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Biology

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64405
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3,4, 1,5
1Mechanobiology Institute (MBI), National University of Singapore, 2Biomedical Engineering Department, National University of Singapore, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4IRL 3639 CNRS, 5Department of Microbiology & Immunology, Immunology Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

Cet article présente un protocole de fabrication pour un nouveau type de substrat de culture avec des centaines de microconteneurs par mm2, dans lequel les organoïdes peuvent être cultivés et observés à l’aide de la microscopie à haute résolution. Les protocoles d’ensemencement cellulaire et d’immunomarquage sont également détaillés.

Abstract

La caractérisation d’un grand nombre de cultures organotypiques tridimensionnelles (3D) (organoïdes) à différentes échelles de résolution est actuellement limitée par les approches d’imagerie standard. Ce protocole décrit un moyen de préparer des puces de culture organoïde microfabriquées, qui permettent une imagerie 3D en direct multi-échelle sur un instrument convivial nécessitant un minimum de manipulations et capable d’atteindre un débit d’imagerie allant jusqu’à 300 organoïdes / h. Ces puces de culture sont compatibles avec les objectifs d’air et d’immersion (air, eau, huile et silicone) et une large gamme de microscopes courants (par exemple, disque rotatif, scanner de point confocale, grand champ et fond clair). De plus, ils peuvent être utilisés avec des modalités de feuille de lumière telles que la technologie de microscopie à objectif unique et à plan unique (SPIM) (soSPIM).

Le protocole décrit ici donne des étapes détaillées pour la préparation des copeaux de culture microfabriqués et la culture et la coloration des organoïdes. Il ne faut que peu de temps pour se familiariser avec et les consommables et l’équipement peuvent être facilement trouvés dans les laboratoires biologiques normaux. Ici, les capacités d’imagerie 3D ne seront démontrées qu’avec des microscopes standard commerciaux (par exemple, disque rotatif pour la reconstruction 3D et microscopie à grand champ pour la surveillance de routine).

Introduction

Dans les cultures de cellules organotypiques 3D, ci-après appelées organoïdes, les cellules souches se différencient et s’auto-organisent en structures spatiales qui partagent de fortes similitudes morphologiques et fonctionnelles avec des organes réels. Les organoïdes offrent des modèles précieux pour étudier la biologie humaine et le développement en dehors du corps 1,2,3. Un nombre croissant de modèles imitant le foie, le cerveau, les reins, les poumons et de nombreux autres organessont en cours de développement 2,4,5. La différenciation dans les organoïdes est dirigée par l’ajout de facteurs de croissance solubles et d’une matrice extracellulaire dans une séquence temporelle précise. Cependant, contrairement aux organes, le développement des organoïdes est assez hétérogène.

Au-delà des nombreux défis biologiques6,7, les cultures organoïdes posent également des défis technologiques en termes de méthodes de culture cellulaire, de caractérisation de la transcriptomique et d’imagerie. Le développement in vivo des organes se produit dans un environnement biologique qui se traduit par une auto-organisation hautement stéréotypée des arrangements cellulaires. Toute altération phénotypique peut être utilisée comme proxy pour diagnostiquer un état malade. En revanche, les organoïdes se développent in vitro dans des microenvironnements peu contrôlés compatibles avec les conditions de culture cellulaire, ce qui entraîne une grande variabilité dans la voie de développement et la formation de la forme pour chaque organoïde individuel.

Une étude récente8 a démontré que l’imagerie quantitative de la forme organoïde (descripteurs de phénotype) couplée à l’évaluation de quelques marqueurs génétiques permet de définir des paysages de développement phénotypiques. On peut soutenir que la capacité de relier la diversité de l’expression génomique chez les organoïdes à leur comportement phénotypique est une étape majeure vers la libération du plein potentiel des cultures organotypiques. Ainsi, il demande le développement d’approches d’imagerie dédiées et à haut contenu permettant la caractérisation des caractéristiques organoïdes aux échelles sous-cellulaires, multicellulaires et organoïdes entières en 3D 9,10.

Nous avons développé une plateforme polyvalente de criblage à haut contenu (HCS) permettant une culture organoïde rationalisée (à partir de cellules souches embryonnaires humaines isolées [CSEh], de cellules souches pluripotentes induites par l’homme [CSIPh] ou de cellules primaires à des organoïdes 3D, multicellulaires et différenciés) et une imagerie 3D rapide et non invasive. Il intègre un dispositif de culture cellulaire 3D miniaturisé de nouvelle génération, appelé puce JeWells (la puce ci-après), qui contient des milliers de micropuits bien disposés flanqués de miroirs à 45° qui permettent une imagerie 3D rapide et haute résolution par microscopie à feuille de lumièreà objectif unique 11. Compatible avec n’importe quel microscope inversé standard commercial, ce système permet l’imagerie de 300 organoïdes en 3D avec une résolution subcellulaire en <1 h.

La microfabrication du dispositif de culture cellulaire part d’un moule microstructuré existant, qui contient des centaines de micropyramides (Figure 1A) avec une base carrée et des parois latérales à 45° par rapport à la base. La figure 1C montre des images au microscope électronique (EM) de telles structures. Le moule lui-même est en poly(diméthylsiloxane) (PDMS) et peut être fabriqué comme une réplique moulée d’un moule primaire (non montré ici) avec les caractéristiques correspondantes (comme des cavités) en utilisant des procédures lithographiques douces standard. Le moule primaire peut être produit par différentes procédures. Celui utilisé pour ce protocole a été fabriqué à l’aide de gravure humide au silicium, comme indiqué dans Galland et al. 11; La procédure de fabrication du moule primaire n’est pas critique pour ce protocole. Les pyramides sont disposées en un réseau carré, avec le même pas pour les directions X et Y (dans ce cas, le pas est de 350 μm).

