Summary
Detta protokoll tillhandahåller metoder för att generera 3D-konstruerade hjärt- och skelettmuskelvävnader och beskriver deras användning i prekliniska läkemedelsscreeningsmetoder. De beskrivna metoderna använder ett magnetiskt avkänningssystem för att underlätta samtidig bedömning av 24 vävnader parallellt.
Abstract
Noggrann modellering av friska och sjukdomstillstånd in vitro är avgörande för utvecklingen av nya behandlingsstrategier och terapier. För hjärt- och skelettmuskelsjukdomar utgör kontraktil kraft och kinetik nyckeltal för att bedöma muskelfunktion. Nya och förbättrade metoder för att generera konstruerade muskelvävnader (EMT) från inducerade pluripotenta stamceller har gjort in vitro-sjukdomsmodellering mer tillförlitlig för kontraktila vävnader; Att reproducerbart tillverka vävnader från suspenderade cellkulturer och mäta deras kontraktilitet är dock utmanande. Sådana tekniker plågas ofta av höga felfrekvenser och kräver komplex instrumentering och anpassade dataanalysrutiner. En ny plattform och enhet som använder 3D EMT i kombination med en etikettfri, mycket parallell och automatiseringsvänlig kontraktilitetsanalys kringgår många av dessa hinder. Plattformen möjliggör enkel och reproducerbar tillverkning av 3D EMT med praktiskt taget vilken cellkälla som helst. Vävnadens kontraktilitet mäts sedan via ett instrument som samtidigt mäter 24 vävnader utan behov av komplexa mjukvaruanalysrutiner. Instrumentet kan på ett tillförlitligt sätt mäta mikronewtonförändringar i kraft, vilket möjliggör dosberoende screening av föreningar för att mäta effekten av ett läkemedel eller terapeutiskt på kontraktil utgång. Konstruerade vävnader tillverkade med denna enhet är fullt funktionella, genererar ryckningar och tetaniska sammandragningar vid elektrisk stimulering och kan analyseras i längdriktningen i odling under veckor eller månader. Här visar vi data från hjärtmuskel-EMT under akut och kronisk dosering med kända toxiska ämnen, inklusive ett läkemedel (BMS-986094) som drogs från kliniska prövningar efter patientdödsfall på grund av oförutsedd kardiotoxicitet. Förändrad skelettmuskelfunktion i konstruerade vävnader som svar på behandling med en myosinhämmare presenteras också. Denna plattform gör det möjligt för forskaren att integrera komplexa, informationsrika biotekniska modellsystem i sitt arbetsflöde för läkemedelsupptäckt med minimal ytterligare utbildning eller färdigheter som krävs.
Introduction
Inducerade pluripotenta stamcellsmodeller (iPSC) blir alltmer nyckelaktörer i den prekliniska pipelinen för terapeutisk upptäckt och utveckling, liksom grundläggande biologisk forskning och sjukdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktila vävnader, såsom hjärt- och skelettmuskulatur härrörande från iPSCs, har stor potential att förbättra den prediktiva kraften hos humana in vitro-studier eftersom direkt bedömning av muskelkontraktil kraft och kinetik är kvantitativa mått för att studera övergripande vävnadsfunktion 4,6,7,8. Vanligtvis har mätningar av kontraktil kraft erhållits antingen indirekt genom optisk spårning av substratböjning 9,10 eller direkt genom bindning av celler/vävnader till en kraftgivare4,11,12. Dessa metoder, även om de är korrekta, är i sig låga genomströmningar och kräver vanligtvis högkvalificerade operatörer för att samla in och analysera data.
Tidigare arbete har visat att magnetfältsavkänning kringgår dessa hinder och ger en alternativ metod för att bedöma konstruerad muskelfunktion samtidigt över flera vävnadskonstruktioner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denna teknik med hjälp av en enhet som kan mäta kontraktiliteten hos konstruerade muskelvävnader på ett mycket parallellt sätt som utnyttjar komplexiteten hos 3D-cellulära modeller med screening med högre genomströmning14. Plattformen möjliggör etikettfri, kvantitativ realtidsövervakning av kontraktil funktion i hjärt- och skelettmuskelvävnader i eller utanför en standardcellodlingsinkubator, vilket eliminerar behovet av optisk baserad kontraktil avbildning och analys. Denna teknik underlättar direkt jämförelse av friska och sjuka cellinjer och möjliggör mätning av ett läkemedels effekt på kontraktila vävnader, vilket fastställer kvantifierbara, in vitro-, säkerhets- och effektdata för nya och befintliga terapeutiska föreningar.
Konstruerade 3D-muskelvävnader kan tillverkas mellan två stolpar på ett mycket reproducerbart sätt med hjälp av Mantarrays förbrukningsplatta med 24 brunnar (figur 1). En stolpe är styv, medan den andra stolpen är flexibel och innehåller en liten magnet. När vävnadskonstruktionen kontraherar förskjuter den den flexibla stolpen och den inbäddade magneten. EMT-plattan är placerad i instrumentet, och postförskjutning mäts via en rad magnetiska sensorer på ett kretskort under platthållaren. De uppmätta förändringarna i magnetfältet omvandlas till absolut kontraktil kraft med hjälp av en matematisk algoritm. Instrumentet använder snabba dataprovtagningsfrekvenser för att möjliggöra insamling av detaljerad information om funktionell kapacitet och mognad hos celltyperna som analyseras, inklusive kontraktionsfrekvens, hastighet och sönderfallstid. Dessa funktionella mätningar kan erhållas över alla 24 brunnar samtidigt med den magnetiska avkänningsplattformen eller individuellt och sekventiellt med traditionella optiska metoder.
