Summary
Dette papir præsenterer en fabrikationsprotokol for en ny type kultursubstrat med hundredvis af mikrobeholdere pr. mm2, hvor organoider kan dyrkes og observeres ved hjælp af mikroskopi med høj opløsning. Protokollerne for cellesåning og immunfarvning er også detaljerede.
Abstract
Karakteriseringen af et stort antal tredimensionelle (3D) organotypiske kulturer (organoider) ved forskellige opløsningsskalaer er i øjeblikket begrænset af standard billeddannelsesmetoder. Denne protokol beskriver en måde at forberede mikrofabrikerede organoidkulturchips på, som muliggør multiskala, 3D live imaging på et brugervenligt instrument, der kræver minimal manipulation og er i stand til op til 300 organoider / h billeddannelsesgennemstrømning. Disse kulturchips er kompatible med både luft- og nedsænkningsmål (luft, vand, olie og silikone) og en lang række almindelige mikroskoper (f.eks. Roterende disk, punktscanner konfokal, bredt felt og brightfield). Desuden kan de bruges med lysarkmodaliteter såsom enkeltobjektiv, enkeltplan belysningsmikroskopi (SPIM) teknologi (soSPIM).
Protokollen beskrevet her giver detaljerede trin til fremstilling af de mikrofabrikerede kulturchips og kultur og farvning af organoider. Der kræves kun kort tid for at blive fortrolig med, og forbrugsstoffer og udstyr kan let findes i normale biolabs. Her vil 3D-billeddannelsesfunktionerne kun blive demonstreret med kommercielle standardmikroskoper (f.eks. Roterende disk til 3D-rekonstruktion og bredfeltmikroskopi til rutinemæssig overvågning).
Introduction
I organotypiske 3D-cellekulturer, i det følgende benævnt organoider, differentierer stamceller og selvorganiserer sig i rumlige strukturer, der deler stærke morfologiske og funktionelle ligheder med virkelige organer. Organoider tilbyder værdifulde modeller til at studere menneskelig biologi og udvikling uden for kroppen 1,2,3. Et stigende antal modeller udvikles, der efterligner leveren, hjernen, nyrerne, lungerne og mange andre organer 2,4,5. Differentiering i organoider styres ved tilsætning af opløselige vækstfaktorer og en ekstracellulær matrix i en præcis tidssekvens. I markant modsætning til organer er udviklingen af organoider imidlertid ret heterogen.
Ud over adskillige biologiske udfordringer6,7 udgør organoidkulturer også teknologiske udfordringer med hensyn til cellekulturmetoder, karakterisering af transkriptomik og billeddannelse. In vivo organudvikling sker i et biologisk miljø, der resulterer i en meget stereotyp selvorganisering af cellearrangementer. Enhver fænotypisk ændring kan bruges som en proxy til at diagnosticere en syg tilstand. I modsætning hertil udvikler organoider in vitro i minimalt kontrollerede mikromiljøer, der er kompatible med cellekulturbetingelser, hvilket resulterer i stor variation i udviklingsvejen og formdannelsen for hver enkelt organoid.
En nylig undersøgelse8 viste, at kvantitativ billeddannelse af organoid form (fænotypedeskriptorer) kombineret med vurderingen af nogle få genetiske markører gør det muligt at definere fænotypiske udviklingslandskaber. Evnen til at relatere mangfoldigheden af genomisk ekspression i organoider med deres fænotypiske adfærd er uden tvivl et stort skridt i retning af at frigøre det fulde potentiale i organotypiske kulturer. Således beder det om udvikling af dedikerede, billeddannelsesmetoder med højt indhold, der muliggør karakterisering af organoidfunktioner på subcellulære, multicellulære og helorganoide skalaer i 3D 9,10.
Vi udviklede en alsidig HCS-platform (high-content screening), der muliggør strømlinet organoidkultur (fra isolerede humane embryonale stamceller [hESC'er], humant inducerede pluripotente stamceller [hIPSC'er] eller primære celler til 3D, multicellulære, differentierede organoider) og hurtig, ikke-invasiv 3D-billeddannelse. Det integrerer en næste generations miniaturiseret 3D-cellekulturenhed, kaldet JeWells-chippen ( chippen herefter), der indeholder tusindvis af velarrayed mikrobrønde flankeret med 45 ° spejle, der muliggør hurtig 3D, høj opløsning billeddannelse ved enkeltobjektiv lysarkmikroskopi11. Kompatibel med ethvert standard, kommercielt, omvendt mikroskop, muliggør dette system billeddannelse af 300 organoider i 3D med subcellulær opløsning på <1 time.
Mikrofabrikationen af cellekulturindretningen starter fra en eksisterende mikrostruktureret form, der indeholder hundredvis af mikropyramider (figur 1A) med en firkantet base og sidevægge ved 45 ° i forhold til basen. Figur 1C viser elektronmikroskopbilleder (EM) af sådanne strukturer. Selve formen er lavet af poly (dimethylsiloxan) (PDMS) og kan fremstilles som en replika støbning af en primær form (ikke vist her) med tilsvarende funktioner (som hulrum) ved hjælp af standard blød-litografiske procedurer. Den primære form kan fremstilles ved forskellige procedurer. Den, der blev brugt til denne protokol, blev fremstillet ved hjælp af siliciumvådætsning som rapporteret i Galland et al. 11; Proceduren til fremstilling af den primære form er ikke kritisk for denne protokol. Pyramiderne er arrangeret i et kvadreret array med samme tonehøjde for X- og Y-retningerne (i dette tilfælde er tonehøjden 350 μm).