À titre d’illustration, des expériences de preuve de concept12 ont été publiées pour démontrer que la puce permet des protocoles de culture à long terme (mois) et de différenciation tout en définissant précisément le nombre de cellules initiales dans les puits. Le développement individuel d’un grand nombre d’organoïdes peut être automatiquement surveillé en direct à l’aide de microscopes à fluorescence à feuille de lumière 3D standard à fond clair. De plus, les organoïdes peuvent être récupérés pour effectuer d’autres recherches biologiques (par exemple, analyse transcriptomique). Cet article décrit les protocoles détaillés pour la fabrication des lamelles de couverture de culture cellulaire, la procédure d’ensemencement et de coloration pour la microscopie à fluorescence, ainsi que la récupération des organoïdes.

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Protocol

REMARQUE: La première partie de ce protocole détaille la microfabrication du dispositif de culture cellulaire. Un moule primaire original avec des cavités pyramidales peut être produit en interne - si des installations de micro-fabrication sont disponibles - ou sous-traité à des entreprises externes. Le moule primaire utilisé dans ce travail est produit à l’interne, avec des étapes de processus de fabrication décrites ailleurs11,13. Un protocole de base pour la microfabrication du moule est disponible dans le dossier supplémentaire 1. CRITIQUE : Les opérations des étapes 1 à 6 doivent être effectuées dans un environnement exempt de poussière. Une hotte à flux laminaire ou une salle blanche, si disponible, sont préférables. Tout au long de ces étapes, des équipements de protection individuelle (EPI) doivent être utilisés, tels que des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité.

1. Découpage en dés du moule PDMS

  1. Coupez de petites portions du moule PDMS à la dimension requise pour le dispositif final (p. ex., 1 cm x 1 cm [Figure 1B]). Coupez-les parallèlement aux directions XY du tableau.
    CRITIQUE: Lors de la découpe du moule PDMS en dés de 1 cm x 1 cm, exécutez les coupes en une seule étape; à l’aide d’une lame de rasoir unilatérale, appliquez une pression et coupez le PDMS en une seule étape. Il s’agit d’éviter la formation de petites particules de PDMS, qui peuvent se déposer à la surface du moule et affecter la qualité des étapes de réplique (étape 3).

2. Préparation de substrats PDMS plats

  1. Peser ~15-20 g de résine base PDMS et 1,5-2 g de son agent de réticulation (c.-à-d. un rapport de 10:1), mélanger soigneusement et dégazer dans un pot sous vide pendant ~20 min.
  2. Verser lentement le PDMS dégazé sur une boîte de Petri en plastique de 15 cm de large (diamètre).
  3. Durcir le PDMS en conservant la boîte de Petri dans un four réglé à 65°C pendant 2 h. Après avoir attendu la fin du durcissement, un film PDMS plat de ~1,5 mm d’épaisseur (contenu dans la boîte de Pétri) est prêt à l’emploi (Figure 2A).
  4. À l’aide d’une lame tranchante, couper des morceaux de 2 cm x 2 cm dans le PDMS (figure 2B-D).
    REMARQUE : L’épaisseur exacte de cette feuille PDMS n’est pas critique ; ~1-2 mm est une plage appropriée. La dimension de la coupe doit être plus grande que le moule texturé mais pas beaucoup plus grande, ce qui entraînerait un gaspillage de matériau.

3. Production de la couche texturée en adhésif durcissable aux UV

  1. Placez un dé de moule PDMS (tel que préparé à l’étape 1) face vers le bas sur la coupe PDMS plate (telle que préparée à l’étape 2) (Figure 3A, B).
    REMARQUE: Assurez-vous que les protubérances pyramidales dans le moule sont orientées vers le substrat PDMS plat et que seule la surface supérieure des pyramides tronquées est en contact. Évaluer l’emplacement correct à l’aide d’un microscope optique (figure 3C,D).
  2. D’un côté du moule, à l’aide d’une pipette, déposer une petite quantité (deux gouttes, environ 0,1 à 0,2 mL) d’adhésif durcissable aux UV (figure 4A).
    REMARQUE: Lorsque le liquide entre en contact avec le bord du moule, la capillarité entraînera le liquide pour remplir la cavité entre le moule lui-même et la coupe plate du PDMS utilisé comme substrat.
    1. Suivez la progression du liquide à l’intérieur de la cavité, par exemple, à l’aide d’un microscope optique inversé avec un objectif de grossissement 10x (Figure 4B,C).
  3. Exposez l’adhésif durcissable aux UV à la lumière UV pour le durcir. Ajustez le temps d’exposition en fonction de la densité de puissance de la source UV utilisée (par exemple, une boîte UV-LED avec une densité de puissance de 35 mW/cm 2;2 min à 50% de puissance dans ce protocole pour durcir complètement l’adhésif).
  4. En utilisant la quantité excessive d’adhésif sur un bord, maintenez l’adhésif durci sur le substrat plat PDMS en appuyant doucement avec un doigt (Figure 5A,B). Pendant ce temps, utilisez une pince à épiler pour pincer un coin du moule à côté du même bord maintenu et décollez-le lentement tout en vous assurant que le film texturé n’est pas soulevé aussi bien.
    REMARQUE : La figure 5C montre le résultat d’une procédure appropriée d’élimination de la moisissure; La figure 5E-G montre la mauvaise procédure.
  5. Coupez l’excès d’adhésif et l’excès de substrat PDMS à l’aide d’une lame de rasoir pour laisser la couche adhésive texturée durcie à plat sur le PDMS avec l’excès de PDMS sur un seul bord (Figure 5D), ce qui sera nécessaire à l’étape 5.

