Summary
この論文は、オルガノイドを培養し、高解像度顕微鏡を使用して観察できる、mm2あたり数百のマイクロコンテナを備えた新しいタイプの培養基質の製造プロトコルを提示します。細胞播種および免疫染色プロトコルも詳述されています。
Abstract
さまざまな解像度スケールでの多数の3次元(3D)器官型培養物(オルガノイド)の特性評価は、現在、標準的なイメージングアプローチによって制限されています。このプロトコルは、微細加工されたオルガノイド培養チップを調製する方法を説明しており、最小限の操作を必要とし、最大300オルガノイド/hのイメージングスループットが可能なユーザーフレンドリーな装置でマルチスケールの3Dライブイメージングを可能にします。これらの培養チップは、空気対物レンズと液浸対物レンズ(空気、水、油、シリコーン)の両方、および幅広い一般的な顕微鏡(スピニングディスク、ポイントスキャナー共焦点、広視野、明視野など)と互換性があります。さらに、単一対物レンズ、単一平面照明顕微鏡(SPIM)技術(soSPIM)などのライトシートモダリティで使用できます。
ここで説明するプロトコルは、微細加工された培養チップの調製、およびオルガノイドの培養と染色のための詳細な手順を示しています。慣れるのに必要な時間は短く、消耗品や機器は通常のバイオラボで簡単に見つけることができます。ここでは、3Dイメージング機能は、市販の標準顕微鏡(3D再構成用のスピニングディスクやルーチンモニタリング用の広視野顕微鏡など)でのみ実証されます。
Introduction
オルガノイドと呼ばれるオルガノタイプ3D細胞培養では、幹細胞は分化し、実際の臓器と強い形態学的および機能的類似性を共有する空間構造に自己組織化します。オルガノイドは、ヒトの生物学と体外での発生を研究するための貴重なモデルを提供します1,2,3。肝臓、脳、腎臓、肺、および他の多くの臓器を模倣するモデルが増えています2,4,5。オルガノイドの分化は、可溶性成長因子と細胞外マトリックスを正確な時系列で添加することによって指示されます。しかしながら、臓器とは著しく対照的に、オルガノイドの発達は非常に不均一である。
多くの生物学的課題6,7に加えて、オルガノイド培養は、細胞培養方法、トランスクリプトミクスの特性評価、およびイメージングの面でも技術的な課題をもたらします。in vivo器官の発達は生物学的環境で起こり、その結果、細胞配置の非常にステレオタイプの自己組織化がもたらされます。任意の表現型の変化は、罹患状態を診断するための代理として使用することができる。対照的に、オルガノイドは、細胞培養条件に適合する最小限の制御された微小環境でin vitroで発達するため、個々のオルガノイドの発生経路と形状形成に大きなばらつきが生じます。
最近の研究8では、いくつかの遺伝子マーカーの評価と組み合わせたオルガノイド形状(表現型記述子)の定量的イメージングにより、表現型発生ランドスケープの定義が可能になることが実証されました。おそらく、オルガノイドのゲノム発現の多様性を表現型挙動と関連付ける能力は、オルガノイド培養の可能性を最大限に引き出すための大きな一歩です。したがって、細胞下、多細胞、および全オルガノイドスケールでのオルガノイドの特徴を3D 9,10で特徴付けることを可能にする、専用のハイコンテントイメージングアプローチの開発が求められています。
当社は、合理化されたオルガノイド培養(単離されたヒト胚性幹細胞[hESC]、ヒト人工多能性幹細胞[hIPSC]、または初代細胞から3D、多細胞、分化型オルガノイドまで)と高速で非侵襲的な3Dイメージングを可能にする汎用性の高いハイコンテントスクリーニング(HCS)プラットフォームを開発しました。これは、JeWellsチップ(以下、 チップ )と呼ばれる次世代の小型3D細胞培養装置を統合しており、45°ミラーに隣接する何千ものウェルアレイマイクロウェルを含み、単一対物レンズライトシート顕微鏡による高速3D高解像度イメージングを可能にします11。標準的な市販の倒立顕微鏡と互換性のあるこのシステムは、300種類のオルガノイドを3Dでイメージングし、細胞内分解能を<1時間で行うことができます。
細胞培養デバイスの微細加工は、正方形のベースとベースに対して45°の側壁を持つ数百のマイクロピラミッド(図1A)を含む既存の微細構造モールドから始まります。 図1C は、このような構造の電子顕微鏡(EM)像を示す。モールド自体はポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)でできており、標準的なソフトリソグラフィー手順を使用して、対応する機能(キャビティとして)を備えた一次モールド(ここには示されていません)のレプリカキャストとして作成できます。一次金型は、さまざまな手順で製造できます。このプロトコルに使用されたものは、Gallandらで報告されているように、シリコンウェットエッチングを使用して作成されました。11;一次金型の製造手順は、このプロトコルにとって重要ではありません。ピラミッドは、X方向とY方向で同じピッチで正方形の配列に配置されます(この場合、ピッチは350μmです)。