Denna studie beskriver en mycket reproducerbar metod för att konstruera 3D-skelettmuskulatur- och hjärtmikrovävnader i en fibrinbaserad hydrogel. Under en kort 80-minuters reaktion katalyserar trombin omvandlingen av fibrinogen till fibrin, vilket ger en ställning för muskelceller att utvecklas i suspenderad kultur15. Stromaceller hjälper till att omforma matrisen och vävnader blir kontraktila när muskelceller bildar ett syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten hos dessa vävnader analyserades med hjälp av magnetisk avkänningsmetod, både före och efter substansexponering, vilket validerade denna modalitet för användning i dos-responsläkemedelsstudier. Primära humana myoblaster från en frisk donatorbiopsi erhölls kommersiellt och odlades i 2D enligt leverantörens protokoll. Celler expanderades med hjälp av ett skelettmuskeltillväxtmedium genom tre passager för att generera tillräckligt med cellnummer för att tillverka 3D-vävnader. Stromaceller och hiPSC-härledda kardiomyocyter odlades enligt leverantörens protokoll i 3 dagar för att möjliggöra återhämtning från kryokonservering innan celler gjuts i vävnader. Representativa resultat tillhandahålls som illustrerar de typer av dataset som kan samlas in med hjälp av magnetavkänningsplattformen. Vanliga fallgropar i samband med generering av konstruerade vävnader med hjälp av dessa metoder behandlas också.
Protocol
1. Protokoll för cellodling
- Primär human myoblastkultur
- Späd den extracellulära matrisen (ECM) i förhållandet 1:100 i 8 ml DMEM / F12-medium på is.
- Applicera 8 ml ECM-lösning på en T175-kolv och inkubera vid 37 °C i minst 1 timme före cellsådd, men högst 24 timmar. Se till att ECM-lösningen täcker hela kolvens botten.
- Alikvot 5 ml av skelettmuskelns tillväxtmedium till ett 15 ml koniskt rör.
- Tina en frusen injektionsflaska med celler (5,0 x 105 myoblaster) i ett vattenbad vid 37 °C i 2 minuter eller tills isen precis smält. Spraya injektionsflaskan med 70 % etanol och överför den till ett biosäkerhetsskåp (BSC).
- Överför cellerna till det alikvoterade mediet med hjälp av en P1000. Triturera inte. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 minuter.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml av tillväxtmediet med en P1000-pipett för att uppnå en enda cellsuspension.
- Tvätta ECM-belagd kolv med 15 ml DPBS. Aspirera DPBS och tillsätt sedan 30 ml av odlingsmediet till kolven.
- Tillsätt 4 ml av odlingsmediet till cellerna, blanda och fördela cellsuspensionen i T-175-kolven. Se till att den totala volymen är 35 ml. Skjut kolven försiktigt längs arbetsytan åt vänster och höger 5–6 gånger följt av framåt och bakåt 5–6 gånger för att säkerställa en jämn fördelning av cellerna på kolvens yta.
- Placera T-175-kolven i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och 5 %CO2. Odla cellerna i 3 dagar eller tills de inte når mer än 70% sammanflöde och passera sedan cellerna.
- Passerar primära humana myoblaster
- Späd ECM i förhållandet 1:100 i 30 ml DMEM / F12-medium på is.
- Applicera 10 ml ECM-lösning på tre T225-kolvar och inkubera vid 37 °C i minst 1 timme före cellsådd, men högst 24 timmar. Se till att ECM-lösningen täcker hela kolvens botten.
- Tvätta cellerna med 15 ml DPBS. Aspirera och tillsätt dissociationsreagenset enligt leverantörens protokoll.
- När cellerna lyfts, stoppa reaktionen enligt säljarens protokoll och samla cellerna i ett koniskt rör. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 3 minuter.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml av tillväxtmediet med en P1000-pipett för att uppnå en enda cellsuspension.
- Tvätta ECM-belagd kolv med 15 ml DPBS. Aspirera DPBS och tillsätt sedan 40 ml av odlingsmediet till varje T225-kolv.
- Tillsätt 14 ml av odlingsmediet till cellsuspensionen, blanda och fördela 5 ml av cellsuspensionen till varje T225-kolv. Se till att den totala volymen i varje kolv är 45 ml. Skjut kolven försiktigt längs arbetsytan åt vänster och höger 5-6 gånger följt av framåt och bakåt 5-6 gånger för att säkerställa jämn fördelning.
- Placera kolvarna i cellodlingsinkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2.
- Odlingsceller i 2-3 dagar eller tills de inte når mer än 70% sammanflöde och sedan passage. Dela cellerna vid 1: 3 eller 1: 4 vid varje passage och frö mellan 3 x 103 och 1 x 104 celler / cm2.
- hiPSC-härledd kardiomyocytodling
- Späd ECM i förhållandet 1:60 i 12 ml DMEM / F12-medium på is.
- Applicera 1 ml ECM-lösning på varje brunn på två 6-brunnsplattor och inkubera vid 37 °C i minst 1 timme före cellsådd, men högst 24 timmar.
- Tina en frusen injektionsflaska med kardiomyocyter i ett vattenbad vid 37 °C i 2 minuter eller tills isen precis smält.
- Spraya injektionsflaskan med 70 % etanol och överför den till BSC.
- Använd en p1000-pipett för att överföra de tinade cellerna till ett 50 ml koniskt rör.
- Skölj den tomma kryovialen med 1 ml rumstemperatur (RT) pläteringsmedium för att återställa eventuella kvarvarande celler.
- Fördela långsamt 1 ml sköljmedel droppvis (en droppe var 5: e s) i det koniska röret av celler under 90 s. Snurra kontinuerligt röret för att blanda cellerna under långsam medietillsats.
- Tillsätt långsamt 8 ml av pläteringsmediet med en 10 ml serologisk pipett till det 50 ml koniska cellröret.
- När allt media har fördelats, pipettera försiktigt upp och ner 3 gånger för att blanda cellerna noggrant. Räkna celler med en hemacytometer och trypan blå.
- Centrifugera cellerna i 50 ml koniska röret vid 300 x g i 3 minuter.
- Efter att cellerna har pelleterats, aspirera supernatanten.
- Använd en p1000-pipett för att överföra 1 ml av pläteringsmediet till röret och bryt försiktigt upp pelleten genom att långsamt pipettera upp och ner 3-5 gånger. Resuspendera cellerna med ett extra pläteringsmedium.
- Frö mellan 2-4 x 10 6 celler per brunn av en6 brunnsplatta i 2 ml av pläteringsmediet.
- Tvätta de ECM-belagda 6-brunnsplattorna med DPBS (2 ml / brunn).
- Pipettera 2 ml cellsuspension per brunn på en 6-brunnsplatta. Flytta plattorna försiktigt längs arbetsytan till vänster och höger 5-6 gånger följt av framåt och bakåt 5-6 gånger för att säkerställa jämn fördelning av celler på plattytorna.