4. Préparation du substrat de la lamelle de couverture

REMARQUE: En tant que substrat pour le dispositif final, des lamelles de couverture arrondies standard de 1,5 H de 25 mm de diamètre sont utilisées. Avant de pouvoir être utilisés, ils doivent être nettoyés pour éliminer la poussière et/ou les résidus organiques de leur surface.

  1. Nettoyage des bordereaux de couverture
    1. Plonger les lames de couverture dans de l’eau savonneuse pendant 5 min pendant l’application des ultrasons (40 kHz, puissance sonore 110 W).
    2. Lavez les lamelles de couverture dans de l’eau désionisée propre (DI), d’abord par immersion et enfin avec de l’eau DI courante provenant d’un robinet. Sécher les lamelles de couverture avec une sarbacane à gaz N2 .
    3. Plonger les lamelles dans un bain d’acétone pendant 5 min; passer immédiatement à un bain 2-propanol (IPA) pendant 5 minutes supplémentaires.
    4. Rincez les lamelles de couverture avec de l’IPA propre à l’aide d’un flacon pressé. Sécher les lamelles de couvercle avec la sarbacane à gaz N2 .
      REMARQUE: Les lamelles de couverture nettoyées à l’aide de cette procédure peuvent être stockées dans un récipient fermé jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires. Conservez-les dans une armoire sèche pour éviter que l’humidité ne se dépose à leur surface.
  2. Lorsqu’il est prêt à être utilisé, traiter une lamelle de couverture propre avec un procédé plasma O 2 court pour améliorer son hydrophilie: O2 20 sccm, pression de 3 mbar, 60 W au groupe électrogène RF et durée de 60 s.
  3. Immédiatement après l’activation du plasma, procéder à l’essorage de la fine couche d’adhésif durcissable aux UV en plaçant le couvercle sur le mandrin sous vide d’un enduit standard et en versant une petite goutte d’adhésif au centre du couvercle (Figure 6). Exécutez le processus de spin-coating : étalement pendant 5 s à 500 tr/min, revêtement à 3 000 tr/min pendant 45 s (avec accélération et décélération réglées à 100 tr/min/s).
    1. Si le revêtement par centrifugation n’est pas disponible, utilisez l’autre méthode suivante pour produire un film mince d’adhésif UV sur les lamelles de couverture:
      1. Sur une lamelle de couverture propre, déposer ~0,1 mL d’adhésif durcissable aux UV à l’aide d’une pipette (Figure 7A).
      2. Prenez un deuxième bordereau de couverture et placez-le sur le premier pour que l’adhésif liquide se répartisse uniformément entre les deux lamelles de couverture (figure 7B-D).
      3. Une fois que l’adhésif d’étalement a atteint les bords des lamelles de couverture, séparez-les doucement en les faisant glisser l’un sur l’autre. Une fois séparés, les deux lamelles sont entièrement recouvertes d’une fine couche d’adhésif liquide (figure 7E).
        REMARQUE: Le revêtement peut ne pas être uniforme et lisse seulement si la séparation n’est pas effectuée avec un mouvement lisse et continu.
  4. Prédurcissement de l’adhésif durcissable aux UV
    1. Après le revêtement, prédurcir l’adhésif par exposition aux UV. Ajustez le temps d’exposition en fonction de la densité de puissance de la source UV utilisée (ici, un boîtier UV-LED d’une densité de puissance de 35 mW/cm2 a été utilisé pendant 1 min à 50% de puissance).
      CRITIQUE : L’adhésif utilisé ici est une colle optique. Voir la discussion pour les points clés liés aux doses d’énergie pour son durcissement.

5. Transfert du film texturé sur le substrat final

  1. Prenez l’un des films texturés (préparé à l’étape 3) et placez-le en contact avec le couvercle enduit d’adhésif (préparé à l’étape 4). Assurez-vous que le contact entre l’adhésif partiellement durci sur le couvercle et le film texturé est aussi uniforme que possible (Figure 8A-C).
    CRITIQUE: À ce stade, l’adhésif sur la lamelle de couverture doit être suffisamment solide pour éviter le reflux, ce qui remplirait les cavités pyramidales du film texturé lorsqu’il est mis en contact, mais serait également suffisamment plastique et adhésif pour que le contact puisse être optimisé en appuyant doucement sur le film texturé.
  2. Exposez les lamelles de couverture à la lumière UV jusqu’à ce que la couche adhésive enduite sur la lamelle de couverture soit complètement durcie. Cela scellera le film texturé sur la lamelle de couverture et fournira une isolation étanche entre les cavités pyramidales.
  3. Enfin, décollez le substrat plat PDMS (Figure 8D-F). À l’aide d’une pince à épiler, pincez le PDMS dans un coin du bord où l’excès de matière a été laissé après le rognage (étape 3.5). De cette façon, la couche de film texturée est laissée adhésive à la lamelle de couverture avec un accès ouvert en haut pour l’ensemencement cellulaire. CRITIQUE : Lors du décollement du PDMS plat, le film texturé doit rester bien attaché à la lamelle de couverture. Les défauts d’adhérence sont facilement confirmés si le film texturé peut être décollé de la lamelle de couverture après une exposition finale aux UV sans aucun effort.

