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Biology

ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और 3 डी इमेजिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64405
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3,4, 1,5
1Mechanobiology Institute (MBI), National University of Singapore, 2Biomedical Engineering Department, National University of Singapore, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4IRL 3639 CNRS, 5Department of Microbiology & Immunology, Immunology Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

यह पेपर प्रति मिमी2 सैकड़ों माइक्रोकंटेनर्स के साथ एक नए प्रकार के कल्चर सब्सट्रेट के लिए एक निर्माण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें ऑर्गेनोइड्स को उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सुसंस्कृत और देखा जा सकता है। सेल सीडिंग और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल भी विस्तृत हैं।

Abstract

विभिन्न रिज़ॉल्यूशन स्केल पर बड़ी संख्या में त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों (ऑर्गेनोइड्स) का लक्षण वर्णन वर्तमान में मानक इमेजिंग दृष्टिकोणों द्वारा सीमित है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोफैब्रिकेटेड ऑर्गेनॉइड कल्चर चिप्स तैयार करने के एक तरीके का वर्णन करता है, जो उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरण पर मल्टीस्केल, 3 डी लाइव इमेजिंग को सक्षम करता है जिसमें न्यूनतम जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है और 300 ऑर्गेनोइड / एच इमेजिंग थ्रूपुट तक सक्षम होता है। ये संस्कृति चिप्स हवा और विसर्जन उद्देश्यों (हवा, पानी, तेल और सिलिकॉन) और सामान्य माइक्रोस्कोप की एक विस्तृत श्रृंखला (जैसे, स्पिनिंग डिस्क, पॉइंट स्कैनर कॉन्फोकल, वाइड फील्ड और ब्राइटफील्ड) दोनों के साथ संगत हैं। इसके अलावा, उनका उपयोग लाइट-शीट तौर-तरीकों जैसे एकल-उद्देश्य, एकल-विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआईएम) प्रौद्योगिकी (एसओएसपीआईएम) के साथ किया जा सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल माइक्रोफैब्रिकेटेड कल्चर चिप्स की तैयारी और ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और धुंधलापन के लिए विस्तृत कदम देता है। परिचित होने के लिए केवल थोड़े समय की आवश्यकता होती है, और उपभोग्य सामग्री और उपकरण आसानी से सामान्य बायोलैब्स में पाए जा सकते हैं। यहां, 3 डी इमेजिंग क्षमताओं को केवल वाणिज्यिक मानक माइक्रोस्कोप (उदाहरण के लिए, 3 डी पुनर्निर्माण के लिए स्पिनिंग डिस्क और नियमित निगरानी के लिए व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी) के साथ प्रदर्शित किया जाएगा।

Introduction

ऑर्गेनोटाइपिक 3 डी सेल संस्कृतियों में, इसके बाद ऑर्गेनोइड्स के रूप में जाना जाता है, स्टेम सेल स्थानिक संरचनाओं में अंतर और आत्म-व्यवस्थित होते हैं जो वास्तविक अंगों के साथ मजबूत रूपात्मक और कार्यात्मक समानताएं साझा करते हैं। ऑर्गेनोइड्स शरीर के बाहर मानव जीव विज्ञान और विकास का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान मॉडल प्रदान करते हैं 1,2,3. मॉडलों की बढ़ती संख्या विकसित की जा रही है जो यकृत, मस्तिष्क, गुर्दे, फेफड़े और कई अन्यअंगों 2,4,5 की नकल करते हैं। ऑर्गेनोइड्स में भेदभाव एक सटीक समय अनुक्रम में घुलनशील विकास कारकों और बाह्य मैट्रिक्स के अतिरिक्त निर्देशित होता है। हालांकि, अंगों के विपरीत, ऑर्गेनोइड्स का विकास काफी विषम है।

कई जैविक चुनौतियों 6,7 से परे, ऑर्गेनोइड संस्कृतियां सेल संस्कृति विधियों, ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के लक्षण वर्णन और इमेजिंग के संदर्भ में तकनीकी चुनौतियां भी पैदा करती हैं। विवो अंग विकास एक जैविक वातावरण में होता है जिसके परिणामस्वरूप सेल व्यवस्था का अत्यधिक रूढ़िवादी स्व-संगठन होता है। किसी भी फेनोटाइपिक परिवर्तन का उपयोग रोगग्रस्त स्थिति का निदान करने के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता है। इसके विपरीत, ऑर्गेनोइड्स सेल कल्चर स्थितियों के साथ संगत न्यूनतम नियंत्रित माइक्रोएन्वायरमेंट में विट्रो में विकसित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक व्यक्तिगत ऑर्गेनॉइड के लिए विकास पथ और आकार गठन में बड़ी परिवर्तनशीलता होती है।

हाल के एक अध्ययन8 से पता चला है कि कुछ आनुवंशिक मार्करों के मूल्यांकन के साथ युग्मित ऑर्गेनॉइड आकार (फेनोटाइप डिस्क्रिप्टर) की मात्रात्मक इमेजिंग फेनोटाइपिक विकास परिदृश्य की परिभाषा की अनुमति देती है। यकीनन, ऑर्गेनोइड्स में जीनोमिक अभिव्यक्ति की विविधता को उनके फेनोटाइपिक व्यवहार के साथ संबंधित करने की क्षमता ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों की पूरी क्षमता को उजागर करने की दिशा में एक बड़ा कदम है। इस प्रकार, यह समर्पित, उच्च-सामग्री इमेजिंग दृष्टिकोण के विकास के लिए भीख मांगता है जो 3 डी 9,10 में उपकोशिकीय, बहुकोशिकीय और पूरे-ऑर्गेनोइड तराजू पर ऑर्गेनोइड सुविधाओं के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है।

हमने एक बहुमुखी उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) मंच विकसित किया है जो सुव्यवस्थित ऑर्गेनोइड संस्कृति (पृथक मानव भ्रूण स्टेम सेल [एचईएससी], मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल [एचआईपीएससी], या प्राथमिक कोशिकाओं से 3 डी, बहुकोशिकीय, विभेदित ऑर्गेनोइड्स) और तेज, गैर-इनवेसिव 3 डी इमेजिंग की अनुमति देता है। यह अगली पीढ़ी के, लघु, 3 डी सेल कल्चर डिवाइस को एकीकृत करता है, जिसे जेवेल्स चिप (इसके बाद चिप ) कहा जाता है, जिसमें 45 डिग्री दर्पण के साथ हजारों अच्छी तरह से सरणी वाले माइक्रोवेल होते हैं जो एकल-उद्देश्य प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी11 द्वारा तेज, 3 डी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति देते हैं। किसी भी मानक, वाणिज्यिक, उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ संगत, यह प्रणाली <1 घंटे में उपकोशिकीय संकल्प के साथ 3 डी में 300 ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग को सक्षम बनाती है।

सेल कल्चर डिवाइस का माइक्रोफैब्रिकेशन एक मौजूदा माइक्रोस्ट्रक्चर्ड मोल्ड से शुरू होता है, जिसमें बेस के संबंध में एक वर्ग आधार और 45 डिग्री पर साइडवॉल के साथ सैकड़ों माइक्रोमाइरामिड (चित्रा 1 ए) होते हैं। चित्रा 1 सी ऐसी संरचनाओं के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) छवियों को दर्शाता है। मोल्ड स्वयं पॉली (डाइमिथाइलसिलोक्सेन) (पीडीएमएस) से बना है और मानक नरम-लिथोग्राफिक प्रक्रियाओं का उपयोग करके संबंधित विशेषताओं (गुहाओं के रूप में) के साथ एक प्राथमिक मोल्ड (यहां नहीं दिखाया गया है) की प्रतिकृति कास्ट के रूप में बनाया जा सकता है। प्राथमिक मोल्ड विभिन्न प्रक्रियाओं द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया गया सिलिकॉन गीली नक़्क़ाशी का उपयोग करके बनाया गया था जैसा कि गैलैंड एट अल में बताया गया है। 11; प्राथमिक मोल्ड के निर्माण की प्रक्रिया इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। पिरामिड को एक वर्ग सरणी में व्यवस्थित किया जाता है, जिसमें एक्स और वाई दिशाओं के लिए एक ही पिच होती है (इस मामले में पिच 350 μm है)।