Som en illustration blev proof-of-concept-eksperimenter12 offentliggjort for at demonstrere, at chippen tillader langsigtet kultur (måneder) og differentieringsprotokoller, samtidig med at antallet af indledende celler i brøndene præcist defineres. Individuel udvikling af et stort antal organoider kan automatisk overvåges live ved hjælp af standard brightfield og 3D lysark fluorescens mikroskoper. Desuden kan organoider hentes for at udføre yderligere biologiske undersøgelser (fx transkriptomisk analyse). Dette papir skitserer detaljerede protokoller til fremstilling af cellekulturdæksedler, sånings- og farvningsproceduren for fluorescensmikroskopi samt hentning af organoiderne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Den første del af denne protokol beskriver mikrofabrikationen af cellekulturenheden. En original primær form med pyramidehulrum kan produceres internt - hvis mikrofabrikationsfaciliteter er tilgængelige - eller outsources til eksterne virksomheder. Den primære form, der anvendes i dette arbejde, produceres internt, med fabrikationsprocestrin beskrevet andetsteds11,13. En grundlæggende protokol til mikrofabrikation af formen er tilgængelig i supplerende fil 1. KRITISK: Operationerne i trin 1 til 6 skal udføres i et støvfrit miljø. En laminar strømningshætte eller et rent rum, hvis det er tilgængeligt, foretrækkes. Gennem alle disse trin skal personlige værnemidler (PPE) bruges, såsom handsker, en laboratoriefrakke og sikkerhedsbriller.
1. Terninger af PDMS-form
- Skær små portioner af PDMS-formen til den dimension, der kræves til den endelige enhed (f.eks. 1 cm x 1 cm [figur 1B]). Skær dem parallelt med XY-retningerne i arrayet.
KRITISK: Når du skærer PDMS-formen i terninger på 1 cm x 1 cm, skal du udføre snittene i enkelte trin; Brug et ensidigt barberblad til at lægge tryk og skære gennem PDMS i et enkelt trin. Dette er for at forhindre dannelse af små partikler af PDMS, som kan aflejres på overfladen af formen og påvirke kvaliteten af replika trinene (trin 3).
2. Fremstilling af flade PDMS-substrater
- Væg ~ 15-20 g PDMS-baseharpiks og 1,5-2 g af dets retikulationsmiddel (dvs. et forhold på 10: 1), bland dem omhyggeligt og afgas i en vakuumbeholder i ~ 20 minutter.
- Hæld langsomt det afgassede PDMS på en 15 cm bred (diameter) petriskål.
- Hærd PDMS ved at opbevare petriskålen i en ovn indstillet til 65 ° C i 2 timer. Efter at have ventet på, at hærdningen er afsluttet, er en flad PDMS-film med ~ 1,5 mm tykkelse (indeholdt i petriskålen) klar til brug (figur 2A).
- Brug et skarpt blad til at skære 2 cm x 2 cm stykker ud af PDMS (figur 2B-D).
BEMÆRK: Den nøjagtige tykkelse af dette PDMS-ark er ikke kritisk; ~1-2 mm er et passende interval. Dimensionen til snittet skal være større end den teksturerede form, men ikke meget større, hvilket ville resultere i spild af materiale.
3. Fremstilling af det teksturerede lag lavet af UV-hærdeligt klæbemiddel
- Placer en PDMS-formterning (som forberedt i trin 1) med forsiden nedad oven på det flade PDMS-snit (som forberedt i trin 2) (figur 3A, B).
BEMÆRK: Sørg for, at pyramidefremspringene i formen er orienteret mod det flade PDMS-substrat, og at kun den øverste overflade af de afkortede pyramider er i kontakt. Vurder den korrekte placering med et optisk mikroskop (figur 3C, D). - Til den ene side af formen skal du ved hjælp af en pipette slippe en lille mængde (to dråber, ca. 0,1-0,2 ml) UV-hærdeligt klæbemiddel (figur 4A).
BEMÆRK: Når væsken kommer i kontakt med formens kant, vil kapillariteten drive væsken til at fylde hulrummet mellem selve formen og det flade snit af PDMS, der anvendes som substrat.- Følg udviklingen af væsken inde i hulrummet, for eksempel ved hjælp af et omvendt optisk mikroskop med et 10x forstørrelsesmål (figur 4B, C).
- Udsæt det UV-hærdelige klæbemiddel for UV-lys for at hærde det. Juster eksponeringstiden afhængigt af effekttætheden af den anvendte UV-kilde (f.eks. en UV-LED-boks med en effekttæthed på 35 mW/cm 2;2 min ved 50% effekt i denne protokol for at hærde klæbemidlet fuldstændigt).
- Brug den overskydende mængde klæbemiddel i den ene kant til at holde det hærdede klæbemiddel på det flade PDMS-substrat ved forsigtigt at trykke med en finger (figur 5A, B). I mellemtiden skal du bruge pincet til at klemme det ene hjørne af formen ved siden af den samme kant, der holdes nede, og langsomt skrælle det af, mens du sørger for, at den teksturerede film ikke også løftes op.