6. Passivation à long terme de la fiche de couverture de culture cellulaire pour la culture cellulaire

NOTE: La passivation est obtenue en générant un revêtement conforme et continu d’un copolymère biomimétique avec une structure similaire au groupe polaire de phospholipides dans la membrane cellulaire. Ce vernis de protection empêche l’adhésion des cellules au dispositif de culture cellulaire

  1. Préparer une solution avec 0,5% (p/v) du copolymère biomimétique dissous dans de l’éthanol pur. Conservez la solution à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Placer la lamelle de protection de culture cellulaire dans une boîte de Petri de 35 mm et la recouvrir complètement de la solution de copolymère biomimétique.
  3. Après 5 min, retirer la capsule de culture cellulaire du récipient avec la solution de copolymère biomimétique et la laisser sécher à température ambiante à l’intérieur de la capsule finale dans une hotte de biosécurité (>1 h).
    NOTE: Un revêtement plus épais peut être produit en augmentant la concentration du copolymère biomimétique dans la solution de revêtement; les résultats d’un revêtement plus épais sont visibles au microscope à fond clair (figure 9A).

7. Ensemencement cellulaire

  1. Dégazage et stérilisation
    1. Juste avant l’ensemencement cellulaire, distribuer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile dans les boîtes de culture cellulaire (généralement 1 mL pour une boîte de Petri de 35 mm). Dégazez la capsule avec le PBS stérile à l’aide d’un appareil à ultrasons pendant ~10 min, suivie de plusieurs tours de pipetage pour éliminer toutes les bulles.
      CRITIQUE : Si l’air est piégé à l’intérieur des cavités pyramidales, il empêchera les cellules d’y pénétrer. Pour s’assurer qu’il n’y a pas d’air piégé dans la pyramide avant l’ensemencement cellulaire, il est recommandé de s’assurer visuellement (sous un microscope de paillasse à fond clair à un grossissement de 10x ou 20x) de l’absence d’air dans ces cavités (Figure 10).
    2. Remplacez le PBS par un milieu de culture stérile et stérilisez la plaque avec de la lumière UV pendant 30 minutes sous une hotte de culture cellulaire.
      NOTE: À partir de cette étape, le plat doit être considéré comme stérile et manipulé à l’aide de techniques stériles. Une autre façon d’éliminer l’air emprisonné du dispositif de culture cellulaire consiste à utiliser un pot à vide avec une pompe à vide.
  2. Préparation de la suspension cellulaire
    REMARQUE: Les cellules peuvent être ensemencées sous forme d’agrégats de cellules simples ou petites et entrer dans les puits d’échantillon par l’ouverture supérieure. Au fil du temps, les cellules insérées s’agrègent et se développent à l’intérieur des puits d’échantillon en sphéroïdes d’une taille supérieure à la taille de l’ouverture. Comme modèles de lignées cellulaires validés, utiliser des cellules cancéreuses HCT116 (CCL-247 ATCC) ou MCF7 (HTB-22 ATCC) maintenues dans le milieu de culture recommandé (lignes directrices ATCC).
    1. Préparer une suspension cellulaire (p. ex., en utilisant un procédé de trypsinisation suivant les lignes directrices de l’ATCC). Suivre les recommandations de trypsinisation / préparation de suspension cellulaire pour les cellules d’intérêt.
    2. Compter et ajuster la concentration cellulaire à 0,5 × 106 cellules/ml dans le milieu de culture recommandé.
  3. Distribution de cellules
    1. Retirer le tampon PBS de la boîte de culture cellulaire de 35 mm, puis distribuer 1 mL de la suspension cellulaire ajustée. Voir la figure 11A pour une image au microscope optique d’une procédure d’ensemencement cellulaire avec une densité cellulaire et une homogénéité adéquates.
    2. Replacez la capsule de culture cellulaire dans l’incubateur cellulaire (37 °C, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité) pendant 10 min. Environ 80 à 100 cellules pénètrent dans chaque cavité pyramidale.
      REMARQUE: Il est possible d’augmenter le nombre de cellules par boîte de culture cellulaire en augmentant soit la concentration cellulaire, soit le temps passé avant le retrait de la suspension cellulaire. En règle générale, la formation de sphéroïdes prend plusieurs heures (selon le type de cellule) après l’ensemencement cellulaire et peut être suivie d’un microscope à fond clair (objectifs 4x à 40x; Graphique 11). À partir de là, le milieu de culture, les matrices extracellulaires et les facteurs de croissance de différenciation peuvent être modifiés ou ajoutés à la boîte de culture cellulaire contenant les sphéroïdes conformément aux protocoles de différenciation typiques qui peuvent durer quelques jours, semaines ou mois.
    3. Après les 10 min d’incubation, récupérez la boîte de culture cellulaire de l’incubateur et aspirez doucement la suspension cellulaire pour éliminer les cellules non piégées. Ajouter 1 mL de milieu de culture à une capsule de 35 mm et la remettre dans l’incubateur cellulaire.
      CRITIQUE: À ce stade, parce que les sphéroïdes ne se sont pas encore formés, il est très important d’éviter une forte aspiration ou distribution qui entraînera la perte des cellules. Le contrôle visuel à l’aide d’un microscope à fond clair de paillasse est fortement recommandé à cette étape.