- Placera plattan i cellodlingsinkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2.
- Upprepa steg 1.3.3-1.3.16 för alla injektionsflaskor med celler som ska tinas.
- Byt till 3-5 ml (beroende på cellinje och densitet) underhållsmedium nästa dag efter plätering och byt sedan mediet varannan dag. Odla celler i 3-4 dagar innan de gjuts i 3D-vävnader.
- Stromal cellodling
- Applicera 30 ml ECM-lösning på en T175-kolv och inkubera vid 37 °C i minst 1 timme före cellsådd, men högst 24 timmar.
- Alikvot 5 ml stromacellsmedium till ett 15 ml koniskt rör.
- Tina en frusen flaska med stromaceller i ett vattenbad vid 37 °C i 2 minuter eller tills isen precis har smält.
- Spraya injektionsflaskan med 70 % etanol och överför den till BSC.
- Använd en p1000-pipett för att långsamt tillsätta 1 ml stromacellsmedium till de tinade cellerna i injektionsflaskan.
- Överför cellsuspensionen från injektionsflaskan till återstående upptiningsmedia i det koniska röret. Använd en 5 ml serologisk pipett för att blanda cellerna. Pipettera upp och ner 3 gånger.
- Räkna cellerna med en hemacytometer och trypan blå. Snurra inte ner celler.
- Tvätta den ECM-belagda T175-kolven med 15 ml DPBS.
- Överför stromaceller till kolven med en densitet av 3-4 x 103 celler/cm2. Skjut kolven försiktigt längs arbetsytan åt vänster och höger 5–6 gånger följt av framåt och bakåt 5–6 gånger för att säkerställa en jämn fördelning av cellerna på kolvens yta.
- Byt media nästa dag med 45 ml uppvärmt stromacellsmedium. Odla cellerna i 3-4 dagar innan de gjuts i 3D-vävnader.
2. Förberedelse av material
- Fibrinogen
OBS: Vid beredning av fibrinogen, var noga med att maximera mängden yta fibrinogenpulvret läggs på. I detta protokoll optimerades mängden spädningsmedel som användes till storleken på behållaren som användes, dvs precis tillräckligt med utspädningsmedel användes för att täcka botten av skålen. Skikt till exempel 0,5 g fibrinogen över 10 ml PBS i en 100 mm skål snarare än ett 50 ml centrifugrör. Att maximera mängden yta på spädningsmedlet kommer att minska den tid som behövs för att rekonstituera fibrinogen och minska potentiell klumpning av protein.- Rekonstituering
- Överför 10 ml PBS till en 100 mm cellodlingsskål och värm till 37 °C i en cellodlingsinkubator.
- Lägg 0,5 g fibrinogenpulver över hela ytan av varm PBS och håll vid 37 °C tills fibrinogen har lösts upp helt. Detta bör inte ta mer än 2 timmar. Det upplösande pulvret kan snurras försiktigt, men skaka inte skålen kraftigt.
- Steril filtrering
- När pulvret har lösts upp helt, kör lösningen genom ett 100 μm filter och samla upp det i ett 50 ml koniskt rör för att avlägsna eventuella klumpar av gelat fibrinogen.
- Häll den filtrerade lösningen i en 10 ml spruta täckt med ett 0,2 μm filter. Tryck lösningen genom filtret och samla den i ett nytt 50 ml koniskt rör. Filtret kan behöva bytas mer än en gång för att sterilisera alla 10 ml lösning.
- Alikvot 300 ml sterilt fibrinogen i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 °C. Tina alikvoterna på is eller vid 4 °C efter behov. Undvik upprepad frysning/upptining.
- Rekonstituering
- Trombin
- Tillsätt 6 ml PBS och 4 mldiH2Odirekt i en injektionsflaska trombin (1 KU) för att göra en 100 E/ml trombinlösning.
- Filtersterilisera med ett 0,2 μm filter, alikvot och förvara vid -20 °C i 1,5 ml mikrocentrifugrör av plast när trombin adsorberas till glas. Undvik upprepad frysning/upptining.
- Poly(etylenimin) lösning (PEI)
VARNING: PEI är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning enligt tillverkarens anvisningar.
PEI levereras som en 50% w/v-lösning. Det är mycket visköst och svårt att pipettera. Gör en 0,1 % lösning från en 10 % stamlösning i stället för direkt från 50 % w/v-lösningen.- Mät 5 ml 50% w/v PEI-lösning i ett 50 ml koniskt rör.
- Tillsätt 20 mldiH2Ooch blanda till en 10 % stamlösning. Denna högkoncentrerade stamlösning kan inte sterilfiltreras.
- För att göra en 0,1% lösning för cellodling, tillsätt 5 ml 10% lager till 495 ml diH2O. Sterilfiltrera med en 500 ml filterkolv och förvara vid rumstemperatur i högst 1 vecka.
- Glutaraldehyd
VARNING: Glutaraldehyd är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning enligt tillverkarens anvisningar.- Glutaraldehyd levereras som en 25% lösning. För att göra en 0,01% lösning, tillsätt 40 μL till 99,6 ml diH2O. Sterilfilter och förvara vid 4 °C i högst 1 vecka.
- Efter förberedelse
- Placera förbrukningsbar vävnadsgjutningssats inuti en steril kulturhuv. Gjutsatsen innehåller ett lock, ett stolpgitter som rymmer 24 par stolpar (ett par stolpar per brunn på en 24-brunnsplatta) och en specialiserad 24-brunnsplattbotten som innehåller 24 gjutbrunnar. Varje gjutbrunn innehåller en dike i botten av brunnen för att hålla cell- / hydrogelkomponenterna och forma dem till en rörformad vävnad när hydrogelen polymeriseras (figur 1B).
- Fyll brunnarna på en 24-brunnsplatta med 1,5 ml / brunn av en 0,1% PEI-lösning och placera stolpar i plattan så att spetsarna på varje par stolpar är nedsänkta. Låt det sitta i 10 minuter. PEI kommer att deponera en positiv laddning på stolparna så att proteiner i hydrogelen fäster ordentligt på stolparna under vävnadsgjutning.
- Fyll brunnarna på en andra platta med 24 brunnar med 2 ml steril diH2Ooch överför stolparna. Låt det sitta i 1 min.
