Summary
Questo documento presenta un protocollo di fabbricazione per un nuovo tipo di substrato di coltura con centinaia di microcontenitori per mm2, in cui gli organoidi possono essere coltivati e osservati utilizzando la microscopia ad alta risoluzione. Anche i protocolli di semina cellulare e immunocolorazione sono dettagliati.
Abstract
La caratterizzazione di un gran numero di colture organotipiche tridimensionali (3D) (organoidi) a diverse scale di risoluzione è attualmente limitata da approcci di imaging standard. Questo protocollo descrive un modo per preparare chip di coltura organoidi microfabbricati, che consentono l'imaging live 3D multiscala su uno strumento intuitivo che richiede manipolazioni minime e in grado di produrre fino a 300 organoidi / h. Questi chip di coltura sono compatibili con obiettivi sia ad aria che ad immersione (aria, acqua, olio e silicone) e con una vasta gamma di microscopi comuni (ad esempio, disco rotante, scanner puntiforme confocale, campo largo e campo chiaro). Inoltre, possono essere utilizzati con modalità light-sheet come la tecnologia di microscopia a luce singola (SPIM) a obiettivo singolo (soSPIM).
Il protocollo qui descritto fornisce passaggi dettagliati per la preparazione dei trucioli di coltura microfabbricati e la coltura e la colorazione degli organoidi. È necessario solo un breve periodo di tempo per familiarizzare e materiali di consumo e attrezzature possono essere facilmente trovati nei normali laboratori biologici. Qui, le capacità di imaging 3D saranno dimostrate solo con microscopi standard commerciali (ad esempio, disco rotante per la ricostruzione 3D e microscopia a campo largo per il monitoraggio di routine).
Introduction
Nelle colture cellulari 3D organotipiche, di seguito denominate organoidi, le cellule staminali si differenziano e si auto-organizzano in strutture spaziali che condividono forti somiglianze morfologiche e funzionali con organi reali. Gli organoidi offrono modelli preziosi per studiare la biologia umana e lo sviluppo al di fuori del corpo 1,2,3. Un numero crescente di modelli sono in fase di sviluppo che imitano il fegato, il cervello, i reni, i polmoni e molti altri organi 2,4,5. La differenziazione negli organoidi è diretta dall'aggiunta di fattori di crescita solubili e di una matrice extracellulare in una precisa sequenza temporale. Tuttavia, in netto contrasto con gli organi, lo sviluppo degli organoidi è piuttosto eterogeneo.
Oltre alle numerose sfide biologiche6,7, le colture organoidi pongono anche sfide tecnologiche in termini di metodi di coltura cellulare, caratterizzazione della trascrittomica e imaging. Lo sviluppo degli organi in vivo avviene in un ambiente biologico che si traduce in un'auto-organizzazione altamente stereotipata delle disposizioni cellulari. Qualsiasi alterazione fenotipica può essere utilizzata come proxy per diagnosticare uno stato patologico. Al contrario, gli organoidi si sviluppano in vitro in microambienti minimamente controllati compatibili con le condizioni di coltura cellulare, con conseguente grande variabilità nel percorso di sviluppo e nella formazione della forma per ogni singolo organoide.
Un recente studio8 ha dimostrato che l'imaging quantitativo della forma organoide (descrittori fenotipici) accoppiato alla valutazione di alcuni marcatori genetici consente la definizione di paesaggi di sviluppo fenotipici. Probabilmente, la capacità di mettere in relazione la diversità dell'espressione genomica negli organoidi con il loro comportamento fenotipico è un passo importante verso lo sfruttamento del pieno potenziale delle colture organotipiche. Pertanto, richiede lo sviluppo di approcci di imaging dedicati e ad alto contenuto che consentano la caratterizzazione delle caratteristiche organoidi su scale subcellulari, multicellulari e organoidi intere in 3D 9,10.
Abbiamo sviluppato una versatile piattaforma di screening ad alto contenuto (HCS) che consente una coltura organoide semplificata (da cellule staminali embrionali umane isolate [hESC], cellule staminali pluripotenti indotte umane [hIPSC] o cellule primarie a organoidi differenziati 3D, multicellulari) e imaging 3D rapido e non invasivo. Integra un dispositivo di coltura cellulare 3D miniaturizzato di nuova generazione, chiamato chip JeWells (il chip di seguito), che contiene migliaia di micropozzetti ben disposti affiancati da specchi a 45 ° che consentono immagini rapide, 3D e ad alta risoluzione mediante microscopia a foglio di luce a singolo obiettivo11. Compatibile con qualsiasi microscopio invertito standard, commerciale, questo sistema consente l'imaging di 300 organoidi in 3D con risoluzione subcellulare in <1 h.
La microfabbricazione del dispositivo di coltura cellulare parte da uno stampo micro strutturato esistente, che contiene centinaia di micropiramidi (Figura 1A) con base quadrata e pareti laterali a 45° rispetto alla base. La figura 1C mostra le immagini al microscopio elettronico (EM) di tali strutture. Lo stampo stesso è realizzato in poli(dimetilsilossano) (PDMS) e può essere realizzato come un calco replica di uno stampo primario (non mostrato qui) con caratteristiche corrispondenti (come cavità) utilizzando procedure litografiche molli standard. Lo stampo primario può essere prodotto con diverse procedure. Quello utilizzato per questo protocollo è stato realizzato utilizzando l'incisione a umido al silicio come riportato in Galland et al. 11; La procedura per la fabbricazione dello stampo primario non è critica per questo protocollo. Le piramidi sono disposte in una matrice quadrata, con lo stesso passo per le direzioni X e Y (in questo caso il passo è di 350 μm).