BEMÆRK: Figur 5C viser resultatet af en korrekt procedure for fjernelse af skimmelsvamp; Figur 5E-G viser den forkerte procedure. - Trim det overskydende klæbemiddel og det overskydende PDMS-substrat ved hjælp af et barberblad for at efterlade det hærdede, teksturerede, klæbende lag fladt på PDMS med overskydende PDMS kun på den ene kant (figur 5D), hvilket vil være nødvendigt i trin 5.
4. Forberedelse af dækselsubstrat
BEMÆRK: Som underlag til den endelige enhed anvendes standard afrundede 1,5 timers dæksedler med en diameter på 25 mm. Før de kan bruges, skal de rengøres for at fjerne støv og / eller organiske rester fra deres overflade.
- Rengøring af dæksler
- Dyp dækslerne i sæbevand i 5 minutter, mens ultralydet påføres (40 kHz, 110 W sonisk effekt).
- Vask dækslerne i rent deioniseret (DI) vand, først ved nedsænkning og til sidst med rindende DI-vand fra en vandhane. Tør dækslerne med en N2 gasblæsepistol.
- Nedsænk dækslerne i et acetonebad i 5 minutter; Flyt straks til et 2-propanol (IPA) bad i yderligere 5 minutter.
- Skyl dækslerne med ren IPA ved hjælp af en klemmeflaske. Tør dækslerne med N2 gasblæsepistolen.
BEMÆRK: Dæksedler, der rengøres ved hjælp af denne procedure, kan opbevares i en lukket beholder, indtil de skal bruges. Opbevar dem i et tørt skab for at undgå, at fugt aflejres på deres overflade.
- Når den er klar til brug, skal du behandle en ren dæksel med en kortO2-plasmaproces for at forbedre dens hydrofilicitet: O2 20 sccm, 3 mbar tryk, 60 W ved RF-generatoren og 60 s varighed.
- Umiddelbart efter plasmaaktiveringen fortsættes med centrifugering af det tynde lag UV-hærdeligt klæbemiddel ved at placere dækselsedlen på vakuumpatronen på en standard spincoater og hælde en lille dråbe klæbemiddel i midten af dæksedlen (figur 6). Kør centrifugeringsprocessen: spredning i 5 s ved 500 o / min, belægning ved 3.000 o / min i 45 s (med acceleration og deceleration indstillet til 100 o / min / s).
- Hvis spin-coating ikke er tilgængelig, skal du bruge følgende alternative måde at producere en tynd film af UV-klæbemiddel på dækslerne:
- På en ren dæksel skal du tabe ~0,1 ml UV-hærdeligt klæbemiddel ved hjælp af en pipette (figur 7A).
- Tag en anden dæksel, og læg den oven på den første for at få det flydende klæbemiddel til at fordele sig jævnt mellem de to dæksedler (figur 7B-D).
- Når spredningslimet har nået kanterne på dæksedlerne, skal du forsigtigt adskille dem ved at glide over hinanden. Når de er adskilt, er begge dæksler fuldt belagt med et tyndt lag flydende klæbemiddel (figur 7E).
BEMÆRK: Belægningen er muligvis ikke ensartet og glat, hvis adskillelsen ikke udføres med en jævn og kontinuerlig bevægelse.
- Hvis spin-coating ikke er tilgængelig, skal du bruge følgende alternative måde at producere en tynd film af UV-klæbemiddel på dækslerne:
- Forhærdning af UV-hærdeligt klæbemiddel
- Efter centrifugering forhærdes klæbemidlet ved udsættelse for UV. Juster eksponeringstiden afhængigt af effekttætheden af den anvendte UV-kilde (her blev en UV-LED-boks med en effekttæthed på 35 mW/cm2 brugt i 1 min ved 50% effekt).
KRITISK: Det klæbemiddel, der bruges her, er en optisk lim. Se diskussionen for nøglepunkter relateret til energidoserne til hærdning.
- Efter centrifugering forhærdes klæbemidlet ved udsættelse for UV. Juster eksponeringstiden afhængigt af effekttætheden af den anvendte UV-kilde (her blev en UV-LED-boks med en effekttæthed på 35 mW/cm2 brugt i 1 min ved 50% effekt).
5. Overførsel af den teksturerede film til det endelige substrat
- Tag en af de teksturerede film (forberedt i trin 3) og anbring den i kontakt med den klæbende belagte dæksel (forberedt i trin 4). Sørg for, at kontakten mellem det delvist hærdede klæbemiddel på dæksedlen og den teksturerede film er så ensartet som muligt (figur 8A-C).
KRITISK: På dette stadium skal klæbemidlet på dæksedlen være solidt nok til at undgå reflow, hvilket ville fylde pyramidehulrummene i den teksturerede film, når den placeres i kontakt, men også være plastisk og klæbende nok til, at kontakten kan optimeres ved forsigtigt at trykke på den teksturerede film. - Udsæt dækslerne for UV-lys, indtil klæbelaget, der er belagt på dæksedlen, er helt hærdet. Dette forsegler den teksturerede film på dækslet og giver lækagesikker isolering mellem pyramidehulrummene.