8. Immunomarquage et imagerie

  1. Fixation et coloration
    REMARQUE: Différentes procédures classiques de fixation et d’immunomarquage sont entièrement compatibles avec la boîte de culture cellulaire. Un protocole typique est décrit ici.
    1. Fixer les organoïdes/sphéroïdes dans la boîte de culture cellulaire pendant 20 min dans du paraformaldéhyde à 4% à température ambiante.
    2. Perméabiliser les organoïdes pendant 24 h dans une solution de tensioactif à 1 % dans du PBS stérile à 4 °C sur un agitateur orbital et incuber pendant 24 h dans un tampon de blocage (2 % d’albumine sérique bovine [BSA] et 1 % de tensioactif dans du PBS stérile) à 4 °C sur un agitateur orbitaire.
    3. Incuber les échantillons avec des anticorps primaires d’intérêt à une dilution comprise entre 1/50 et 1/200 (ou selon les recommandations du fabricant) dans un tampon de dilution d’anticorps (2 % de BSA et 0,2 % de tensioactif dans du PBS stérile) à 4 °C pendant 48 h.
    4. Rincer les échantillons 3x avec un tampon de lavage sur un agitateur orbital (3% de NaCl et 0,2% de tensioactif dans du PBS stérile) et incuber avec les anticorps secondaires correspondants dans un tampon de dilution d’anticorps (dilution entre 1/100 et 1/300 ou selon les recommandations du fabricant), 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), et 0,2 μg/mL Alexa Fluor 647 ou 488 Phalloïdine à 4 °C pendant 24 h sur un agitateur orbital, suivi de cinq étapes de rinçage avec PBS. En option, montez les échantillons à l’aide d’un agent de nettoyage soluble dans l’eau préchauffé à 37 °C.
  2. Imagerie
    NOTE: A ce stade, les organoïdes de la plaque de micropuits peuvent être considérés comme une boîte de culture normale contenant des échantillons fixes et colorés pour l’imagerie: toute procédure d’imagerie standard peut être utilisée sans adaptation ni modification requise. La figure 12 illustre un résultat représentatif d’images et de reconstruction 3D obtenues à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif, avec un objectif air 40x (ouverture numérique 0,75).
    1. Utilisez un logiciel constructeur pour le processus d’acquisition automatique d’images avec les paramètres suivants: temps d’exposition = 50 ms, avec un étage motorisé z pour acquérir une pile z (1 μm Z-step, pour une hauteur totale de 70 μm).
    2. Effectuez une reconstruction 3D à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

9. Libération et collecte des organoïdes

REMARQUE: La couche adhésive texturée de la boîte de culture cellulaire peut être détachée de la lamelle de couverture pour libérer les sphéroïdes / organoïdes vivants (avant la fixation) contenus à l’intérieur des cavités pyramidales pour l’analyse des cellules avec d’autres procédures telles que le séquençage de l’ARN, les approches -omiques, les expériences in vitro et la transplantation in vivo .

  1. Avec l’échantillon encore dans la boîte de Petri et dans une hotte de biosécurité, utilisez une lame telle qu’un scalpel pour couper un coin de la couche adhésive texturée.
  2. À l’aide d’une pince à épiler, pincez la couche adhésive texturée sur le bord coupé et retirez-la doucement de la couche de verre, mais maintenez-la immergée dans le milieu (certains organoïdes peuvent rester avec la couche adhésive, Figure 13).
  3. Rincer 3x avec le milieu de culture et recueillir les organoïdes par pipetage.

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Representative Results

La figure 8F montre l’aspect typique d’une feuille de couverture de culture cellulaire après une fabrication réussie. La couche adhésive durcissable aux UV semble plate et adhère bien à la lamelle de couverture. Le transfert de la couche adhésive sur la lamelle de couverture peut échouer si la couche sur la lamelle de couverture est surdurcie ou si le retrait du substrat PDMS plat est effectué de manière incorrecte (comme illustré à la figure 8G,H). Dans les deux cas, la défaillance est évidente car aucun film texturé n’est transféré sur la lame.

Pour que les micropuits fonctionnent, le film texturé produit (tel que décrit à l’étape 3 du protocole) doit avoir les côtés supérieur et inférieur des pyramides ouverts pour s’assurer que les cellules pendant l’ensemencement à l’étape 7 peuvent entrer dans les cavités et rester contenues une fois que les organoïdes commencent à se former. La figure 9 montre l’augmentation de l’épaisseur du revêtement en augmentant la concentration du copolymère biomimétique dans la solution de revêtement. La figure 10 montre les résultats du dégazage des boîtes de culture cellulaire pour s’assurer qu’aucun air n’est piégé dans les cavités pyramidales. La figure 10A,B montre le dégazage complet, tandis que la figure 10C,D montre les bulles d’air dans les cavités pyramidales.

Dans la figure 11, les cellules sont piégées à l’intérieur des pyramides, et les organoïdes correspondants sont formés après les jours 2 et 15 de culture. Si l’ouverture supérieure des micropuits est plutôt fermée (à la suite d’une étape 3 incorrecte), aucune cellule ne sera laissée après le rinçage de l’échantillon après l’ensemencement cellulaire. La figure 12 montre des images représentatives des organoïdes et une reconstruction 3D obtenue à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif avec un objectif air 40x (ouverture numérique 0,75). Après la libération et la collecte, les organoïdes peuvent être conservés dans un petit flacon et utilisés pour une analyse plus approfondie (par exemple, séquençage de l’ARN). La figure 13B montre un exemple d’échantillon d’organoïdes prélevés comme décrit.