A titolo illustrativo, sono stati pubblicati12 esperimenti proof-of-concept per dimostrare che il chip consente una coltura a lungo termine (mesi) e protocolli di differenziazione, definendo con precisione il numero di cellule iniziali nei pozzi. Lo sviluppo individuale di un gran numero di organoidi può essere monitorato automaticamente in tempo reale utilizzando microscopi a fluorescenza standard a campo chiaro e 3D a foglio di luce. Inoltre, gli organoidi possono essere recuperati per eseguire ulteriori indagini biologiche (ad esempio, analisi trascrittomica). Questo documento delinea i protocolli dettagliati per la fabbricazione dei vetrini di copertura della coltura cellulare, la procedura di semina e colorazione per la microscopia a fluorescenza, nonché il recupero degli organoidi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: La prima parte di questo protocollo descrive in dettaglio la microfabbricazione del dispositivo di coltura cellulare. Uno stampo primario originale con cavità piramidali può essere prodotto internamente - se sono disponibili strutture di micro-fabbricazione - o esternalizzato a società esterne. Lo stampo primario utilizzato in questo lavoro è prodotto internamente, con fasi del processo di fabbricazione descritte altrove11,13. Un protocollo di base per la microfabbricazione dello stampo è disponibile nel file supplementare 1. CRITICO: Le operazioni nelle fasi da 1 a 6 devono essere condotte in un ambiente privo di polvere. Una cappa a flusso laminare o una camera bianca, se disponibile, sono preferibili. In tutti questi passaggi, è necessario utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI), come guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
1. Dadini di muffa PDMS
- Tagliare piccole porzioni dello stampo PDMS fino alla dimensione richiesta per il dispositivo finale (ad esempio, 1 cm x 1 cm [Figura 1B]). Tagliarli parallelamente alle direzioni XY dell'array.
CRITICO: Quando si taglia lo stampo PDMS in dadi da 1 cm x 1 cm, eseguire i tagli in singoli passaggi; utilizzando una lama di rasoio unilaterale, applicare pressione e tagliare il PDMS in un unico passaggio. Questo per prevenire la formazione di piccole particelle di PDMS, che possono depositarsi sulla superficie dello stampo e influire sulla qualità delle fasi di replica (fase 3).
2. Preparazione di substrati PDMS piatti
- Pesare ~ 15-20 g di resina base PDMS e 1,5-2 g del suo agente reticolante (cioè un rapporto di 10: 1), mescolarli accuratamente e degassare in un barattolo sottovuoto per ~ 20 minuti.
- Versare lentamente il PDMS degassato su una capsula di Petri di plastica larga 15 cm (diametro).
- Polimerizzare il PDMS mantenendo la piastra di Petri in forno impostato a 65°C per 2 ore. Dopo aver atteso il completamento della polimerizzazione, un film PDMS piatto di ~ 1,5 mm di spessore (contenuto nella capsula di Petri) è pronto per l'uso (Figura 2A).
- Utilizzando una lama affilata, tagliare pezzi di 2 cm x 2 cm dal PDMS (Figura 2B-D).
NOTA: lo spessore esatto di questo foglio PDMS non è critico; ~ 1-2 mm è un intervallo adatto. La dimensione per il taglio dovrebbe essere maggiore dello stampo strutturato ma non molto più grande, il che comporterebbe uno spreco di materiale.
3. Produzione dello strato testurizzato in adesivo polimerizzabile UV
- Posizionare un dado di stampo PDMS (come preparato al punto 1) a faccia in giù sopra il taglio PDMS piatto (come preparato al punto 2) (Figura 3A,B).
NOTA: assicurarsi che le sporgenze piramidali nello stampo siano orientate verso il substrato PDMS piatto e che solo la superficie superiore delle piramidi troncate sia in contatto. Valutare il posizionamento corretto con un microscopio ottico (Figura 3C,D). - Su un lato dello stampo, usando una pipetta, far cadere una piccola quantità (due gocce, circa 0,1-0,2 ml) di adesivo polimerizzabile UV (Figura 4A).
NOTA: Quando il liquido entra in contatto con il bordo dello stampo, la capillarità guiderà il liquido a riempire la cavità tra lo stampo stesso e il taglio piatto di PDMS utilizzato come substrato.- Seguire la progressione del liquido all'interno della cavità, ad esempio, utilizzando un microscopio ottico invertito con un obiettivo di ingrandimento 10x (Figura 4B,C).
- Esporre l'adesivo polimerizzabile UV alla luce UV per polimerizzarlo. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV utilizzata (ad esempio, una scatola UV-LED con una densità di potenza di 35 mW / cm 2;2 min al 50% di potenza in questo protocollo per polimerizzare completamente l'adesivo).
- Utilizzando la quantità eccessiva di adesivo su un bordo, tenere l'adesivo polimerizzato sul substrato PDMS piatto premendo delicatamente con un dito (Figura 5A,B). Nel frattempo, utilizzare una pinzetta per pizzicare un angolo dello stampo vicino allo stesso bordo tenuto premuto e staccarlo lentamente assicurandosi che anche il film strutturato non venga sollevato.
NOTA: La Figura 5C mostra il risultato di una corretta procedura di rimozione dello stampo; La figura 5E-G mostra la procedura errata. - Tagliare l'adesivo in eccesso e il substrato PDMS in eccesso utilizzando una lametta per lasciare lo strato adesivo polimerizzato e testurizzato piatto sul PDMS con PDMS in eccesso su un solo bordo (Figura 5D), che sarà necessario nel passaggio 5.