- Til sidst skal du fjerne PDMS flade substrat (figur 8D-F). Brug pincet til at klemme PDMS i det ene hjørne ved kanten, hvor overskydende materiale blev efterladt efter trimning (trin 3.5). På denne måde efterlades det teksturerede filmlag klæbende til dæksedlen med åben adgang øverst til cellesåning. KRITISK: Når du skræller det flade PDMS af, skal den teksturerede film forblive godt fastgjort til dækslet. Vedhæftningsfejl bekræftes let, hvis den teksturerede film kan skrælles af dækslet efter endelig eksponering for UV uden nogen anstrengelse.
6. Langsigtet passivering af cellekulturdækslet til cellekultur
BEMÆRK: Passivering opnås ved at generere en konform og kontinuerlig belægning af en biomimetisk copolymer med en struktur svarende til den polære gruppe af phospholipider i cellemembranen. Denne konforme belægning forhindrer cellevedhæftning til cellekulturenheden
- Der fremstilles en opløsning med 0,5% (w/v) af den biomimetiske copolymer opløst i ren ethanol. Opbevar opløsningen ved 4 °C til fremtidig brug.
- Anbring cellekulturdækslet i en 35 mm petriskål og dæk det helt med den biomimetiske copolymeropløsning.
- Efter 5 minutter fjernes cellekulturdækslet fra beholderen med den biomimetiske copolymeropløsning og lader det tørre ved stuetemperatur inde i den endelige skål i en biosikkerhedshætte (>1 time).
BEMÆRK: En tykkere belægning kan fremstilles ved at øge koncentrationen af den biomimetiske copolymer i belægningsopløsningen; resultaterne af en tykkere belægning er synlige under et brightfieldmikroskop (figur 9A).
7. Cellesåning
- Afgasning og sterilisering
- Lige før cellesåning dispenseres sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) i cellekulturskålene (typisk 1 ml til en 35 mm petriskål). Afgas skålen med den sterile PBS ved hjælp af en ultralydsenhed i ~ 10 minutter, efterfulgt af flere runder pipettering for at fjerne alle boblerne.
KRITISK: Hvis luft er fanget inde i pyramidehulrummene, forhindrer det cellerne i at komme ind i dem. For at sikre, at der ikke er luft fanget i pyramiden før cellesåning, anbefales det visuelt at sikre (under et bænket brightfieldmikroskop ved 10x eller 20x forstørrelse) fraværet af luft i disse hulrum (figur 10). - Udskift PBS med sterilt dyrkningsmedium og steriliser pladen med UV-lys i 30 minutter under en cellekulturhætte.
BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter skal skålen betragtes som steril og manipuleres ved hjælp af sterile teknikker. En alternativ måde at fjerne fanget luft fra cellekulturindretningen er at bruge en vakuumbeholder med en vakuumpumpe.
- Lige før cellesåning dispenseres sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) i cellekulturskålene (typisk 1 ml til en 35 mm petriskål). Afgas skålen med den sterile PBS ved hjælp af en ultralydsenhed i ~ 10 minutter, efterfulgt af flere runder pipettering for at fjerne alle boblerne.
- Fremstilling af cellesuspension
BEMÆRK: Celler kan podes som enkelt- eller småcelleaggregater og trænge ind i prøvebrøndene gennem den øverste blænde. Over tid samles de indsatte celler og vokser inde i prøvebrøndene til sfæroider af en størrelse, der er større end blændens størrelse. Som validerede cellelinjemodeller skal du bruge HCT116 (CCL-247 ATCC) eller MCF7 (HTB-22 ATCC) kræftceller, der opretholdes i anbefalet dyrkningsmedium (ATCC-retningslinjer).- Forbered en cellesuspension (f.eks. ved hjælp af en trypsiniseringsproces efter ATCC-retningslinjer). Følg trypsinisering / cellesuspension forberedelse anbefalinger for celler af interesse.
- Cellekoncentrationen tælles og justeres til 0,5 × 106 celler/ml i det anbefalede dyrkningsmedium.
- Celledispensering
- PBS-bufferen fjernes fra 35 mm cellekulturskålen, og der dispenseres derefter 1 ml af den justerede cellesuspension. Se figur 11A for et optisk mikroskopbillede af en cellesåningsprocedure med tilstrækkelig celletæthed og homogenitet.
- Sæt cellekulturskålen tilbage i celleinkubatoren (37 ° C, 5% CO2 og 100% fugtighed) i 10 minutter. Ca. 80-100 celler kommer ind i hvert pyramidehulrum.
BEMÆRK: Det er muligt at øge antallet af celler pr. cellekulturskål ved at øge enten cellekoncentrationen eller den tid, der bruges før fjernelse af cellesuspension. Typisk tager sfærisk dannelse flere timer (afhængigt af celletype) efter cellesåning og kan følges med et brightfieldmikroskop (4x til 40x mål; Figur 11). Herfra kan dyrkningsmedium, ekstracellulære matricer og differentieringsvækstfaktorer ændres eller tilsættes til cellekulturskålen, der indeholder sfæroiderne i overensstemmelse med typiske differentieringsprotokoller, der kan vare et par dage, uger eller måneder. - Efter 10 minutters inkubation genvindes cellekulturskålen fra inkubatoren og aspireres forsigtigt den cellulære suspension for at fjerne ufangede celler. Tilsæt 1 ml dyrkningsmedium til en 35 mm skål og læg den tilbage i celleinkubatoren.
