोशिका लाइनों दोनों के लिए कुल मायोजेनिक सामग्री 80% से ऊपर होनी चाहिए। सेल लाइनों में सिकुड़ा हुआ बलों और कैनेटीक्स की तुलना करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

कास्टिंग के बाद पहले कुछ दिनों के भीतर, कार्डियोमायोसाइट्स संस्कृति में अनायास धड़कना शुरू कर देते हैं, प्रत्येक मांसपेशी संकुचन के साथ लचीली पोस्ट को लयबद्ध रूप से झुकाते हैं। भेदभाव शुरू करने के बाद 7 वें दिन तक विद्युत उत्तेजना के जवाब में कंकाल की मांसपेशी संरचनाएं सिकुड़ जाती हैं। क्षेत्र उत्तेजना को एक कस्टम 24-वेल इलेक्ट्रोड ढक्कन से जुड़े बाहरी उत्तेजक के माध्यम से कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों पर लागू किया गया था। ढक्कन, प्रत्येक कुएं के लिए कार्बन इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी के साथ बनाया गया है, ऊतकों की 24-वेल प्लेट के शीर्ष पर बैठता है, साथ ही मांसपेशियों के संकुचन को प्रेरित करने के लिए प्रत्येक ईएमटी को उत्तेजित करता है। कार्यात्मक माप के दौरान 1 हर्ट्ज पर 10 एमएस पल्स अवधि के लिए 10 वी उत्तेजना का उपयोग करके ऊतकों को गति दी गई थी। सिकुड़ा हुआ ऊतक कंकाल के मायोब्लास्ट्स को इंगित करता है जो जुड़ गए हैं, कार्यात्मक सरकोमेरेस और सिकुड़ा हुआ मशीनरी के साथ पूर्ण मायोट्यूब बनाते हैं। मायोसिन हेवी चेन (मायएचसी) के लिए कंकाल ईएमटी का दाग सकारात्मक है और डिस्ट्रोफिन को मायोट्यूब झिल्ली में स्थानीयकृत किया जाता है जो क्रॉस-सेक्शनल इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण (चित्रा 5) में एक क्लासिक रिंग आकार का खुलासा करता है। एक बार ईएमटी कार्यात्मक होने के बाद, चुंबकीय संवेदन उपकरण, ट्रैकिंग बल और कैनेटीक्स में अनुबंध को दैनिक रूप से मापा जा सकता है क्योंकि निर्माण समय के साथ विकसित और परिपक्व होते हैं। हृदय और कंकाल की मांसपेशियों के ऊतक दोनों 3 डी संस्कृति (चित्रा 6) में हफ्तों से महीनों तक सिकुड़े रहते हैं, और उनका उपयोग अनुबंध अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है।

चुंबकीय पहचान दृष्टिकोण का उपयोग संरचनात्मक कार्डियोटॉक्सिकेंट्स के तीव्र और पुराने प्रभावों को एक साथ मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि डॉक्सोर्यूबिसिन (चित्रा 7) और बीएमएस -986094 (चित्रा 8), साथ ही अन्य दवाएं जो मांसपेशियों के संकुचन को प्रभावित करती हैं। संकुचन का पता लगाने के ऑप्टिकल ट्रैकिंग तरीकों का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन तीव्र दवा प्रभावों का अध्ययन करते समय सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि माप क्रमिक रूप से लिया जाना चाहिए। 3 डी संस्कृति में कार्डियक और कंकाल ईएमटी की विस्तारित दीर्घायु इन ऊतकों में दीर्घकालिक दवा अध्ययन को सक्षम बनाती है। यह उपयोगकर्ताओं को दोहराए जाने वाले खुराक के प्रभावों का पता लगाने की अनुमति देता है, साथ ही यौगिकों के लिए निरंतर, दीर्घकालिक जोखिम जो समय के साथ कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव दिखा सकते हैं जैसा कि डॉक्सोर्यूबिसिन के साथ होता है। डॉक्सोर्यूबिसिन (डॉक्स) एक कैंसर विरोधी कीमोथेरेपी दवाहै। रोगियों को दी जाने वाली दवा की मात्रा कैंसर के प्रकार, रोगी की उम्र, रोगी की ऊंचाई और वजन के साथ-साथ अन्य