Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Высокопроизводительная платформа для культуры и 3D-визуализации органоидов

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64405
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3,4, 1,5
1Mechanobiology Institute (MBI), National University of Singapore, 2Biomedical Engineering Department, National University of Singapore, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4IRL 3639 CNRS, 5Department of Microbiology & Immunology, Immunology Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

В этой статье представлен протокол изготовления нового типа культуральной подложки с сотнями микроконтейнеров намм2, в котором органоиды можно культивировать и наблюдать с помощью микроскопии высокого разрешения. Протоколы посева клеток и иммуноокрашивания также детализированы.

Abstract

Характеристика большого количества трехмерных (3D) оловоорганических культур (органоидов) в различных масштабах разрешения в настоящее время ограничена стандартными подходами к визуализации. Этот протокол описывает способ подготовки микрофабрикированных чипов органоидных культур, которые обеспечивают многомасштабную 3D-визуализацию в реальном времени на удобном для пользователя инструменте, требующем минимальных манипуляций и способном к пропускной способности до 300 органоидов в час. Эти микросхемы культуры совместимы как с воздушными, так и с погружными объективами (воздух, вода, масло и силикон) и широким спектром распространенных микроскопов (например, вращающийся диск, конфокальный точечный сканер, широкое поле и яркое поле). Кроме того, они могут использоваться с модальностями светового листа, такими как технология однообъективной одноплоскостной микроскопии освещения (SPIM) (soSPIM).

Протокол, описанный здесь, дает подробные этапы для приготовления микрофабрикированных чипов культуры, а также культивирования и окрашивания органоидов. Для ознакомления требуется лишь небольшой промежуток времени, а расходные материалы и оборудование можно легко найти в обычных биолабораториях. Здесь возможности 3D-визуализации будут продемонстрированы только с помощью коммерческих стандартных микроскопов (например, вращающийся диск для 3D-реконструкции и широкоугольная микроскопия для рутинного мониторинга).

Introduction

В органотипических 3D-клеточных культурах, далее называемых органоидами, стволовые клетки дифференцируются и самоорганизуются в пространственные структуры, которые имеют сильное морфологическое и функциональное сходство с реальными органами. Органоиды предлагают ценные модели для изучения биологии человека и развития вне организма 1,2,3. Все большее число моделей разрабатывается, которые имитируют печень, мозг, почки, легкие и многие другие органы 2,4,5. Дифференцировка в органоидах направляется добавлением растворимых факторов роста и внеклеточного матрикса в точной временной последовательности. Однако в отличие от органов, развитие органоидов довольно неоднородно.

Помимо многочисленных биологических проблем 6,7, органоидные культуры также создают технологические проблемы с точки зрения методов культивирования клеток, характеристики транскриптомики и визуализации. Развитие органов in vivo происходит в биологической среде, что приводит к крайне стереотипной самоорганизации клеточных устройств. Любое фенотипическое изменение может быть использовано в качестве прокси для диагностики болезненного состояния. Напротив, органоиды развиваются in vitro в минимально контролируемых микросредах, совместимых с условиями клеточной культуры, что приводит к большой изменчивости пути развития и формирования формы для каждого отдельного органоида.

Недавнее исследование8 показало, что количественная визуализация органоидной формы (дескрипторы фенотипа) в сочетании с оценкой нескольких генетических маркеров позволяет определить фенотипические ландшафты развития. Можно утверждать, что способность соотносить разнообразие геномной экспрессии в органоидах с их фенотипическим поведением является важным шагом на пути к раскрытию всего потенциала органотипических культур. Таким образом, это требует разработки специализированных подходов к визуализации с высоким содержанием, позволяющих характеризовать органоидные особенности в субклеточных, многоклеточных и цельноорганоидных масштабах в 3D 9,10.

Мы разработали универсальную платформу скрининга с высоким содержанием (HCS), позволяющую оптимизировать органоидную культуру (от изолированных эмбриональных стволовых клеток человека [hESCs], индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток [hIPSC] или первичных клеток до 3D, многоклеточных, дифференцированных органоидов) и быструю, неинвазивную 3D-визуализацию. Он интегрирует миниатюрное устройство 3D-культуры клеток следующего поколения, называемое чипом JeWells ( чип ниже), которое содержит тысячи хорошо расположенных микролунок, окруженных зеркалами 45°, которые позволяют быстро получать 3D-изображения с высоким разрешением с помощью однообъективной световой листовой микроскопии11. Совместимая с любым стандартным, коммерческим, инвертированным микроскопом, эта система позволяет визуализировать 300 органоидов в 3D с субклеточным разрешением за <1 ч.