実例として、チップがウェル内の初期細胞数を正確に定義しながら、長期培養(月)および分化プロトコルを可能にすることを実証するために、概念実証実験12 が公開された。多数のオルガノイドの個々の発達は、標準的な明視野および3Dライトシート蛍光顕微鏡を使用してライブで自動的に監視できます。さらに、オルガノイドを取り出して、さらなる生物学的調査(例えば、トランスクリプトミクス解析)を実行することができる。この論文では、細胞培養カバーガラスの作製、蛍光顕微鏡のシードおよび染色手順、およびオルガノイドの検索に関する詳細なプロトコルについて概説します。
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Protocol
注:このプロトコルの最初の部分では、細胞培養デバイスの微細加工について詳しく説明しています。ピラミッド型の空洞を持つオリジナルの一次金型は、微細加工設備があれば社内で製作することも、外部企業に外注することもできます。この作業で使用される一次金型は社内で製造され、製造プロセスのステップは他の場所に記載されています11、13。金型の微細加工のための基本的なプロトコルは、 補足ファイル1で入手できます。重要:手順1〜6の操作は、ほこりのない環境で実行する必要があります。層流フードまたはクリーンルーム(利用可能な場合)が好ましい。これらの手順を通じて、手袋、白衣、安全メガネなどの個人用保護具(PPE)を使用する必要があります。
1. PDMS金型のダイシング
- PDMSモールドのごく一部を最終デバイスに必要な寸法(1 cm x 1 cmなど)にカットします[図1B])。配列のXY方向に平行にカットします。
重要:PDMS金型を1 cm x 1 cmのサイコロに切断する場合は、1つのステップで切断を実行します。片面かみそりの刃を使用して、圧力を加え、1つのステップでPDMSを切断します。これは、金型の表面に堆積し、レプリカステップの品質に影響を与える可能性のあるPDMSの小さな粒子の形成を防ぐためです(ステップ3)。
2. フラットPDMS基板の作製
- PDMSベースレジン15-20gとその網状化剤1.5-2g(10:1の比率)を量り、慎重に混合し、真空ジャーで~20分間脱気します。
- 脱気したPDMSを幅15cm(直径)のプラスチック製のペトリ皿にゆっくりと注ぎます。
- ペトリ皿を65°Cに設定されたオーブンに2時間保持することにより、PDMSを硬化させます。硬化が完了するのを待った後、厚さ~1.5 mmの平らなPDMSフィルム(ペトリ皿に含まれています)を使用できるようになります(図2A)。
- 鋭利な刃を使用して、PDMSから2 cm x 2 cmの断片を切り取ります(図2B-D)。
注:このPDMSシートの正確な厚さは重要ではありません。~1-2 mmが適切な範囲です。カットの寸法は、テクスチャモールドよりも大きくする必要がありますが、それほど大きくないため、材料の無駄になります。
3. 紫外線硬化型接着剤によるテクスチャ層の製造
- 平らなPDMSカット(ステップ2で準備)の上に、PDMSモールドダイス(ステップ1で準備)を裏向きに置きます(図3A、B)。
注記: 金型内のピラミッド状の突起が平らなPDMS基板に向けられており、ピラミッドの切頭台の上面のみが接触していることを確認してください。光学顕微鏡で正しい配置を評価します(図3C、D)。 - 金型の片側に、ピペットを使用して、少量(2滴、約0.1〜0.2 mL)のUV硬化型接着剤を滴下します(図4A)。
注:液体が金型の端に接触すると、毛細管現象によって液体が駆動され、金型自体と基板として使用されるPDMSのフラットカットとの間の空洞が充填されます。- たとえば、10倍の倍率対物レンズを備えた倒立光学顕微鏡を使用して、キャビティ内の液体の進行を追跡します(図4B、C)。
- UV硬化型接着剤をUV光にさらして硬化させます。使用するUV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整します(たとえば、パワー密度が35 mW / cm 2のUV-LEDボックス、このプロトコルでは50%のパワーで2分間接着剤を完全に硬化させます)。
- 一方の端に過剰量の接着剤を使用して、指で軽く押して、硬化した接着剤を平らなPDMS基板上に保持します(図5A、B)。その間、ピンセットを使用して、押さえられている同じエッジの横にある金型の片隅をつまみ、テクスチャフィルムも持ち上げられないようにしながらゆっくりと剥がします。
注意: 図5Cは、適切なカビ除去手順の結果を示しています。図 5E-G は、間違った手順を示しています。 - かみそりの刃を使用して余分な接着剤と余分なPDMS基板をトリミングし、硬化したテクスチャ加工された接着剤層をPDMS上に平らにし、ステップ5で必要になる片方の端だけに余分なPDMSを付けます(図5D)。
4.カバーガラス基板の準備
注:最終デバイスの基板として、直径25mmの標準の丸みを帯びた1.5Hカバーガラスが使用されます。使用する前に、表面からほこりや有機残留物を取り除くために洗浄する必要があります。
