Summary
يقدم هذا البحث بروتوكول تصنيع لنوع جديد من الركيزة المستزرعة مع مئات الحاويات الدقيقة لكل مم2 ، حيث يمكن استزراع الكائنات العضوية ومراقبتها باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة. كما يتم تفصيل بروتوكولات بذر الخلايا وتلطيخ المناعة.
Abstract
إن توصيف عدد كبير من الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) (organoids) بمقاييس دقة مختلفة محدود حاليا بواسطة مناهج التصوير القياسية. يصف هذا البروتوكول طريقة لإعداد رقائق الثقافة العضوية الدقيقة ، والتي تتيح التصوير المباشر متعدد المقاييس 3D على أداة سهلة الاستخدام تتطلب الحد الأدنى من التلاعب وقادرة على ما يصل إلى 300 من إنتاجية التصوير العضوي / ساعة. تتوافق رقائق الاستزراع هذه مع كل من أهداف الهواء والغمر (الهواء والماء والزيت والسيليكون) ومجموعة واسعة من المجاهر الشائعة (على سبيل المثال ، القرص الدوار ، والماسح الضوئي المحوري ، والمجال الواسع ، والحقل الساطع). علاوة على ذلك ، يمكن استخدامها مع طرائق ورقة الضوء مثل تقنية مجهر الإضاءة أحادي الهدف أحادي المستوى (SPIM).
يقدم البروتوكول الموصوف هنا خطوات مفصلة لإعداد رقائق الاستزراع الدقيقة وزراعة وتلطيخ المواد العضوية. لا يلزم سوى فترة زمنية قصيرة للتعرف عليها ، ويمكن العثور بسهولة على المواد الاستهلاكية والمعدات في المختبرات الحيوية العادية. هنا ، سيتم عرض قدرات التصوير ثلاثي الأبعاد فقط باستخدام المجاهر القياسية التجارية (على سبيل المثال ، القرص الدوار لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد والفحص المجهري واسع المجال للمراقبة الروتينية).
Introduction
في ثقافات الخلايا العضوية 3D ، المشار إليها فيما يلي باسم organoids ، تتمايز الخلايا الجذعية وتنظم نفسها في هياكل مكانية تشترك في أوجه تشابه مورفولوجية ووظيفية قوية مع الأعضاء الحقيقية. تقدم الكائنات العضوية نماذج قيمة لدراسة البيولوجيا البشرية والتنمية خارج الجسم1،2،3. يتم تطوير عدد متزايد من النماذج التي تحاكي الكبد والدماغ والكلى والرئة والعديد من الأعضاء الأخرى2،4،5. يتم توجيه التمايز في المواد العضوية عن طريق إضافة عوامل نمو قابلة للذوبان ومصفوفة خارج الخلية في تسلسل زمني دقيق. ومع ذلك ، في تناقض ملحوظ مع الأعضاء ، فإن تطور المواد العضوية غير متجانس تماما.
بالإضافة إلى العديد من التحديات البيولوجية6،7 ، تشكل الثقافات العضوية أيضا تحديات تكنولوجية من حيث طرق زراعة الخلايا ، وتوصيف النسخ ، والتصوير. يحدث تطور الأعضاء في الجسم الحي في بيئة بيولوجية تؤدي إلى تنظيم ذاتي نمطي للغاية لترتيبات الخلايا. يمكن استخدام أي تغيير في النمط الظاهري كوكيل لتشخيص حالة مريضة. في المقابل ، تتطور الكائنات العضوية في المختبر في بيئات دقيقة يتم التحكم فيها بالحد الأدنى ومتوافقة مع ظروف زراعة الخلايا ، مما يؤدي إلى تباين كبير في مسار التطوير وتشكيل الشكل لكل عضو عضوي فردي.
أظهرت دراسة حديثة8 أن التصوير الكمي للشكل العضوي (واصفات النمط الظاهري) إلى جانب تقييم عدد قليل من العلامات الجينية يسمح بتعريف المناظر الطبيعية لتطور النمط الظاهري. يمكن القول إن القدرة على ربط تنوع التعبير الجيني في الكائنات العضوية بسلوكها الظاهري هي خطوة رئيسية نحو إطلاق العنان للإمكانات الكاملة للثقافات العضوية. وبالتالي ، فإنه يطرح لتطوير مناهج تصوير مخصصة وعالية المحتوى تسمح بتوصيف الميزات العضوية في المقاييس تحت الخلوية والمتعددة الخلايا والعضوية الكاملة في 3D 9,10.
لقد طورنا منصة فحص عالية المحتوى (HCS) متعددة الاستخدامات تسمح بزراعة عضوية مبسطة (من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المعزولة [hESCs] ، أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان [hIPSCs] ، أو الخلايا الأولية إلى 3D ، متعددة الخلايا ، عضويات متباينة) وتصوير ثلاثي الأبعاد سريع وغير جراحي. إنه يدمج الجيل التالي ، مصغر ، جهاز زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد ، يسمى رقاقة JeWells ( الشريحة فيما بعد) ، والتي تحتوي على الآلاف من الآبار الدقيقة المصفوفة جيدا والمحاطة بمرايا 45 درجة تسمح بتصوير سريع وثلاثي الأبعاد وعالي الدقة بواسطة الفحص المجهريأحادي الهدف 11. متوافق مع أي مجهر قياسي تجاري مقلوب ، يتيح هذا النظام تصوير 300 مادة عضوية ثلاثية الأبعاد بدقة تحت الخلوية في <1 ساعة.
يبدأ التصنيع الدقيق لجهاز زراعة الخلايا من قالب منظم دقيق موجود ، والذي يحتوي على مئات الأهرامات الدقيقة (الشكل 1 أ) مع قاعدة مربعة وجدران جانبية عند 45 درجة فيما يتعلق بالقاعدة. يوضح الشكل 1C صور المجهر الإلكتروني (EM) لمثل هذه الهياكل. القالب نفسه مصنوع من بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) (PDMS) ويمكن صنعه كنسخة طبق الأصل من قالب أولي (غير موضح هنا) مع الميزات المقابلة (كتجاويف) باستخدام إجراءات الطباعة الحجرية اللينة القياسية. يمكن إنتاج القالب الأساسي بإجراءات مختلفة. تم إجراء البروتوكول المستخدم لهذا البروتوكول باستخدام النقش الرطب السيليكوني كما ورد في Galland et al. 11 ؛ إجراء تصنيع القالب الأساسي ليس بالغ الأهمية لهذا البروتوكول. يتم ترتيب الأهرامات في مصفوفة مربعة ، مع نفس الملعب لاتجاهات X و Y (في هذه الحالة تكون درجة الصوت 350 ميكرومتر).