Микропроизводство устройства для культивирования клеток начинается с существующей микроструктурированной формы, которая содержит сотни микропирамид (рисунок 1А) с квадратным основанием и боковыми стенками под углом 45° по отношению к основанию. На рисунке 1С показаны изображения таких структур в электронном микроскопе (ЭМ). Сама форма изготовлена из поли(диметилсилоксана) (PDMS) и может быть изготовлена в виде реплики отливки первичной формы (не показана здесь) с соответствующими характеристиками (в виде полостей) с использованием стандартных мягко-литографических процедур. Первичная форма может быть изготовлена различными процедурами. Тот, который использовался для этого протокола, был сделан с использованием кремниевого влажного травления, как сообщалось в Galland et al. 11; процедура изготовления первичной формы не является критической для этого протокола. Пирамиды расположены в квадратном массиве, с одинаковым шагом для направлений X и Y (в этом случае шаг составляет 350 мкм).

В качестве иллюстрации были опубликованы экспериментальные эксперименты12 , чтобы продемонстрировать, что чип допускает долгосрочную культуру (месяцы) и протоколы дифференцировки, точно определяя количество начальных ячеек в скважинах. Индивидуальное развитие большого количества органоидов может автоматически контролироваться в режиме реального времени с помощью стандартных ярко-полевых и 3D-флуоресцентных микроскопов. Кроме того, органоиды могут быть извлечены для выполнения дальнейших биологических исследований (например, транскриптомного анализа). В этой статье описываются подробные протоколы изготовления покровных пластинок клеточной культуры, процедура посева и окрашивания для флуоресцентной микроскопии, а также извлечение органоидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: В первой части этого протокола подробно описывается микропроизводство устройства для культивирования клеток. Оригинальная первичная форма с пирамидальными полостями может быть изготовлена собственными силами, если имеются микроизготовительные установки, или передана на аутсорсинг внешним компаниям. Первичная пресс-форма, используемая в этой работе, производится собственными силами, а этапы процесса изготовления описаны в другом месте11,13. Базовый протокол микрофабрикации пресс-формы доступен в дополнительном файле 1. КРИТИЧЕСКИЙ: Операции на этапах с 1 по 6 должны проводиться в свободной от пыли среде. Предпочтительнее ламинарный вытяжка или чистая комната, если таковая имеется. На всех этих этапах необходимо использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как перчатки, лабораторный халат и защитные очки.

1. Нарезка пресс-формы PDMS

  1. Отрежьте небольшие участки формы PDMS до размера, необходимого для конечного устройства (например, 1 см x 1 см [Рисунок 1B]). Вырежьте их параллельно направлениям XY массива.
    КРИТИЧЕСКИЙ: При резке формы PDMS на кубики размером 1 см х 1 см выполняйте разрезы в один этап; используя односторонний бритвенный клинок, примените давление и прорежьте PDMS за один шаг. Это делается для предотвращения образования мелких частиц PDMS, которые могут оседать на поверхности пресс-формы и влиять на качество стадий реплики (этап 3).

2. Подготовка плоских подложек PDMS

  1. Взвесьте ~15-20 г базовой смолы PDMS и 1,5-2 г ее сетчатого агента (т.е. соотношение 10:1), тщательно перемешайте их и дегазируйте в вакуумной банке в течение ~20 мин.
  2. Медленно вылейте дегазированную PDMS на пластиковую чашку Петри шириной 15 см (диаметром).
  3. Вылечите PDMS, храня чашку Петри в духовке при температуре 65°C в течение 2 ч. После ожидания завершения отверждения плоская пленка PDMS толщиной ~1,5 мм (содержащаяся в чашке Петри) готова к использованию (рисунок 2A).
  4. С помощью острого лезвия вырежьте из PDMS куски размером 2 см х 2 см (рисунок 2B-D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точная толщина этого листа PDMS не является критической; ~1-2 мм является подходящим диапазоном. Размер для разреза должен быть больше, чем текстурированная форма, но не намного больше, что приведет к потере материала.