- カバーガラス洗浄
- 超音波が適用されている間、カバーガラスを石鹸水に5分間浸します(40 kHz、110 W音響パワー)。
- カバーガラスをきれいな脱イオン(DI)水で、最初に浸漬し、最後に蛇口からDI水を流して洗浄します。カバーガラスをN2 ガスブローガンで乾かします。
- カバーガラスをアセトン浴に5分間浸します。すぐに2-プロパノール(IPA)浴にさらに5分間移動します。
- スクイーズボトルを使用して、カバーガラスをきれいなIPAですすいでください。N2 ガスブローガンでカバーガラスを乾かします。
注意: この手順を使用してクリーニングされたカバーガラスは、必要になるまで密閉容器に保管できます。表面に湿気が付着しないように、乾いたキャビネットに保管してください。
- 使用する準備ができたら、きれいなカバーガラスを短いO 2プラズマプロセスで処理して親水性を改善します:O2 20 sccm、3 mbarの圧力、RF発電機で60 W、および60秒の持続時間。
- プラズマ活性化の直後に、標準的なスピンコーターの真空チャックにカバーガラスを置き、カバーガラスの中央に接着剤を少量注ぐことにより、UV硬化型接着剤の薄層をスピンコーティングします(図6)。スピンコーティングプロセスを実行します:500rpmで5秒間拡散し、3,000rpmで45秒間コーティングします(加速と減速を100rpm / sに設定)。
- スピンコーティングが利用できない場合は、次の別の方法を使用して、カバーガラスにUV接着剤の薄膜を作成します。
- 清潔なカバーガラスの上に、ピペットを使用して~0.1 mLのUV硬化型接着剤を滴下します(図7A)。
- 2番目のカバーガラスを取り、最初のカバーガラスの上に置き、液体接着剤を2つのカバーガラスの間に均等に広げます(図7B-D)。
- 拡散接着剤がカバーガラスの端に到達したら、カバーガラスをスライドさせてゆっくりと分離します。分離されると、両方のカバーガラスは液体接着剤の薄層で完全にコーティングされます(図7E)。
注意: コーティングは、分離が滑らかで連続的な動きで行われない場合にのみ、均一で滑らかではない可能性があります。
- スピンコーティングが利用できない場合は、次の別の方法を使用して、カバーガラスにUV接着剤の薄膜を作成します。
- 紫外線硬化型接着剤の予備硬化
- スピンコーティング後、UVにさらして接着剤をプリキュアします。使用するUV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整してください(ここでは、パワー密度35mW / cm2 のUV-LEDボックスを50%のパワーで1分間使用しました)。
クリティカル:ここで使用される接着剤は光学接着剤です。その硬化のためのエネルギー線量に関連する重要なポイントについては、議論を参照してください。
- スピンコーティング後、UVにさらして接着剤をプリキュアします。使用するUV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整してください(ここでは、パワー密度35mW / cm2 のUV-LEDボックスを50%のパワーで1分間使用しました)。
5.テクスチャフィルムの最終基板への転写
- テクスチャフィルム(手順3で準備)の1つを取り、接着剤でコーティングされたカバーガラス(手順4で準備)に接触させます。カバーガラス上の部分的に硬化した接着剤とテクスチャフィルムとの接触が可能な限り均一であることを確認してください(図8A-C)。
重要:この段階では、カバーガラスの接着剤は、接触したときにテクスチャフィルムのピラミッド空洞を埋めるリフローを回避するのに十分な固体である必要がありますが、テクスチャフィルムを軽く押すことで接触を最適化できるほどプラスチックで接着性も必要です。 - カバーガラスにコーティングされた接着剤層が完全に硬化するまで、カバーガラスをUV光にさらします。これにより、カバーガラスのテクスチャフィルムがシールされ、ピラミッド型の空洞間の漏れ防止の分離が提供されます。
- 最後に、PDMSフラット基板をはがします(図8D-F)。ピンセットを使用して、トリミング後に余分な材料が残ったエッジの一方のコーナーでPDMSをつまみます(ステップ3.5)。このようにして、テクスチャードフィルム層は、細胞播種のために上部にオープンアクセスを備えたカバーガラスに接着されたままになります。重要:平らなPDMSを剥がすとき、テクスチャフィルムはカバーガラスにしっかりと付着したままである必要があります。UVに最後にさらした後、テクスチャフィルムをカバーガラスから簡単に剥がすことができれば、接着不良を簡単に確認できます。
6.細胞培養用カバーガラスの長期パッシベーション
注:パッシベーションは、細胞膜中のリン脂質の極性基と同様の構造を有する生体模倣コポリマーのコンフォーマルで連続的なコーティングを生成することによって達成されます。このコンフォーマルコーティングにより、細胞培養デバイスへの細胞の接着を防ぎます
- 純粋なエタノールに溶解した0.5%(w / v)の生体模倣コポリマーを含む溶液を調製します。将来の使用のために溶液を4°Cで保管してください。