4. Preparazione del substrato di copertura
NOTA: Come substrato per il dispositivo finale, vengono utilizzati coprivetrini standard arrotondati 1,5H con diametro di 25 mm. Prima di poter essere utilizzati, devono essere puliti per rimuovere polvere e / o residui organici dalla loro superficie.
- Pulizia del coprislip
- Immergere i coperchi in acqua saponata per 5 minuti durante l'applicazione degli ultrasuoni (40 kHz, 110 W di potenza sonica).
- Lavare i vetrini di copertura in acqua deionizzata pulita (DI), prima per immersione e infine con acqua corrente DI da un rubinetto. Asciugare i coperchi con una pistola a gas N2 .
- Immergere le copertine in un bagno di acetone per 5 minuti; passare immediatamente a un bagno di 2-propanolo (IPA) per altri 5 minuti.
- Risciacquare i coprivetrini con alcool isopropilico pulito usando un flacone da spremere. Asciugare i coperchi con la pistola a gas N2 .
NOTA: I coprivetrini puliti con questa procedura possono essere conservati in un contenitore chiuso fino al momento del bisogno. Conservali in un armadio asciutto per evitare che l'umidità si depositi sulla loro superficie.
- Quando è pronto per essere utilizzato, trattare un coprislip pulito con un breve processo al plasma O 2 per migliorarne l'idrofilia: O2 20 sccm, pressione 3 mbar, 60 W al generatore di corrente RF e durata 60 s.
- Subito dopo l'attivazione del plasma, procedere con lo spin-coating del sottile strato di adesivo polimerizzabile ai raggi UV posizionando il coprislip sul mandrino sottovuoto di uno spin-coater standard e versando una piccola goccia di adesivo al centro del vetrino (Figura 6). Eseguire il processo di spin-coating: stesura per 5 s a 500 giri/min, rivestimento a 3.000 giri/min per 45 s (con accelerazione e decelerazione impostate a 100 giri/min).
- Se lo spin-coating non è disponibile, utilizzare il seguente modo alternativo per produrre un film sottile di adesivo UV sui vetrini:
- Su un vetrino pulito, far cadere ~0,1 mL di adesivo polimerizzabile UV usando una pipetta (Figura 7A).
- Prendere un secondo coprivetrino e posizionarlo sopra il primo per far sì che l'adesivo liquido si diffonda uniformemente tra i due vetrini (Figura 7B-D).
- Una volta che l'adesivo spalmabile ha raggiunto i bordi dei vetrini, separarli delicatamente facendo scorrere uno sull'altro. Una volta separati, entrambi i vetrini sono completamente rivestiti con un sottile strato di adesivo liquido (Figura 7E).
NOTA: Il rivestimento potrebbe non essere uniforme e liscio solo se la separazione non viene eseguita con un movimento regolare e continuo.
- Se lo spin-coating non è disponibile, utilizzare il seguente modo alternativo per produrre un film sottile di adesivo UV sui vetrini:
- Prestampaggio di adesivo polimerizzabile UV
- Dopo lo spin-coating, pre-stampare l'adesivo mediante esposizione ai raggi UV. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV utilizzata (qui, è stata utilizzata una scatola UV-LED con una densità di potenza di 35 mW / cm2 per 1 minuto al 50% di potenza).
CRITICO: L'adesivo utilizzato qui è una colla ottica. Vedi la discussione per i punti chiave relativi alle dosi energetiche per la sua cura.
- Dopo lo spin-coating, pre-stampare l'adesivo mediante esposizione ai raggi UV. Regolare il tempo di esposizione in base alla densità di potenza della sorgente UV utilizzata (qui, è stata utilizzata una scatola UV-LED con una densità di potenza di 35 mW / cm2 per 1 minuto al 50% di potenza).
5. Trasferimento del film testurizzato sul substrato finale
- Prendere una delle pellicole testurizzate, preparate al punto 3) e metterla a contatto con il coprislip rivestito con adesivo (preparato al punto 4). Assicurarsi che il contatto tra l'adesivo parzialmente polimerizzato sul vetrino e il film testurizzato sia il più uniforme possibile (Figura 8A-C).
CRITICO: In questa fase, l'adesivo sul coprislip dovrebbe essere abbastanza solido da evitare il riflusso, che riempirebbe le cavità piramidali del film testurizzato quando messo a contatto, ma anche essere abbastanza plastico e adesivo da poter ottimizzare il contatto premendo delicatamente sul film testurizzato. - Esporre i vetrini alla luce UV fino a quando lo strato adesivo rivestito sul vetrino non è completamente polimerizzato. Ciò sigillerà il film testurizzato sul coprislip e fornirà un isolamento a prova di perdite tra le cavità piramidali.
- Infine, staccare il substrato piatto PDMS (Figura 8D-F). Utilizzando una pinzetta, pizzicare il PDMS su un angolo del bordo in cui è stato lasciato il materiale in eccesso dopo il taglio (passo 3.5). In questo modo, lo strato di pellicola testurizzata viene lasciato adesivo al coprivetrino con accesso aperto nella parte superiore per la semina cellulare. CRITICO: Quando si stacca il PDMS piatto, il film testurizzato deve rimanere ben attaccato al vetrino. I fallimenti di adesione sono facilmente confermati se la pellicola testurizzata può essere staccata dal vetrino dopo l'esposizione finale ai raggi UV senza alcuno sforzo.