एक उदाहरण के रूप में, प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रयोग12 को यह प्रदर्शित करने के लिए प्रकाशित किया गया था कि चिप कुओं में प्रारंभिक कोशिकाओं की संख्या को सटीक रूप से परिभाषित करते हुए दीर्घकालिक संस्कृति (महीनों) और भेदभाव प्रोटोकॉल की अनुमति देता है। मानक ब्राइटफील्ड और 3 डी लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड्स के व्यक्तिगत विकास की स्वचालित रूप से लाइव निगरानी की जा सकती है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड्स को आगे की जैविक जांच (जैसे, ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण) करने के लिए पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। यह पेपर सेल कल्चर कवरलिप्स के निर्माण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए सीडिंग और धुंधला प्रक्रिया के साथ-साथ ऑर्गेनोइड्स की पुनर्प्राप्ति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल का पहला भाग सेल कल्चर डिवाइस के माइक्रोफैब्रिकेशन का विवरण देता है। पिरामिड गुहाओं के साथ एक मूल प्राथमिक मोल्ड का उत्पादन घर में किया जा सकता है - यदि सूक्ष्म-निर्माण सुविधाएं उपलब्ध हैं - या बाहरी कंपनियों को आउटसोर्स की जाती हैं। इस काम में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक मोल्ड का उत्पादन इन-हाउस किया जाता है, जिसमें निर्माण प्रक्रिया चरणों को कहीं और वर्णितकिया जाता है 11,13। मोल्ड के माइक्रोफैब्रिकेशन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल पूरक फ़ाइल 1 में उपलब्ध है। महत्वपूर्ण: चरण 1 से 6 में संचालन धूल मुक्त वातावरण में आयोजित करने की आवश्यकता है। यदि उपलब्ध हो, तो एक लामिनार प्रवाह हुड या एक साफ कमरा पसंद किया जाता है। इन सभी चरणों के माध्यम से, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जैसे दस्ताने, एक लैब कोट और सुरक्षा चश्मा।

1. पीडीएमएस मोल्ड का डाइकिंग

  1. पीडीएमएस मोल्ड के छोटे हिस्सों को अंतिम डिवाइस के लिए आवश्यक आयाम में काटें (उदाहरण के लिए, 1 सेमी x 1 सेमी [चित्रा 1 बी])। उन्हें सरणी के एक्सवाई दिशाओं के समानांतर काटें।
    महत्वपूर्ण: पीडीएमएस मोल्ड को 1 सेमी x 1 सेमी सूचकांक में काटते समय, एकल चरणों में कटौती निष्पादित करें; एक तरफा रेजरब्लेड का उपयोग करके, दबाव लागू करें और एक ही चरण में पीडीएमएस के माध्यम से काट लें। यह पीडीएमएस के छोटे कणों के गठन को रोकने के लिए है, जो मोल्ड की सतह पर जमा हो सकते हैं और प्रतिकृति चरणों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं (चरण 3)।

2. फ्लैट पीडीएमएस सब्सट्रेट्स की तैयारी

  1. पीडीएमएस बेस राल के ~ 15-20 ग्राम और इसके रेटिकुलेशन एजेंट के 1.5-2 ग्राम (यानी, 10: 1 का अनुपात), उन्हें सावधानी से मिलाएं, और ~ 20 मिनट के लिए वैक्यूम जार में डेगैस करें।
  2. धीरे-धीरे डिगैस्ड पीडीएमएस को प्लास्टिक पर डालें, 15 सेमी चौड़ा (व्यास) पेट्री डिश।
  3. पेट्री डिश को 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित ओवन में रखकर पीडीएमएस का इलाज करें। इलाज पूरा होने की प्रतीक्षा करने के बाद, ~ 1.5 मिमी मोटाई (पेट्री डिश में निहित) की एक सपाट पीडीएमएस फिल्म उपयोग के लिए तैयार है (चित्रा 2 ए)।
  4. एक तेज ब्लेड का उपयोग करके, पीडीएमएस (चित्रा 2 बी-डी) से 2 सेमी x 2 सेमी टुकड़े काट लें।
    नोट: इस पीडीएमएस शीट की सटीक मोटाई महत्वपूर्ण नहीं है; ~ 1-2 मिमी एक उपयुक्त सीमा है। कट के लिए आयाम बनावट वाले मोल्ड से बड़ा होना चाहिए लेकिन बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप सामग्री बर्बाद हो जाएगी।

3. यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाला से बनी बनावट परत का उत्पादन

  1. फ्लैट पीडीएमएस कट (चरण 2 में तैयार के अनुसार) के शीर्ष पर एक पीडीएमएस मोल्ड पासा (जैसा कि चरण 1 में तैयार किया गया है) रखें (चित्रा 3 ए, बी)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि मोल्ड में पिरामिड प्रोट्रूशियंस फ्लैट पीडीएमएस सब्सट्रेट की ओर उन्मुख हैं और यह कि कटे हुए पिरामिड की केवल शीर्ष सतह संपर्क में है। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 सी, डी) के साथ सही प्लेसमेंट का आकलन करें।
  2. मोल्ड के एक तरफ, पिपेट का उपयोग करके, यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाला (चित्रा 4 ए) की एक छोटी मात्रा (दो बूंदें, लगभग 0.1-0.2 एमएल) गिराएं।
    नोट: जैसे ही तरल मोल्ड के किनारे के संपर्क में आता है, केशिका तरल को मोल्ड और सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले पीडीएमएस के फ्लैट कट के बीच गुहा को भरने के लिए प्रेरित करेगी।
    1. गुहा के अंदर तरल की प्रगति का पालन करें, उदाहरण के लिए, 10x आवर्धन उद्देश्य (चित्रा 4 बी, सी) के साथ एक उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना।
  3. इसे ठीक करने के लिए यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाले को यूवी प्रकाश में उजागर करें। उपयोग किए गए यूवी स्रोत के शक्ति घनत्व के आधार पर एक्सपोजर के समय को समायोजित करें (उदाहरण के लिए, 35 mW / cm2 के शक्ति घनत्व के साथ एक यूवी-एलईडी बॉक्स; चिपकने वाले को पूरी तरह से ठीक करने के लिए इस प्रोटोकॉल में 50% शक्ति पर 2 मिनट)।
  4. एक किनारे पर चिपकने वाले की अतिरिक्त मात्रा का उपयोग करते हुए, एक उंगली से धीरे से दबाकर फ्लैट पीडीएमएस सब्सट्रेट पर ठीक चिपकने वाले को पकड़ें (चित्रा 5 ए, बी)। इस बीच, चिमटी का उपयोग करके उसी किनारे के बगल में मोल्ड के एक कोने को दबाने के लिए दबाएं और धीरे-धीरे इसे छील दें, जबकि यह सुनिश्चित करें कि बनावट वाली फिल्म भी ऊपर न उठे।
    नोट: चित्रा 5 सी एक उचित मोल्ड हटाने की प्रक्रिया का परिणाम दिखाता है; चित्रा 5ई-जी गलत प्रक्रिया दिखाता है।
  5. अतिरिक्त चिपकने वाला और अतिरिक्त पीडीएमएस सब्सट्रेट को रेजर ब्लेड का उपयोग करके ट्रिम करें ताकि पीडीएमएस पर ठीक, बनावट, चिपकने वाली परत को केवल एक किनारे पर अतिरिक्त पीडीएमएस के साथ सपाट छोड़ दिया जा सके (चित्रा 5 डी), जिसकी चरण 5 में आवश्यकता होगी।