- I en tredje 24-brunnsplatta fyller du brunnarna med 1,5 ml / brunn med 0,01% glutaraldehyd (GA) och överför stolparna. Låt det sitta i 30 minuter. GA fixar den positiva laddningen från PEI till stolparna.
- Medan stolparna sitter i glutaraldehyd, aspirera diH2O-brunnarna, tvätta med 2 ml / brunn steril diH 2 O, aspirera och fyll på med 2 ml / brunn steril diH2O. En färsk platta med 24 brunnar kan användas istället för sköljning.
- När 30 minuter är slut, överför stolparna till 2 ml / brunn steril diH2O. Låt det sitta i 1 min.
- AspireradiH2Ooch tillsätt ytterligare 2 ml/brunn sterildiH2O. Låt det sitta i 5 min.
- Överför stolparna till en platta med 24 brunnar för att torka (cirka 15 min).
- När det är torrt, sätt ihop gjutsatsen igen. Parafilma kanterna för att täta locket och plattan tillsammans och förvara sedan vid 4 °C i upp till 72 timmar före cellsådd. Längre lagringstider är sannolikt möjliga men har inte testats.
3. Protokoll för vävnadsgjutning
- Förberedelse av gjutplatta
- Förkyl mjukpappersgjutsatsen vid 4 °C.
- Överför en hink is till BSC. På is, förbered 50 μL trombinlösning (3 μL trombinlager + 47 μL EMT-medium) per brunn som ska gjutas.
Se steg 3.2.1 för mer information om EMT-medium. - Ta bort den kylda gjutsatsen från kylskåpet och placera den på ett kallt block eller is inuti cellodlingshuven. Lägg gjutplattan platt på is och flytta stolpgitteret från gjutplattan till en ny, steril 24-brunnsplatta.
- Pipettera 50 μl trombinlösning i varje förkyld brunn på gjutplattan.
- Sätt ihop satsen igen och sätt tillbaka den i kylskåpet tills den behövs för vävnadsgjutning. Gjut vävnaderna inom 3 timmar trombin utöver brunnarna.
- Förberedelse av celler
- Förbered EMT-basmedium, sterilt filter och låt stå på is.
OBS: Om cellspecifikt gjutmedium innehåller FBS, använd värmeinaktiverat FBS eftersom det kan interagera med fibrinogen och orsaka för tidig polymerisation.- Förbered hjärt-EMT-medium: Tillsätt 500 ml RPMI-medium, 10 ml B27 och 2,5 g aminokapronsyra. (Valfritt) Tillsätt 10 mM ROCK-hämmare (tillsätt endast till EMT-mediet som används för gjutning av vävnader och inte hela 500 ml volym).
- Förbered skelett EMT-medium: Tillsätt 50 ml F10-medium och 0.25 g aminokapronsyra (ACA) för primära EMT och 0.1 g ACA för iPSC-härledda EMT.
- Värm dissociationsreagenset av cellodlingskvalitet till 37 °C. Värm en lika stor volym EMT-medium för att späda dissociationsreagenset.
OBS: Det är viktigt att det använda proteaset är helt inaktiverat. Aktivt proteas kommer att störa 3D-vävnadsbildning och efterföljsamhet. - Tvätta cellerna (figur 1A) med PBS. Använd 2 ml / brunn för en 6-brunnsplatta. Använd 6 ml, 15 ml och 15 ml för en 100 mm skål, T175-kolv respektive T225-kolv.
- Tillsätt det uppvärmda dissociationsreagenset av cellodlingskvalitet för att lyfta cellerna och inkubera vid 37 °C i 5 minuter eller tills cellerna har lyfts. För hjärtkulturer, använd 10x dissociationsreagenset. För stromaceller och skelettmuskelmyoblaster, använd ett 1x dissociationsreagens. Använd 1 ml/brunn för en 6-brunnsplatta, 3 ml för en 100 mm skål, 8 ml för en T175-kolv och 10 ml för en T225-kolv.
- Kontrollera kulturerna var 2-3: e minut genom att knacka på sidan av plattan.
- När cellerna har lyft, överför dem till ett 50 ml koniskt rör och triturera med en P1000-pipett för att säkerställa en encellssuspension.
- Tvätta plattan eller kolven med ett extra EMT-medium för att samla de återstående cellerna och tillsätt dem till det koniska röret. Använd 1 ml / brunn av EMT-mediet för en 6-brunnsplatta, 2 ml för en 100 mm skål, 5 ml för en T175-kolv och 5 ml för en T225-kolv.
- Triturera cellerna för att säkerställa en enda cellsuspension.
- Lägg till EMT-medium för att avsluta dissociationsprocessen och ta sedan prover av cellsuspensionerna för cellantal. Använd 1 ml/brunn för en 6-brunnsplatta, 3 ml för en 100 mm skål, 8 ml för en T175-kolv och 10 ml för en T225-kolv.
- Snurra cellerna vid 200 x g i 4 minuter. Utför celltal med hjälp av en hemacytometer och trypanblå medan suspensioner centrifugeras.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 5 ml EMT-basmedium för att avlägsna det kvarvarande dissociationsreagenset.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 4 minuter. Aspirera supernatanten och förbered cellsuspensionerna vid lämpliga densiteter.
- Öka livslängden och funktionen hos 3D-skelettmuskel EMT med tillsats av 10% -20% ECM-proteiner i EMT-mediet14,16.
- Fröstamcellshärledda kardiomyocyter och deras stromaceller vid 5 x 10 5 celler respektive7,5 x 104 celler per vävnadskonstruktion. Frö skelettmuskelmyoblasterna vid 7,5 x 105 celler per vävnadskonstruktion.
- Hjärtvävnader
- Aspirera supernatanten och resuspendera stromaceller med en densitet av 2,5 x 106 celler per ml i EMT-medium och lägg dem på is. Använd 30 μL av denna suspension per EMT.
- Aspirera supernatanten och resuspendera CM: erna med en densitet av 8,3 x 106 celler per ml i EMT-medium och lägg dem på is. Använd 60 μL av denna suspension per EMT.
- Skelettmuskelvävnader
- Aspirera supernatanten och resuspendera skelettmuskelcellerna med en densitet av 8,3 x 106 celler per ml i EMT-medium och lägg dem på is. Använd 90 μL av denna suspension per EMT.