- 細胞培養カバーガラスを35 mmのペトリ皿に入れ、生体模倣コポリマー溶液で完全に覆います。
- 5分後、生体模倣コポリマー溶液の入った容器から細胞培養カバーガラスを取り出し、バイオセーフティフード内の最終皿内で室温で乾燥させます(>1時間)。
注:コーティング溶液中の生体模倣コポリマーの濃度を上げることにより、より厚いコーティングを生成できます。より厚いコーティングの結果は、明視野顕微鏡で見ることができます(図9A)。
7.細胞播種
- 脱気と滅菌
- 細胞播種の直前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を細胞培養ディッシュ(通常、35 mmペトリ皿の場合は1 mL)に分注します。超音波装置を使用して滅菌PBSで皿を~10分間脱気し、その後、すべての気泡を除去するためにピペッティングを数回行います。
クリティカル:空気がピラミッド空洞内に閉じ込められている場合、細胞がそれらに入るのを防ぎます。細胞播種前にピラミッドに空気が閉じ込められていないことを確認するために、これらの空洞内に空気がないことを視覚的に確認することをお勧めします(10倍または20倍の倍率のベンチトップ明視野顕微鏡の下で)。 - PBSを滅菌培地と交換し、細胞培養フードの下でプレートをUV光で30分間滅菌します。
注意: このステップ以降、皿は無菌と見なされ、無菌技術を使用して操作する必要があります。細胞培養装置から閉じ込められた空気を除去する別の方法は、真空ポンプを備えた真空ジャーを使用することです。
- 細胞播種の直前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を細胞培養ディッシュ(通常、35 mmペトリ皿の場合は1 mL)に分注します。超音波装置を使用して滅菌PBSで皿を~10分間脱気し、その後、すべての気泡を除去するためにピペッティングを数回行います。
- 細胞懸濁液の調製
注:細胞は単一または小さな細胞凝集体として播種し、上部開口部からサンプルウェルに入ることができます。時間が経つにつれて、挿入された細胞は凝集し、サンプルウェル内でアパーチャのサイズよりも大きいサイズのスフェロイドに成長します。検証済みの細胞株モデルとして、推奨培地(ATCCガイドライン)で維持されているHCT116(CCL-247 ATCC)またはMCF7(HTB-22 ATCC)がん細胞を使用してください。- 細胞懸濁液を調製する(例えば、ATCCガイドラインに従ったトリプシン処理を用いる)。目的の細胞に対するトリプシン処理/細胞懸濁液調製の推奨事項に従ってください。
- 推奨培地で細胞濃度をカウントし、0.5×106 細胞/mLに調整します。
- セル分注
- 35 mm細胞培養皿からPBSバッファーを除去し、調整した細胞懸濁液1 mLを分注します。適切な細胞密度と均質性を備えた細胞播種手順の光学顕微鏡画像については 、図11A を参照してください。
- 細胞培養皿を細胞インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度100%)に10分間戻します。約80〜100個の細胞が各錐体腔に入ります。
注:細胞濃度または細胞懸濁液除去までの時間を増やすことにより、細胞培養皿あたりの細胞数を増やすことができます。通常、スフェロイド形成は細胞播種後数時間(細胞の種類によって異なります)かかり、明視野顕微鏡(4倍から40倍の対物レンズ; 図11)。ここから、培養培地、細胞外マトリックス、および分化増殖因子は、数日、数週間、または数ヶ月続く可能性のある典型的な分化プロトコルに従って、スフェロイドを含む細胞培養皿に変更または添加することができます。 - 10分間のインキュベーション後、細胞培養皿をインキュベーターから回収し、細胞懸濁液を穏やかに吸引して、閉じ込められていない細胞を除去します。1 mLの培養液を35 mmディッシュに加え、セルインキュベーターに戻します。
クリティカル:この段階では、スフェロイドはまだ形成されていないため、細胞の損失につながる強い吸引や分注を避けることが非常に重要です。このステップでは、ベンチトップ明視野顕微鏡を使用した視覚制御を強くお勧めします。
8. 免疫染色とイメージング
- 固定と染色
注:固定と免疫染色の異なる古典的な手順は、細胞培養皿と完全に互換性があります。ここでは、一般的なプロトコルの 1 つについて説明します。- オルガノイド/スフェロイドを細胞培養皿に4%パラホルムアルデヒド溶液中で室温で20分間固定します。
- オルガノイドをオービタルシェーカー上で4°Cの滅菌PBS中の1%界面活性剤溶液中で24時間透過処理し、オービタルシェーカー上で4°Cでブロッキングバッファー(2%ウシ血清アルブミン[BSA]および滅菌PBS中の1%界面活性剤)中で24時間インキュベートします。
- 目的の一次抗体を含むサンプルを、抗体希釈バッファー(滅菌PBS中の2%BSAおよび0.2%界面活性剤)で4°Cで48時間、1/50〜1/200の希釈(またはメーカーの推奨に従って)でインキュベートします。
- サンプルをオービタルシェーカー上の洗浄バッファー(滅菌PBS中の3%NaClおよび0.2%界面活性剤)で3回すすぎ、抗体希釈バッファー(1/100〜1/300またはメーカーの推奨による希釈)、0.5 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、および0.2 μg/mL Alexa Fluor 647または488ファロイジンをオービタルシェーカー上で4°Cで24時間インキュベートします。 その後、PBSで5回のすすぎステップを行います。オプションで、37°Cに予熱した水溶性透明化剤を使用してサンプルをマウントします。
- イメージング
注:この段階では、マイクロウェルプレート内のオルガノイドは、イメージング用の固定および染色サンプルを含む通常の培養皿と見なすことができます:適応や変更を必要とせずに、標準的なイメージング手順を使用できます。 図12 は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて得られた画像と3D再構成の代表的な結果を示しており、40倍の空気対物レンズ(開口数0.75)を有する。- 自動画像取得プロセスには、露光時間=50ms、z電動ステージでzスタック(1μmのZステップ、全高70μm)を取得できる設定でコンストラクタソフトウェアを使用します。
- 画像解析ソフトで3D再構成を行います。
9. オルガノイドの放出と回収
注:細胞培養皿のテクスチャード加工された接着剤層をカバーガラスから剥離して、錐体腔内に含まれる生きたスフェロイド/オルガノイド(固定前)を放出し、RNAシーケンシング、オミクスアプローチ、in vitro 実験、 in vivo 移植などの他の手順で細胞を分析することができます。
- サンプルをペトリ皿とバイオセーフティフードに入れたまま、メスなどの刃を使用して、テクスチャード加工された接着剤層の角を切り取ります。
- ピンセットを使用して、切り口のテクスチャード加工された接着剤層をつまみ、ガラスカバーガラスからそっと剥がしますが、培地に浸したままにします(一部のオルガノイドが接着剤層に残っている場合があります、 図13)。
- 培養液で3回すすぎ、ピペッティングでオルガノイドを回収します。
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Representative Results
図8F は、作製が成功した後の細胞培養カバーガラスの典型的な側面を示す。UV硬化型接着剤層は平らに見え、カバーガラスによく接着します。カバーガラス上の層が過剰に硬化している場合、または平らなPDMS基板の除去が正しく行われていない場合( 図8G、Hに示すように)、カバーガラス上の接着剤層の転写が失敗する可能性があります。どちらの場合も、テクスチャフィルムがカバーガラスに転写されないため、失敗は明らかです。
マイクロウェルが機能するためには、作製されたテクスチャーフィルム(プロトコルステップ3で説明)をピラミッドの上側と下側の両方を開いて、ステップ7の播種中の細胞が空洞に入り、オルガノイドが形成され始めた後も封じ込められたままになるようにする必要があります。図9は、コーティング溶液中の生体模倣コポリマーの濃度を増加させることによるコーティングの厚さの増加を示す。図10は、細胞培養皿を脱気して、錐体腔内に空気が閉じ込められないようにした結果を示す。図10A,Bは完全な脱気を示し、図10C,Dはピラミッド空洞内の気泡を示しています。
図11では、細胞はピラミッド内に閉じ込められ、対応するオルガノイドは培養の2日目と15日目の後に形成されます。マイクロウェルの上部開口部が代わりに閉じられた場合(誤ったステップ3の結果として)、細胞播種後にサンプルをすすぎた後、細胞は残りません。 図12は、オルガノイドの代表的な画像と、40倍の空気対物レンズ(開口数0.75)を備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して得られた3D再構成を示しています。放出および収集後、オルガノイドは小さなバイアルに保存し、さらなる分析(RNAシーケンシングなど)に使用できます。図13Bは、記載されたように収集されたオルガノイドのサンプルの例を示す。
図1:ポリ(ジメチルシロキサン)モールド。 (A)4インチのテクスチャーウェーハのキャストレプリカとして得られた開始PDMSモールド( 補足ファイル1を参照)。(B)開始PDMSモールドの1 cm x 1 cm幅のカット。(C)型の表面に配置された正方形の配列に配置された台形の柱の走査型電子顕微鏡画像。スケールバー= 1 cm(A)、100 μm、および200 μm(それぞれC の上部と下部)。略語:PDMS =ポリ(ジメチシロキサン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フラットPDMS基板 。 (A)厚さ1~1mmのPDMSの層を、標準的な幅15cmのシャーレに調製する。(B)PDMSの新鮮なカットから剥がす。