4. कवरस्लिप सब्सट्रेट तैयारी

नोट: अंतिम डिवाइस के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में, 25 मिमी व्यास के साथ मानक गोल 1.5 एच कवरलिप का उपयोग किया जाता है। इससे पहले कि उनका उपयोग किया जा सके, उन्हें अपनी सतह से धूल और / या कार्बनिक अवशिष्ट को हटाने के लिए साफ करने की आवश्यकता होती है।

  1. कवरस्लिप सफाई
    1. अल्ट्रासाउंड लागू होने के दौरान 5 मिनट के लिए साबुन के पानी में कवरलिप्स को डुबोएं (40 kHz, 110 W ध्वनि शक्ति)।
    2. कवरलिप्स को साफ डीआयनाइज्ड (डीआई) पानी में धोएं, पहले विसर्जन द्वारा और अंत में नल से चल रहे डीआई पानी के साथ। एन2 गैस ब्लो-गन के साथ कवरलिप्स को सुखाएं।
    3. 5 मिनट के लिए एसीटोन स्नान में कवरलिप्स को डुबोएं; अतिरिक्त 5 मिनट के लिए तुरंत 2-प्रोपेनोल (आईपीए) स्नान पर जाएं।
    4. एक निचोड़ बोतल का उपयोग करके साफ आईपीए के साथ कवरलिप्स को धोएं। एन2 गैस ब्लो-गन के साथ कवरलिप्स को सुखाएं।
      नोट: इस प्रक्रिया का उपयोग करके साफ किए गए कवरलिप्स को आवश्यकतानुसार बंद कंटेनर में संग्रहीत किया जा सकता है। उनकी सतह पर आर्द्रता जमा होने से बचने के लिए उन्हें एक शुष्क कैबिनेट में रखें।
  2. उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, इसकी हाइड्रोफिलिसिटी में सुधार करने के लिए एक छोटी ओ2 प्लाज्मा प्रक्रिया के साथ एक साफ कवरस्लिप का इलाज करें: ओ2 20 एससीसीएम, 3 एमबार दबाव, आरएफ पावर जनरेटर पर 60 डब्ल्यू, और 60 एस अवधि।
  3. प्लाज्मा सक्रियण के तुरंत बाद, एक मानक स्पिन-कोटर के वैक्यूम चक पर कवरस्लिप रखकर और कवरस्लिप के केंद्र में चिपकने वाले की एक छोटी बूंद डालकर यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाली पतली परत को स्पिन-कोटिंग के साथ आगे बढ़ें (चित्रा 6)। स्पिन-कोटिंग प्रक्रिया चलाएं: 500 आरपीएम पर 5 सेकंड के लिए फैलना, 45 सेकंड के लिए 3,000 आरपीएम पर कोटिंग (त्वरण और मंदी सेट 100 आरपीएम / सेकंड पर सेट)।
    1. यदि स्पिन-कोटिंग उपलब्ध नहीं है, तो कवरलिप्स पर यूवी चिपकने वाली एक पतली फिल्म का उत्पादन करने के लिए निम्नलिखित वैकल्पिक तरीके का उपयोग करें:
      1. एक साफ कवरस्लिप पर, पिपेट (चित्रा 7 ए) का उपयोग करके यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाला ~ 0.1 एमएल गिराएं।
      2. एक दूसरा कवरस्लिप लें और इसे पहले कवरस्लिप के शीर्ष पर रखें ताकि तरल चिपकने वाला दो कवरलिप्स (चित्रा 7 बी-डी) के बीच समान रूप से फैल सके।
      3. एक बार जब फैलने वाला चिपकने वाला आवरण के किनारों तक पहुंच जाता है, तो धीरे से उन्हें एक दूसरे पर स्लाइड करके अलग करें। एक बार अलग होने के बाद, दोनों कवरलिप पूरी तरह से तरल चिपकने वाले की एक पतली परत के साथ लेपित होते हैं (चित्रा 7 ई)।
        नोट: कोटिंग केवल तभी समान और चिकनी नहीं हो सकती है जब पृथक्करण एक चिकनी और निरंतर आंदोलन के साथ नहीं किया जाता है।
  4. यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाला का प्रीक्यूरिंग
    1. स्पिन-कोटिंग के बाद, यूवी के संपर्क में आने से चिपकने वाला प्रीक्योर करें। उपयोग किए गए यूवी स्रोत के शक्ति घनत्व के आधार पर एक्सपोज़र के समय को समायोजित करें (यहां, 35 mW / cm2 के शक्ति घनत्व के साथ एक यूवी-एलईडी बॉक्स का उपयोग 50% शक्ति पर 1 मिनट के लिए किया गया था)।
      महत्वपूर्ण: यहां इस्तेमाल किया जाने वाला चिपकने वाला एक ऑप्टिकल गोंद है। इसके इलाज के लिए ऊर्जा खुराक से संबंधित प्रमुख बिंदुओं के लिए चर्चा देखें।

5. बनावट वाली फिल्म को अंतिम सब्सट्रेट में स्थानांतरित करना

  1. बनावट वाली फिल्मों में से एक लें (चरण 3 में तैयार) और इसे चिपकने वाला-लेपित कवरस्लिप (चरण 4 में तैयार) के संपर्क में रखें। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप और बनावट वाली फिल्म पर आंशिक रूप से ठीक चिपकने वाले के बीच संपर्क जितना संभव हो उतना समान है (चित्रा 8 ए-सी)।
    महत्वपूर्ण: इस स्तर पर, कवरस्लिप पर चिपकने वाला पुन: प्रवाह से बचने के लिए पर्याप्त ठोस होना चाहिए, जो संपर्क में रखे जाने पर बनावट वाली फिल्म के पिरामिड गुहाओं को भर देगा, लेकिन प्लास्टिक और चिपकने वाला भी होगा कि संपर्क को धीरे से दबाकर अनुकूलित किया जा सकता है।
  2. कवरस्लिप को यूवी प्रकाश में उजागर करें जब तक कि कवरस्लिप पर लेपित चिपकने वाली परत पूरी तरह से ठीक न हो जाए। यह कवरस्लिप पर बनावट वाली फिल्म को सील करेगा और पिरामिड गुहाओं के बीच लीक-प्रूफ अलगाव प्रदान करेगा।
  3. अंत में, पीडीएमएस फ्लैट सब्सट्रेट (चित्रा 8 डी-एफ) को छील दें। चिमटी का उपयोग करके, पीडीएमएस को किनारे पर एक कोने पर चुटकी लें जहां ट्रिमिंग के बाद अतिरिक्त सामग्री बची थी (चरण 3.5)। इस तरह, बनावट वाली फिल्म परत को सेल सीडिंग के लिए शीर्ष पर खुली पहुंच के साथ कवरस्लिप पर चिपकने वाला छोड़ दिया जाता है। महत्वपूर्ण: फ्लैट पीडीएमएस को छीलते समय, बनावट वाली फिल्म को कवरस्लिप से अच्छी तरह से जुड़ा रहना चाहिए। आसंजन विफलताओं की आसानी से पुष्टि की जाती है यदि बनावट वाली फिल्म को बिना किसी प्रयास के यूवी के अंतिम संपर्क के बाद कवरस्लिप से छील दिया जा सकता है।