Figure 1
Figure 1 : Moule en poly(diméthylsiloxane). (A) Le moule PDMS de départ obtenu en tant que réplique moulée d’une plaquette texturée de 4 » (voir le dossier supplémentaire 1). (B) Coupe de 1 cm x 1 cm de large du moule PDMS de départ. (C) Images au microscope électronique à balayage des piliers trapézoïdaux disposés en un réseau carré, qui peuplent la surface du moule. Barres d’échelle = 1 cm (A), 100 μm et 200 μm (C haut et bas, respectivement). Abréviation : PDMS = poly(diméthysiloxane). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Substrat plat du PDMS. (A) Une couche de PDMS, ~1 mm d’épaisseur, est préparée dans une boîte de Petri standard de 15 cm de large. (B) Décollage d’une nouvelle coupe de PDMS. (C) Le PDMS restant sur la boîte de Petri peut être coupé en plusieurs morceaux pour une utilisation ultérieure. (D) Découpe PDMS plate et moule PDMS côte à côte; le PDMS plat est plus grand que le moule. Abréviation : PDMS = poly(diméthysiloxane). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Mise en place du moule sur le substrat. (A) Le moule est placé sur le substrat plat avec les pyramides tournées vers le bas. (B) Apparence différente d’un mauvais contact (en haut) et d’un bon contact (en bas) entre le moule et le substrat PDMS. C) Image au microscope optique d’une zone où le contact est faible; Les cercles rouges mettent en évidence les piliers qui ne sont pas en contact avec le substrat - ils apparaissent d’une couleur plus vive que ceux en contact dans la même image. (D) Image optique d’une zone où tous les piliers sont en bon contact. Barres d’échelle = 200 μm (C,D). Abréviation : PDMS = poly(diméthysiloxane). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Remplissage capillaire d’un adhésif durcissable aux UV. (A) Cette séquence d’images montre (de gauche à droite) le coulée d’une petite quantité d’adhésif sur un bord et la progression de l’adhésif liquide dans la cavité entre le moule et le substrat. Les flèches jaunes pointent vers la direction de l’écoulement du liquide. B) Séquence d’images optiques (grossissement 40x) du front liquide en mouvement; Lorsqu’il est en bon contact, l’avant du liquide se déplace sur les bords des pyramides sans fuites. Les flèches jaunes pointent vers le sens d’écoulement et les flèches rouges pointent vers le bord d’attaque du front liquide se déplaçant autour des bords de contact. C) Séquence d’images optiques (40x) du front liquide se déplaçant lorsque le contact est mauvais; Les flèches rouges pointent vers le bord d’attaque du liquide infiltrant entre le moule et le substrat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Retrait du moule après durcissement de l’adhésif. (A-C) Procédure correcte pour décoller le moule: tout en appuyant doucement sur l’excès d’adhésif sur les bords gauche avec une pince à épiler, le moule est pincé près du même bord et plié lentement pour se décoller. (D) Le résultat de la procédure correcte; l’excès est coupé sur trois bords, tandis qu’un petit excès de PDMS est laissé sur le quatrième côté (flèche jaune). (E-G) Exemple d’une procédure incorrecte pour enlever le moule: le moule est pincé avec une pince à épiler du bord opposé, ce qui entraîne le décollement du substrat plat du film adhésif avec le moule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Revêtement de la lamelle de couverture en verre. (A,B) Exemple d’une bonne procédure de revêtement : le couvercle en verre est placé sur le mandrin sous vide d’un spin-coater, et suffisamment d’adhésif est distribué au centre, ce qui donne un revêtement homogène du couvercle. (C, D) Exemple d’une mauvaise procédure de revêtement : pas assez d’adhésif est distribué, ce qui entraîne un revêtement non uniforme de la lamelle de couverture. (E) De gauche à droite, exemples de bons, acceptables et mauvais revêtements. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Procédé de revêtement alternatif. (A) Une petite goutte d’adhésif liquide est placée au centre de la lamelle de couverture. (B) Un deuxième capseau est délicatement placé sur le premier. (C, D) Le liquide s’est réparti entre les deux lamelles de couverture et réparti uniformément. (E) Exemples de résultats après séparation correcte des lamelles de couverture (à gauche) ou séparation incorrecte (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Transférer sur la lame. (A) Le film adhésif durci et rogné (figure 5D) est placé sur le couvercle avec de l’adhésif partiellement durci. (B) Exemple de bon contact entre le film texturé et la lame. L’encart est une image optique montrant un contact uniforme des zones entre les cavités trapézoïdales (couleur uniforme foncée). (C) Exemple de mauvais contact entre le film texturé et la lame. Les zones les plus claires ne sont pas en contact, les flèches rouges pointent vers ces zones. L’encart est une image optique montrant l’apparence différente d’un bon contact (deux à gauche) et d’un mauvais contact (deux à droite). Barres d’échelle (jaune, B,C) = 200 μm. (D,E) Procédure correcte pour retirer le substrat plat PDMS: une pince à épiler est utilisée pour pincer le PDMS sur le bord avec un excès de PDMS et se plier pour se décoller doucement. (F) Le résultat avec le film texturé adhésif UV transféré avec succès sur la lamelle de couverture. (G,H) Exemple de procédure de pelage incorrecte : une pince à épiler est utilisée pour pincer le PDMS plat sur l’un des bords où l’excès de matière a été coupé ; ainsi, le film est retiré avec le PDMS plat. Abréviation : PDMS = poly(diméthysiloxane). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Enrobage avec copolymère biomimétique. (A) Dispositif de culture cellulaire recouvert d’un copolymère biomimétique utilisant une solution de 0,5 % (à gauche) ou (B) à 1 % (à droite) (p/v) dans de l’éthanol pur. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Dégazage du dispositif de culture cellulaire. (A) Dispositif de culture cellulaire avant dégazage complet. B) Dispositif de culture cellulaire après dégazage complet; (C,D) dispositif de culture cellulaire avec dégazage partiel où des bulles d’air sont piégées dans les pyramides. Barres d’échelle = 200 μm (A-D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : Images représentatives en fond clair de l’ensemencement cellulaire et de la croissance des organoïdes. (A) Les cellules sont visibles flottant sur le dessus. (B) Cellules piégées dans les cavités pyramidales après rinçage de la suspension cellulaire. Seules les cellules piégées seront conservées comme indiqué. (C) Les cellules s’agrègent pour former des sphéroïdes dans chaque cavité (jour 2 après l’ensemencement cellulaire). (D) Image au jour 15 après l’ensemencement cellulaire d’un organoïde qui s’est développé dans une cavité pyramidale. Barres d’échelle = 200 μm (A B), 120 μm (C) et 150 μm (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12 : Imagerie 3D des organoïdes. (A) Trois plans Z différents acquis à l’aide d’un disque rotatif confocale (lentille 40x, air, ouverture numérique : 0,75) d’un organoïde sous différenciation neuroectodermique (jour 7 après l’ensemencement cellulaire). Coloration à l’actine à l’aide de phalloïdine (Alexa Fluor 647) en orange et immunocoloration N-cadhérine (Alexa Fluor 561) en bleu. (B) Une reconstruction 3D à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images des organoïdes correspondants (plans 80 Z, hauteur totale de 100 μm). Flèches blanches: amas de cellules autour d’une traînée avec un niveau élevé d’expression d’actine. Flèches bleues : amas cellulaires positifs pour l’expression de la protéine N-cadhérine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 13
Figure 13 : Libération des organoïdes. (A) Enlèvement de la couche adhésive texturée avec une pince à épiler; (B) image en fond clair d’une suspension organoïde obtenue après le retrait. Barre d’échelle = 200 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dossier supplémentaire 1 : Un protocole étape par étape pour la microfabrication d’un moule Si avec microcavités pyramidales est présenté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La procédure de fabrication de la boîte de culture de micropuits, qui permet la culture organoïde à haute densité et la différenciation, a été décrite dans cet article. En raison de la géométrie et de la disposition des microcavités, des milliers de sphéroïdes peuvent être cultivés et colorés dans une seule plaque pendant de longues périodes (plusieurs semaines ou plus) sans perte de matière. À titre de comparaison, une zone de 4 mm x 2 mm sur la plaque de culture cellulaire peut contenir autant de sphéroïdes qu’une seule plaque de 384 puits d’une surface de 12 cm x 8 cm.