(C)ペトリ皿に残っているPDMSは、さらに使用するためにさらに細かく切ることができます。(D)フラットPDMSカットとPDMSモールドを並べて。フラットPDMSは金型よりも大きいです。略語:PDMS =ポリ(ジメチシロキサン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:基板上に金型を配置し ます。 (A)型は、ピラミッドを下に向けて平らな基板上に置きます。(B)金型とPDMS基板の接触不良(上)と接触良好(下)の外観が異なります。(C)接触不良領域の光学顕微鏡画像。赤い円は、基板と接触していない柱を強調し、同じ画像で接触している柱よりも明るい色で見えます。(D)すべての柱が良好に接触している領域の光学画像。スケールバー = 200 μm (C、D)。略語:PDMS =ポリ(ジメチシロキサン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:UV硬化型接着剤のキャピラリー充填 。 (A)この一連の画像は、(左から右に)一方の端に少量の接着剤を流し込み、金型と基板の間のキャビティに液体接着剤が進行することを示しています。黄色の矢印は、液体の流れの方向を指しています。(b)液面移動の光学画像(倍率40倍)のシーケンス。接触が良好になると、液体の前面は漏れることなくピラミッドの端を移動します。黄色の矢印は流れ方向を指し、赤い矢印は接触エッジの周りを移動する液体フロントの前縁を指します。(C)接触が悪いときに動く液面の光学画像(40倍)のシーケンス。赤い矢印は、金型と基板の間に浸透する液体の前縁を指しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:接着剤硬化後の金型の取り外し。 (A-C)金型を剥がす正しい手順:左端の余分な接着剤をピンセットで軽く押しながら、同じ端の近くで型をつまみ、ゆっくりと曲げて剥がします。 (D)正しい手順の結果。余分な部分は3つのエッジでトリミングされ、4番目の側には少量の過剰なPDMSが残ります(黄色の矢印)。(E-G)金型を取り外すための誤った手順の例:金型を反対側の端からピンセットで挟み込み、金型と一緒に接着フィルムの平らな基材から剥がれます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ガラスカバーガラスのコーティング 。 (A,B)良好なコーティング手順の例:ガラスカバースリップをスピンコーターの真空チャックに置き、中央に十分な接着剤を塗布して、カバーガラスを均一にコーティングします。(C,D)不適切なコーティング手順の例:十分な接着剤が塗布されず、カバーガラスのコーティングが不均一になります。(E)左から順に、良好なコーティング、合格、および悪いコーティングの例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:代替コーティングプロセス 。 (A)液体接着剤の小さな滴がカバーガラスの中央に配置されます。(B)2番目のカバーガラスを最初のカバーガラスの上にそっと置きます。(C,D)液体は2つのカバーガラスの間に広がり、均等に分散されました。(E)カバーガラスを正しく分離した後の結果の例(左)または誤った分離(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:カバーガラスに移します 。 (A)硬化およびトリミングされた接着フィルム(図5D)を、部分的に硬化した接着剤でカバーガラス上に配置します。(B)テクスチャフィルムとカバーガラスとの良好な接触の例。挿入図は、台形空洞間の領域の均一な接触(暗い均一な色)を示す光学画像である。(C)テクスチャフィルムとカバーガラスとの接触不良の例。明るい領域は接触しておらず、赤い矢印はそれらの領域を指しています。挿入図は、良好な接触(左側に2つ)と不十分な接触(右側に2つ)の異なる外観を示す光学画像です。スケールバー(黄色、 B、C)= 200μm。 (D、E)PDMSフラット基板を取り外すための正しい手順:ピンセットを使用して、PDMSの端を過剰なPDMSでつまみ、曲げて穏やかに剥がします。 (F)UV接着剤テクスチャフィルムの結果は、カバーガラスに正常に転写されます。(G,H)誤った剥離手順の例:ピンセットを使用して、余分な材料がトリミングされたエッジの1つで平らなPDMSをつまみます。したがって、フィルムはフラットPDMSと一緒に除去されます。略語:PDMS =ポリ(ジメチシロキサン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:生体模 倣コポリマーによるコーティング。 (A)純粋なエタノール中の0.5%(左)または(B)1%(右)(w / v)の溶液を使用して、生体模倣コポリマーでコーティングされた細胞培養デバイス。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:細胞培養装置の脱気。 (a)完全脱気前の細胞培養装置。(b)完全脱気後の細胞培養装置;(C、D)ピラミッドに気泡が閉じ込められている部分的な脱気のみを備えた細胞培養装置。