- Beräkna volymerna av varje celllösning som krävs för att bilda önskat antal vävnader (t.ex. 60 μL av de beredda CM och 30 μL av de beredda stromaceller eller 90 μL av skelettmuskelcellerna per EMT).
- Pipettera de beräknade cellvolymerna till ett 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 10 μL fibrinogen per EMT till cellsuspensionen och håll den på is.
- Totalt antal reagens och cellvolymer per EMT: Se till att varje EMT har 90 μL celler, 10 μL fibrinogen och 50 μL trombinlösning.
- Förbered EMT-basmedium, sterilt filter och låt stå på is.
- Gjutning av vävnader
- Överför vävnadsgjutsatsen till en cellodlingshuv och ta bort locket (postgitter som innehåller flexibla och styva stolpar ska finnas kvar på gjutplattan; Figur 1B). Håll gjutplattan med stolpgitter liggande platt på is.
- Blanda cell/fibrinogenblandningen och dra upp 100 μl med en P200-pipett.
- Tillsätt 100 μL av blandningen till brunnar beredda med 50 μL trombinlösning och triturera 5 gånger för att blanda väl. Tryck inte pipetten förbi det första stoppet och ta bort spetsen efter trituration för att undvika att skapa bubblor.
- I detta skede, och tills postgitteret är klart att lyftas från gjutplattan (steg 3.3.10), kan gitterets rörelse äventyra vävnadens långsiktiga fastsättning vid stolparna. Håll både gallret och gjutbrunnsplattan samtidigt med pekfingret och tummen på ena handen för att undvika rörelse av gallret.
- Upprepa med en ny P200-spets för varje vävnad tills alla vävnader är gjutna. Blanda cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör innan du gjuter varje vävnad eftersom cellerna sätter sig snabbt.
- Överför försiktigt det sådda kitet till inkubatorn, se till att inte flytta gitteret. Rörelse av gitter efter sådd kan resultera i minskad framgång vid överföring av vävnader från gjutbrunnarna. Inkubera vid 37 °C i 80 minuter, oavsett celltyp. Detta kommer att börja polymerisationen av hydrogelen och tillåta proteiner att fästa vid stolparna.
- Förbered under tiden en ny 24-brunnsplatta med 2 ml / brunn av EMT-mediet för hjärtvävnader. 10 mM ROCK-hämmare kan tillsättas till EMT-mediet om så önskas. Inkubera plattan vid 37 °C för att värma mediet.
- Bered 2 ml / brunn tillväxtmedium innehållande 5 g / L aminokapronsyra (0,2 mm sterilfiltrerad) för primär skelettmuskelvävnad eller 2 g / L ACA för iPSC-härledda EMT. Inkubera plattan vid 37 °C för att värma mediet.
- Efter inkubation, tillsätt försiktigt 1 ml EMT-medium till kanten av gjutbrunnarna och inkubera i ytterligare 10 minuter vid 37 °C, oavsett celltyp. Detta kommer att lossa hydrogelen från kanterna på gjutbrunnen och möjliggöra enkel överföring av vävnaden.
- Efter 10 minuter lyfter du försiktigt postgitteret och överför vävnaderna från gjutplattan till en förberedd platta med 24 brunnar med medium (figur 1C). Sätt tillbaka plattorna med vävnader i cellodlingsinkubatorn vid 37 °C.
- Underhåll
- Efter 24 timmar, överför de gjutna vävnaderna till en ny platta med 24 brunnar med 2 ml / brunn av EMT-mediet (utan ROCK-hämmaren om den inkluderades) och inkubera vid 37 ° C. För skelettmuskelceller, byt tillväxtmediet till differentieringsmediet för att främja myoblastfusion.
- Överför hjärtvävnaderna till färska brunnar med 2 ml / brunn av EMT-mediet var 2-3: e dag.
- Överför skelettmuskelvävnaderna till färska brunnar med 2 ml / brunnsdifferentieringsmedium innehållande 5 g / L aminokapronsyra (0,2 mm sterilfiltrerad) var 2-3: e dag. Använd 2 g/L ACA för vävnader som härrör från iPSC.
- För att underlätta medelförändringar, överför postgitteret till en ny 24-brunnsplatta snarare än att byta medium i samma platta för att undvika att skada 3D-vävnaderna. Förbered en andra 24-brunnsplatta med EMT-mediet och överför vävnaderna till det färska mediet. Håll plattan med det gamla mediet tillsammans med den aktiva kulturen för att använda för nästa mediebyte. Överför postgitteret fram och tillbaka mellan de två plattorna under hela kulturperioden. Alternativt kan du använda en ny platta för varje mediumbyte.
- Mät EMT-kontraktionen antingen via optisk spårning av efterböjning (figur 1D) eller magnetisk avkänningshårdvara13,14. Hjärtvävnader börjar slå spontant efter 3-4 dagar i odling. Skelettmuskelvävnader är typiskt kontraktila med elektrisk fältstimulering efter 7 dagar i odling.
Representative Results
Celler göts in i konstruerade muskelvävnader i 2-postförbrukningsplattan (figur 1). Framgångsrika EMT kommer att visas enhetliga, och matrisen kommer att fördelas jämnt mellan stolparna (figur 2A). Matrisen bör också lindas runt båda stolparna, vilket ger likvärdiga förankringspunkter för vävnaden. Fel i gjutning är sällsynta med denna metod och är vanligtvis uppenbara med en visuell inspektion. Misslyckad EMT-produktion kan sträcka sig från katastrofala fel, såsom vävnadsavlossning från stolparna (figur 2B) till mer subtila strukturella brister, såsom luftbubblor och lös fastsättning på stolparna (figur 2C, D). Vävnader med mindre brister kan fortfarande vara livskraftiga, men data från dessa vävnader bör undersökas noggrant för att säkerställa att de är jämförbara med kompromisslösa EMT. Till exempel kan luftbubblor i en EMT pressas ut när vävnaden komprimeras över tiden, vilket gör en fullt fungerande konstruktion utan kontraktila brister. Dessa vävnader måste dock utvärderas från fall till fall, eftersom luftbubblornas placering kan påverka funktionell återhämtning. Luftbubblor som genereras vid stolparna kan till exempel påverka vävnadsfästningen, vilket kan hindra långvarig vidhäftning till stolpen.