कारकों के आधार पर भिन्न होती है। इस कारण से, सांद्रता और वितरण कार्यक्रमों की एक विस्तृत श्रृंखला में डॉक्स के प्रभाव का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है। यहां, कार्डियक ईएमटी का इलाज 27 दिनों के दौरान डॉक्स की तीन अलग-अलग सांद्रता (0.1 μM, 1 μM, और 10 μM) के साथ किया गया था (चित्रा 7)। समूहों को प्रत्येक एकाग्रता पर ईएमटी का इलाज करके या तो बोलस उपचार या हर 72 घंटे में मध्यम परिवर्तन के साथ निरंतर प्रशासन के साथ स्तरीकृत किया गया था। डॉक्स के बोलस उपचार दिए गए कुओं को तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर दवा के संपर्क में लाया गया था, जिससे खुराक के बीच वसूली की अनुमति मिली। बोलस की दो उच्चतम खुराक और निरंतर जोखिम ने पूरे अध्ययन में सिकुड़ा हुआ बल उत्पादन की तत्काल और लंबे समय तक समाप्ति दिखाई। प्रशासन विधि के आधार पर, मध्य और सबसे कम सांद्रता का ऊतकों पर अलग-अलग प्रभाव पड़ा। दवा की सबसे कम सांद्रता में, बोलस समूह ने नियंत्रण से कोई अंतर नहीं दिखाया। हालांकि, लगातार जोखिम के 2 सप्ताह के बाद सिकुड़ा हुआ बल कम हो गया। दवा की मध्य-श्रेणी एकाग्रता का एक दिलचस्प प्रभाव था। जबकि निरंतर खुराक ने उपचार के पहले कुछ दिनों में बल को कम कर दिया और पूरे प्रयोग के दौरान चला, बोलस समूह ने 3 दिनों के बाद दवा को धोने पर स्तर को नियंत्रित करने के लिए सिकुड़ा हुआ बल की वसूली दिखाई। हालांकि, दवा के दूसरे बोलस ने बल की पूर्ण समाप्ति का कारण बना, इसके बाद कोई वसूली नहीं हुई (चित्रा 7), यह दर्शाता है कि इस एकाग्रता पर बार-बार खुराक करने से इस दवा के साथ इलाज किए गए रोगियों में कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव हो सकता है। इस अध्ययन का व्यापक दायरा, समय और प्रयोगात्मक दोनों स्थितियों में, विषाक्तता स्क्रीनिंग में 3 डी इंजीनियर ऊतकों की उपयोगिता पर प्रकाश डालता है, क्योंकि वे विस्तारित अवधि में रासायनिक जोखिम के लिए सिकुड़ा हुआ और उत्तरदायी रहते हैं, जिससे मांसपेशियों के ऊतकों के एक सेट के भीतर दीर्घकालिक दवा अध्ययन की अनुमति मिलती है। यह न केवल उन यौगिकों की पहचान करने की सुविधा प्रदान करता है जो क्रोनिक एक्सपोजर के साथ कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव डाल सकते हैं, बल्कि प्रशासन के संभावित कार्डियोटॉक्सिक समय का भी पता लगा सकते हैं।

मानव मांसपेशियों के ऊतकों में इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण नैदानिक परीक्षणों में मानव रोगियों को सुरक्षित रखने में मदद करने का एक तरीका है। बीएमएस -986094 एक न्यूक्लियोटाइड पोलीमरेज़ (एनएस 5 बी) अवरोधक है जिसका उपयोग हेपेटाइटिस सी के इलाज के लिए किया जाता है। दवा द्वितीय चरण के नैदानिक विकास में थी जब ब्रिस्टल-मायर्स स्क्विब ने18,19 रोगियों में अप्रत्याशित दिल की विफलता के कई मामलों के कारण विकास बंद कर दिया था। यहां, बीएमएस -986094 को कार्डियक ईएमटी पर लागू किया गया था ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि क्या 3 डी इंजीनियर मांसपेशी ऊतक दवा के लिए कार्डियोटॉक्सिक प्रतिक्रिया विकसित करेंगे (चित्रा 8)। दवा की तीन अलग-अलग सांद्रता लागू की गई थी, और ऊतकों की निगरानी 13 दिनों में की गई थी। खुराक-निर्भर तरीके से दवा को जोड़ने के साथ सिकुड़ा हुआ बल गिर गया (चित्रा 8 ए)। ट्विच आवृत्ति भी काफी प्रभावित हुई क्योंकि बीट दर धीमी हो गई और अंततः कार्डियोटॉक्सिक यौगिक (पी < 0.05, चित्रा 8 बी) के निरंतर संपर्क के साथ उम्मीद के अनुसार बंद हो गई। इन परिणामों से पता चलता है कि 3 डी-इंजीनियर मानव मांसपेशियों के ऊतकों का उपयोग बाजार में नई दवाओं को लाने और यौगिकों को ध्वजित करने की सुविधा के लिए कैसे किया जा सकता है जो अंततः कार्डियोटॉक्सिसिटी के कारण विफल हो जाते हैं। इसके अलावा, यह तकनीक नैदानिक परीक्षणों में रोगियों में डालने से पहले खतरनाक दवाओं को उजागर करके संभावित रूप से जीवन बचा सकती है।

मानव सिकुड़ा हुआ ऊतक पर तीव्र और क्रोनिक रूप से लागू दवाओं के प्रभाव को मापने की क्षमता सुरक्षा और प्रभावकारिता के लिए चिकित्सीय जांच करते समय एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। हालांकि, यह जानना महत्वपूर्ण है कि लागू दवाओं की एकाग्रता शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और इन विट्रो परीक्षण के लिए उपयुक्त है। कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों का उपयोग पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया वक्र में 2,3-ब्यूटेनडियोन मोनोक्सीम (बीडीएम) के लिए आईसी50 मान स्थापित करने के लिए किया गया था। यह दवा कंकाल की मांसपेशी मायोसिन -II20 का एक अच्छी तरह से विशेषता एटीपीस अवरोधक है। बीडीएम सरकोमेरेस21 में एक्टिन फिलामेंट के साथ मायोसिन क्रॉस-ब्रिज गठन को रोककर मांसपेशियों के संकुचन को रोकता है। यहां दिखाए गए परिणाम दवा लागू होने पर पूर्ण बल में खुराक-निर्भर कमी को प्रकट करते हैं और दवा को धोए जाने पर सिकुड़ा हुआ बल की पूरी वसूली, यह दर्शाता है कि क्षणिक प्रभाव मांसपेशियों के संकुचन को रोक रहा है और न केवल ऊतक के भीतर कोशिकाओं को मार रहा है (चित्रा 9 ए)। इसके अलावा, जांच की गई सात सांद्रता में एक पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया वक्र मापा गया था, जो इन मानव माइक्रोटिश्यू (चित्रा 9 बी) में 3.2 एमएम का आईसी50 स्थापित करता है।

Figure 1
चित्र 1: 2-पोस्ट मंतर्रे उपभोग्य 24-वेल प्लेट में ईएमटी कास्टिंग। (ए) ऊतक कास्टिंग से पहले मायोजेनिक और स्ट्रोमल कोशिकाओं को 2 डी सतहों पर संवर्धित किया गया था। (बी) कोशिकाओं को 2 डी सतहों से उठाया जाता है और इनसेट में दिखाए गए व्यक्तिगत प्लेट कास्टिंग कुओं में हाइड्रोगेल बनाने के लिए बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ मिलाया जाता है। (सी) 24-वेल प्लेट जिसमें हर कुएं में इंजीनियर ऊतक होते हैं। (डी) चुंबकीय पोस्ट (हरी सलाखों) के विस्थापन की तुलना करते हुए, आराम से और अनुबंधित इंजीनियर मांसपेशियों को दिखाने वाले प्रतिनिधि ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: सफल और असफल ईएमटी कास्टिंग( ए) आदर्श इंजीनियर मांसपेशी ऊतक 24 घंटे पोस्ट-कास्टिंग पूरे ऊतक में समरूप सेल / मैट्रिक्स संरचना के साथ पदों के चारों ओर समान रूप से कॉम्पैक्ट होती है। (बी) लचीली पोस्ट से हाइड्रोगेल की अलगाव को दर्शाने वाला असफल ईएमटी( सी) ईएमटी जिसमें पूरे ऊतक में हवा के बुलबुले होते हैं। (डी) दोनों पदों के आसपास असमान ऊतक जमाव। ऊतक को एक तरफ लचीली पोस्ट पर शिथिल रूप से लंगर डाला जाता है। स्केल पट्टियाँ 1 