スケールバー = 200 μm (西暦)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:細胞播種とオルガノイドの成長の代表的な明視野画像 。 (A)細胞が上に浮かんでいるのが見える。(B)細胞懸濁液を洗い流した後に錐体腔に捕捉された細胞。図のように、トラップされたセルのみが保持されます。(C)細胞が凝集して各空洞にスフェロイドを形成する(細胞播種後2日目)。(D)錐体腔内で増殖したオルガノイドの細胞播種後15日目の画像。スケールバー = 200 μm (A B)、120 μm (C)、および 150 μm (D)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:オルガノイドの3Dイメージング 。 (A)神経外胚葉分化下(細胞播種後7日目)のオルガノイドのスピニングディスク共焦点(レンズ40倍、空気、開口数:0.75)を使用して取得した3つの異なるZプラン。オレンジ色のファロイジン(Alexa Fluor 647)と青色のN-カドヘリン免疫染色(Alexa Fluor 561)を使用したアクチン染色。(B)対応するオルガノイド(80 Zプラン、全高100 μm)の画像解析ソフトウェアを使用した3D再構成。白い矢印:高レベルのアクチン発現を有する縞の周りの細胞のクラスター。青い矢印:N-カドヘリンタンパク質発現陽性の細胞クラスター。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図13:オルガノイドの放出 。 (A)ピンセットでテクスチャード加工された接着剤層を除去する。(b)除去後に得られたオルガノイド懸濁液の明視野像。スケールバー= 200μm(B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:ピラミッド型の微小共振器を備えたSiモールドの微細加工のための段階的なプロトコルが提示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
高密度オルガノイド培養と分化を可能にするマイクロウェル培養皿の作製手順は、この論文に記載されています。微小空洞の形状と配置により、数千のスフェロイドを1枚のプレートで長期間(数週間以上)培養および染色することができ、材料の損失はほとんどありません。比較として、細胞培養プレート上の4 mm x 2 mmの領域には、12 cm x 8 cmの面積を持つ単一の384ウェルプレートと同じ数のスフェロイドを含めることができます。
マイクロキャビティの規則的な分布と基板として使用されるフラットな標準カバーガラスにより、培養容器とイメージング支持体の間で複雑で時間のかかるサンプル操作を必要とせずに、何千もの生オルガノイドまたは固定オルガノイドを3Dでモニタリングできます。ベースよりも上部が小さいピラミッド形状のため、培地交換中のピペッティングステップ、細胞外マトリックスの分注、または染色手順によるオルガノイドの損失はありません。これらのステップはすべて、古典的なオルガノイド生成技術(例えば、吊り下げ液滴、低付着プレート、アグリウェル)とは異なり、特別な予防措置なしに2D細胞単層のように直接実行することができる。
さらに、これらの既存の技術と比較して、マイクロウェルは、すべてのタイプの液浸レンズ(空気、水、油、およびシリコン)と互換性のある高解像度3Dイメージング用に設計されています。平らなガラスカバーガラスに閉じたオルガノイドの長期維持により、細胞培養カバースリップは高解像度の光学顕微鏡と互換性がありますが、これは複雑な取り扱いと厳密なオルガノイド移動なしに既存の方法では不可能です。さらに、最適化されたパッシベーション手順により、長期培養のための細胞/オルガノイドの接着を回避し、3D培養の分化を制御します 最後に、テクスチャード加工された接着層は除去可能であるため、生きているオルガノイドを取り出して、オミクスアッセイや in vivo 移植などの他のタイプの実験を行うことができます。
このプロトコルに使用されるマイクロキャビティのピラミッド形状とアレイ配置は、シリコンウェットエッチングによって製造された一次金型に由来し、表面に鏡のような仕上げと45°の傾斜を提供し、単一対物レンズのライトシート顕微鏡(soSPIM11)を可能にすることに注意してください。これらの要件の議論とそのような金型の製造方法に関する完全な説明は他の場所にありますが12,13、簡単なプロトコルも補足ファイル1に記載されています。一次金型を製造するさまざまな方法が利用可能であり、このプロトコルのチップの製造と完全に互換性があります。例えば、ガラスのレーザーエッチングや高解像度3Dプリントは、オルガノイドの封じ込めに適した空洞を持つ一次型を製造するために使用できますが、soSPIMイメージングには適していません。