Vävnader börjar komprimera inom de första 24 timmarna när celler omformar matrisen i hydrogelen (figur 3). Komprimering är en gradvis process och fortsätter vanligtvis under de första 2-4 veckorna av kulturen. Sammantaget är vävnadskomprimeringen konsekvent mellan tekniska och biologiska replikat (figur 4). Det är normalt för vissa cellinjer att komprimera matrisen mer än andra eftersom vävnader mognar över tiden. Andelen myogena celler i en konstruktion påverkar hastigheten och den totala graden av EMT-komprimering. Totalt myogent innehåll för både hjärt- och skelettmuskelcellinjer bör vara över 80% för att minimera variationen mellan konstruerade vävnader. Detta är särskilt viktigt när man jämför kontraktila krafter och kinetik över cellinjer.
Inom de första dagarna efter gjutning börjar kardiomyocyter spontant slå i kultur och böjer rytmiskt den flexibla stolpen med varje muskelsammandragning. Skelettmuskelkonstruktioner kontraherar som svar på elektrisk stimulering vid dag 7 efter påbörjad differentiering. Fältstimulering applicerades på skelettmuskelvävnader via en extern stimulator fäst vid ett anpassat 24-brunns elektrodlock. Locket, tillverkat med ett par kolelektroder för varje brunn, sitter ovanpå vävnadsplattan med 24 brunnar och stimulerar samtidigt varje EMT för att inducera muskelsammandragningar. Vävnader stimulerades med hjälp av en 10 V-stimulans för 10 ms pulsvaraktigheter vid 1 Hz under funktionella mätningar. Kontraktila vävnader indikerar skelettmyoblaster som har smält samman och bildar myorör komplett med funktionella sarkomerer och kontraktila maskiner. Skelett EMT fläckar positivt för myosin tungkedja (MyHC) och dystrofin är lokaliserad till myotubemembranet och avslöjar en klassisk ringform i tvärsnittsimmunohistokemisk analys (figur 5). När EMT är funktionella kan kontraktilitet mätas dagligen i det magnetiska avkänningsinstrumentet, spårningskraft och kinetik när konstruktionerna utvecklas och mognar över tiden. Både hjärt- och skelettmuskelvävnader förblir kontraktila i veckor till månader i 3D-kultur (figur 6), och de kan användas för ett brett spektrum av kontraktilitetsstudier.
Den magnetiska detektionsmetoden kan användas för att samtidigt mäta akuta och kroniska effekter av strukturella kardiotoxiska medel, såsom doxorubicin (figur 7) och BMS-986094 (figur 8), liksom andra läkemedel som påverkar muskelkontraktiliteten. Optiska spårningsmetoder för kontraktionsdetektering kan också användas, men försiktighet måste iakttas när man studerar akuta läkemedelseffekter eftersom mätningar måste göras sekventiellt. Den förlängda livslängden för hjärt- och skelett-EMT i 3D-kultur möjliggör långsiktiga läkemedelsstudier i dessa vävnader. Detta gör det möjligt för användare att undersöka effekterna av upprepad dosering, samt fortsatt, långvarig exponering för föreningar som kan visa kardiotoxiska effekter över tid som förekommer med doxorubicin. Doxorubicin (dox) är ett läkemedel mot cancerkemoterapi17. Mängden läkemedel som administreras till patienter varierar beroende på typ av cancer, patientens ålder, patientens längd och vikt samt andra faktorer. Av denna anledning är det viktigt att testa effekten av dox över ett brett spektrum av koncentrationer och leveransscheman. Här behandlades hjärt-EMT under 27 dagar med tre separata koncentrationer (0,1 μM, 1 μM och 10 μM) dox (figur 7). Grupperna stratifierades ytterligare genom att behandla EMT vid varje koncentration med antingen en bolusbehandling eller kontinuerlig administrering med en medelförändring var 72: e timme. Brunnar som fick bolusbehandlingar av dox exponerades för läkemedlet vid tre separata tidpunkter, vilket möjliggjorde återhämtning mellan dosering. De två högsta doserna av bolus och kontinuerlig exponering visade ett omedelbart och långvarigt upphörande av kontraktil kraftgenerering under hela studien. De mellersta och lägsta koncentrationerna hade varierande effekter på vävnaderna, beroende på administreringsmetod. I den lägsta koncentrationen av läkemedlet visade bolusgruppen ingen skillnad från kontrollerna. Kontraktil kraft minskade dock efter 2 veckors kontinuerlig exponering. Mellanklasskoncentrationen av läkemedlet hade en intressant effekt. Medan kontinuerlig dosering minskade kraften under de första dagarna av behandlingen och varade under hela experimentet, visade bolusgruppen en återhämtning av kontraktil kraft tillbaka till kontrollnivåerna när läkemedlet tvättades ut efter 3 dagar. Den andra bolusen av läkemedlet orsakade emellertid ett fullständigt upphörande av kraften, följt av ingen återhämtning (figur 7), vilket indikerar att upprepad dosering vid denna koncentration kan ha en kardiotoxisk effekt hos patienter som behandlas med detta läkemedel. Den breda omfattningen av denna studie, både i tid och experimentella förhållanden, belyser användbarheten av 3D-konstruerade vävnader vid toxicitetsscreening, eftersom de förblir kontraktila och mottagliga för kemisk exponering under längre tidsperioder, vilket möjliggör långsiktiga läkemedelsstudier inom en enda uppsättning muskelvävnader. Detta underlättar inte bara identifiering av föreningar som kan ha en kardiotoxisk effekt med kronisk exponering utan också detektering av potentiell kardiotoxisk tidpunkt för administrering.