6. Passivazione a lungo termine del copricostume della coltura cellulare per la coltura cellulare
NOTA: La passivazione si ottiene generando un rivestimento conforme e continuo di un copolimero biomimetico con una struttura simile al gruppo polare dei fosfolipidi nella membrana cellulare. Questo rivestimento conforme impedisce l'adesione delle cellule al dispositivo di coltura cellulare
- Preparare una soluzione con 0,5% (p/v) del copolimero biomimetico disciolto in etanolo puro. Conservare la soluzione a 4 °C per un uso futuro.
- Posizionare il coprifoglietto della coltura cellulare in una capsula di Petri da 35 mm e coprirlo completamente con la soluzione di copolimerio biomimetico.
- Dopo 5 minuti, rimuovere il coprislip di coltura cellulare dal contenitore con la soluzione di copolimerio biomimetico e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente all'interno del piatto finale in una cappa di biosicurezza (>1 h).
NOTA: Un rivestimento più spesso può essere prodotto aumentando la concentrazione del copolimero biomimetico nella soluzione di rivestimento; i risultati di un rivestimento più spesso sono visibili al microscopio a campo chiaro (Figura 9A).
7. Semina cellulare
- Degasaggio e sterilizzazione
- Poco prima della semina cellulare, erogare soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) nelle piastre di coltura cellulare (tipicamente 1 ml per una capsula di Petri da 35 mm). Degasare il piatto con il PBS sterile utilizzando un dispositivo ad ultrasuoni per ~ 10 minuti, seguito da diversi cicli di pipettaggio per rimuovere tutte le bolle.
CRITICO: Se l'aria è intrappolata all'interno delle cavità piramidali, impedirà alle cellule di entrarvi. Per assicurarsi che non ci sia aria intrappolata nella piramide prima della semina cellulare, si raccomanda di garantire visivamente (sotto un microscopio a campo chiaro da banco con ingrandimento 10x o 20x) l'assenza di aria in queste cavità (Figura 10). - Sostituire il PBS con terreno di coltura sterile e sterilizzare la piastra con luce UV per 30 minuti sotto un cappuccio di coltura cellulare.
NOTA: Da questo passaggio in poi, il piatto deve essere considerato sterile e manipolato utilizzando tecniche sterili. Un modo alternativo per rimuovere l'aria intrappolata dal dispositivo di coltura cellulare è utilizzare un barattolo sottovuoto con una pompa per vuoto.
- Poco prima della semina cellulare, erogare soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) nelle piastre di coltura cellulare (tipicamente 1 ml per una capsula di Petri da 35 mm). Degasare il piatto con il PBS sterile utilizzando un dispositivo ad ultrasuoni per ~ 10 minuti, seguito da diversi cicli di pipettaggio per rimuovere tutte le bolle.
- Preparazione della sospensione cellulare
NOTA: Le cellule possono essere seminate come aggregati a cella singola o piccola ed entrare nei pozzetti del campione attraverso l'apertura superiore. Nel corso del tempo, le cellule inserite si aggregano e crescono all'interno dei pozzetti campione in sferoidi di dimensioni maggiori della dimensione dell'apertura. Come modelli di linee cellulari convalidati, utilizzare cellule tumorali HCT116 (CCL-247 ATCC) o MCF7 (HTB-22 ATCC) mantenute nel terreno di coltura raccomandato (linee guida ATCC).- Preparare una sospensione cellulare (ad esempio, utilizzando un processo di tripsinizzazione seguendo le linee guida ATCC). Seguire le raccomandazioni sulla preparazione della tripsinizzazione / sospensione cellulare per le cellule di interesse.
- Contare e regolare la concentrazione cellulare a 0,5 × 106 cellule/ml nel terreno di coltura raccomandato.
- Erogazione cellulare
- Rimuovere il tampone PBS dal piatto di coltura cellulare da 35 mm e quindi erogare 1 mL della sospensione cellulare regolata. Vedere la Figura 11A per un'immagine al microscopio ottico di una procedura di semina cellulare con adeguata densità e omogeneità cellulare.
- Rimettere il piatto di coltura cellulare nell'incubatore cellulare (37 °C, 5% CO2 e 100% umidità) per 10 minuti. Circa 80-100 cellule entreranno in ogni cavità piramidale.
NOTA: È possibile aumentare il numero di cellule per piatto di coltura cellulare aumentando la concentrazione cellulare o il tempo trascorso prima della rimozione della sospensione cellulare. Tipicamente, la formazione di sferoidi richiede diverse ore (a seconda del tipo di cellula) dopo la semina cellulare e può essere seguita con un microscopio a campo luminoso (obiettivi da 4x a 40x; Figura 11). Da qui, il terreno di coltura, le matrici extracellulari e i fattori di crescita di differenziazione possono essere modificati o aggiunti al piatto di coltura cellulare contenente gli sferoidi secondo i tipici protocolli di differenziazione che potrebbero durare alcuni giorni, settimane o mesi. - Dopo l'incubazione di 10 minuti, recuperare il piatto di coltura cellulare dall'incubatore e aspirare delicatamente la sospensione cellulare per rimuovere le cellule non intrappolate. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura a un piatto da 35 mm e rimetterlo nell'incubatore cellulare.
CRITICO: In questa fase, poiché gli sferoidi non si sono ancora formati, è molto importante evitare forti aspirazioni o erogazioni che comporteranno la perdita delle cellule. Il controllo visivo con un microscopio a campo chiaro da banco è altamente raccomandato in questa fase.