6. सेल संस्कृति की दीर्घकालिक निष्क्रियता सेल संस्कृति के लिए कवरलिप कवरस्लिप

नोट: निष्क्रिय कोशिका झिल्ली में फॉस्फोलिपिड्स के ध्रुवीय समूह के समान संरचना के साथ एक बायोमिमेटिक कॉपोलीमर की अनुरूप और निरंतर कोटिंग उत्पन्न करके प्राप्त किया जाता है। यह अनुरूप कोटिंग कोशिकाओं को सेल कल्चर डिवाइस से आसंजन से रोकती है

  1. शुद्ध इथेनॉल में घुलने वाले बायोमिमेटिक कॉपोलीमर के 0.5% (डब्ल्यू / वी) के साथ एक समाधान तैयार करें। भविष्य के उपयोग के लिए समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सेल कल्चर कवरस्लिप को 35 मिमी पेट्री डिश में रखें और इसे बायोमिमेटिक कॉपोलिमर समाधान के साथ पूरी तरह से कवर करें।
  3. 5 मिनट के बाद, बायोमिमेटिक कॉपोलीमर समाधान के साथ कंटेनर से सेल कल्चर कवरस्लिप को हटा दें और इसे बायोसेफ्टी हुड (>1 घंटे) में अंतिम डिश के अंदर कमरे के तापमान पर सूखने के लिए छोड़ दें।
    नोट: कोटिंग समाधान में बायोमिमेटिक कॉपोलीमर की एकाग्रता को बढ़ाकर एक मोटी कोटिंग का उत्पादन किया जा सकता है; एक मोटी कोटिंग के परिणाम एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप (चित्रा 9 ए) के तहत दिखाई देते हैं।

7. सेल सीडिंग

  1. डिगैसिंग और नसबंदी
    1. सेल सीडिंग से ठीक पहले, सेल कल्चर व्यंजनों में बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) वितरित करें (आमतौर पर 35 मिमी पेट्री डिश के लिए 1 एमएल)। ~ 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक डिवाइस का उपयोग करके बाँझ पीबीएस के साथ डिश को डेगास करें, इसके बाद सभी बुलबुले को हटाने के लिए पाइपिंग के कई राउंड।
      महत्वपूर्ण: यदि हवा पिरामिड गुहाओं के अंदर फंस गई है, तो यह कोशिकाओं को उनमें प्रवेश करने से रोक देगा। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेल सीडिंग से पहले पिरामिड में कोई हवा नहीं फंसी है, इन गुहाओं में हवा की अनुपस्थिति (10x या 20x आवर्धन पर बेंचटॉप ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत) नेत्रहीन रूप से सुनिश्चित करने की सिफारिश की जाती है (चित्रा 10)।
    2. पीबीएस को बाँझ संस्कृति माध्यम के साथ बदलें और सेल कल्चर हुड के तहत 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ प्लेट को निष्फल करें।
      नोट: इस चरण से, पकवान को बाँझ माना जाना चाहिए और बाँझ तकनीकों का उपयोग करके हेरफेर किया जाना चाहिए। सेल कल्चर डिवाइस से फंसी हुई हवा को हटाने का एक वैकल्पिक तरीका वैक्यूम पंप के साथ वैक्यूम जार का उपयोग करना है।
  2. सेल निलंबन की तैयारी
    नोट: कोशिकाओं को एकल या छोटे सेल समुच्चय के रूप में बीज दिया जा सकता है और शीर्ष एपर्चर के माध्यम से नमूना कुओं में प्रवेश किया जा सकता है। समय के साथ, डाली गई कोशिकाएं एकत्रित होती हैं और नमूना कुओं के अंदर एपर्चर के आकार से अधिक आकार के स्फेरॉइड में बढ़ती हैं। मान्य सेल लाइन मॉडल के रूप में, अनुशंसित संस्कृति माध्यम (एटीसीसी दिशानिर्देशों) में बनाए गए एचसीटी 116 (सीसीएल -247 एटीसीसी) या एमसीएफ 7 (एचटीबी -22 एटीसीसी) कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करें।
    1. एक सेल निलंबन तैयार करें (उदाहरण के लिए, एटीसीसी दिशानिर्देशों के बाद ट्रिप्सिनाइजेशन प्रक्रिया का उपयोग करना)। हितों की कोशिकाओं के लिए ट्रिप्सिनाइजेशन / सेल निलंबन तैयारी सिफारिशों का पालन करें।
    2. अनुशंसित संस्कृति माध्यम में सेल एकाग्रता को 0.5 × 106 कोशिकाओं / एमएल तक गणना और समायोजित करें।
  3. सेल वितरण
    1. 35 मिमी सेल कल्चर डिश से पीबीएस बफर को हटा दें और फिर समायोजित सेल निलंबन के 1 एमएल को वितरित करें। पर्याप्त सेल घनत्व और समरूपता के साथ सेल सीडिंग प्रक्रिया की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि के लिए चित्रा 11 ए देखें।
    2. सेल कल्चर डिश को 10 मिनट के लिए सेल इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 100% आर्द्रता) में वापस रखें। लगभग 80-100 कोशिकाएं प्रत्येक पिरामिड गुहा में प्रवेश करेंगी।
      नोट: सेल एकाग्रता या सेल निलंबन हटाने से पहले बिताए गए समय को बढ़ाकर प्रति सेल कल्चर डिश कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करना संभव है। आमतौर पर, सेल सीडिंग के बाद स्फेरॉइड गठन में कई घंटे (सेल प्रकार के आधार पर) लगते हैं और इसे ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप (4x से 40x उद्देश्यों) के साथ पालन किया जा सकता है; चित्र 11)। यहां से, संस्कृति माध्यम, बाह्य मैट्रिक्स, और भेदभाव विकास कारकों को विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल के अनुसार स्फेरॉइड युक्त सेल कल्चर डिश में बदला या जोड़ा जा सकता है जो कुछ दिनों, हफ्तों या महीनों तक रह सकता है।
    3. 10 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, इनक्यूबेटर से सेल कल्चर डिश को पुनर्प्राप्त करें और अनट्रैप्ड कोशिकाओं को हटाने के लिए सेलुलर निलंबन को धीरे से एस्पिरेट करें। 35 मिमी डिश में 1 एमएल कल्चर माध्यम जोड़ें और इसे सेल इनक्यूबेटर में वापस रखें।
      महत्वपूर्ण: इस स्तर पर, क्योंकि स्फेरॉइड अभी तक नहीं बने हैं, मजबूत आकांक्षा या वितरण से बचना बहुत महत्वपूर्ण है जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं का नुकसान होगा। बेंचटॉप ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दृश्य नियंत्रण इस चरण में अत्यधिक अनुशंसित है।