3. Производство текстурированного слоя из УФ-отверждаемого клея

  1. Поместите один кубик формы PDMS (подготовленный на этапе 1) лицевой стороной вниз поверх плоского разреза PDMS (как подготовлено на этапе 2) (рисунок 3A, B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пирамидальные выступы в пресс-форме ориентированы на плоскую подложку PDMS и что только верхняя поверхность усеченных пирамид находится в контакте. Оцените правильное размещение с помощью оптического микроскопа (рисунок 3C,D).
  2. На одну сторону формы, используя пипетку, опустите небольшое количество (две капли, примерно 0,1-0,2 мл) УФ-отверждаемого клея (рисунок 4А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда жидкость вступает в контакт с краем формы, капиллярность будет заставлять жидкость заполнять полость между самой формой и плоским срезом PDMS, используемым в качестве подложки.
    1. Проследите за прогрессированием жидкости внутри полости, например, с помощью перевернутого оптического микроскопа с 10-кратным увеличением объектива (рисунок 4B, C).
  3. Подвергайте УФ-отверждаемый клей воздействию ультрафиолетового света, чтобы вылечить его. Отрегулируйте время воздействия в зависимости от плотности мощности используемого УФ-источника (например, УФ-светодиодная коробка с плотностью мощности 35 мВт/см2; 2 мин при 50% мощности в этом протоколе для полного отверждения клея).
  4. Используя избыточное количество клея на одном краю, удерживайте отвержденный клей на плоской подложке PDMS, осторожно надавливая пальцем (рисунок 5A,B). Между тем, используйте пинцет, чтобы зажать один угол формы рядом с тем же краем, который удерживается, и медленно отклеить его, убедившись, что текстурированная пленка также не поднимается вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5C показан результат правильной процедуры удаления плесени; На рисунке 5E-G показана неправильная процедура.
  5. Обрежьте избыток клея и избыточную подложку PDMS с помощью лезвия бритвы, чтобы оставить отвержденный, текстурированный, клеевой слой плоским на PDMS с избытком PDMS только на одном краю (рисунок 5D), что потребуется на этапе 5.

4. Подготовка покровного субстрата

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве подложки для конечного устройства используются стандартные закругленные крышки 1,5Н диаметром 25 мм. Прежде чем их можно будет использовать, их необходимо очистить, чтобы удалить пыль и / или органический остаток с их поверхности.

  1. Очистка крышки
    1. Погрузите крышки в мыльную воду на 5 мин во время применения ультразвука (40 кГц, звуковая мощность 110 Вт).
    2. Промойте крышки в чистой деионизированной (DI) воде, сначала погружением и, наконец, проточной водой DI из-под крана. Высушите крышкигазовым выдувным пистолетом N2.
    3. Погрузите крышки в ацетоновую ванну на 5 мин; сразу же перейти к 2-пропанольной (IPA) ванне еще на 5 мин.
    4. Промойте крышки чистым IPA с помощью бутылочки для выжимания. Высушите крышки газовым выдувным пистолетом N2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чехлы, очищенные с помощью этой процедуры, можно хранить в закрытом контейнере до тех пор, пока это не понадобится. Храните их в сухом шкафу, чтобы избежать осаждения влаги на их поверхности.
  2. Когда он будет готов к использованию, обработайте чистый покров коротким плазменным процессом O2 для улучшения его гидрофильности: O2 20 sccm, давление 3 мбар, 60 Вт в радиочастотном генераторе и продолжительность 60 с.
  3. Сразу после плазменной активации приступайте к спин-покрытию тонкого слоя УФ-отверждаемого клея, помещая крышку на вакуумный патрон стандартного спин-коатера и заливая небольшую каплю клея в центр обтекателя (рисунок 6). Запустите процесс спин-покрытия: разбрасывание в течение 5 с при 500 об/мин, покрытие при 3000 об/мин в течение 45 с (с ускорением и замедлением на уровне 100 об/с).
    1. Если спин-покрытие недоступно, используйте следующий альтернативный способ получения тонкой пленки УФ-клея на крышках:
      1. На чистый покров капли ~0,1 мл УФ-отверждаемого клея с помощью пипетки (рисунок 7А).
      2. Возьмите второй обшивочный лист и поместите его поверх первого, чтобы жидкий клей равномерно распределился между двумя крышками (рисунок 7B-D).
      3. Как только растекающийся клей достигнет краев чехлов, аккуратно разделите их, скользя один над другим. После разделения оба обтекателя полностью покрываются тонким слоем жидкого клея (рисунок 7E).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие может быть неравномерным и гладким только в том случае, если разделение не осуществляется плавным и непрерывным движением.
  4. Предварительное отверждение УФ-отверждаемого клея
    1. После спин-покрытия предварительно нанесите клей под воздействием ультрафиолета. Отрегулируйте время экспозиции в зависимости от плотности мощности используемого УФ-источника (здесь в течение 1 мин при 50% мощности использовалась УФ-светодиодная коробка плотностью мощности 35 мВт/см2 ).
      КРИТИЧЕСКИЙ: Клей, используемый здесь, является оптическим клеем. Смотрите обсуждение ключевых моментов, связанных с энергетическими дозами для его лечения.