8. Immunocolorazione e imaging
- Fissazione e colorazione
NOTA: Diverse procedure classiche di fissazione e immunocolorazione sono completamente compatibili con il piatto di coltura cellulare. Un protocollo tipico è descritto qui.- Fissare gli organoidi/sferoidi nella capsula di coltura cellulare per 20 minuti in paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente.
- Permeabilizzare gli organoidi per 24 ore in soluzione tensioattiva all'1% in PBS sterile a 4 °C su uno shaker orbitale e incubare per 24 ore in tampone bloccante (albumina sierica bovina al 2% [BSA] e tensioattivo all'1% in PBS sterile) a 4 °C su uno shaker orbitale.
- Incubare i campioni con anticorpi primari di interesse ad una diluizione compresa tra 1/50 e 1/200 (o secondo le raccomandazioni del produttore) in tampone anticorpale (2% BSA e 0,2% tensioattivo in PBS sterile) a 4 °C per 48 h.
- Risciacquare i campioni 3 volte con tampone di lavaggio su uno shaker orbitale (3% NaCl e tensioattivo 0,2% in PBS sterile) e incubare con i corrispondenti anticorpi secondari nel tampone anticorpale di diluizione (diluizione tra 1/100 e 1/300 o secondo le raccomandazioni del produttore), 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e 0,2 μg/mL Alexa Fluor 647 o 488 Phalloidin a 4 °C per 24 ore su uno shaker orbitale, seguito da cinque fasi di risciacquo con PBS. Facoltativamente, montare i campioni utilizzando un agente clearing solubile in acqua preriscaldato a 37 °C.
- Imaging
NOTA: In questa fase, gli organoidi nella piastra del micropozzetto possono essere considerati come un normale piatto di coltura contenente campioni fissi e colorati per l'imaging: qualsiasi procedura di imaging standard può essere utilizzata senza alcun adattamento o modifica richiesta. La figura 12 illustra un risultato rappresentativo di immagini e ricostruzione 3D ottenute utilizzando un microscopio confocale a disco rotante, con un obiettivo aereo 40x (apertura numerica 0,75).- Utilizzare il software costruttore per il processo di acquisizione automatica delle immagini con le seguenti impostazioni: tempo di esposizione = 50 ms, con uno stadio motorizzato z per acquisire uno z-stack (1 μm Z-step, per un'altezza totale di 70 μm).
- Esegui la ricostruzione 3D utilizzando il software di analisi delle immagini.
9. Rilascio e raccolta degli organoidi
NOTA: Lo strato adesivo testurizzato del piatto di coltura cellulare può essere staccato dal coprislip per rilasciare gli sferoidi/organoidi viventi (prima della fissazione) contenuti all'interno delle cavità piramidali per l'analisi delle cellule con altre procedure come il sequenziamento dell'RNA, approcci -omici, esperimenti in vitro e trapianto in vivo .
- Con il campione ancora nella capsula di Petri e in un cappuccio di biosicurezza, utilizzare una lama come un bisturi per tagliare un angolo dello strato adesivo strutturato.
- Con una pinzetta, pizzicare lo strato adesivo testurizzato sul bordo tagliato e staccarlo delicatamente dal vetrino, ma tenerlo immerso nel mezzo (alcuni organoidi potrebbero rimanere con lo strato adesivo, Figura 13).
- Risciacquare 3 volte con terreno di coltura e raccogliere gli organoidi mediante pipettaggio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 8F mostra l'aspetto tipico di un copricostume per coltura cellulare dopo una fabbricazione riuscita. Lo strato adesivo polimerizzabile ai raggi UV appare piatto e aderisce bene al vetrino. Il trasferimento dello strato adesivo sul vetrino potrebbe non riuscire se lo strato sul vetrino è sovrapolimerizzato o se la rimozione del substrato PDMS piatto viene eseguita in modo errato (come mostrato nella Figura 8G,H). In entrambi i casi, il guasto è evidente in quanto nessuna pellicola strutturata viene trasferita sul vetrino.
Affinché i micropozzetti funzionino, il film testurizzato prodotto (come descritto nella fase 3 del protocollo) deve avere entrambi i lati superiore e inferiore delle piramidi aperti per garantire che le cellule durante la semina nella fase 7 possano entrare nelle cavità e rimanere contenute una volta che gli organoidi iniziano a formarsi. La figura 9 mostra l'aumento dello spessore del rivestimento aumentando la concentrazione del copolimero biomimetico nella soluzione di rivestimento. La figura 10 mostra i risultati del degasaggio delle piastre di coltura cellulare per garantire che l'aria non sia intrappolata nelle cavità piramidali. La Figura 10A,B mostra il degassamento completo, mentre la Figura 10C,D mostra le bolle d'aria nelle cavità piramidali.
Nella Figura 11, le cellule sono intrappolate all'interno delle piramidi e gli organoidi corrispondenti si formano dopo i giorni 2 e 15 di coltivazione. Se l'apertura superiore dei micropozzetti è invece chiusa (come conseguenza di un passaggio 3 errato), non rimarranno cellule dopo il risciacquo del campione dopo la semina cellulare. La figura 12 mostra immagini rappresentative degli organoidi e una ricostruzione 3D ottenuta utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con un obiettivo d'aria 40x (apertura numerica 0,75). Dopo il rilascio e la raccolta, gli organoidi possono essere conservati in una piccola fiala e utilizzati per ulteriori analisi (ad esempio, sequenziamento dell'RNA). La figura 13B mostra un esempio di un campione di organoidi raccolti come descritto.