8. इम्यूनोस्टेनिंग और इमेजिंग

  1. निर्धारण और धुंधलापन
    नोट: निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग की विभिन्न शास्त्रीय प्रक्रियाएं सेल कल्चर डिश के साथ पूरी तरह से संगत हैं। एक विशिष्ट प्रोटोकॉल यहां वर्णित है।
    1. सेल कल्चर डिश में ऑर्गेनोइड्स / स्फेरॉइड को कमरे के तापमान पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 20 मिनट के लिए ठीक करें।
    2. ऑर्बिटल शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पीबीएस में 1% सर्फेक्टेंट घोल में 24 घंटे के लिए ऑर्गेनोइड्स को स्थिर करें और एक कक्षीय शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर (2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए] और बाँझ पीबीएस में 1% सर्फेक्टेंट) को अवरुद्ध करने में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. 1/50 और 1/200 (या निर्माता की सिफारिशों के अनुसार) के बीच कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी वाले नमूनों को एंटीबॉडी तनुकरण बफर (बाँझ पीबीएस में 2% बीएसए और 0.2% सर्फेक्टेंट) में 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. एक कक्षीय शेकर (बाँझ पीबीएस में 3% NaCl और 0.2% सर्फेक्टेंट) पर वाशिंग बफर के साथ नमूने को 3x कुल्ला करें और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर (1/100 और 1/300 के बीच कमजोर पड़ने या निर्माता की सिफारिशों के अनुसार), 0.5 μg/mL 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI), और 0.2 μg/mL एलेक्सा फ्लुअर 647 या 488 phalloidin पर 4 °C पर 4 °C पर 24 °C पर इसके बाद पीबीएस के साथ पांच कुल्ला चरण हैं। वैकल्पिक रूप से, पानी में घुलनशील क्लियरिंग एजेंट का उपयोग करके नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस तक माउंट करें।
  2. इमेजिंग
    नोट: इस स्तर पर, माइक्रोवेल प्लेट में ऑर्गेनोइड्स को इमेजिंग के लिए निश्चित और दाग वाले नमूने युक्त एक सामान्य संस्कृति डिश के रूप में माना जा सकता है: किसी भी मानक इमेजिंग प्रक्रिया का उपयोग बिना किसी अनुकूलन या संशोधन की आवश्यकता के किया जा सकता है। चित्र 12 40x वायु उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 0.75) के साथ एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त छवियों और 3 डी पुनर्निर्माण के प्रतिनिधि परिणाम को दर्शाता है।
    1. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ स्वचालित छवि अधिग्रहण प्रक्रिया के लिए कंस्ट्रक्टर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें: जेड-स्टैक प्राप्त करने के लिए जेड मोटराइज्ड स्टेज के साथ एक्सपोज़र टाइम = 50 एमएस (1 μm Z-step, 70 μm की कुल ऊंचाई के लिए)।
    2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर3 डी पुनर्निर्माण करें।

9. ऑर्गेनोइड्स की रिहाई और संग्रह

नोट: सेल कल्चर डिश की बनावट चिपकने वाली परत को अन्य प्रक्रियाओं जैसे आरएनए अनुक्रमण, -ओमिक दृष्टिकोण, इन विट्रो प्रयोगों और विवो प्रत्यारोपण के साथ कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए पिरामिड गुहाओं के अंदर निहित जीवित स्फेरॉइड / ऑर्गेनोइड्स (निर्धारण से पहले) को छोड़ने के लिए कवरस्लिप से अलग किया जा सकता है।

  1. पेट्री डिश में और जैव सुरक्षा हुड में अभी भी नमूना होने के साथ, बनावट चिपकने वाली परत के एक कोने को काटने के लिए स्केलपेल जैसे ब्लेड का उपयोग करें।
  2. चिमटी के साथ, कटे हुए किनारे पर बनावट चिपकने वाली परत को चुटकी लें और धीरे से इसे ग्लास कवरस्लिप से छील लें, लेकिन इसे माध्यम में डुबोकर रखें (कुछ ऑर्गेनोइड चिपकने वाली परत के साथ शेष रह सकते हैं, चित्रा 13)।
  3. कल्चर माध्यम के साथ 3x को धोएं और पाइप द्वारा ऑर्गेनोइड्स इकट्ठा करें।

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Representative Results

चित्रा 8 एफ सफल निर्माण के बाद सेल संस्कृति कवरस्लिप के विशिष्ट पहलू को दर्शाता है। यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाली परत सपाट दिखाई देती है और कवरस्लिप का अच्छी तरह से पालन करती है। कवरस्लिप पर चिपकने वाली परत का स्थानांतरण विफल हो सकता है यदि कवरस्लिप पर परत अधिक ठीक हो जाती है, या यदि फ्लैट पीडीएमएस सब्सट्रेट को गलत तरीके से हटाया जाता है (जैसा कि चित्रा 8 जी, एच में दिखाया गया है)। दोनों मामलों में, विफलता स्पष्ट है क्योंकि कोई बनावट वाली फिल्म कवरस्लिप में स्थानांतरित नहीं होती है।

माइक्रोवेल्स के काम करने के लिए, निर्मित बनावट वाली फिल्म (जैसा कि प्रोटोकॉल चरण 3 में वर्णित है) को पिरामिड के शीर्ष और निचले दोनों किनारों को खुला रखने की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चरण 7 में सीडिंग के दौरान कोशिकाएं गुहाओं में प्रवेश कर सकती हैं और ऑर्गेनोइडबनाना शुरू होने के बाद निहित रह सकती हैं। चित्र 9 कोटिंग समाधान में बायोमिमेटिक कॉपोलीमर की एकाग्रता को बढ़ाकर कोटिंग की मोटाई में वृद्धि को दर्शाता है। चित्र 10 सेल कल्चर व्यंजनों को डिगैसिंग के परिणामों को दर्शाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पिरामिड गुहाओं में कोई हवा नहीं फंसी है। चित्रा 10 ए, बी पूर्ण डिगैसिंग दिखाता है, जबकि चित्रा 10 सी, डी पिरामिड गुहाओं में हवा के बुलबुले दिखाता है।

चित्रा 11 में, कोशिकाएं पिरामिड के अंदर फंस जाती हैं, और संबंधित ऑर्गेनोइड्स संवर्धन के दिनों 2 और 15 के बाद बनते हैं। यदि माइक्रोवेल का शीर्ष उद्घाटन इसके बजाय बंद हो जाता है (गलत चरण 3 के परिणामस्वरूप), सेल सीडिंग के बाद नमूने को धोने के बाद कोई कोशिका नहीं बचेगी। चित्र 12 ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियों और 40x वायु उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 0.75) के साथ एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त 3 डी पुनर्निर्माण दिखाता है। रिलीज और संग्रह के बाद, ऑर्गेनोइड्स को एक छोटी शीशी में संग्रहीत किया जा सकता है और आगे के विश्लेषण (जैसे, आरएनए अनुक्रमण) के लिए उपयोग किया जा सकता है। चित्रा 13 बी वर्णित के रूप में एकत्र किए गए ऑर्गेनोइड्स के नमूने का एक उदाहरण दिखाता है।