Kritisk: På dette stadium, fordi sfæroider endnu ikke er dannet, er det meget vigtigt at undgå stærk aspiration eller dispensering, der vil resultere i tab af cellerne. Visuel kontrol ved hjælp af et benchtop brightfield mikroskop anbefales stærkt på dette trin.
8. Immunfarvning og billeddannelse
- Fastgørelse og farvning
BEMÆRK: Forskellige klassiske procedurer for fiksering og immunfarvning er fuldstændig kompatible med cellekulturskålen. En typisk protokol er beskrevet her.- Fastgør organoiderne / sfæroiderne i cellekulturskålen i 20 minutter i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur.
- Permeabiliser organoiderne i 24 timer i 1 % overfladeaktiv opløsning i steril PBS ved 4 °C på en orbitalryster og inkuberes i 24 timer i blokerende buffer (2 % bovin serumalbumin [BSA] og 1 % overfladeaktivt stof i sterilt PBS) ved 4 °C på en orbitalryster.
- Prøverne inkuberes med primære antistoffer af interesse ved en fortynding mellem 1:50 og 1:200 (eller i henhold til producentens anbefalinger) i antistoffortyndingsbuffer (2% BSA og 0,2% overfladeaktivt stof i sterilt PBS) ved 4 °C i 48 timer.
- Prøverne skylles 3x med vaskebuffer på en orbitalryster (3 % NaCl og 0,2 % overfladeaktivt stof i sterilt PBS) og inkuberes med tilsvarende sekundære antistoffer i antistoffortyndingsbuffer (fortynding mellem 1/100 og 1/300 eller i henhold til producentens anbefalinger), 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og 0,2 μg/ml Alexa Fluor 647 eller 488 Phalloidin ved 4 °C i 24 timer på en orbitalryster, efterfulgt af fem skylletrin med PBS. Prøverne monteres eventuelt med et vandopløseligt clearingmiddel, der er forvarmet til 37 °C.
- Imaging
BEMÆRK: På dette stadium kan organoiderne i mikrobrøndpladen betragtes som en normal kulturskål, der indeholder faste og farvede prøver til billeddannelse: enhver standardbilleddannelsesprocedure kan anvendes uden tilpasning eller modifikation påkrævet. Figur 12 illustrerer et repræsentativt resultat af billeder og 3D-rekonstruktion opnået ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskop med et 40x luftmål (numerisk blænde 0,75).- Brug konstruktørsoftware til automatisk billedoptagelsesproces med følgende indstillinger: eksponeringstid = 50 ms, med et z-motoriseret trin for at erhverve en z-stak (1 μm Z-trin, for en samlet højde på 70 μm).
- Udfør 3D-rekonstruktion ved hjælp af billedanalysesoftware.
9. Frigivelse og indsamling af organoiderne
BEMÆRK: Det teksturerede klæbende lag af cellekulturskålen kan løsnes fra dækslet for at frigive de levende sfæroider / organoider (før fiksering) indeholdt i pyramidehulrummene til analyse af cellerne med andre procedurer såsom RNA-sekventering, -omiske tilgange, in vitro-eksperimenter og in vivo-transplantation .
- Mens prøven stadig er i petriskålen og i en biosikkerhedshætte, skal du bruge et blad som en skalpel til at skære et hjørne af det teksturerede klæbende lag.
- Med pincet skal du klemme det teksturerede klæbende lag på den afskårne kant og forsigtigt skrælle det af glasdækslet, men holde det nedsænket i mediet (nogle organoider kan forblive med klæbemiddellaget, figur 13).
- Skyl 3x med dyrkningsmedium og saml organoiderne ved pipettering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 8F viser det typiske aspekt af en cellekultur coverslip efter vellykket fabrikation. Det UV-hærdelige klæbende lag ser fladt ud og klæber godt til dækslet. Overførslen af klæbelaget på dæksedlen kan mislykkes, hvis laget på dæksedlen er overhærdet, eller hvis fjernelsen af det flade PDMS-substrat udføres forkert (som vist i figur 8G,H). I begge tilfælde er fejlen tydelig, da der ikke overføres tekstureret film til dæksedlen.
For at mikrobrøndene skal fungere, skal den teksturerede film, der produceres (som beskrevet i protokoltrin 3), have både over- og bundsiden af pyramiderne åben for at sikre, at celler under såningen i trin 7 kan komme ind i hulrummene og forblive indeholdt, når organoiderne begynder at dannes. Figur 9 viser stigningen i belægningens tykkelse ved at øge koncentrationen af den biomimetiske copolymer i belægningsopløsningen. Figur 10 viser resultaterne af afgasning af cellekulturskålene for at sikre, at der ikke fanges luft i pyramidehulrummene. Figur 10A,B viser fuldstændig afgasning, mens figur 10C,D viser luftbobler i pyramidehulrummene.
I figur 11 fanges celler inde i pyramiderne, og de tilsvarende organoider dannes efter dag 2 og 15 af dyrkning. Hvis den øverste åbning af mikrobrøndene i stedet lukkes (som følge af forkert trin 3), vil der ikke være celler tilbage efter skylning af prøven efter cellesåning. Figur 12 viser repræsentative billeder af organoiderne og en 3D-rekonstruktion opnået ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskop med et 40x luftmål (numerisk blænde 0,75). Efter frigivelse og opsamling kan organoiderne opbevares i et lille hætteglas og anvendes til yderligere analyse (f.eks. RNA-sekventering). Figur 13B viser et eksempel på en prøve af organoider indsamlet som beskrevet.