मिमी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: समय के साथ इंजीनियर मांसपेशी ऊतक में संघनन। (ए) ईएमटी निर्माण कास्टिंग के 1 दिन बाद दिखाया गया। ऊतकों को विभेदन माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है, सेल संलयन और हाइड्रोगेल संघनन के दिन 0 की शुरुआत होती है। (B-E) दिन 7 से 21 वें दिन तक एक ही ईएमटी समय के साथ दो पदों के बीच थोड़ी कम समग्र लंबाई और ईएमटी के मध्य खंड के माध्यम से मापा जाने पर छोटी चौड़ाई दिखाता है। स्केल पट्टियाँ 1 मिमी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: समय के साथ ईएमटी व्यास। ऊतकों की चार प्लेटों को 21 दिनों में ट्रैक किया गया था, पूरे संघनन में ईएमटी व्यास की तुलना की गई थी। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रत्येक ऊतक को हर हफ्ते मध्य-खंड के माध्यम से मापा गया था। समय बिंदु प्लेटों के बीच लगातार ईएमटी आकार दिखाते हैं। मैट्रिक्स रीमॉडेलिंग को स्थिर करने के रूप में 21 वें दिन अधिकतम संघनन तक पहुंच जाता है। तालिका ऊतकों की प्रत्येक प्लेट के भीतर संघनन के मानक विचलन (कुल का%) और सभी प्लेटों के लिए औसत विचलन दिखाती है। रंगीन सलाखों अलग-अलग प्लेटें हैं। त्रुटि पट्टियाँ प्लेटों के भीतर EMT की SD होती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इंजीनियर कंकाल की मांसपेशी ऊतकों का इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। ईएमटी को संस्कृति के 10 वें दिन तय किया गया था और पैराफिन में एम्बेडेड किया गया था। इमेजिंग से पहले पतले क्रॉस-सेक्शन (7 μm) को मायोसिन भारी श्रृंखला और डिस्ट्रोफिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। हरा = MyHC, लाल = डिस्ट्रोफिन, नीला = DAPI। उद्देश्य आवर्धन 40X है; स्केल पट्टी 50 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: समय के साथ इंजीनियर मांसपेशियों के ऊतकों में सिकुड़ा हुआ बल। (ए) संस्कृति में दिन 7 से दिन 63 तक कार्डियक ईएमटी से मापा गया औसत पूर्ण ट्विच बल; n = 3 प्रति समूह। (बी) संस्कृति में दिन 7 से दिन 53 तक प्राथमिक सेल लाइन से प्राप्त कंकाल ईएमटी में औसत पूर्ण ट्विच बल; n = 3. त्रुटि पट्टियाँ दोनों ग्राफ़ के लिए SD हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: इंजीनियर मांसपेशी ऊतक में तीव्र और पुरानी डॉक्सोर्यूबिसिन उपचार। डॉक्स की तीन अलग-अलग खुराक सांद्रता, 0.1 μM, 1 μM, और 10 μM, या तो बोलस में वितरित की गई थी या 27 दिनों के दौरान इंजीनियर मांसपेशियों के ऊतकों को लगातार प्रशासित की गई थी। एक्स-अक्ष पर हरे तीरों द्वारा नोट किए गए 0, 12 और 24 दिनों में मीडिया परिवर्तनों में दवा की बोलस खुराक को जोड़ा गया था। दवा को निरंतर खुराक के लिए हर मीडिया परिवर्तन पर मीडिया में जोड़ा गया था, जिसे एक्स-अक्ष पर काले और हरे तीरों द्वारा नोट किया गया था। बेसलाइन मूल्यों (पूर्व-दवा उपचार) से बल में प्रतिशत परिवर्तन वाई-अक्ष पर है, और उपचार के दिनों में समय एक्स-अक्ष पर है। हल्का नारंगी = डीएमएसओ निरंतर नियंत्रण, गहरा नारंगी = डीएमएसओ बोलस नियंत्रण, हल्का हरा = 0.1 μM dox निरंतर, गहरा हरा = 0.1 μM dox bolus, हल्का नीला = 1 μM dox निरंतर, गहरा नीला = 1 μM Dox bolus, हल्का पीला = 10 μM dox निरंतर, गहरा पीला = 10 μM dox bolus। त्रुटि पट्टियाँ SD हैं; n = 3 प्रति शर्त। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: इंजीनियर मांसपेशी ऊतक में बीएमएस -986094 के साथ क्रोनिक उपचार। ईएमटी को 13 दिनों में 0.4 μM (हरा), 2 μM (गहरा नीला), और 10 μM (हल्का नीला) BMS-986094 के साथ इलाज किया गया था। (ए) सिकुड़ा हुआ ट्विच बल (वाई-अक्ष) पहले 2 दिनों में सभी दवा सांद्रता में कम हो जाता है, जबकि डीएमएसओ में नियंत्रण ऊतक समय के साथ मजबूत होते रहते हैं (एक्स-अक्ष)। (बी) कार्डियक बीट रेट, या ट्विच फ्रीक्वेंसी, ग्राफ ए में दिखाए गए सिकुड़ा हुआ बल की समाप्ति के साथ खुराक-निर्भर तरीके से समाप्त हो जाती है। त्रुटि पट्टियाँ SD हैं; n = 3 प्रति शर्त। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्र 9: इंजीनियर कंकाल की मांसपेशी ऊतकों में BDM के लिए खुराक-प्रतिक्रिया। (A) पूर्ण ट्विच बल खुराक-निर्भर तरीके से कम हो जाता है जब प्राथमिक सेल-व्युत्पन्न EMTS को 3D संस्कृति में 16 वें दिन 2,3-ब्यूटेनडियोन मोनोक्सीम (BDM) के संपर्क में लाया जाता है। जब दवा को धोया जाता है तो पूर्ण चिकोटी बल बेसलाइन मूल्यों के करीब लौटता है। (बी) बेसलाइन मूल्यों के लिए सामान्यीकृत पूर्ण ट्विच बल बीडीएम के संपर्क में आने पर खुराक-निर्भर तरीके से कम हो जाता है, जिससे पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया वक्र और आईसी50 मूल्य प्राप्त होता है; एन = 4 प्रति खुराक। त्रुटि पट्टियाँ SD हैं. कृपया इस चित्र का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह अध्ययन 24-अच्छी तरह से उपभोग्य कास्टिंग किट के भीतर 3 डी इंजीनियर हृदय और कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों को उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है। इन विधियों का पालन करके, बाद में दवा स्क्रीनिंग के लिए बिना कास्टिंग विफलताओं के साथ लगातार 24 ऊतकों की एक पूरी सरणी प्राप्त करना संभव है। इस तरह के परिणाम को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण विचार यह सुनिश्चित कर रहे हैं कि कास्टिंग के दौरान हाइड्रोगेल के समय से पहले पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए बर्फ पर सभी चरण किए जाते हैं, ऊतक कास्टिंग से पहले सेल पृथक्करण अभिकर्मक को हटाने, प्रत्येक ऊतक के लिए सेल और हाइड्रोगेल निलंबन का पूरी तरह से मिश्रण, ऊतकों के बीच पिपेट युक्तियों का प्रतिस्थापन, और गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस का उपयोग (यदि बिल्कुल उपयोग किया जाता है)। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कास्टिंग शुरू होने के बाद पोस्ट जाली को स्थानांतरित नहीं किया जाता है और हाइड्रोगेल बनने के बाद धीरे से स्थानांतरित किया जाता है।

प्रमुख संशोधनों में कार्डियक बनाम कंकाल ईएमटी प्राप्त करने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों का उपयोग और सेलुलर परिपक्वता और ऊतक स्थिरता को बढ़ावा देने के लिए तहखाने झिल्ली प्रोटीन की चर सांद्रता के साथ हाइड्रोगेल का डोपिंग शामिल है। इस तरह के डोपिंग के लाभकारी प्रभावों को मामले-दर-मामले के आधार पर परीक्षण किया जाना चाहिए, लेकिन कुछ परिस्थितियों में कार्यात्मक परिणामों और ऊतक दीर्घायु में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। यह भी उल्लेखनीय है