على سبيل التوضيح ، تم نشر تجارب إثبات المفهوم12 لإثبات أن الشريحة تسمح بالزراعة طويلة المدى (أشهر) وبروتوكولات التمايز مع تحديد عدد الخلايا الأولية في الآبار بدقة. يمكن مراقبة التطوير الفردي لعدد كبير من الكائنات العضوية تلقائيا على الهواء مباشرة باستخدام مجاهر مضان ساطعة قياسية و 3D ذات صفائح ضوئية. علاوة على ذلك ، يمكن استرجاع المواد العضوية لإجراء مزيد من التحقيقات البيولوجية (على سبيل المثال ، تحليل النسخ). تحدد هذه الورقة البروتوكولات التفصيلية لتصنيع أغطية زراعة الخلايا ، وإجراء البذر والتلوين للفحص المجهري الفلوري ، وكذلك استرجاع المواد العضوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يفصل الجزء الأول من هذا البروتوكول التصنيع الدقيق لجهاز زراعة الخلايا. يمكن إنتاج قالب أولي أصلي مع تجاويف هرمية داخليا - إذا كانت مرافق التصنيع الدقيقة متاحة - أو الاستعانة بمصادر خارجية لشركات خارجية. يتم إنتاج القالب الأساسي المستخدم في هذا العمل داخليا ، مع خطوات عملية التصنيع الموضحة في مكان آخر11،13. يتوفر بروتوكول أساسي للتصنيع الدقيق للقالب في الملف التكميلي 1. حرجة: يجب إجراء العمليات في الخطوات من 1 إلى 6 في بيئة خالية من الغبار. يفضل استخدام غطاء تدفق رقائقي أو غرفة نظيفة ، إن وجدت. من خلال كل هذه الخطوات ، يجب استخدام معدات الحماية الشخصية (PPE) ، مثل القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة.
1. تقطيع قالب PDMS
- قطع أجزاء صغيرة من قالب PDMS إلى البعد المطلوب للجهاز النهائي (على سبيل المثال ، 1 سم × 1 سم [الشكل 1B]). قصها بالتوازي مع اتجاهات XY للمصفوفة.
حرج: عند قطع قالب PDMS في نرد 1 سم × 1 سم ، قم بتنفيذ القطع في خطوات واحدة ؛ باستخدام شفرة حلاقة من جانب واحد ، اضغط وقطع PDMS في خطوة واحدة. هذا لمنع تكوين جزيئات صغيرة من PDMS ، والتي يمكن أن تترسب على سطح القالب وتؤثر على جودة خطوات النسخ المتماثلة (الخطوة 3).
2. إعداد ركائز PDMS المسطحة
- تزن ~ 15-20 جم من راتنج قاعدة PDMS و 1.5-2 جم من عامل الشبكة (أي نسبة 10: 1) ، واخلطها بعناية ، وقم بالتخلص من الغازات في وعاء مفرغ لمدة ~ 20 دقيقة.
- صب ببطء PDMS المفرغة على طبق بتري بلاستيكي بعرض 15 سم.
- عالج PDMS عن طريق حفظ طبق بتري في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. بعد انتظار اكتمال المعالجة ، يكون فيلم PDMS المسطح بسمك ~ 1.5 مم (الموجود في طبق بتري) جاهزا للاستخدام (الشكل 2 أ).
- باستخدام شفرة حادة ، قم بقص قطع 2 سم × 2 سم من PDMS (الشكل 2B-D).
ملاحظة: السماكة الدقيقة لورقة PDMS هذه ليست حرجة ؛ ~ 1-2 مم هو نطاق مناسب. يجب أن يكون بعد القطع أكبر من القالب المحكم ولكن ليس أكبر بكثير ، مما قد يؤدي إلى إهدار المواد.
3. إنتاج طبقة محكم مصنوعة من لاصق قابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية
- ضع نرد قالب PDMS واحد (كما هو موضح في الخطوة 1) ووجهه لأسفل أعلى قطع PDMS المسطح (كما هو موضح في الخطوة 2) (الشكل 3 أ ، ب).
ملاحظة: تأكد من أن النتوءات الهرمية في القالب موجهة نحو ركيزة PDMS المسطحة وأن السطح العلوي للأهرامات المقطوعة فقط على اتصال. قم بتقييم الموضع الصحيح باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 3C ، D). - على جانب واحد من القالب ، باستخدام ماصة ، قم بإسقاط كمية صغيرة (قطرتان ، حوالي 0.1-0.2 مل) من مادة لاصقة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (الشكل 4 أ).
ملاحظة: عندما يتلامس السائل مع حافة القالب ، ستدفع الشعيرات الدموية السائل لملء التجويف بين القالب نفسه والقطع المسطح ل PDMS المستخدم كركيزة.- اتبع تقدم السائل داخل التجويف ، على سبيل المثال ، باستخدام مجهر بصري مقلوب بهدف تكبير 10x (الشكل 4B ، C).
- تعريض المادة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية لضوء الأشعة فوق البنفسجية لعلاجها. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة الطاقة لمصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدم (على سبيل المثال ، صندوق UV-LED بكثافة طاقة 35 ميجاوات / سم 2 ؛2 دقيقة بقوة 50٪ في هذا البروتوكول لمعالجة المادة اللاصقة تماما).
- باستخدام الكمية الزائدة من المادة اللاصقة على حافة واحدة ، أمسك المادة اللاصقة المعالجة على ركيزة PDMS المسطحة عن طريق الضغط برفق بإصبع (الشكل 5 أ ، ب). في هذه الأثناء ، استخدم الملقط لقرص زاوية واحدة من القالب بجوار نفس الحافة التي يتم الضغط عليها لأسفل وقشرها ببطء مع التأكد من عدم رفع الفيلم المحكم أيضا.