Figur 1: Poly(dimethylsiloxan)skimmel. (A) PDMS-startformen fremstillet som en støbt kopi af en 4" tekstureret wafer (se supplerende fil 1). (B) 1 cm x 1 cm bredt snit af start-PDMS-formen. (C) Scanningselektronmikroskopbilleder af de trapezformede søjler arrangeret i et firkantet array, som befolker formens overflade. Skalastænger = 1 cm (A), 100 μm og 200 μm (henholdsvis C top og bund). Forkortelse: PDMS = poly(dimethysiloxan). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fladt PDMS-substrat . (A) Et lag PDMS, ~ 1 mm tykt, fremstilles i en standard 15 cm bred petriskål. (B) Afskalning af et frisk stykke PDMS. (C) De resterende PDMS på petriskålen kan skæres i flere stykker til videre brug. (D) Flad PDMS-skæring og PDMS-form side om side; den flade PDMS er større end formen. Forkortelse: PDMS = poly(dimethysiloxan). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Placering af formen på underlaget . (A) Formen placeres på det flade substrat med pyramiderne nedad. (B) Forskelligt udseende af dårlig kontakt (øverst) og god kontakt (bund) mellem formen og PDMS-substratet. (C) Optisk mikroskopbillede af et område med dårlig kontakt; De røde cirkler fremhæver søjlerne, der ikke er i kontakt med underlaget - de ser ud til at have en lysere farve end dem, der er i kontakt i det samme billede. (D) Optisk billede af et område med alle søjler i god kontakt. Skalastænger = 200 μm (C,D). Forkortelse: PDMS = poly(dimethysiloxan). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kapillærfyldning af UV-hærdeligt klæbemiddel. (A) Denne billedsekvens viser (fra venstre mod højre) hældningen af en lille mængde klæbemiddel på den ene kant og progressionen af det flydende klæbemiddel i hulrummet mellem formen og substratet. De gule pile peger i retning af væskestrømmen. (B) Sekvens af optiske billeder (40x forstørrelse) af væskens frontbevægelse; Når den er i god kontakt, bevæger væskens forside sig rundt om pyramidernes kanter uden lækager. De gule pile peger på strømningsretningen, og de røde pile peger på forkanten af væskefronten, der bevæger sig rundt om kontaktkanterne. (C) Sekvens af optiske billeder (40x) af væskefronten, der bevæger sig, når kontakten er dårlig; De røde pile peger på forkanten af væsken, der infiltrerer mellem formen og underlaget. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fjernelse af formen efter klæbende hærdning. (A-C) Korrekt procedure til afskalning af formen: Mens der forsigtigt trykkes på overskydende klæbemiddel i venstre kanter med pincet, klemmes formen nær den samme kant og bøjes langsomt for at skrælle af. D) resultatet af den korrekte procedure overskuddet trimmes ud på tre kanter, mens et lille overskud af PDMS efterlades på fjerde side (gul pil). (E-G) Eksempel på en forkert procedure til fjernelse af formen: formen klemmes med pincet fra den modsatte kant, hvilket resulterer i afskalning fra klæbefilmens flade substrat sammen med formen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Overtræk af glasdækslet. (A,B) Eksempel på en god belægningsprocedure: glasdækslet placeres på vakuumpatronen på en spincoater, og der dispenseres nok klæbemiddel i midten, hvilket giver en homogen belægning af dæksedlen. (C,D) Eksempel på en dårlig belægningsprocedure: Der dispenseres ikke nok klæbemiddel, hvilket resulterer i uensartet belægning af dæksedlen. (E) Fra venstre mod højre, eksempler på god, acceptabel og dårlig belægning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Alternativ belægningsproces . (A) En lille dråbe flydende klæbemiddel placeres i midten af dæksedlen. (B) En anden dæksel placeres forsigtigt oven på den første. (C,D) Væsken spredte sig mellem de to dæksler og fordeles jævnt. (E) Eksempler på resultater efter korrekt adskillelse af dæksedlerne (venstre) eller forkert adskillelse (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Overførsel til dæksedlen. (A) Den hærdede og trimmede klæbefilm (figur 5D) anbringes på dæksedlen med delvist hærdet klæbemiddel. (B) Eksempel på god kontakt mellem tekstureret film og dæksedlen. Indsatsen er et optisk billede, der viser ensartet kontakt mellem områderne mellem de trapezformede hulrum (mørk ensartet farve). (C) Eksempel på dårlig kontakt mellem tekstureret film og dæksedlen. De lysere områder er ikke i kontakt, de røde pile peger på disse områder. Indsatsen er et optisk billede, der viser det forskellige udseende af god kontakt (to til venstre) og dårlig kontakt (to til højre). Skalastænger (gul, B, C) = 200 μm. (D, E) Korrekt procedure til fjernelse af PDMS fladt substrat: pincet bruges til at klemme PDMS i kanten med overskydende PDMS og bøjes for forsigtigt at skrælle af. (F) Resultatet med den UV-klæbende teksturerede film overføres med succes til dæksedlen. (G,H) Eksempel på forkert skrælningsprocedure: pincet bruges til at klemme den flade PDMS på en af kanterne, hvor det overskydende materiale blev trimmet af; således fjernes filmen sammen med den flade PDMS. Forkortelse: PDMS = poly(dimethysiloxan). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Overtræk med biomimetisk copolymer. (A) Cellekulturanordning belagt med biomimetisk copolymer under anvendelse af en opløsning på 0,5% (venstre) eller (B) 1% (højre) (w/v) i ren ethanol. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Afgasning af cellekulturanordning. A) Cellekulturanordning før fuldstændig afgasning. B) Cellekulturanordning efter fuldstændig afgasning (C, D) cellekulturanordning med kun delvis afgasning, hvor luftbobler er fanget i pyramiderne. Skalastænger = 200 μm (A-D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Repræsentative brightfield-billeder af cellesåning og vækst af organoider . (A) Celler er synlige flydende på toppen. (B) Celler fanget i pyramidehulen efter skylning af cellesuspensionen. Kun fangede celler bevares som vist. (C) Celler aggregeres til dannelse af sfæroider i hvert hulrum (dag 2 efter cellesåning). (D) Billede på dag 15 efter cellesåning af en organoid, der er vokset i et pyramidehulrum. Skalastænger = 200 μm (A B), 120 μm (C) og 150 μm (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12: 3D-billeddannelse af organoider. (A) Tre forskellige Z-planer erhvervet ved hjælp af en roterende skivekonfokal (linse 40x, luft, numerisk blænde: 0,75) af en organoid under neuroektoderm differentiering (dag 7 efter cellesåning). Actinfarvning ved hjælp af phalloidin (Alexa Fluor 647) i orange og N-cadherin immunfarvning (Alexa Fluor 561) i blå. (B) En 3D-rekonstruktion ved hjælp af billedanalysesoftware af de tilsvarende organoider (80 Z-planer, totalhøjde på 100 μm). Hvide pile: klynger af celler omkring en stribe med højt niveau af aktinekspression. Blå pile: celleklynger, der er positive for N-cadherinproteinekspression. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 13: Frigivelse af organoider. (A) Fjernelse af det teksturerede klæbende lag med pincet; B) brightfield-billede af en organoid suspension opnået efter fjernelsen. Skalabjælke = 200 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: En trin-for-trin protokol til mikrofabrikation af en Si-form med pyramidale mikrohulrum præsenteres. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåden til fremstilling af mikrobrøndkulturskålen, som tillader organoidkultur og differentiering med høj densitet, er beskrevet i dette papir. På grund af geometrien og arrangementet af mikrohulrummene kan tusindvis af sfæroider dyrkes og farves i en enkelt plade i lange perioder (flere uger eller mere) næsten uden tab af materiale. Til sammenligning kan et område på 4 mm x 2 mm på cellekulturpladen indeholde så mange sfæroider som en enkelt 384-brøndplade med et areal på 12 cm x 8 cm.
Den regelmæssige fordeling af mikrohulrummene og det flade standarddæksel, der anvendes som substrat, muliggør overvågning af tusindvis af levende eller faste organoider i 3D uden behov for kompleks og tidskrævende prøvemanipulation mellem dyrkningsbeholdere og billedunderstøtninger. På grund af pyramideformen med en mindre top end basen er der intet tab af organoider på grund af pipetteringstrin under medieudvekslingen, dispensering af ekstracellulære matricer eller farvningsprocedurer. Alle disse trin kunne udføres direkte, som for et 2D-cellemonolag uden ekstra forholdsregler, i modsætning til klassiske organoidgenereringsteknikker (f.eks. Hængende dråber, lave fastgørelsesplader, Aggrewell).
Desuden er mikrobrøndene sammenlignet med disse eksisterende teknikker designet til 3D-billeddannelse med høj opløsning, der er kompatibel med alle typer nedsænkningslinser (luft, vand, olie og silicium). Langvarig vedligeholdelse af organoider lukket til et fladt glasdæksel gør cellekulturdækslet kompatibelt med lysmikroskoper med høj opløsning, hvilket er umuligt med de eksisterende metoder uden kompleks håndtering og hurtig organoidoverførsel. Endvidere undgår en optimeret passiveringsprocedure enhver vedhæftning af celler / organoider til langvarig kultur og kontrollerer dermed differentieringen af 3D-kulturen Endelig, da det teksturerede klæbemiddellag er aftageligt, kan levende organoider hentes for at udføre andre typer eksperimenter såsom -omics-assays eller in vivo-transplantation .
Det skal bemærkes, at pyramideformen og arrayarrangementet af de mikrohulrum, der anvendes til denne protokol, stammer fra den primære form, som er fremstillet ved hjælp af siliciumvådætsning for at give overflader spejllignende finish og 45 ° hældning for at muliggøre enkeltobjektiv lysarkmikroskopi (soSPIM11). Mens en diskussion af disse krav og en fuldstændig beskrivelse af, hvordan man fremstiller sådanne forme, kan findes andetsteds12,13, gives der også en simpel protokol i supplerende fil 1. Forskellige måder at producere en primær form er tilgængelige på, som er fuldt kompatible med fremstillingen af chipsene i denne protokol. Laserætsning af glas og 3D-print med høj opløsning kan for eksempel bruges til at fremstille en primær form med passende hulrum til indeslutning af organoiderne, men er ikke egnet til soSPIM-billeddannelse.