कि सूचीबद्ध सेल घनत्व एक गाइड हैं और विभिन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक हाइड्रोगेल रचनाओं को प्राप्त ईएमटी23,24,25 के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों को संशोधित करने के साधन के रूप में भी माना जा सकता है। मूल मांसपेशी माइक्रोएन्वायरमेंट में रूप और कार्य26,27 में मायोसाइट्स का समर्थन करने के लिए वैस्कुलराइजेशन, संक्रमण और मैट्रिक्स जमाव को बढ़ावा देने के लिए सहायक सेल प्रकार भी शामिल हैं। जबकि यहां वर्णित प्रणाली वर्तमान में फाइब्रोब्लास्ट को 3 डी हृदय ऊतकों में शामिल करती है, अतिरिक्त सेल प्रकार विट्रो में चिकित्सीय यौगिकों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एक अधिक शारीरिक प्रासंगिक मॉडल बना सकते हैं। इससे पहले, सहायक सेल प्रकारों की एक श्रृंखला को सफलतापूर्वक 3 डी-इंजीनियर ऊतकों में एकीकृत किया गया है, जो चुंबकीय संवेदन अनुबंध मंच 28,29,30 का उपयोग करके भविष्य के अध्ययन के लिए एक रोमांचक टेम्पलेट प्रस्तुत करता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए समस्या निवारण कास्टिंग प्रक्रिया के दौरान अविश्वसनीय या असंगत ऊतकों के गठन पर केंद्रित है। हाइड्रोगेल में बुलबुले के गठन से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि वे मिश्रण के दौरान कोशिकाओं के वितरण की सुविधा प्रदान करते हुए भी डाले जाते हैं। आदर्श सेल घनत्व, सेल अनुपात और मैट्रिक्स संरचना की पहचान करने के लिए प्रत्येक नए सेल प्रकार के लिए अनुकूलन प्रयोगों की आवश्यकता होगी।

इस तकनीक के लिए एक बड़ी सीमा 24 ईएमटी की एक पूर्ण प्लेट स्थापित करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या है। यहां प्रस्तुत आंकड़ों के लिए, प्रति प्लेट 15 मिलियन कार्डियोमायोसाइट्स और 18 मिलियन कंकाल मायोब्लास्ट का उपयोग किया गया था। कुछ शोधकर्ताओं के पास सेलुलर सामग्री के ऐसे बड़े पूल तक पहुंच नहीं हो सकती है, जो इस मंच का पूरी तरह से उपयोग करने की उनकी क्षमता को बाधित कर सकती है। यदि अंतिम उपयोगकर्ताओं के पास चुंबकीय संवेदन हार्डवेयर तक पहुंच नहीं है, तो पोस्ट विक्षेपण के माप को ऑप्टिकल रूप से किया जाना चाहिए, जो थ्रूपुट को काफी कम कर देता है और कई कुओं में मांसपेशियों के संकुचन की एक साथ रिकॉर्डिंग को रोकता है। हालांकि, मंतर्रे हार्डवेयर इन सीमाओं को पार करते हुए पहली वाणिज्यिक प्रणाली की पेशकश करता है जो कई संरचनाओं में एक साथ ईएमटी संकुचन के निरंतर, गैर-इनवेसिव विश्लेषण में सक्षम है।

24 कुओं में चुंबकीय संवेदन वास्तविक समय में ईएमटी कार्यात्मक विकास के अनुदैर्ध्य अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है और रासायनिक, पर्यावरणीय या आनुवंशिक हेरफेर के लिए तीव्र प्रतिक्रियाओं के सटीक माप की अनुमति देता है। जबकि चुंबकीय संवेदन के कई फायदे हैं जैसे कि कई ऊतकों में एक साथ माप, और जटिल डेटा विश्लेषण की आवश्यकता नहीं होती है, ऑप्टिकल डिटेक्शन विधियां कैल्शियम फ्लक्स या वोल्टेज मैपिंग जैसे शारीरिक मैट्रिक्स के एक साथ माप को सक्षम करती हैं। हालांकि, परिणाम अनुभाग में चित्रित डेटा सेट दवा विकास स्थान में इस तकनीक के अनुप्रयोगों की चौड़ाई को प्रदर्शित करते हैं। यह देखते हुए कि बाजार पर कुछ परख इंजीनियर मांसपेशियों में सिकुड़ा हुआ उत्पादन का प्रत्यक्ष मूल्यांकन करने के साधन प्रदान करते हैं, ये विधियां प्रीक्लिनिकल विकास पाइपलाइन में क्रांति लाने की क्षमता रखती हैं।