ملاحظة: يوضح الشكل 5C نتيجة إجراء إزالة العفن المناسب ؛ يوضح الشكل 5E-G الإجراء الخاطئ. - قم بقص المادة اللاصقة الزائدة وركيزة PDMS الزائدة باستخدام شفرة حلاقة لترك الطبقة اللاصقة المعالجة والمنسوجة مسطحة على PDMS مع PDMS الزائد على حافة واحدة فقط (الشكل 5D) ، والتي ستكون مطلوبة في الخطوة 5.
4. إعداد الركيزة Coverslip
ملاحظة: كركيزة للجهاز النهائي ، يتم استخدام أغطية قياسية مستديرة 1.5H بقطر 25 مم. قبل استخدامها ، يجب تنظيفها لإزالة الغبار و / أو بقايا العضوية من سطحها.
- تنظيف الغطاء
- اغمر الأغطية في الماء والصابون لمدة 5 دقائق أثناء تطبيق الموجات فوق الصوتية (40 كيلو هرتز ، 110 واط طاقة صوتية).
- اغسل الأغطية بماء نظيف منزوع الأيونات (DI) ، أولا عن طريق الغمر وأخيرا بمياه DI الجارية من الصنبور. جفف أغطية الأغطية بمسدس نفخ غاز N2 .
- اغمر الأغطية في حمام الأسيتون لمدة 5 دقائق ؛ انتقل على الفور إلى حمام 2-بروبانول (IPA) لمدة 5 دقائق إضافية.
- اشطف أغطية الأغطية باستخدام IPA نظيف باستخدام زجاجة ضغط. جفف أغطية الغطاء باستخدام مسدس النفخ الغازي N2 .
ملاحظة: يمكن تخزين أغطية الأغطية التي يتم تنظيفها باستخدام هذا الإجراء في حاوية مغلقة لحين الحاجة. احتفظ بها في خزانة جافة لتجنب ترسب الرطوبة على سطحها.
- عندما تكون جاهزا للاستخدام ، عالج غطاء نظيفا بعملية بلازما O 2 قصيرة لتحسين حمودتها للماء: O2 20 sccm ، وضغط 3 ملي بار ، و 60 واط في مولد طاقة التردد اللاسلكي ، ومدة 60 ثانية.
- مباشرة بعد تنشيط البلازما ، تابع طلاء الطبقة الرقيقة من المادة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية عن طريق وضع الغطاء على ظرف الفراغ لطبقة الدوران القياسية وسكب قطرة صغيرة من المادة اللاصقة في وسط غطاء الغطاء (الشكل 6). قم بتشغيل عملية الطلاء الدوراني: الانتشار لمدة 5 ثوان عند 500 دورة في الدقيقة ، والطلاء عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية (مع ضبط التسارع والتباطؤ على 100 دورة في الدقيقة / ثانية).
- في حالة عدم توفر طلاء الدوران ، استخدم الطريقة البديلة التالية لإنتاج طبقة رقيقة من لاصق الأشعة فوق البنفسجية على أغطية الغطاء:
- على غطاء نظيف ، قم بإسقاط ~ 0.1 مل من مادة لاصقة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية باستخدام ماصة (الشكل 7 أ).
- خذ غطاء ثان وضعه فوق الغطاء الأول لجعل المادة اللاصقة السائلة تنتشر بالتساوي بين الغطاءين (الشكل 7B-D).
- بمجرد وصول المادة اللاصقة المنتشرة إلى حواف أغطية الغطاء ، افصلها برفق عن طريق تحريك واحدة فوق الأخرى. بمجرد فصلهما ، يتم طلاء كلا الغطاءين بالكامل بطبقة رقيقة من المادة اللاصقة السائلة (الشكل 7E).
ملاحظة: قد لا يكون الطلاء موحدا وسلسا فقط إذا لم يتم الفصل بحركة سلسة ومستمرة.
- في حالة عدم توفر طلاء الدوران ، استخدم الطريقة البديلة التالية لإنتاج طبقة رقيقة من لاصق الأشعة فوق البنفسجية على أغطية الغطاء:
- المعالجة المسبقة للمواد اللاصقة القابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية
- بعد طلاء الدوران ، قم بمعالجة المادة اللاصقة عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة طاقة مصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدم (هنا ، تم استخدام صندوق UV-LED بكثافة طاقة 35 ميجاوات / سم2 لمدة 1 دقيقة بطاقة 50٪).
حرج: المادة اللاصقة المستخدمة هنا هي غراء بصري. انظر المناقشة لمعرفة النقاط الرئيسية المتعلقة بجرعات الطاقة لمعالجتها.
- بعد طلاء الدوران ، قم بمعالجة المادة اللاصقة عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة طاقة مصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدم (هنا ، تم استخدام صندوق UV-LED بكثافة طاقة 35 ميجاوات / سم2 لمدة 1 دقيقة بطاقة 50٪).
5. نقل الفيلم المحكم إلى الركيزة النهائية
- خذ أحد الأفلام المحكم (المعد في الخطوة 3) وضعه على اتصال مع غطاء الغطاء المطلي باللاصق (المحضر في الخطوة 4). تأكد من أن التلامس بين المادة اللاصقة المعالجة جزئيا على غطاء الغطاء والفيلم المحكم موحد قدر الإمكان (الشكل 8A-C).
حرج: في هذه المرحلة ، يجب أن تكون المادة اللاصقة الموجودة على غطاء الغطاء صلبة بما يكفي لتجنب إعادة التدفق ، والتي من شأنها أن تملأ التجاويف الهرمية للفيلم المحكم عند وضعها في اتصال ولكن أيضا تكون بلاستيكية ولاصقة بدرجة كافية بحيث يمكن تحسين الاتصال عن طريق الضغط برفق على الفيلم المحكم. - قم بتعريض أغطية الغطاء لضوء الأشعة فوق البنفسجية حتى يتم علاج الطبقة اللاصقة المطلية على الغطاء بالكامل. سيؤدي ذلك إلى إغلاق الفيلم المحكم على غطاء الغطاء وتوفير عزل مانع للتسرب بين التجاويف الهرمية.