Figure 1
चित्र 1: पॉली (डाइमिथाइलसिलोक्सेन) मोल्ड। (ए) प्रारंभिक पीडीएमएस मोल्ड 4 "बनावट वाले वेफर की एक कास्ट प्रतिकृति के रूप में प्राप्त होता है ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)। (बी) शुरुआती पीडीएमएस मोल्ड का 1 सेमी x 1 सेमी चौड़ा कट। (सी) ट्रेपोज़ॉइडल स्तंभों की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों को एक वर्ग सरणी में व्यवस्थित किया गया है, जो मोल्ड की सतह को आबाद करते हैं। स्केल सलाखों = 1 सेमी (ए), 100 μm, और 200 μm (क्रमशः C शीर्ष और नीचे)। संक्षिप्त नाम: पीडीएमएस = पॉली (डाइमिथाइलोक्सेन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) पीडीएमएस की एक परत, ~ 1 मिमी मोटी, एक मानक 15 सेमी चौड़ी पेट्री डिश में तैयार की जाती है। (बी) पीडीएमएस की एक नई कटौती से छीलना। (सी) पेट्री डिश पर शेष पीडीएमएस को आगे के उपयोग के लिए अधिक टुकड़ों में काटा जा सकता है। (डी) फ्लैट पीडीएमएस कट और पीडीएमएस साथ-साथ ढाला; फ्लैट पीडीएमएस मोल्ड से बड़ा है। संक्षिप्त नाम: पीडीएमएस = पॉली (डाइमिथाइलोक्सेन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: मोल्ड को सब्सट्रेट पर रखना। (A) मोल्ड को फ्लैट सब्सट्रेट पर रखा जाता है जिसमें पिरामिड नीचे की ओर होते हैं। (बी) मोल्ड और पीडीएमएस सब्सट्रेट के बीच खराब संपर्क (ऊपर) और अच्छे संपर्क (नीचे) की अलग-अलग उपस्थिति। (सी) खराब संपर्क वाले क्षेत्र की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि; लाल घेरे सब्सट्रेट के संपर्क में नहीं आने वाले स्तंभों को उजागर करते हैं-वे एक ही छवि में संपर्क में आने वाले लोगों की तुलना में उज्जवल रंग के दिखाई देते हैं। (डी) एक क्षेत्र की ऑप्टिकल छवि जिसमें सभी खंभे अच्छे संपर्क में हैं। स्केल सलाखों = 200 μm (C, D)। संक्षिप्त नाम: पीडीएमएस = पॉली (डाइमिथाइलोक्सेन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाला केशिका भरना। (A) छवियों का यह अनुक्रम (बाएं से दाएं) एक किनारे पर चिपकने वाले पदार्थ की एक छोटी मात्रा को डालने और मोल्ड और सब्सट्रेट के बीच गुहा में तरल चिपकने वाले की प्रगति को दर्शाता है। पीले तीर तरल प्रवाह की दिशा में इंगित करते हैं। (बी) तरल फ्रंट मूविंग के ऑप्टिकल छवियों (40 एक्स आवर्धन) का अनुक्रम; जब अच्छे संपर्क में होता है, तो तरल का सामने का हिस्सा बिना लीक के पिरामिड के किनारों के चारों ओर घूमता है। पीले तीर प्रवाह की दिशा में इंगित करते हैं और लाल तीर संपर्क किनारों के चारों ओर घूमने वाले तरल मोर्चे के अग्रणी किनारे पर इंगित करते हैं। (सी) संपर्क खराब होने पर तरल मोर्चे की ऑप्टिकल छवियों का अनुक्रम (40x); लाल तीर मोल्ड और सब्सट्रेट के बीच घुसपैठ करने वाले तरल के अग्रणी किनारे पर इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: चिपकने वाला उपचार के बाद मोल्ड को हटाना। (A-C) सांचे को छीलने की सही प्रक्रिया: चिमटी के साथ बाएं किनारों पर चिपकने वाले की अधिकता पर धीरे-धीरे दबाते समय, मोल्ड को उसी किनारे के पास पिन किया जाता है और धीरे-धीरे छीलने के लिए मोड़ा जाता है। (D) सही प्रक्रिया का परिणाम; अतिरिक्त को तीन किनारों पर छंटनी की जाती है, जबकि पीडीएमएस की एक छोटी सी अधिकता को चौथी तरफ (पीला तीर) छोड़ दिया जाता है। (ई-जी) मोल्ड को हटाने के लिए एक गलत प्रक्रिया का उदाहरण: मोल्ड को विपरीत किनारे से चिमटी के साथ पिन किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मोल्ड के साथ चिपकने वाली फिल्म के फ्लैट सब्सट्रेट से छील दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
(ए, बी) एक अच्छी कोटिंग प्रक्रिया का उदाहरण: ग्लास कवरस्लिप को स्पिन-कोटर के वैक्यूम चक पर रखा जाता है, और केंद्र में पर्याप्त चिपकने वाला पदार्थ वितरित किया जाता है, जिससे कवरस्लिप की एक सजातीय कोटिंग मिलती है। (C, D) एक खराब कोटिंग प्रक्रिया का उदाहरण: पर्याप्त चिपकने वाला नहीं निकलता है, जिसके परिणामस्वरूप कवरस्लिप की गैर-समान कोटिंग होती है। (ई) बाएं से दाएं, अच्छी, स्वीकार्य और बुरी कोटिंग के उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: वैकल्पिक कोटिंग प्रक्रिया। (A) तरल चिपकने वाले की एक छोटी बूंद को कवरस्लिप के केंद्र में रखा जाता है। (बी) एक दूसरा कवरलिप धीरे से पहले वाले के शीर्ष पर रखा जाता है। (C, D) तरल दो कवरलिप्स के बीच फैल गया और समान रूप से वितरित किया गया। (ई) कवरलिप्स (बाएं) या गलत पृथक्करण (दाएं) के सही पृथक्करण के बाद परिणामों के उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: कवरस्लिप में स्थानांतरण। (A) ठीक और छंटनी चिपकने वाली फिल्म (चित्रा 5D) को आंशिक रूप से ठीक किए गए चिपकने वाले के साथ कवरस्लिप पर रखा जाता है। (बी) बनावट फिल्म और कवरस्लिप के बीच अच्छे संपर्क का उदाहरण। इनसेट एक ऑप्टिकल छवि है जो ट्रेपोज़ॉइडल गुहाओं (गहरे समान रंग) के बीच के क्षेत्रों के समान संपर्क को दर्शाती है। (सी) बनावट फिल्म और कवरस्लिप के बीच खराब संपर्क का उदाहरण। उज्ज्वल क्षेत्र संपर्क में नहीं हैं, लाल तीर उन क्षेत्रों पर इंगित करते हैं। इनसेट एक ऑप्टिकल छवि है जो अच्छे संपर्क (बाईं ओर दो) और खराब संपर्क (दाईं ओर दो) की अलग-अलग उपस्थिति दिखाती है। स्केल सलाखों (पीला, B,C) = 200 μm. (D,E) PDMS फ्लैट सब्सट्रेट को हटाने के लिए सही प्रक्रिया: चिमटी का उपयोग PDMS की अधिकता के साथ किनारे पर चुटकी लेने के लिए किया जाता है और धीरे-धीरे छीलने के लिए झुकता है। (F) UV चिपकने वाली बनावट वाली फिल्म के परिणाम सफलतापूर्वक कवरस्लिप में स्थानांतरित हो जाते हैं। (G, H) गलत छीलने की प्रक्रिया का उदाहरण: चिमटी का उपयोग उन किनारों में से एक पर फ्लैट पीडीएमएस को चुटकी लेने के लिए किया जाता है जहां अतिरिक्त सामग्री को छंटनी की गई थी; इस प्रकार, फिल्म को फ्लैट पीडीएमएस के साथ हटा दिया जाता है। संक्षिप्त नाम: पीडीएमएस = पॉली (डाइमिथाइलोक्सेन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
(ए) शुद्ध इथेनॉल में 0.5% (बाएं) या (बी) 1% (दाएं) (डब्ल्यू / वी) के घोल का उपयोग करके बायोमिमेटिक कॉपोलिमर के साथ लेपित सेल कल्चर डिवाइस। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: सेल कल्चर डिवाइस का विघटन। (A) पूर्ण डिगैसिंग से पहले सेल कल्चर डिवाइस। (बी) पूर्ण विघटन के बाद सेल कल्चर डिवाइस; (सी, डी) सेल कल्चर डिवाइस केवल आंशिक डिगैसिंग के साथ जहां पिरामिड में हवा के बुलबुले फंस जाते हैं। स्केल सलाखों = 200 μm (A-D)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्र 11: सेल सीडिंग और ऑर्गेनोइड्स के विकास की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। (A) कोशिकाएं शीर्ष पर तैरती हुई दिखाई देती हैं। (बी) सेल निलंबन को धोने के बाद पिरामिड गुहाओं में फंसी कोशिकाएं। केवल फंसे हुए कोशिकाओं को दिखाया गया है। (सी) कोशिकाएं प्रत्येक गुहा (सेल सीडिंग के बाद दिन 2) में स्फेरॉइड बनाने के लिए एकत्रित होती हैं। (डी) पिरामिड गुहा में उगने वाले ऑर्गेनॉइड के सेल सीडिंग के बाद 15 वें दिन की छवि। स्केल सलाखों = 200 μm (A B), 120 μm (C), और 150 μm (D)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 12
(ए) न्यूरोएक्टोडर्म भेदभाव (सेल सीडिंग के बाद दिन 7) के तहत एक ऑर्गेनॉइड के स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल (लेंस 40एक्स, वायु, संख्यात्मक एपर्चर: 0.75) का उपयोग करके तीन अलग-अलग जेड योजनाएं हासिल की गईं। नारंगी रंग में फेलोइडिन (एलेक्सा फ्लोर 647) और नीले रंग में एन-कैडरिन इम्यूनोस्टेनिंग (एलेक्सा फ्लोर 561) का उपयोग करके एक्टिन धुंधला होना। (बी) संबंधित ऑर्गेनोइड्स के छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक 3 डी पुनर्निर्माण (80 जेड योजनाएं, 100 μm की कुल ऊंचाई)। सफेद तीर: एक लकीर के चारों ओर कोशिकाओं के समूह जिनमें उच्च स्तर की एक्टिन अभिव्यक्ति होती है। नीले तीर: एन-कैडरिन प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सेल क्लस्टर सकारात्मक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 13
चित्र 13: ऑर्गेनोइड्स की रिहाई। (ए) चिमटी के साथ बनावट चिपकने वाली परत को हटाना; (बी) हटाने के बाद प्राप्त ऑर्गेनॉइड निलंबन की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। स्केल बार = 200 μm (B)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: पिरामिड माइक्रोकैविटी के साथ एक एसआई मोल्ड के माइक्रोफैब्रिकेशन के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माइक्रोवेल कल्चर डिश के निर्माण की प्रक्रिया, जो उच्च घनत्व वाले ऑर्गेनोइड संस्कृति और भेदभाव की अनुमति देती है, इस पेपर में वर्णित की गई है। माइक्रोकैविटीज़ की ज्यामिति और व्यवस्था के कारण, हजारों स्फेरॉइड को लंबे समय तक (कई सप्ताह या उससे अधिक) के लिए एक ही प्लेट में सुसंस्कृत और दाग दिया जा सकता है, जिसमें सामग्री का लगभग कोई नुकसान नहीं होता है। तुलना के रूप में, सेल कल्चर प्लेट पर 4 मिमी x 2 मिमी के क्षेत्र में 12 सेमी x 8 सेमी के क्षेत्र के साथ एकल 384-वेल प्लेट के रूप में कई स्फेरॉइड हो सकते हैं।

सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोकैविटीज़ और फ्लैट मानक कवरस्लिप का नियमित वितरण 3 डी में हजारों जीवित या निश्चित ऑर्गेनोइड्स की निगरानी को सक्षम करता है, बिना संवर्धन वाहिकाओं और इमेजिंग समर्थन के बीच जटिल और समय लेने वाले नमूना हेरफेर की आवश्यकता के बिना। आधार की तुलना में छोटे शीर्ष के साथ पिरामिड आकार के कारण, मध्यम विनिमय के दौरान पाइपिंग चरणों, बाह्य मैट्रिक्स के वितरण, या धुंधला प्रक्रियाओं के कारण ऑर्गेनोइड्स का कोई नुकसान नहीं होता है। इन सभी चरणों को सीधे किया जा सकता है, बिना किसी अतिरिक्त सावधानी के 2 डी सेल मोनोलेयर के लिए, शास्त्रीय ऑर्गेनॉइड पीढ़ी तकनीकों (जैसे, लटकने वाली बूंदें, कम अनुलग्नक प्लेटें, एग्ग्रेवेल) के विपरीत।

इसके अलावा, इन मौजूदा तकनीकों की तुलना में, माइक्रोवेल को सभी प्रकार के विसर्जन लेंस (हवा, पानी, तेल और सिलिकॉन) के साथ संगत उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक फ्लैट ग्लास कवरस्लिप के लिए बंद ऑर्गेनोइड्स का दीर्घकालिक रखरखाव सेल कल्चर कवरस्लिप को उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ संगत बनाता है, जो जटिल हैंडलिंग और फास्टिड ऑर्गनॉइड ट्रांसफर के बिना मौजूदा तरीकों के साथ असंभव है। इसके अलावा, एक अनुकूलित निष्क्रिय प्रक्रिया दीर्घकालिक संस्कृति के लिए कोशिकाओं / ऑर्गेनोइड्स के किसी भी आसंजन से बचती है, इस प्रकार 3 डी संस्कृति के भेदभाव को नियंत्रित करती है, अंत में, चूंकि बनावट चिपकने वाली परत हटाने योग्य है, इसलिए जीवित ऑर्गेनोइड्स को अन्य प्रकार के प्रयोगों जैसे -ओमिक्स परख या विवो प्रत्यारोपण में करने के लिए पुनः प्राप्त किया जा सकता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोकैविटीज के पिरामिड आकार और सरणी व्यवस्था प्राथमिक मोल्ड से ली गई है, जिसे सिलिकॉन वेट-नक़्क़ाशी के माध्यम से दर्पण जैसी परिष्करण और एकल-उद्देश्य प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी (एसओएसपीआईएम11) की अनुमति देने के लिए 45 ° झुकाव के साथ सतहों को प्रदान करने के लिए बनाया गया है। जबकि इन आवश्यकताओं की चर्चा और इस तरह के मोल्डों का उत्पादन करने के तरीके पर एक पूर्ण विवरणकहीं और पाया जा सकता है 12,13, पूरक फ़ाइल 1 में एक सरल प्रोटोकॉल भी दिया गया है। एक प्राथमिक मोल्ड के उत्पादन के विभिन्न तरीके उपलब्ध हैं, जो इस प्रोटोकॉल में चिप्स के निर्माण के साथ पूरी तरह से संगत हैं। ग्लास की लेजर नक़्क़ाशी और उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी प्रिंटिंग, उदाहरण के लिए, ऑर्गेनोइड्स के नियंत्रण के लिए उपयुक्त गुहाओं के साथ एक प्राथमिक मोल्ड का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एसओएसपीआईएम इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

यहां प्रकट किए गए निर्माण प्रोटोकॉल को किसी भी मानक जैविक प्रयोगशाला में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, क्योंकि कोई समर्पित, उन्नत माइक्रोफैब्रिकेशन टूल की आवश्यकता नहीं है। माइक्रोवेल के निर्माण के कुछ महत्वपूर्ण चरण बनावट चिपकने वाली फिल्म के केशिका भरने और ग्लास सब्सट्रेट में इसके हस्तांतरण के माध्यम से उत्पादन हैं। हालांकि, हमारे अनुभव में, उन्हें कम समय में उच्च प्रजनन क्षमता के साथ महारत हासिल की जा सकती है। ऑर्गेनोइड्स के विकास के लिए गुहाओं के घनत्व को बढ़ाने के लिए पिरामिड के बीच की दूरी जितनी संभव हो उतनी छोटी होनी चाहिए, लेकिन इसे पर्याप्त रूप से बड़ा होने की भी आवश्यकता है ताकि गुहाओं को किसी भी रिसाव या उनके बीच सीलिंग की कमी के बिना सब्सट्रेट पर सील किया जा सके। हमने पाया कि 50 μm की दूरी इस मामले के लिए एक अच्छा समझौता है।

सेल सीडिंग के दौरान, एक महत्वपूर्ण पहलू सेल प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए गुहाओं के अंदर फंसे किसी भी हवा के बुलबुले को हटाना है। हम यहां एक मान्य समाधान का वर्णन करते हैं, जो केवल शास्त्रीय प्रयोगशाला उपकरण (जैसे, एक अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र या वैक्यूम जार) का उपयोग करता है। प्रति सेल कल्चर डिश कोशिकाओं की संख्या के बेहतर समरूपीकरण की अनुमति देने के लिए, डिश के किनारे से सेल निलंबन को वितरित करने की सिफारिश की जाती है और सीधे कवरस्लिप के ऊपर नहीं। कोमल मैनुअल आंदोलन सेलुलर समाधान को समरूप बनाने में भी मदद कर सकता है।