Figura 1: Stampo di poli(dimetilsilossano). (A) Lo stampo PDMS di partenza ottenuto come replica colata di un wafer testurizzato da 4" (vedi file supplementare 1). (B) Taglio largo 1 cm x 1 cm dello stampo PDMS di partenza. (C) Immagini al microscopio elettronico a scansione dei pilastri trapezoidali disposti in una matrice quadrata, che popolano la superficie dello stampo. Barre della scala = 1 cm (A), 100 μm e 200 μm (C superiore e inferiore, rispettivamente). Abbreviazione: PDMS = poli(dimethysiloxane). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Substrato PDMS piatto. (A) Uno strato di PDMS, spesso ~1 mm, viene preparato in una capsula di Petri larga 15 cm. (B) Peeling da un nuovo taglio di PDMS. (C) Il PDMS rimanente sulla piastra di Petri può essere tagliato in più pezzi per un ulteriore utilizzo. (D) Taglio piatto PDMS e stampo PDMS fianco a fianco; il PDMS piatto è più grande dello stampo. Abbreviazione: PDMS = poli(dimethysiloxane). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Posizionamento dello stampo sul substrato. (A) Lo stampo viene posizionato sul substrato piano con le piramidi rivolte verso il basso. (B) Diverso aspetto di scarso contatto (superiore) e buon contatto (inferiore) tra lo stampo e il substrato PDMS. (C) Immagine al microscopio ottico di un'area con scarso contatto; I cerchi rossi evidenziano i pilastri non a contatto con il substrato: appaiono di un colore più brillante rispetto a quelli a contatto nella stessa immagine. (D) Immagine ottica di un'area con tutti i pilastri in buon contatto. Barre della scala = 200 μm (C,D). Abbreviazione: PDMS = poli(dimethysiloxane). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Riempimento capillare di adesivo polimerizzabile ai raggi UV . (A) Questa sequenza di immagini mostra (da sinistra a destra) il versamento di una piccola quantità di adesivo su un bordo e la progressione dell'adesivo liquido nella cavità tra lo stampo e il substrato. Le frecce gialle indicano la direzione del flusso di liquido. (B) Sequenza di immagini ottiche (ingrandimento 40x) del fronte liquido in movimento; Quando è in buon contatto, la parte anteriore del liquido si muove attorno ai bordi delle piramidi senza perdite. Le frecce gialle puntano alla direzione del flusso e le frecce rosse puntano al bordo anteriore del liquido che si muove attorno ai bordi di contatto. (C) Sequenza di immagini ottiche (40x) del fronte liquido che si muove quando il contatto è scarso; Le frecce rosse puntano sul bordo anteriore del liquido che si infiltra tra lo stampo e il substrato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Rimozione dello stampo dopo la polimerizzazione dell'adesivo. (A-C) Procedura corretta per staccare lo stampo: mentre si preme delicatamente sull'eccesso di adesivo ai bordi sinistro con una pinzetta, lo stampo viene pizzicato vicino allo stesso bordo e piegato lentamente per staccarsi. (D) Il risultato della procedura corretta; l'eccesso viene tagliato su tre bordi, mentre un piccolo eccesso di PDMS viene lasciato sul quarto lato (freccia gialla). (E-G) Esempio di una procedura errata per la rimozione dello stampo: lo stampo viene pizzicato con una pinzetta dal bordo opposto, con conseguente distacco dal substrato piatto del film adesivo insieme allo stampo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Rivestimento del vetrino. (A,B) Esempio di una buona procedura di rivestimento: il vetrino di copertura viene posizionato sul mandrino sottovuoto di uno spin-coater, e al centro viene erogato abbastanza adesivo, dando un rivestimento omogeneo del vetrino. (C,D) Esempio di una cattiva procedura di rivestimento: non viene erogato abbastanza adesivo, con conseguente rivestimento non uniforme del vetrino. (E) Da sinistra a destra, esempi di rivestimento buono, accettabile e cattivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Processo di rivestimento alternativo . (A) Una piccola goccia di adesivo liquido è posta al centro del vetrino. (B) Un secondo vetrino di copertina è posto delicatamente sopra il primo. (C,D) Il liquido si è diffuso tra i due coprivetrini e distribuito uniformemente. (E) Esempi di risultati dopo una corretta separazione dei vetrini di copertura (a sinistra) o una separazione errata (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Trasferire sul vetrino. (A) La pellicola adesiva polimerizzata e rifilata (figura 5D) viene posizionata sul vetrino con adesivo parzialmente polimerizzato. (B) Esempio di buon contatto tra la pellicola testurizzata e il vetrino. L'inserto è un'immagine ottica che mostra il contatto uniforme delle aree tra le cavità trapezoidali (colore uniforme scuro). (C) Esempio di scarso contatto tra la pellicola testurizzata e il vetrino. Le aree più luminose non sono in contatto, le frecce rosse puntano a quelle aree. L'inserto è un'immagine ottica che mostra il diverso aspetto di buon contatto (due a sinistra) e scarso contatto (due a destra). Barre della scala (gialle, B,C) = 200 μm. (D,E) Procedura corretta per la rimozione del substrato piatto PDMS: le pinzette vengono utilizzate per pizzicare il PDMS sul bordo con eccesso di PDMS e piegare per staccarsi delicatamente. (F) Il risultato con la pellicola adesiva UV trasferita con successo sul vetrino. (G,H) Esempio di procedura di peeling errata: le pinzette vengono utilizzate per pizzicare il PDMS piatto su uno dei bordi in cui il materiale in eccesso è stato tagliato; pertanto, la pellicola viene rimossa insieme al PDMS piatto. Abbreviazione: PDMS = poli(dimethysiloxane). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Rivestimento con copolimero biomimetico. (A) Dispositivo di coltura cellulare rivestito con copolimero biomimetico utilizzando una soluzione allo 0,5% (a sinistra) o (B) all'1% (a destra) (p/v) in etanolo puro. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Degasaggio del dispositivo di coltura cellulare. (A) Dispositivo di coltura cellulare prima del degasaggio completo. b) dispositivo di coltura cellulare dopo il degasaggio completo; (C,D) dispositivo di coltura cellulare con degasaggio solo parziale in cui le bolle d'aria sono intrappolate nelle piramidi. Barre della scala = 200 μm (A-D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 11: Immagini rappresentative in campo chiaro della semina cellulare e della crescita degli organoidi . (A) Le cellule sono visibili galleggianti sulla parte superiore. (B) Cellule intrappolate nelle cavità piramidali dopo aver risciacquato la sospensione cellulare. Solo le celle intrappolate verranno mantenute come mostrato. (C) Le cellule si aggregano per formare sferoidi in ogni cavità (giorno 2 dopo la semina cellulare). (D) Immagine al giorno 15 dopo la semina cellulare di un organoide cresciuto in una cavità piramidale. Barre della scala = 200 μm (A B), 120 μm (C) e 150 μm (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 12: Imaging 3D di organoidi. (A) Tre diversi piani Z acquisiti utilizzando un disco rotante confocale (lente 40x, aria, apertura numerica: 0,75) di un organoide sotto differenziazione neuroectodermica (giorno 7dopo la semina cellulare). Colorazione dell'actina con falloidina (Alexa Fluor 647) in arancione e immunocolorazione N-caderina (Alexa Fluor 561) in blu. (B) Una ricostruzione 3D mediante software di analisi delle immagini degli organoidi corrispondenti (piani 80 Z, altezza totale di 100 μm). Frecce bianche: gruppi di cellule attorno a una striscia con alto livello di espressione di actina. Frecce blu: cluster cellulari positivi per l'espressione della proteina N-caderina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 13: Rilascio di organoidi. (A) Rimozione dello strato adesivo testurizzato con una pinzetta; (B) immagine in campo chiaro di una sospensione organoide ottenuta dopo la rimozione. Barra di scala = 200 μm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: Viene presentato un protocollo passo-passo per la microfabbricazione di uno stampo Si con microcavità piramidali. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La procedura per la fabbricazione del piatto di coltura a micropozzetto, che consente la coltura e la differenziazione di organoidi ad alta densità, è stata descritta in questo articolo. A causa della geometria e della disposizione delle microcavità, migliaia di sferoidi possono essere coltivati e colorati in una singola piastra per lunghi periodi di tempo (diverse settimane o più) con quasi nessuna perdita di materiale. A titolo di confronto, un'area di 4 mm x 2 mm sulla piastra di coltura cellulare può contenere tanti sferoidi quanto una singola piastra a 384 pozzetti con un'area di 12 cm x 8 cm.
La distribuzione regolare delle microcavità e il coprislip standard piatto utilizzato come substrato consentono il monitoraggio di migliaia di organoidi vivi o fissi in 3D, senza la necessità di una complessa e dispendiosa manipolazione del campione tra vasi di coltura e supporti di imaging. A causa della forma piramidale con una parte superiore più piccola della base, non vi è alcuna perdita di organoidi dovuta a passaggi di pipettaggio durante lo scambio del mezzo, erogazione di matrici extracellulari o procedure di colorazione. Tutti questi passaggi potrebbero essere eseguiti direttamente, come per un monostrato di celle 2D senza ulteriori precauzioni, a differenza delle classiche tecniche di generazione di organoidi (ad esempio, goccioline appese, piastre di attacco basso, Aggrewell).
Inoltre, rispetto a queste tecniche esistenti, i micropozzetti sono stati progettati per l'imaging 3D ad alta risoluzione compatibile con tutti i tipi di lenti ad immersione (aria, acqua, olio e silicio). La manutenzione a lungo termine degli organoidi chiusi a un vetrino piano rende il coprislip della coltura cellulare compatibile con microscopi ottici ad alta risoluzione, cosa impossibile con i metodi esistenti senza una manipolazione complessa e un fastidioso trasferimento di organoidi. Inoltre, una procedura di passivazione ottimizzata evita qualsiasi adesione di cellule / organoidi per la coltura a lungo termine, controllando così la differenziazione della coltura 3D Infine, poiché lo strato adesivo testurizzato è rimovibile, gli organoidi viventi possono essere recuperati per eseguire altri tipi di esperimenti come saggi -omici o trapianto in vivo .
Va notato che la forma piramidale e la disposizione delle matrici delle microcavità utilizzate per questo protocollo derivano dallo stampo primario, che è stato fabbricato mediante incisione a umido al silicio per fornire superfici con finitura a specchio e inclinazione di 45 ° per consentire la microscopia a foglio di luce a singolo obiettivo (soSPIM11). Mentre una discussione di questi requisiti e una descrizione completa su come produrre tali stampi possono essere trovati altrove12,13, un semplice protocollo è anche dato nel file supplementare 1. Sono disponibili diversi modi di produrre uno stampo primario, che sono pienamente compatibili con la fabbricazione dei chip in questo protocollo. L'incisione laser del vetro e la stampa 3D ad alta risoluzione, ad esempio, potrebbero essere utilizzate per produrre uno stampo primario con cavità adatte per il contenimento degli organoidi, ma non sono adatte per l'imaging soSPIM.