La distribution régulière des microcavités et la lame de couverture standard plate utilisée comme substrat permettent de surveiller des milliers d’organoïdes vivants ou fixes en 3D, sans nécessiter de manipulation complexe et fastidieuse des échantillons entre les récipients de culture et les supports d’imagerie. En raison de la forme pyramidale avec un sommet plus petit que la base, il n’y a pas de perte d’organoïdes due aux étapes de pipetage pendant l’échange de milieu, à la distribution de matrices extracellulaires ou aux procédures de coloration. Toutes ces étapes pourraient être effectuées directement, comme pour une monocouche cellulaire 2D sans précautions supplémentaires, contrairement aux techniques classiques de génération organoïde (par exemple, gouttelettes suspendues, plaques de fixation basses, Aggrewell).

De plus, par rapport à ces techniques existantes, les micropuits ont été conçus pour une imagerie 3D haute résolution compatible avec tous les types de lentilles d’immersion (air, eau, huile et silicium). L’entretien à long terme des organoïdes fermés à un couvercle de verre plat rend le couvercle de culture cellulaire compatible avec les microscopes optiques à haute résolution, ce qui est impossible avec les méthodes existantes sans manipulation complexe et transfert organoïde fastidieux. De plus, une procédure de passivation optimisée évite toute adhérence des cellules/organoïdes pour une culture à long terme, contrôlant ainsi la différenciation de la culture 3D Enfin, comme la couche adhésive texturée est amovible, des organoïdes vivants peuvent être récupérés pour effectuer d’autres types d’expériences telles que des dosages -omiques ou des transplantations in vivo .

Il convient de noter que la forme pyramidale et la disposition en réseau des microcavités utilisées pour ce protocole sont dérivées du moule primaire, qui a été fabriqué au moyen d’une gravure humide au silicium pour fournir des surfaces avec une finition semblable à un miroir et une inclinaison de 45° pour permettre la microscopie à feuille de lumière à objectif unique (soSPIM11). Bien qu’une discussion de ces exigences et une description complète sur la façon de produire de tels moules puissent être trouvées ailleurs12,13, un protocole simple est également donné dans le dossier supplémentaire 1. Différentes façons de produire un moule primaire sont disponibles, qui sont entièrement compatibles avec la fabrication des puces dans ce protocole. La gravure laser du verre et l’impression 3D haute résolution, par exemple, pourraient être utilisées pour produire un moule primaire avec des cavités appropriées pour le confinement des organoïdes, mais ne conviennent pas à l’imagerie soSPIM.

Le protocole de fabrication décrit ici peut être adapté pour être utilisé dans n’importe quel laboratoire biologique standard, car aucun outil de microfabrication avancé dédié n’est requis. Certaines étapes critiques de la fabrication des micropuits sont la production par remplissage capillaire du film adhésif texturé et son transfert sur le substrat de verre. Cependant, selon notre expérience, ils peuvent être maîtrisés avec une reproductibilité élevée en peu de temps. La distance entre les pyramides doit être aussi petite que possible pour augmenter la densité des cavités pour la croissance des organoïdes, mais elle doit également être suffisamment grande pour que les cavités puissent être scellées sur le substrat sans fuite ni manque d’étanchéité entre elles. Nous avons constaté qu’une distance de 50 μm est un bon compromis pour ce cas.

Pendant l’ensemencement cellulaire, un aspect critique est l’élimination de toutes les bulles d’air piégées à l’intérieur des cavités pour assurer l’entrée des cellules. Nous décrivons ici une solution validée, qui n’utilise que des équipements de laboratoire classiques (par exemple, un homogénéisateur à ultrasons ou un pot à vide). Pour permettre une meilleure homogénéisation du nombre de cellules par boîte de culture cellulaire, il est recommandé de distribuer la suspension cellulaire sur le côté de la capsule et non directement au-dessus de la lame. Une agitation manuelle douce pourrait également aider à homogénéiser la solution cellulaire.