- أخيرا ، انزع الركيزة المسطحة PDMS (الشكل 8D-F). باستخدام الملقط ، اضغط على PDMS في زاوية واحدة عند الحافة حيث تركت المواد الزائدة بعد التشذيب (الخطوة 3.5). بهذه الطريقة ، يتم ترك طبقة الفيلم المحكم لاصقة على غطاء الغطاء مع وصول مفتوح في الأعلى لبذر الخلايا. حرج: عند تقشير PDMS المسطح ، يجب أن يظل الفيلم المحكم متصلا جيدا بغطاء الغطاء. يتم تأكيد فشل الالتصاق بسهولة إذا كان من الممكن تقشير الفيلم المحكم من الغطاء بعد التعرض النهائي للأشعة فوق البنفسجية دون أي جهد.
6. التخميل طويل الأجل لغطاء زراعة الخلايا لزراعة الخلايا
ملاحظة: يتم تحقيق التخميل عن طريق توليد طلاء مطابق ومستمر لبوليمر مشترك محاكي حيوي بهيكل مشابه للمجموعة القطبية من الدهون الفوسفاتية في غشاء الخلية. يمنع هذا الطلاء المطابق التصاق الخلايا بجهاز زراعة الخلايا
- تحضير محلول يحتوي على 0.5٪ (وزن / حجم) من البوليمر المشترك المحاكي الحيوي المذاب في الإيثانول النقي. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
- ضع غطاء زراعة الخلية في طبق بتري 35 مم وقم بتغطيته بالكامل بمحلول البوليمر المشترك المحاكي الحيوي.
- بعد 5 دقائق ، قم بإزالة غطاء زراعة الخلايا من الحاوية بمحلول البوليمر المشترك المحاكي حيويا واتركه حتى يجف في درجة حرارة الغرفة داخل الطبق النهائي في غطاء السلامة الحيوية (>1 ساعة).
ملاحظة: يمكن إنتاج طلاء أكثر سمكا عن طريق زيادة تركيز البوليمر المشترك المحاكي الحيوي في محلول الطلاء ؛ تظهر نتائج الطلاء السميك تحت مجهر برايت فيلد (الشكل 9 أ).
7. بذر الخلية
- التفريغ والتعقيم
- قبل بذر الخلية مباشرة ، قم بتوزيع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) في أطباق زراعة الخلايا (عادة 1 مل لطبق بتري 35 مم). قم بإزالة الطبق باستخدام PBS المعقم باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية لمدة ~ 10 دقائق ، تليها عدة جولات من السحب لإزالة جميع الفقاعات.
حرج: إذا كان الهواء محاصرا داخل التجاويف الهرمية ، فسوف يمنع الخلايا من دخولها. للتأكد من عدم وجود هواء محبوس في الهرم قبل بذر الخلية ، يوصى بالتأكد بصريا (تحت مجهر برايت فيلد على الطاولة عند تكبير 10x أو 20x) من عدم وجود هواء في هذه التجاويف (الشكل 10). - استبدل PBS بوسط زراعة معقم وقم بتعقيم اللوحة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة تحت غطاء زراعة الخلية.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب اعتبار الطبق معقما والتلاعب به باستخدام تقنيات معقمة. هناك طريقة بديلة لإزالة الهواء المحبوس من جهاز زراعة الخلايا وهي استخدام جرة تفريغ مع مضخة تفريغ.
- قبل بذر الخلية مباشرة ، قم بتوزيع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) في أطباق زراعة الخلايا (عادة 1 مل لطبق بتري 35 مم). قم بإزالة الطبق باستخدام PBS المعقم باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية لمدة ~ 10 دقائق ، تليها عدة جولات من السحب لإزالة جميع الفقاعات.
- إعداد تعليق الخلية
ملاحظة: يمكن زرع الخلايا كمجاميع خلية مفردة أو صغيرة ودخول آبار العينة من خلال الفتحة العلوية. بمرور الوقت ، تتجمع الخلايا المدرجة وتنمو داخل آبار العينة إلى كرويات بحجم أكبر من حجم الفتحة. كنماذج خط خلية تم التحقق من صحتها ، استخدم خلايا سرطانية HCT116 (CCL-247 ATCC) أو MCF7 (HTB-22 ATCC) محفوظة في وسط المزرعة الموصى به (إرشادات ATCC).- قم بإعداد معلق خلوي (على سبيل المثال ، باستخدام عملية التربسين باتباع إرشادات ATCC). اتبع توصيات إعداد التربسين / تعليق الخلية للخلايا ذات الاهتمام.
- عد واضبط تركيز الخلية إلى 0.5 × 106 خلايا / مل في وسط الاستزراع الموصى به.
- الاستغناء عن الخلايا
- قم بإزالة المخزن المؤقت PBS من طبق زراعة الخلايا 35 مم ثم قم بتوزيع 1 مل من تعليق الخلية المعدل. انظر الشكل 11A للحصول على صورة مجهر ضوئي لإجراء بذر الخلية بكثافة خلية وتجانس كافيين.
- ضع طبق زراعة الخلايا مرة أخرى في حاضنة الخلية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 100٪ رطوبة) لمدة 10 دقائق. ما يقرب من 80-100 خلية ستدخل كل تجويف هرمي.
ملاحظة: من الممكن زيادة عدد الخلايا لكل طبق زراعة خلوي عن طريق زيادة تركيز الخلية أو الوقت الذي يقضيه قبل إزالة تعليق الخلية. عادة ، يستغرق تكوين كروي عدة ساعات (حسب نوع الخلية) بعد بذر الخلية ويمكن متابعته بمجهر برايتفيلد (4x إلى 40x الأهداف ؛ الشكل 11). من هنا ، يمكن تغيير وسط الاستزراع والمصفوفات خارج الخلية وعوامل نمو التمايز أو إضافتها إلى طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على الأجسام الكروية وفقا لبروتوكولات التمايز النموذجية التي يمكن أن تستمر بضعة أيام أو أسابيع أو أشهر. - بعد الحضانة لمدة 10 دقائق ، استرجع طبق زراعة الخلايا من الحاضنة واستنشق المعلق الخلوي برفق لإزالة الخلايا غير المحاصرة. أضف 1 مل من وسط الاستزراع إلى طبق 35 مم وضعه مرة أخرى في حاضنة الخلية.
حرج: في هذه المرحلة ، نظرا لأن الأجسام الكروية لم تتشكل بعد ، من المهم جدا تجنب الطموح القوي أو الاستغناء الذي سيؤدي إلى فقدان الخلايا. يوصى بشدة بالتحكم البصري باستخدام مجهر برايت فيلد على الطاولة في هذه الخطوة.