Il protocollo di fabbricazione qui divulgato può essere adattato per l'uso in qualsiasi laboratorio biologico standard, in quanto non sono richiesti strumenti di microfabbricazione avanzati dedicati. Alcune fasi critiche della fabbricazione dei micropozzetti sono la produzione attraverso il riempimento capillare del film adesivo testurizzato e il suo trasferimento al substrato di vetro. Tuttavia, nella nostra esperienza, possono essere padroneggiati con alta riproducibilità in un breve periodo di tempo. La distanza tra le piramidi dovrebbe essere la più piccola possibile per aumentare la densità delle cavità per la crescita degli organoidi, ma deve anche essere abbastanza grande in modo che le cavità possano essere sigillate sul substrato senza alcuna perdita o mancanza di sigillatura tra di loro. Abbiamo scoperto che una distanza di 50 μm è un buon compromesso per questo caso.
Durante la semina cellulare, un aspetto critico è la rimozione di eventuali bolle d'aria intrappolate all'interno delle cavità per garantire l'ingresso delle cellule. Descriviamo qui una soluzione convalidata, che utilizza solo apparecchiature di laboratorio classiche (ad esempio, un omogeneizzatore ad ultrasuoni o un barattolo sottovuoto). Per consentire una migliore omogeneizzazione del numero di cellule per piatto di coltura cellulare, si raccomanda di erogare la sospensione cellulare dal lato del piatto e non direttamente sopra il vetrino di copertura. Una leggera agitazione manuale potrebbe anche aiutare a omogeneizzare la soluzione cellulare.
Dopo la semina delle cellule, il piatto di coltura cellulare con organoidi può essere trattato come qualsiasi altro supporto di coltura classico; Non sono necessarie manipolazioni specifiche o passaggi critici. Tutti i protocolli che sono stati utilizzati con i dispositivi micropozzetto sono praticamente gli stessi di quelli utilizzati in piatti a basso attacco come le piastre con fondo a U. Pertanto, la coltura organoide in questi micropozzetti non richiede alcun cambiamento nelle condizioni di coltura rispetto ad altri standard.
Un altro fattore critico è che l'adesivo utilizzato qui è una colla ottica. Nel suo miglior utilizzo suggerito (fare riferimento anche alle note applicative del fornitore), due elementi ottici da incollare sono allineati e l'adesivo polimerizzabile UV viene applicato all'interfaccia. Una prima esposizione ai raggi UV di un'energia insufficiente a causare la polimerizzazione completa viene utilizzata per solidificare la colla mantenendo le proprietà adesive. I componenti ottici possono essere spostati per ottenere un allineamento ottimale, quindi la colla viene completamente polimerizzata al suo stato finale con una seconda esposizione ai raggi UV per fornire un'adesione permanente. Le dosi energetiche di prima e seconda esposizione (cioè i tempi di esposizione se viene utilizzata una sorgente di densità energetica nota e costante) devono essere ottimizzate in funzione della densità energetica della sorgente UV utilizzata, dello spessore dello strato di colla, della trasmissione dei raggi UV attraverso gli elementi ottici, della testurizzazione superficiale (o della mancanza di essa) della superficie da incollare.
Mentre l'adesione tra il film testurizzato e il coprislip rivestito con adesivo deve essere abbastanza forte da fornire una tenuta a tenuta stagna, deve anche essere possibile rimuovere il film testurizzato per recuperare gli organoidi dopo l'imaging, se sono necessarie ulteriori analisi, come la profilazione genotipica. Con il protocollo qui descritto è stato raggiunto un compromesso corretto tra sigillatura a tenuta stagna e capacità di staccare il film testurizzato, ma potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione dei tempi di prestampa e polimerizzazione finale per lo strato sottile adesivo sul vetrino in quanto dipende dal sistema di esposizione ai raggi UV e dallo spessore del film utilizzato.
Una limitazione nell'attuale versione dei micropozzetti è nella procedura di semina; le cellule devono essere seminate prima dei componenti ECM per consentire loro di entrare nelle vicinanze della piramide. Sono in corso miglioramenti per rivestire i micropozzetti con componenti della matrice extracellulare, come primo passo. Non abbiamo ancora eseguito alcuna microscopia elettronica (EM) sugli organoidi fissi all'interno delle cavità. Saranno necessarie alcune modifiche a questi protocolli di fabbricazione e coltura cellulare prima che l'imaging degli organoidi nei micropozzetti con EM diventi un'opzione praticabile.
Una naturale estensione futura di questo metodo è quella di fornire capacità di screening ad alto contenuto per consentire test multicondizione in un unico flusso di lavoro (piastra multipozzetto). Questo dispositivo di coltura cellulare fornisce un'alternativa unica alle tecniche organoidi esistenti, offrendo una coltura e una produttività di imaging insuperabili e aprendo nuove prospettive nel campo della ricerca sugli organoidi per l'applicazione biomedica e la scoperta di farmaci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Una domanda di brevetto internazionale è stata pubblicata con il numero di pubblicazione WO 2021/167535 A1.
Acknowledgments
La ricerca è supportata dal progetto CALIPSO sostenuto dalla National Research Foundation, Ufficio del Primo Ministro, Singapore, nell'ambito del suo programma Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. riconosce il supporto dello sperimentatore NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding e ANR ADGastrulo. A.B. e G.G. riconoscono il sostegno del finanziamento di base dell'MBI. A.B. riconosce Andor Technologies per il prestito del microscopio BC43.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