Fabrikationsprotokollen, der er beskrevet her, kan tilpasses til brug i ethvert standard biologisk laboratorium, da der ikke kræves dedikerede, avancerede mikrofabrikationsværktøjer. Nogle kritiske trin i fremstillingen af mikrobrøndene er produktionen gennem kapillærfyldning af den teksturerede klæbefilm og dens overførsel til glassubstratet. Men efter vores erfaring kan de mestres med høj reproducerbarhed på kort tid. Afstanden mellem pyramiderne skal være så lille som muligt for at øge tætheden af hulrum til vækst af organoider, men den skal også være stor nok, så hulrummene kan forsegles på underlaget uden lækage eller manglende tætning mellem dem. Vi fandt ud af, at en afstand på 50 μm er et godt kompromis for denne sag.
Under cellesåning er et kritisk aspekt fjernelse af eventuelle luftbobler fanget inde i hulrummene for at sikre celleindgang. Vi beskriver her en valideret løsning, der kun bruger klassisk laboratorieudstyr (fx en ultralydhomogenisator eller en vakuumbeholder). For at muliggøre bedre homogenisering af antallet af celler pr. cellekulturskål anbefales det at dispensere cellesuspensionen fra siden af skålen og ikke direkte over dæksedlen. Blid manuel omrøring kan også bidrage til at homogenisere den cellulære opløsning.
Efter såning af celler kan cellekulturskålen med organoider behandles som enhver anden klassisk kulturstøtte; Der kræves ingen specifik manipulation eller kritiske trin. Alle protokoller, der er blevet brugt med mikrobrøndsenhederne, er praktisk talt de samme som dem, der bruges i skåle med lav fastgørelse, såsom U-bundplader. Derfor kræver organoidkultur i disse mikrobrønde ingen ændring i dyrkningsforholdene sammenlignet med andre standarder.
En anden kritisk faktor er, at klæbemidlet, der anvendes her, er en optisk lim. I den foreslåede bedste anvendelse (se også applikationsnoter fra leverandøren) justeres to optiske elementer, der skal limes, og UV-hærdeligt klæbemiddel påføres ved grænsefladen. En første eksponering for UV af en energi, der ikke er tilstrækkelig til at forårsage fuld polymerisation, bruges til at størkne limen, samtidig med at klæbeegenskaberne opretholdes. De optiske komponenter kan flyttes for at opnå optimal justering, og derefter hærdes limen fuldt ud til sin endelige tilstand med en anden eksponering for UV for at give permanent vedhæftning. Den første og anden eksponeringsenergidosis (dvs. eksponeringstider, hvis der anvendes en kilde med kendt og konstant energitæthed) skal optimeres afhængigt af energitætheden af den anvendte UV-kilde, tykkelsen af limlaget, transmissionen af UV gennem de optiske elementer og overfladetekstureringen (eller manglen på den) af overfladen, der skal limes.
Mens vedhæftningen mellem den teksturerede film og det klæbende belagte dæksel skal være stærk nok til at sørge for lækagesikker forsegling, skal det også være muligt at fjerne den teksturerede film for at hente organoiderne efter billeddannelse, hvis der kræves yderligere analyse, såsom genotypisk profilering. Et korrekt kompromis mellem lækagesikker forsegling og evnen til at skrælle den teksturerede film af er opnået med den her beskrevne protokol, men yderligere optimering af forhærdnings- og sluthærdningstiderne for det klæbende tynde lag på dækselen kan være påkrævet, da det afhænger af UV-eksponeringssystemet og den anvendte filmtykkelse.
En begrænsning i den nuværende microwells-version er i såningsproceduren; celler skal podes før ECM-komponenterne for at give dem mulighed for at komme ind i nærheden af pyramiden. Forbedringer er i gang for at belægge mikrobrøndene med ekstracellulære matrixkomponenter som et første skridt. Vi har endnu ikke udført nogen elektronmikroskopi (EM) på de faste organoider i hulrummene. Nogle ændringer af disse fabrikations- og cellekulturprotokoller vil være påkrævet, før billeddannelse af organoider i mikrobrøndene med EM bliver en levedygtig mulighed.
En naturlig fremtidig udvidelse af denne metode er at tilvejebringe screeningskapacitet med højt indhold for at muliggøre multicondition-test i en enkelt arbejdsgang (multiwell-plade). Denne cellekulturenhed giver et unikt alternativ til eksisterende organoidteknikker, der tilbyder uovertruffen dyrkning og billeddannelse og åbner nye perspektiver inden for organoidforskning til biomedicinsk anvendelse og lægemiddelopdagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er offentliggjort en international patentansøgning med publikationsnummer WO 2021/167535 A1.
Acknowledgments
Forskningen er støttet af CALIPSO-projektet støttet af National Research Foundation, premierministerens kontor, Singapore, under dets Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) program. V.V. anerkender støtten fra NRF-efterforsker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-frøfinansiering og ANR ADGastrulo. A.B. og G.G. anerkender støtten fra MBI's kernefinansiering. A.B. anerkender Andor Technologies for lånet af BC43-mikroskopet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