8. التلوين المناعي والتصوير
- التثبيت والتلوين
ملاحظة: الإجراءات الكلاسيكية المختلفة للتثبيت والتلوين المناعي متوافقة تماما مع طبق زراعة الخلايا. يتم وصف بروتوكول نموذجي واحد هنا.- ثبت العضويات / الكروية في طبق زراعة الخلايا لمدة 20 دقيقة في 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة.
- تغلغل المواد العضوية لمدة 24 ساعة في محلول خافض للتوتر السطحي بنسبة 1٪ في PBS معقم عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري واحتضان لمدة 24 ساعة في المخزن المؤقت المانع (2٪ ألبومين مصل بقري [BSA] و 1٪ خافض للتوتر السطحي في PBS معقم) عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري.
- احتضان العينات بالأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية عند التخفيف بين 1/50 و 1/200 (أو وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) في محلول تخفيف الأجسام المضادة (2٪ BSA و 0.2٪ خافض للتوتر السطحي في PBS المعقم) عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.
- شطف العينات 3x مع عازلة الغسيل على شاكر المداري (3٪ كلوريد الصوديوم و 0.2٪ الفاعل بالسطح في PBS معقمة) واحتضان الأجسام المضادة الثانوية المقابلة في عازلة تخفيف الأجسام المضادة (التخفيف بين 1/100 و 1/300 أو وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) ، 0.5 ميكروغرام / مل 4'،6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) ، و 0.2 ميكروغرام / مل Alexa Fluor 647 أو 488 Phalloidin عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على شاكر مداري ، تليها خمس خطوات شطف مع برنامج تلفزيوني. اختياريا ، قم بتركيب العينات باستخدام عامل إزالة قابل للذوبان في الماء تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
- التصوير
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن اعتبار المواد العضوية الموجودة في لوحة microwell بمثابة طبق استزراع عادي يحتوي على عينات ثابتة وملطخة للتصوير: يمكن استخدام أي إجراء تصوير قياسي دون الحاجة إلى تكييف أو تعديل. يوضح الشكل 12 نتيجة تمثيلية للصور وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار ، مع هدف هوائي 40x (فتحة عددية 0.75).- استخدم برنامج المنشئ لعملية الحصول التلقائي على الصور بالإعدادات التالية: وقت التعرض = 50 مللي ثانية ، مع مرحلة آلية z للحصول على مكدس z (1 ميكرومتر Z-step ، لارتفاع إجمالي يبلغ 70 ميكرومتر).
- إجراء إعادة بناء 3D باستخدام برنامج تحليل الصور.
9. الافراج عن وجمع المواد العضوية
ملاحظة: يمكن فصل الطبقة اللاصقة المحكم لطبق زراعة الخلايا عن الغطاء لتحرير الأجسام الكروية / العضوية الحية (قبل التثبيت) الموجودة داخل التجاويف الهرمية لتحليل الخلايا بإجراءات أخرى مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، ونهج -omic ، والتجارب في المختبر ، وزرع الجسم الحي .
- مع بقاء العينة في طبق بتري وفي غطاء السلامة الحيوية ، استخدم شفرة مثل مشرط لقطع زاوية من الطبقة اللاصقة المنسوجة.
- باستخدام الملقط ، اضغط على الطبقة اللاصقة المحكم على الحافة المقطوعة وقشرها برفق من الغطاء الزجاجي ولكن احتفظ بها مغمورة في الوسط (قد تبقى بعض المواد العضوية مع الطبقة اللاصقة ، الشكل 13).
- شطف 3x مع وسط الاستزراع وجمع المواد العضوية عن طريق ماصة العين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 8F الجانب النموذجي لغطاء زراعة الخلية بعد التصنيع الناجح. تظهر الطبقة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية مسطحة وتلتصق جيدا بغطاء الغطاء. قد يفشل نقل الطبقة اللاصقة على غطاء الغطاء إذا تم تجاوز الطبقة الموجودة على غطاء الغطاء ، أو إذا تمت إزالة ركيزة PDMS المسطحة بشكل غير صحيح (كما هو موضح في الشكل 8G ، H). في كلتا الحالتين ، يكون الفشل واضحا حيث لا يتم نقل أي فيلم محكم إلى غطاء الغطاء.
لكي تعمل الآبار الدقيقة ، يحتاج الفيلم المحكم المنتج (كما هو موضح في خطوة البروتوكول 3) إلى فتح الجانبين العلوي والسفلي من الأهرامات لضمان أن الخلايا أثناء البذر في الخطوة 7 يمكن أن تدخل التجاويف وتظل محتواة بمجرد أن تبدأ الكائنات العضوية في التكون. يوضح الشكل 9 الزيادة في سمك الطلاء عن طريق زيادة تركيز البوليمر المشترك المحاكي الحيوي في محلول الطلاء. يوضح الشكل 10 نتائج تفريغ أطباق زراعة الخلايا لضمان عدم حبس الهواء في التجاويف الهرمية. يوضح الشكل 10A ، B التفريغ الكامل ، بينما يوضح الشكل 10C ، D فقاعات الهواء في التجاويف الهرمية.
في الشكل 11 ، يتم احتجاز الخلايا داخل الأهرامات ، وتتشكل الكائنات العضوية المقابلة بعد اليومين 2 و 15 من الزراعة. إذا تم إغلاق الفتحة العلوية للآبار الدقيقة بدلا من ذلك (نتيجة للخطوة 3 غير الصحيحة) ، فلن يتم ترك أي خلايا بعد شطف العينة بعد بذر الخلية. يوضح الشكل 12 صورا تمثيلية للكائنات العضوية وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد تم الحصول عليها باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار مع هدف هوائي 40x (فتحة عددية 0.75). بعد الإطلاق والجمع ، يمكن تخزين المواد العضوية في قنينة صغيرة واستخدامها لمزيد من التحليل (على سبيل المثال ، تسلسل الحمض النووي الريبي). يوضح الشكل 13B مثالا لعينة من الكائنات العضوية التي تم جمعها كما هو موضح.