In vitro toxicitetstestning i konstruerade mänskliga muskelvävnader är ett sätt att hjälpa till att hålla mänskliga patienter säkra i kliniska prövningar. BMS-986094 är en nukleotidpolymerashämmare (NS5B) som används för att behandla hepatit C. Läkemedlet var i klinisk fas II-utveckling när Bristol-Myers Squibb avbröt utvecklingen på grund av flera fall av oväntad hjärtsvikt hos patienter18,19. Här applicerades BMS-986094 på hjärt-EMT för att testa om 3D-konstruerade muskelvävnader skulle utveckla en kardiotoxisk reaktion på läkemedlet (figur 8). Tre olika koncentrationer av läkemedlet applicerades och vävnader övervakades under 13 dagar. Kontraktil kraft sjönk med tillägg av läkemedlet på ett dosberoende sätt (figur 8A). Twitch-frekvensen påverkades också signifikant när taktfrekvensen avtog och slutligen stannade som förväntat med fortsatt exponering för den kardiotoxiska föreningen (p < 0,05, figur 8B). Dessa resultat visar hur 3D-konstruerade mänskliga muskelvävnader kan användas för att underlätta införandet av nya läkemedel på marknaden och flagga föreningar som så småningom misslyckas på grund av kardiotoxicitet. Dessutom kan denna teknik potentiellt rädda liv genom att exponera farliga läkemedel innan de sätts in i patienter i kliniska prövningar.
Förmågan att mäta effekten av akuta och kroniskt applicerade läkemedel på mänsklig kontraktil vävnad är ett viktigt första steg när man undersöker terapeutiska medel för säkerhet och effekt. Det är dock viktigt att veta att koncentrationen av läkemedel som appliceras är fysiologiskt relevant och lämplig för in vitro-testning . Skelettmuskelvävnader användes för att fastställa ett IC50-värde för 2,3-butandionmonoxim (BDM) i en full dos-responskurva. Detta läkemedel är en välkarakteriserad ATPas-hämmare av skelettmuskelmyosin-II20. BDM hämmar muskelsammandragningar genom att förhindra myosinkorsbrobildning med aktinfilamentet i sarkomerer21. Resultaten som visas här avslöjar en dosberoende minskning av absolut kraft när läkemedlet appliceras och fullständig återhämtning av kontraktil kraft när läkemedlet tvättas ut, vilket indikerar att den övergående effekten förhindrar muskelsammandragningar och inte bara dödar celler i vävnaden (figur 9A). Dessutom mättes en fullständig dos-responskurva över de sju undersökta koncentrationerna, vilket fastställde en IC50 på 3,2 mM i dessa mänskliga mikrovävnader (figur 9B).
Figur 1: EMT-gjutning i Mantarrays förbrukningsplatta med 24 brunnar med 2 inlägg . (A) Myogena celler och stromaceller odlades på 2D-ytor före vävnadsgjutning. (B) Celler lyfts från 2D-ytor och blandas med extracellulära matrisproteiner för att bilda hydrogeler i de enskilda plattgjutningsbrunnarna som visas i insatsen. (C) 24-brunnsplatta som innehåller konstruerade vävnader i varje brunn. d) Representativa vävnader som visar avslappnade och sammandragna konstruerade muskler som jämför förskjutningen av magnetstolpen (gröna staplar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Framgångsrik och misslyckad EMT-gjutning . (A) Idealisk konstruerad muskelvävnad 24 timmar efter gjutning jämnt komprimerad runt stolparna med homogen cell/matrissammansättning i hela vävnaden. (B) Misslyckad EMT som visar att hydrogelen lossnar från den flexibla stolpen. (C) EMT innehållande luftbubblor i hela vävnaden. (D) Ojämn vävnadsavsättning runt båda stolparna. Vävnaden är löst förankrad i den flexibla stolpen på ena sidan. Skalstänger är 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Komprimering i konstruerad muskelvävnad över tid . (A) EMT-konstruktion visas 1 dag efter gjutning. Vävnader överförs till differentieringsmedium, med början dag 0 av cellfusion och hydrogelkomprimering. (B–E) Samma EMT vid dag 7 till dag 21 som visar en något kortare total längd mellan de två stolparna över tid och mindre bredd mätt genom EMT: s mittdel. Skalstänger är 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: EMT-diameter över tid. Fyra plattor av vävnader spårades under 21 dagar och jämförde EMT-diameter under komprimering. Varje vävnad mättes genom mitten av sektionen varje vecka med optisk mikroskopi. Tidpunkter visar konsekvent EMT-storlek mellan plattorna. Maximal packning uppnås dag 21 när matrisombyggnaden stabiliseras. Tabellen visar standardavvikelsen (% av totalen) för komprimering inom varje vävnadsplatta och den genomsnittliga avvikelsen för alla plattor. Färgade staplar är enskilda plattor. Felstaplar är SD för EMT i plattor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Immunhistokemi av de konstruerade skelettmuskelvävnaderna. EMT fixades på dag 10 av kulturen och inbäddad i paraffin. Tunna tvärsnitt (7 μm) färgades med antikroppar mot myosin tungkedja och dystrofin före avbildning. Grön = MyHC, röd = Dystrofin, blå = DAPI. Objektivförstoring är 40X; Skalstången är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Kontraktil kraft i konstruerade muskelvävnader över tid. (A) Genomsnittlig absolut ryckkraft mätt från hjärt-EMT från dag 7 till dag 63 i odling; n = 3 per grupp. (B) Genomsnittlig absolut ryckkraft i skelett-EMT härrörande från en primär cellinje dag 7 till dag 53 i odling; n = 3. Felstaplar är SD för båda diagrammen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Akut och kronisk doxorubicinbehandling i den konstruerade muskelvävnaden. Tre separata doskoncentrationer av dox, 0,1 μM, 1 μM och 10 μM, administrerades antingen i bolus eller administrerades kontinuerligt till konstruerade muskelvävnader under 27 dagar. Bolusdoser av läkemedlet tillsattes vid medieförändringar på dag 0, 12 och 24, noterade av de gröna pilarna på X-axeln. Läkemedlet tillsattes till media vid varje mediebyte för kontinuerlig dosering, noterat av de svarta och gröna pilarna på X-axeln. Den procentuella förändringen i kraft från baslinjevärdena (pre-läkemedelsbehandling) är på Y-axeln, och tiden i behandlingsdagar är på X-axeln. Ljusorange = DMSO kontinuerlig kontroll, mörkorange = DMSO-boluskontroll, ljusgrön = 0,1 μM dox kontinuerlig, mörkgrön = 0,1 μM dox bolus, ljusblå = 1 μM dox kontinuerlig, mörkblå = 1 μM Dox bolus, ljusgul = 10 μM dox kontinuerlig, mörkgul = 10 μM dox bolus. Felstaplar är SD; n = 3 per villkor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Kronisk behandling med BMS-986094 i konstruerad muskelvävnad. EMT behandlades med 0.4 μM (grön), 2 μM (mörkblå) och 10 μM (ljusblå) BMS-986094 under 13 dagar. (A) Kontraktil ryckkraft (Y-axeln) minskar vid alla läkemedelskoncentrationer under de första 2 dagarna, medan kontrollvävnaderna i DMSO fortsätter att bli starkare med tiden (X-axeln). (B) Hjärtslagsfrekvensen, eller ryckfrekvensen, upphör på ett dosberoende liknande sätt i takt med att kontraktilkraften upphör som visas i diagram A. Kontrollvävnader i DMSO (grå) upprätthåller en regelbunden slagfrekvens under hela experimentet. Felstaplar är SD; n = 3 per villkor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Dosrespons på BDM i konstruerad skelettmuskelvävnad. (A) Absolut ryckkraft minskar på ett dosberoende sätt när primära cellhärledda EMT exponeras för 2,3-butandionmonoxim (BDM) på dag 16 i 3D-odling. Absolut ryckkraft återgår till nära baslinjevärden när läkemedlet tvättas ut. (B) Absolut ryckkraft normaliserad till baslinjevärden minskar på ett dosberoende sätt när den utsätts för BDM vilket ger en full dos-responskurva och IC50-värde; n = 4 per dos. Felstaplar är SD. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Denna studie beskriver metoder för att generera 3D-konstruerade hjärt- och skelettmuskelvävnader i ett 24-brunns förbrukningsbart gjutningssats. Genom att följa dessa metoder är det möjligt att konsekvent uppnå en komplett uppsättning av 24 vävnader utan gjutningsfel för efterföljande läkemedelsscreening. Kritiska överväganden för att uppnå ett sådant resultat är att säkerställa att alla steg utförs på is under gjutning för att förhindra för tidig polymerisation av hydrogelerna, avlägsnande av celldissociationsreagens före vävnadsgjutning, grundlig blandning av cellen och hydrogelsuspensionen för varje vävnad, ersättning av pipettspetsar mellan vävnader och användning av värmeinaktiverad FBS (om den används alls). Det är också viktigt att se till att postgitteret inte flyttas när gjutningen börjar och överförs försiktigt när hydrogeler har bildats.
Stora modifieringar inkluderar användningen av olika celltyper för att uppnå hjärt- kontra skelett-EMT och dopning av hydrogeler med varierande koncentrationer av basalmembranproteiner för att främja cellulär mognad och vävnadsstabilitet. De gynnsamma effekterna av sådan dopning måste testas från fall till fall, men har visat sig förbättra funktionella resultat och vävnadslivslängd under vissa omständigheter14,16,22. Det är också anmärkningsvärt att de listade celldensiteterna är en guide och kan behöva optimeras för olika cellinjer. Alternativa hydrogelkompositioner kan också betraktas som ett sätt att modifiera de strukturella och funktionella egenskaperna hos de uppnådda EMT23,24,25. Den ursprungliga muskelmikromiljön innehåller också stödjande celltyper för att främja vaskularisering, innervation och matrisavsättning för att stödja myocyter i form och funktion26,27. Medan systemet som beskrivs här för närvarande innehåller fibroblaster i 3D-hjärtvävnader, kan ytterligare celltyper skapa en mer fysiologisk relevant modell för att studera säkerheten och effekten av terapeutiska föreningar in vitro. Tidigare har en rad stödjande celltyper framgångsrikt integrerats i 3D-konstruerade vävnader som presenterar en spännande mall för framtida studier med hjälp av magnetisk avkänningskontraktilitetsplattform28,29,30.
Felsökning för detta protokoll fokuserar på bildandet av opålitliga eller inkonsekventa vävnader under gjutningsprocessen. Försiktighet måste vidtas för att undvika bubbelbildning i hydrogelerna när de gjuts samtidigt som man underlättar jämn fördelning av cellerna under blandning. Optimeringsexperiment kommer sannolikt att behövas för varje ny celltyp för att identifiera ideala celldensiteter, cellförhållanden och matrissammansättning.
En stor begränsning för denna teknik är det betydande antalet celler som krävs för att etablera en hel platta med 24 EMT. För de data som presenteras här användes 15 miljoner kardiomyocyter och 18 miljoner skelettmyoblaster per platta. Vissa forskare kanske inte har tillgång till så stora pooler av cellulärt material, vilket kan hämma deras förmåga att använda denna plattform i sin fulla utsträckning. Om slutanvändarna inte har tillgång till hårdvara för magnetisk avkänning måste mätningar av efterböjningar utföras optiskt, vilket avsevärt minskar genomströmningen och förhindrar samtidig registrering av muskelsammandragningar över flera brunnar. Mantarray-hårdvaran övervinner dock dessa begränsningar för att erbjuda det första kommersiella systemet som kan kontinuerlig, icke-invasiv analys av EMT-kontraktion samtidigt över flera konstruktioner.
Magnetisk avkänning över 24 brunnar underlättar longitudinella studier av EMT-funktionell utveckling i realtid och möjliggör noggrann mätning av akuta svar på kemisk, miljömässig eller genetisk manipulation. Medan magnetisk avkänning har flera fördelar som samtidig mätning över flera vävnader och inte kräver komplicerad dataanalys, möjliggör optiska detektionsmetoder samtidig mätning av fysiologiska mätvärden som kalciumflöde eller spänningskartläggning. Datauppsättningar som de som illustreras i resultatavsnittet visar dock bredden av applikationer som denna teknik har inom läkemedelsutvecklingsområdet. Med tanke på att få analyser på marknaden erbjuder medel för att utföra en direkt bedömning av kontraktil produktion i konstruerad muskel, har dessa metoder potential att revolutionera den prekliniska utvecklingspipelinen.
Disclosures
Alla författare är anställda och aktieägare i Curi Bio Inc., företaget som kommersialiserar Mantarray-hårdvaran och tillhörande programvara.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av finansiering från Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tilldelad Health and Environmental Sciences Institute) och genom finansiering från National Institutes of Health (HL151094 till Dr. Geisse). Vi tackar Dr. Alec S. T. Smith för hans hjälp med utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary - DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary - MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
- Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
- Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
- Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
- Scheraga, H. A.
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
- Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
- Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
- Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
- Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
- Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
- Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
- Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
- Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).
- Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
- Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
- Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