Disclosures

सभी लेखक कुरी बायो इंक में कर्मचारी और इक्विटी धारक हैं, कंपनी जो मंतर्रे हार्डवेयर और संबंधित सॉफ्टवेयर का व्यावसायीकरण करती है।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से खाद्य और औषधि प्रशासन (स्वास्थ्य और पर्यावरण विज्ञान संस्थान को प्रदान किया गया U01 FD006676-01) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (HL151094 से डॉ. गीसे) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस पांडुलिपि की तैयारी के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ एलेक एस टी स्मिथ को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm cell strainer  CELLTREAT 229485
100 mm cell culture dish ThermoFisher 150466
50 mL Steriflip filter MilliporeSigma  SCGP00525
500 mL filter flask MilliporeSigma  S2GVU05RE
6-aminocaproic acid Sigma A2504
B27 Gibco 17504044
Cardiosight Maintenance Medium NEXEL CM-002A
Cardiosight Plating Medium NEXEL CM-020A
C-Pace EM stimulator  IonOptix  EM
Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit Primary - DIFF
Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit Curi Bio Primary - MAINT
DAPI Invitrogen D1306
DMEM, high glucose, GlutaMAX Gibco 10566-016
Dnase Sigma 11284932001
DPBS Gibco 14190-250
Dystrophin antibody  Abcam ab154168
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific 10082147 Must be heat-inactivated
Fibrinogen (Bovine) Sigma E8630
Glutaraldehyde Sigma 354400
Ham's F10 Gibco 11550043
Hemacytometer  Sigma  Z359629
HS-27A Fibroblasts ATCC CRL-2496
Human Skeletal Muscle Myoblasts  Lonza  CC-2580
Luer Lock 0.2 µm syringe filter Corning 431219
Luer Lock 10 mL syringe BH Supplies BH10LL
Mantarray Instrument Curi Bio MANTA-24-B1 System
Mantarray Plate Kits Curi Bio MA-24-SKM-5 Pack of 5 kits
Mantarray stimulation lid  Curi Bio EM
Matrigel (ECM) Corning 356231
Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes NEXEL C-002
Optical Microscope Nikon Ti2E MEA54000
Pan Myosin Heavy Chain antibody  DSHB MF-20
Poly(ethyleneimine) Sigma P3143
ROCK inhibitor StemCell Technologies Y-27632
RPMI Gibco 11875-093
Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) Lonza CC-3245
Standard 24-well plates Greiner M8812  Other manufacturer's plates will not fit
Standard 6-well plates ThermoFisher 140675
Stromal medium (DMEM + 20% FBS)
T175 Filter Flask ThermoFisher 159910
T225 Filter Flask ThermoFisher 159934
Thrombin Sigma T4648
Trypan Blue solution, 0.4% ThermoFisher 15250061
TrypLE Select Enzyme (10x) Thermo Scientific A1217702
TrypLE Select Enzyme (1x) Thermo Scientific 12563011

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बायोइंजीनियरिंग अंक 194
स्केलेबल 3 डी इंजीनियर मांसपेशी ऊतकों में प्रीक्लिनिकल ड्रग परीक्षण
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