الشكل 1: قالب بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان). (أ) تم الحصول على قالب PDMS الأولي كنسخة طبق الأصل من رقاقة محكم مقاس 4 بوصات (انظر الملف التكميلي 1). (ب) قطع بعرض 1 سم × 1 سم من قالب PDMS البداية. (ج) صور المجهر الإلكتروني الماسح للأعمدة شبه المنحرفة المرتبة في مصفوفة مربعة تملأ سطح القالب. قضبان المقياس = 1 سم (A) و 100 ميكرومتر و 200 ميكرومتر (C أعلى وأسفل ، على التوالي). اختصار: PDMS = بولي (ديميثيسيلوكسان). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: ركيزة PDMS مسطحة. (أ) يتم تحضير طبقة من PDMS ، ~ 1 مم ، في طبق بتري قياسي بعرض 15 سم. (ب) تقشير قطعة جديدة من PDMS. (ج) يمكن تقطيع PDMS المتبقي على طبق بتري إلى المزيد من القطع لمزيد من الاستخدام. (د) قطع PDMS المسطح وقالب PDMS جنبا إلى جنب ؛ PDMS المسطح أكبر من القالب. اختصار: PDMS = بولي (ديميثيسيلوكسان). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: وضع القالب على الركيزة. (أ) يوضع القالب على الركيزة المسطحة بحيث تكون الأهرامات متجهة لأسفل. (ب) مظهر مختلف لضعف الاتصال (أعلى) والاتصال الجيد (أسفل) بين القالب وركيزة PDMS. (ج) صورة مجهرية ضوئية لمنطقة ضعيفة الاتصال؛ تسلط الدوائر الحمراء الضوء على الأعمدة التي لا تتلامس مع الركيزة - فهي تبدو بلون أكثر إشراقا من تلك الملامسة في نفس الصورة. (د) صورة بصرية لمنطقة تكون جميع الأعمدة على اتصال جيد. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (C ، D). اختصار: PDMS = بولي (ديميثيسيلوكسان). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: الحشو الشعري للمادة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية . (أ) يوضح تسلسل الصور هذا (من اليسار إلى اليمين) سكب كمية صغيرة من المادة اللاصقة على حافة واحدة وتقدم المادة اللاصقة السائلة في التجويف بين القالب والركيزة. تشير الأسهم الصفراء إلى اتجاه تدفق السائل. (ب) تسلسل الصور البصرية (تكبير 40x) للجبهة السائلة المتحركة ؛ عندما تكون على اتصال جيد ، يتحرك الجزء الأمامي من السائل حول حواف الأهرامات دون تسرب. تشير الأسهم الصفراء إلى اتجاه التدفق وتشير الأسهم الحمراء إلى الحافة الأمامية للجبهة السائلة التي تتحرك حول حواف التلامس. (ج) تسلسل الصور البصرية (40x) للجبهة السائلة تتحرك عندما يكون الاتصال ضعيفا ؛ تشير الأسهم الحمراء إلى الحافة الأمامية للسائل المتسلل بين القالب والركيزة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: إزالة القالب بعد المعالجة اللاصقة. (أ-ج) الإجراء الصحيح لتقشير القالب: أثناء الضغط برفق على الجزء الزائد من المادة اللاصقة عند الحواف اليسرى بملاقط ، يتم قرص القالب بالقرب من نفس الحافة وينحني ببطء للتقشر. (د) نتيجة الإجراء الصحيح ؛ يتم قطع الفائض على ثلاثة حواف ، بينما يتم ترك فائض صغير من PDMS على الجانب الرابع (السهم الأصفر). (ه-ز) مثال على إجراء غير صحيح لإزالة القالب: يتم قرص القالب بملاقط من الحافة المقابلة ، مما يؤدي إلى تقشير الركيزة المسطحة للفيلم اللاصق مع القالب. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: طلاء الغطاء الزجاجي. (أ ، ب) مثال على إجراء طلاء جيد: يتم وضع غطاء الغطاء الزجاجي على ظرف الفراغ لطلاء الدوران ، ويتم توزيع مادة لاصقة كافية في المركز ، مما يعطي طلاءا متجانسا لغطاء الغطاء. (ج، د) مثال على إجراء طلاء سيء: لا يتم الاستغناء عن مادة لاصقة كافية ، مما يؤدي إلى طلاء غير موحد لغطاء الغطاء. (ه) من اليسار إلى اليمين، أمثلة على الطلاء الجيد والمقبول والسيئ. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: عملية طلاء بديلة. (أ) توضع قطرة صغيرة من المادة اللاصقة السائلة في وسط الغطاء اللاصق. (ب) توضع زلة غطاء ثانية برفق فوق الأولى. (ج، د) ينتشر السائل بين الغطاءين ويوزع بالتساوي. (ه) أمثلة على النتائج بعد الفصل الصحيح لأغطية الغطاء (يسار) أو الفصل غير الصحيح (يمين). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: نقل إلى غطاء الغطاء. (أ) يتم وضع الفيلم اللاصق المعالج والمشذب (الشكل 5D) على غطاء الغطاء بمادة لاصقة معالجة جزئيا. (ب) مثال على الاتصال الجيد بين الفيلم المحكم وقسيمة الغطاء. الجزء الداخلي عبارة عن صورة بصرية تظهر اتصالا موحدا للمناطق الواقعة بين التجاويف شبه المنحرفة (لون موحد غامق). (ج) مثال على ضعف الاتصال بين الفيلم المحكم وقسيمة الغطاء. المناطق الأكثر إشراقا ليست على اتصال ، تشير الأسهم الحمراء إلى تلك المناطق. الجزء الداخلي عبارة عن صورة بصرية تظهر المظهر المختلف للاتصال الجيد (اثنان على اليسار) والاتصال الضعيف (اثنان على اليمين). قضبان المقياس (أصفر ، B ، C) = 200 ميكرومتر. (D ، E) الإجراء الصحيح لإزالة الركيزة المسطحة PDMS: تستخدم الملقط لقرص PDMS عند الحافة مع وجود فائض من PDMS والانحناء لتقشر برفق. (F) تم نقل النتيجة مع فيلم UV اللاصق المحكم بنجاح إلى غطاء الغطاء. (ز، ح) مثال على إجراء تقشير غير صحيح: تستخدم الملقط لقرص PDMS المسطح على أحد الحواف حيث تم قطع المواد الزائدة ؛ وبالتالي ، تتم إزالة الفيلم مع PDMS المسطح. اختصار: PDMS = بولي (ديميثيسيلوكسان). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 9: طلاء باستخدام بوليمر مشترك محاكي حيوي. (أ) جهاز زراعة الخلايا المطلي ببوليمر مشترك محاكي حيويا باستخدام محلول 0.5٪ (يسار) أو (ب) 1٪ (يمين) (وزن / حجم) في الإيثانول النقي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 10: تفريغ جهاز زراعة الخلايا. (أ) جهاز زراعة الخلايا قبل التفريغ الكامل. (ب) جهاز زراعة الخلايا بعد التفريغ الكامل ؛ (C ، D) جهاز زراعة الخلايا مع تفريغ جزئي فقط حيث يتم احتجاز فقاعات الهواء في الأهرامات. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (A-D). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 11: صور برايتفيلد تمثيلية لبذر الخلايا ونمو الكائنات العضوية . (أ) الخلايا مرئية تطفو على القمة. ب: الخلايا المحبوسة في التجاويف الهرمية بعد شطف المعلق. سيتم الاحتفاظ بالخلايا المحاصرة فقط كما هو موضح. (ج) تتجمع الخلايا لتكوين كرويات في كل تجويف (اليوم 2 بعد بذر الخلية). (د) صورة في اليوم 15 بعد بذر خلية عضو عضوي نما في تجويف هرمي. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (A B) و 120 ميكرومتر (C) و 150 ميكرومتر (D). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 12: التصوير ثلاثي الأبعاد للكائنات العضوية. (أ) ثلاث خطط Z مختلفة تم الحصول عليها باستخدام قرص دوار متحد البؤر (العدسة 40x ، الهواء ، الفتحة العددية: 0.75) لعضو عضوي تحت تمايز الأديم الظاهر العصبي (اليوم 7 بعد بذر الخلية). تلطيخ الأكتين باستخدام phalloidin (Alexa Fluor 647) باللون البرتقالي و N-cadherin المناعي (Alexa Fluor 561) باللون الأزرق. (ب) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج تحليل الصور للعضويات المقابلة (خطط 80 Z ، الارتفاع الإجمالي 100 ميكرومتر). الأسهم البيضاء: مجموعات من الخلايا حول خط مع مستوى عال من تعبير الأكتين. الأسهم الزرقاء: مجموعات الخلايا إيجابية لتعبير بروتين N-cadherin. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 13: إطلاق المواد العضوية . (أ) إزالة الطبقة اللاصقة المحكم بالملاقط. (ب) صورة برايتفيلد لمعلق عضوي تم الحصول عليه بعد الإزالة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (B). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة للتصنيع الدقيق لقالب Si مع تجاويف دقيقة هرمية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم وصف الإجراء الخاص بتصنيع طبق استزراع البئر الصغير ، والذي يسمح بالثقافة العضوية عالية الكثافة والتمايز ، في هذه الورقة. نظرا لهندسة وترتيب التجاويف الدقيقة ، يمكن استزراع الآلاف من الأجسام الكروية وتلطيخها في لوحة واحدة لفترات طويلة من الزمن (عدة أسابيع أو أكثر) دون أي فقد للمواد تقريبا. على سبيل المقارنة ، يمكن أن تحتوي مساحة 4 مم × 2 مم على لوحة زراعة الخلايا على العديد من الأجسام الكروية مثل لوحة واحدة 384 بئرا بمساحة 12 سم × 8 سم.
يتيح التوزيع المنتظم للتجاويف الدقيقة والغطاء القياسي المسطح المستخدم كركيزة مراقبة الآلاف من الكائنات العضوية الحية أو الثابتة في 3D ، دون الحاجة إلى معالجة عينات معقدة وتستغرق وقتا طويلا بين أوعية الاستزراع ودعامات التصوير. نظرا لشكل الهرم مع قمة أصغر من القاعدة ، لا يوجد فقدان للعضويات بسبب خطوات السحب أثناء التبادل المتوسط ، أو الاستغناء عن المصفوفات خارج الخلية ، أو إجراءات التلوين. يمكن تنفيذ كل هذه الخطوات مباشرة ، كما هو الحال بالنسبة لطبقة أحادية الخلية 2D دون أي احتياطات إضافية ، على عكس تقنيات توليد العضوية الكلاسيكية (على سبيل المثال ، قطرات معلقة ، لوحات تعلق منخفضة ، Aggrewell).
علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع هذه التقنيات الحالية ، تم تصميم الآبار الدقيقة للتصوير عالي الدقة 3D المتوافق مع جميع أنواع عدسات الغمر (الهواء والماء والزيت والسيليكون). الصيانة طويلة الأجل للعضويات المغلقة على غطاء زجاجي مسطح تجعل غطاء زراعة الخلية متوافقا مع المجاهر الضوئية عالية الدقة ، وهو أمر مستحيل مع الطرق الحالية دون معالجة معقدة ونقل عضوي سريع. علاوة على ذلك ، يتجنب إجراء التخميل الأمثل أي التصاق للخلايا / الكائنات العضوية للثقافة طويلة الأجل ، وبالتالي التحكم في تمايز ثقافة 3D أخيرا ، نظرا لأن الطبقة اللاصقة المحكم قابلة للإزالة ، يمكن استرداد الكائنات العضوية الحية لإجراء أنواع أخرى من التجارب مثل فحوصات -omics أو زرع الجسم الحي .
وتجدر الإشارة إلى أن الشكل الهرمي وترتيب الصفيف للتجاويف الدقيقة المستخدمة في هذا البروتوكول مشتقان من القالب الأساسي ، الذي تم تصنيعه عن طريق النقش الرطب السيليكوني لتزويد الأسطح بتشطيب يشبه المرآة وميل 45 درجة للسماح بإجراء فحص مجهري أحادي الهدف للصفائح الضوئية (soSPIM11). بينما يمكن العثور على مناقشة لهذه المتطلبات ووصف كامل حول كيفية إنتاج مثل هذه القوالب في مكان آخر12،13 ، يتم أيضا تقديم بروتوكول بسيط في الملف التكميلي 1. تتوفر طرق مختلفة لإنتاج قالب أولي ، وهي متوافقة تماما مع تصنيع الرقائق في هذا البروتوكول. يمكن استخدام النقش بالليزر للزجاج والطباعة ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ، على سبيل المثال ، لإنتاج قالب أولي مع تجاويف مناسبة لاحتواء المواد العضوية ، ولكنها ليست مناسبة لتصوير soSPIM.