Après l’ensemencement des cellules, la boîte de culture cellulaire avec des organoïdes peut être traitée comme n’importe quel autre support de culture classique; Aucune manipulation spécifique ou étape critique n’est requise. Tous les protocoles qui ont été utilisés avec les dispositifs de micropuits sont pratiquement les mêmes que ceux utilisés dans les antennes à faible fixation telles que les plaques à fond en U. Par conséquent, la culture organoïde dans ces micropuits ne nécessite aucun changement dans les conditions de culture par rapport à d’autres normes.

Un autre facteur critique est que l’adhésif utilisé ici est une colle optique. Dans sa meilleure utilisation suggérée (reportez-vous également aux notes d’application du fournisseur), deux éléments optiques à coller sont alignés et un adhésif durcissable aux UV est appliqué à l’interface. Une première exposition aux UV d’une énergie insuffisante pour provoquer une polymérisation complète est utilisée pour solidifier la colle tout en conservant ses propriétés adhésives. Les composants optiques peuvent être déplacés pour obtenir un alignement optimal, puis la colle est complètement durcie à son état final avec une deuxième exposition aux UV pour fournir une adhérence permanente. Les première et deuxième doses d’énergie d’exposition (c.-à-d. les temps d’exposition si une source de densité énergétique connue et constante est utilisée) doivent être optimisées en fonction de la densité énergétique de la source UV utilisée, de l’épaisseur de la couche de colle, de la transmission des UV à travers les éléments optiques et de la texturation de surface (ou de l’absence de texturation) de la surface à coller.

Bien que l’adhérence entre le film texturé et le couvercle revêtu d’adhésif doive être suffisamment forte pour permettre une étanchéité étanche, il doit également être possible de retirer le film texturé pour récupérer les organoïdes après l’imagerie, si une analyse supplémentaire est nécessaire, telle qu’un profilage génotypique. Un compromis correct entre l’étanchéité étanche et la capacité de décoller le film texturé a été obtenu avec le protocole décrit ici, mais une optimisation supplémentaire des temps de préfixation et de durcissement final de la couche mince adhésive sur la lamelle de couverture peut être nécessaire car cela dépend du système d’exposition aux UV et de l’épaisseur du film utilisé.

L’une des limites de la version actuelle des micropuits réside dans la procédure d’ensemencement; les cellules doivent être ensemencées avant les composants ECM pour leur permettre d’entrer à proximité de la pyramide. Des améliorations sont en cours pour recouvrir les micropuits de composants de matrice extracellulaire, dans un premier temps. Nous n’avons pas encore effectué de microscopie électronique (EM) sur les organoïdes fixes dans les cavités. Certaines modifications à ces protocoles de fabrication et de culture cellulaire seront nécessaires avant que l’imagerie des organoïdes dans les micropuits avec EM devienne une option viable.

Une extension future naturelle de cette méthode est de fournir des capacités de criblage à haut contenu pour permettre des tests multiconditions dans un seul flux de travail (plaque multipuits). Ce dispositif de culture cellulaire offre une alternative unique aux techniques organoïdes existantes, offrant un débit de culture et d’imagerie inégalé et ouvrant de nouvelles perspectives dans le domaine de la recherche organoïde pour l’application biomédicale et la découverte de médicaments.

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Disclosures

Une demande internationale de brevet a été publiée sous le numéro de publication WO 2021/167535 A1.

Acknowledgments

La recherche est soutenue par le projet CALIPSO soutenu par la National Research Foundation, Cabinet du Premier ministre, Singapour, dans le cadre de son programme Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. remercie l’investigateur NRF-NRFI2018-07, le MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, le financement de démarrage MBI et ANR ADGastrulo. A.B. et G.G. reconnaissent le soutien du financement de base de MBI. A.B. remercie Andor Technologies pour le prêt du microscope BC43.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Thermofisher scientific AA19397K7
Acetone Thermofisher scientific AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope Andor Technology spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin  Thermofisher scientific 37525
Buffered oxide etching solution Merck 901621-1L
CEE Spin Coater Brewer Science 200X
DAPI Thermofisher scientific 62248
Developer AZ400K Merck 18441223164
DI Milliq water Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 10082147
Glass coverslips Marienfled 117650 1.5H, round 25 mm diameter
Hepes Invitrogen 15630080
Imaris software BitPlane image analysis software
Inverted Transmission optical microscope Nikon TSF100-F
Labsonic M Sartorius Stedium Biotech Ultrasonic homogenizer
Lipidure NOF America CM5206 bio-mimetic copolymer
NOA73 Norland Products 17-345 UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070063
Phalloidin Thermofisher scientific  A12379 Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution Thermofisher scientific 10010023
Photo Resist AZ5214E Merck 14744719710
Pico Plasma tool Diener Electronic GmbH + Co. KG Pico Plasma For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52 Sunjin lab RC 152001 water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool Samco Inc. (JPN) RIE-10NR
RPMI 1640 Invitrogen 11875093 culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich 448931-10G
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284 surfactant
Trypsin EDTA Thermofisher scientific 15400054
Ultrasonic Cleaner Bransonic CPX2800
UV-KUB 2 KLOE UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner SUSS Microtec Semiconductor (DE) MJB4

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References

  1. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
  4. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  5. O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
  6. Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
  7. Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
  8. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  9. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  10. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  11. Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  12. Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
  13. Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).

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Biologie numéro 188
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Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad… More

Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad Raffi, S. B., Marchand, M., Suryana, M., Sahni, G., Viasnoff, V., Beghin, A. A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids. J. Vis. Exp. (188), e64405, doi:10.3791/64405 (2022).

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