कोशिकाओं के सीडिंग के बाद, ऑर्गेनोइड्स के साथ सेल कल्चर डिश को किसी भी अन्य शास्त्रीय संस्कृति समर्थन की तरह माना जा सकता है; कोई विशिष्ट हेरफेर या महत्वपूर्ण कदमों की आवश्यकता नहीं है। माइक्रोवेल उपकरणों के साथ उपयोग किए जाने वाले सभी प्रोटोकॉल व्यावहारिक रूप से यू-बॉटम प्लेटों जैसे कम-अनुलग्नक व्यंजनों में उपयोग किए जाने वाले समान हैं। इसलिए, इन माइक्रोवेल में ऑर्गेनॉइड संस्कृति को अन्य मानकों की तुलना में संस्कृति स्थितियों में किसी भी बदलाव की आवश्यकता नहीं है।

एक और महत्वपूर्ण कारक यह है कि यहां इस्तेमाल किया जाने वाला चिपकने वाला एक ऑप्टिकल गोंद है। इसके सुझाए गए सर्वोत्तम उपयोग में (विक्रेता से एप्लिकेशन नोट्स को भी संदर्भित करें), चिपके हुए दो ऑप्टिकल तत्वों को संरेखित किया जाता है और इंटरफ़ेस पर यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाला लागू होता है। पूर्ण पोलीमराइजेशन का कारण बनने के लिए अपर्याप्त ऊर्जा के यूवी के पहले संपर्क का उपयोग चिपकने वाले गुणों को बनाए रखते हुए गोंद को ठोस बनाने के लिए किया जाता है। ऑप्टिकल घटकों को इष्टतम संरेखण प्राप्त करने के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है, और फिर गोंद को स्थायी आसंजन प्रदान करने के लिए यूवी के दूसरे संपर्क के साथ अपनी अंतिम स्थिति में पूरी तरह से ठीक किया जाता है। पहली और दूसरी एक्सपोज़र ऊर्जा खुराक (यानी, यदि ज्ञात और निरंतर ऊर्जा घनत्व के स्रोत का उपयोग किया जाता है) का उपयोग किए गए यूवी स्रोत के ऊर्जा घनत्व, गोंद की परत की मोटाई, ऑप्टिकल तत्वों के माध्यम से यूवी के संचरण और सतह की सतह टेक्सचरिंग (या इसकी कमी) के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।

जबकि बनावट वाली फिल्म और चिपकने वाला-लेपित कवरस्लिप के बीच आसंजन को लीक-प्रूफ सीलिंग प्रदान करने के लिए पर्याप्त मजबूत होना आवश्यक है, इमेजिंग के बाद ऑर्गेनोइड्स को पुनः प्राप्त करने के लिए बनावट वाली फिल्म को हटाना भी संभव होना चाहिए, अगर किसी और विश्लेषण की आवश्यकता है, जैसे जीनोटाइपिक प्रोफाइलिंग। लीक-प्रूफ सीलिंग और बनावट वाली फिल्म को छीलने की क्षमता के बीच एक सही समझौता यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ हासिल किया गया है, लेकिन कवरस्लिप पर चिपकने वाली पतली परत के लिए प्रीक्यूरिंग और अंतिम इलाज समय के आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि यह यूवी-एक्सपोज़र सिस्टम और उपयोग की जाने वाली फिल्म मोटाई पर निर्भर करता है।

वर्तमान माइक्रोवेल्स संस्करण में एक सीमा सीडिंग प्रक्रिया में है; कोशिकाओं को ईसीएम घटकों से पहले बीज दिया जाना चाहिए ताकि उन्हें पिरामिड के आसपास के क्षेत्र में प्रवेश करने की अनुमति मिल सके। पहले चरण के रूप में, बाह्य मैट्रिक्स घटकों के साथ माइक्रोवेल को कोट करने के लिए सुधार चल रहे हैं। हमने अभी तक गुहाओं के भीतर निश्चित ऑर्गेनोइड्स पर कोई इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) नहीं किया है। ईएम के साथ माइक्रोवेल में ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग एक व्यवहार्य विकल्प बनने से पहले इन निर्माण और सेल कल्चर प्रोटोकॉल में कुछ संशोधन की आवश्यकता होगी।

इस पद्धति का एक प्राकृतिक भविष्य विस्तार एकल वर्कफ़्लो (मल्टीवेल प्लेट) में मल्टीकंडीशन परीक्षण की अनुमति देने के लिए उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग क्षमता प्रदान करना है। यह सेल कल्चर डिवाइस मौजूदा ऑर्गेनोइड तकनीकों के लिए एक अनूठा विकल्प प्रदान करता है, जो नायाब संवर्धन और इमेजिंग थ्रूपुट की पेशकश करता है और बायोमेडिकल अनुप्रयोग और दवा की खोज के लिए ऑर्गेनोइड अनुसंधान के क्षेत्र में नए दृष्टिकोण खोलता है।

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Disclosures

प्रकाशन संख्या डब्ल्यूओ 2021/167535 ए 1 के साथ एक अंतरराष्ट्रीय पेटेंट आवेदन प्रकाशित किया गया है।

Acknowledgments

अनुसंधान को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, प्रधान मंत्री कार्यालय, सिंगापुर द्वारा समर्थित कैलिप्सो परियोजना द्वारा समर्थित किया गया है, जो अपने कैंपस फॉर रिसर्च एक्सीलेंस एंड टेक्नोलॉजिकल एंटरप्राइज (क्रिएट) कार्यक्रम के तहत है। वी.वी. एनआरएफ अन्वेषक एनआरएफ-एनआरएफआई 2018-07, एमओई टियर 3 एमओई 2016-टी 3-1-005, एमबीआई बीज वित्तपोषण और एएनआर एडीजीस्ट्रुलो के समर्थन को स्वीकार करता है। एबी और जीजी एमबीआई कोर फंडिंग से समर्थन स्वीकार करते हैं। एबी बीसी 43 माइक्रोस्कोप के ऋण के लिए एंडोर टेक्नोलॉजीज को स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Thermofisher scientific AA19397K7
Acetone Thermofisher scientific AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope Andor Technology spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin  Thermofisher scientific 37525
Buffered oxide etching solution Merck 901621-1L
CEE Spin Coater Brewer Science 200X
DAPI Thermofisher scientific 62248
Developer AZ400K Merck 18441223164
DI Milliq water Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 10082147
Glass coverslips Marienfled 117650 1.5H, round 25 mm diameter
Hepes Invitrogen 15630080
Imaris software BitPlane image analysis software
Inverted Transmission optical microscope Nikon TSF100-F
Labsonic M Sartorius Stedium Biotech Ultrasonic homogenizer
Lipidure NOF America CM5206 bio-mimetic copolymer
NOA73 Norland Products 17-345 UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070063
Phalloidin Thermofisher scientific  A12379 Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution Thermofisher scientific 10010023
Photo Resist AZ5214E Merck 14744719710
Pico Plasma tool Diener Electronic GmbH + Co. KG Pico Plasma For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52 Sunjin lab RC 152001 water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool Samco Inc. (JPN) RIE-10NR
RPMI 1640 Invitrogen 11875093 culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich 448931-10G
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284 surfactant
Trypsin EDTA Thermofisher scientific 15400054
Ultrasonic Cleaner Bransonic CPX2800
UV-KUB 2 KLOE UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner SUSS Microtec Semiconductor (DE) MJB4

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References

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  13. Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).

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जीव विज्ञान अंक 188
ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और 3 डी इमेजिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म
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Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad Raffi, S. B., Marchand, M., Suryana, M., Sahni, G., Viasnoff, V., Beghin, A. A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids. J. Vis. Exp. (188), e64405, doi:10.3791/64405 (2022).

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