يمكن تكييف بروتوكول التصنيع الذي تم الكشف عنه هنا للاستخدام في أي مختبر بيولوجي قياسي ، حيث لا يلزم وجود أدوات تصنيع دقيقة مخصصة ومتقدمة. بعض الخطوات الحاسمة لتصنيع الآبار الدقيقة هي الإنتاج من خلال ملء الشعيرات الدموية للفيلم اللاصق المحكم ونقله إلى الركيزة الزجاجية. ومع ذلك ، في تجربتنا ، يمكن إتقانها مع قابلية عالية للتكاثر في فترة زمنية قصيرة. يجب أن تكون المسافة بين الأهرامات صغيرة قدر الإمكان لزيادة كثافة التجاويف لنمو المواد العضوية ، ولكن يجب أيضا أن تكون كبيرة بما يكفي بحيث يمكن إغلاق التجاويف على الركيزة دون أي تسرب أو عدم وجود ختم بينهما. وجدنا أن مسافة 50 ميكرومتر هي حل وسط جيد لهذه الحالة.
أثناء تلقيح الخلايا ، يتمثل أحد الجوانب الحاسمة في إزالة أي فقاعات هواء محاصرة داخل التجاويف لضمان دخول الخلية. وصفنا هنا حلا تم التحقق من صحته ، والذي يستخدم فقط معدات المختبرات الكلاسيكية (على سبيل المثال ، الخالط بالموجات فوق الصوتية أو جرة فراغ). للسماح بتجانس أفضل لعدد الخلايا لكل طبق زراعة خلوي ، يوصى بتوزيع معلق الخلية من جانب الطبق وليس فوق الغطاء مباشرة. يمكن أن يساعد التحريض اليدوي اللطيف أيضا في تجانس المحلول الخلوي.
بعد بذر الخلايا ، يمكن التعامل مع طبق زراعة الخلايا مع المواد العضوية مثل أي دعم ثقافة كلاسيكي آخر ؛ لا يلزم التلاعب المحدد أو الخطوات الحرجة. جميع البروتوكولات التي تم استخدامها مع أجهزة microwell هي عمليا نفس تلك المستخدمة في الأطباق منخفضة التعلق مثل الألواح السفلية على شكل حرف U. وبالتالي ، فإن الاستزراع العضوي في هذه الآبار الدقيقة لا يتطلب أي تغيير في ظروف الاستزراع مقارنة بالمعايير الأخرى.
عامل حاسم آخر هو أن المادة اللاصقة المستخدمة هنا هي غراء بصري. في أفضل استخدام مقترح (راجع أيضا ملاحظات التطبيق من البائع) ، يتم محاذاة عنصرين بصريين يتم لصقهما ويتم تطبيق مادة لاصقة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية على الواجهة. يتم استخدام التعرض الأول للأشعة فوق البنفسجية لطاقة غير كافية للتسبب في البلمرة الكاملة لتصلب الغراء مع الحفاظ على خصائص اللصق. يمكن نقل المكونات البصرية لتحقيق المحاذاة المثلى ، ثم يتم معالجة الغراء بالكامل إلى حالته النهائية مع التعرض الثاني للأشعة فوق البنفسجية لتوفير التصاق دائم. يجب تحسين جرعات طاقة التعرض الأولى والثانية (أي أوقات التعرض إذا تم استخدام مصدر كثافة طاقة معروفة وثابتة) اعتمادا على كثافة الطاقة لمصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدم ، وسمك طبقة الغراء ، وانتقال الأشعة فوق البنفسجية من خلال العناصر البصرية ، والتركيب السطحي (أو عدم وجوده) للسطح المراد لصقه.
في حين أن الالتصاق بين الفيلم المحكم والغطاء المطلي باللاصق مطلوب أن يكون قويا بما يكفي لتوفير ختم مانع للتسرب ، يجب أيضا أن يكون من الممكن إزالة الفيلم المحكم لاسترداد المواد العضوية بعد التصوير ، إذا كان هناك حاجة إلى مزيد من التحليل ، مثل التنميط الجيني. تم التوصل إلى حل وسط صحيح بين الختم المانع للتسرب والقدرة على تقشير الفيلم المحكم باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين لأوقات المعالجة المسبقة والمعالجة النهائية للطبقة الرقيقة اللاصقة على غطاء الغطاء لأنها تعتمد على نظام التعرض للأشعة فوق البنفسجية وسمك الفيلم المستخدم.
أحد القيود في نسخة microwells الحالية هو في إجراء البذر. يجب زرع الخلايا قبل مكونات ECM للسماح لها بالدخول بالقرب من الهرم. التحسينات جارية لتغليف الآبار الدقيقة بمكونات مصفوفة خارج الخلية ، كخطوة أولى. لم نقم بعد بإجراء أي مجهر إلكتروني (EM) على الكائنات العضوية الثابتة داخل التجاويف. ستكون هناك حاجة إلى بعض التعديلات على بروتوكولات التصنيع وزراعة الخلايا هذه قبل أن يصبح تصوير الكائنات العضوية في الآبار الدقيقة باستخدام EM خيارا قابلا للتطبيق.
يتمثل الامتداد المستقبلي الطبيعي لهذه الطريقة في توفير قدرات فحص عالية المحتوى للسماح بالاختبار متعدد الحالات في سير عمل واحد (لوحة متعددة الآبار). يوفر جهاز زراعة الخلايا هذا بديلا فريدا لتقنيات الكائنات العضوية الحالية ، حيث يوفر إنتاجية غير مسبوقة للزراعة والتصوير ويفتح آفاقا جديدة في مجال أبحاث الكائنات العضوية للتطبيقات الطبية الحيوية واكتشاف الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم نشر طلب براءة دولي برقم المنشور WO 2021/167535 A1.
Acknowledgments
يتم دعم البحث من قبل مشروع CALIPSO المدعوم من المؤسسة الوطنية للبحوث ، مكتب رئيس الوزراء ، سنغافورة ، في إطار برنامج الحرم الجامعي للتميز البحثي والمشاريع التكنولوجية (CREATE). يقر V.V. بدعم محقق NRF NRF-NRFI2018-07 ، و MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005 ، والتمويل الأولي MBI ، و ANR ADGastrulo. يقر A.B. و G.G. بالدعم المقدم من التمويل الأساسي ل MBI. A.B. تعترف Andor Technologies بقرض مجهر BC43.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