ここに開示される製造プロトコルは、専用の高度な微細加工ツールを必要としないため、任意の標準的な生物学実験室での使用に適合させることができます。マイクロウェルの製造におけるいくつかの重要なステップは、テクスチャード加工された接着フィルムの毛細管充填による製造およびガラス基板へのその転写である。しかし、私たちの経験では、短期間で高い再現性で習得することができます。ピラミッド間の距離は、オルガノイドの成長のための空洞の密度を増加させるためにできるだけ小さくする必要がありますが、空洞を基板上に漏れたり、それらの間のシールの欠如なしに密閉できるように十分に大きくする必要もあります。この場合、50μmの距離が適切な妥協点であることがわかりました。
細胞播種中の重要な側面は、細胞への侵入を確実にするために空洞内に閉じ込められた気泡を除去することです。ここでは、古典的な実験装置(超音波ホモジナイザーや真空ジャーなど)のみを使用する検証済みのソリューションについて説明します。細胞培養ディッシュあたりの細胞数のより良い均質化を可能にするために、カバーガラスの真上ではなく、ディッシュの側面から細胞懸濁液を分注することをお勧めします。穏やかな手動攪拌は、細胞溶液を均質化するのにも役立ちます。
細胞の播種後、オルガノイドを含む細胞培養皿は、他の古典的な培養支持体と同様に処理することができます。特定の操作や重要な手順は必要ありません。マイクロウェル装置で使用されているすべてのプロトコルは、U底プレートなどの低付着皿で使用されているものと実質的に同じです。したがって、これらのマイクロウェルでのオルガノイド培養は、他の標準と比較して培養条件の変更を必要としません。
もう一つの重要な要素は、ここで使用されている接着剤が光学接着剤であることです。推奨される最適な使用法(ベンダーからのアプリケーションノートも参照)では、接着する2つの光学素子を位置合わせし、UV硬化型接着剤を界面に塗布します。完全な重合を引き起こすには不十分なエネルギーのUVへの最初の曝露は、接着特性を維持しながら接着剤を固化させるために使用されます。光学部品を移動して最適な位置合わせを実現し、接着剤をUVに2回さらして最終状態に完全に硬化させ、永続的な接着力を提供します。第1および第2の露光エネルギー線量(すなわち、既知で一定のエネルギー密度の源が使用される場合の露光時間)は、使用されるUV源のエネルギー密度、接着剤の層の厚さ、光学素子を通るUVの透過、および接着される表面の表面テクスチャリング(またはその欠如)に応じて最適化されなければならない。
テクスチャードフィルムと接着剤でコーティングされたカバーガラスとの間の接着は、漏れ防止シーリングを提供するのに十分な強度である必要がありますが、遺伝子型プロファイリングなどのさらなる分析が必要な場合は、イメージング後にオルガノイドを取得するためにテクスチャードフィルムを除去できることも必要です。ここで説明するプロトコルでは、漏れ防止シーリングとテクスチャフィルムを剥離する機能との間の正しい妥協点が達成されていますが、カバーガラス上の接着剤薄層の予備硬化時間と最終硬化時間のさらなる最適化が必要になる場合がありますUV露光システムと使用する膜厚によって異なります。
現在のマイクロウェルバージョンの1つの制限は、播種手順にあります。セルは、ピラミッドの近くに入ることができるように、ECMコンポーネントの前にシードする必要があります。最初のステップとして、マイクロウェルを細胞外マトリックス成分でコーティングするための改善が進行中です。空洞内の固定オルガノイドの電子顕微鏡(EM)はまだ行っていません。EMを用いたマイクロウェル内のオルガノイドのイメージングが実行可能な選択肢になる前に、これらの製造および細胞培養プロトコルにいくつかの変更が必要になります。
この方法の自然な将来の拡張は、単一のワークフロー(マルチウェルプレート)で多条件試験を可能にするハイコンテントスクリーニング能力を提供することです。この細胞培養装置は、既存のオルガノイド技術に代わるユニークな選択肢を提供し、卓越した培養およびイメージングスループットを提供し、生物医学応用および創薬のためのオルガノイド研究の分野に新しい展望を開きます。
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Disclosures
国際特許出願が公開番号WO 2021/167535 A1で公開されています。
Acknowledgments
この研究は、シンガポールの首相官邸にある国立研究財団が支援するCALIPSOプロジェクトによって、研究卓越性と技術企業のためのキャンパス(CREATE)プログラムの下でサポートされています。V.V.は、NRFの調査員NRF-NRFI2018-07、MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005、MBIシード資金、およびANR ADGasttruloの支援を認めています。A.B.とG.G.は、MBIコア資金からの支援を認めています。A.B.は、BC43顕微鏡の貸与についてAndor Technologiesを認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
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