5. Перенос текстурированной пленки на конечную подложку

  1. Возьмите одну из текстурированных пленок (подготовленную на этапе 3) и поместите ее в контакт с покрытой клеем крышкой (подготовленной на этапе 4). Убедитесь, что контакт между частично отвержденным клеем на крышке и текстурированной пленкой является как можно более однородным (рисунок 8A-C).
    КРИТИЧЕСКИЙ: На этом этапе клей на крышке должен быть достаточно твердым, чтобы избежать переплавки, которая заполнила бы пирамидальные полости текстурированной пленки при контакте, но также была бы достаточно пластичной и клейкой, чтобы контакт можно было оптимизировать, осторожно надавливая на текстурированную пленку.
  2. Подвергайте крышки воздействию ультрафиолетового излучения до тех пор, пока клеевой слой, покрытый на крышке, не будет полностью отвержден. Это запечатает текстурированную пленку на крышке и обеспечит герметичную изоляцию между пирамидальными полостями.
  3. Наконец, снимите плоскую подложку PDMS (рисунок 8D-F). Используя пинцет, зажмите PDMS на один угол по краю, где после обрезки остался лишний материал (шаг 3.5). Таким образом, текстурированный слой пленки остается клеевым к крышке с открытым доступом в верхней части для посева клеток. КРИТИЧЕСКИЙ: При отслаивании плоской PDMS текстурированная пленка должна хорошо прикрепляться к крышке. Отказы адгезии легко подтверждаются, если текстурированная пленка может быть отслоена от крышки после окончательного воздействия ультрафиолета без каких-либо усилий.

6. Длительная пассивация покрова клеточной культуры для клеточной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассивация достигается путем создания конформного и непрерывного покрытия биомиметического сополимера со структурой, аналогичной полярной группе фосфолипидов в клеточной мембране. Это конформное покрытие предотвращает адгезию клеток к устройству клеточной культуры

  1. Готовят раствор с 0,5% (мас./об.) биомиметического сополимера, растворенного в чистом этаноле. Храните раствор при температуре 4 °C для будущего использования.
  2. Поместите покров клеточной культуры в чашку Петри 35 мм и полностью накройте ее раствором биомиметического сополимера.
  3. Через 5 мин вынимают покров клеточной культуры из емкости с раствором биомиметического сополимера и оставляют сушиться при комнатной температуре внутри конечной посуды в вытяжке биобезопасности (>1 ч).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстое покрытие может быть получено путем увеличения концентрации биомиметического сополимера в растворе покрытия; результаты более толстого покрытия видны под микроскопом яркого поля (рисунок 9А).

7. Посев клеток

  1. Дегазация и стерилизация
    1. Непосредственно перед посевом клеток дозируйте стерильный фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) в чашки для культивирования клеток (обычно 1 мл для чашки Петри толщиной 35 мм). Дегазируйте блюдо со стерильным PBS с помощью ультразвукового устройства в течение ~ 10 минут с последующим несколькими раундами пипетки, чтобы удалить все пузырьки.
      КРИТИЧЕСКИЙ: Если воздух захвачен внутри пирамидальных полостей, это предотвратит попадание клеток в них. Чтобы убедиться, что в пирамиде нет воздуха, захваченного перед посевом клеток, рекомендуется визуально обеспечить (под настольным микроскопом Brightfield при 10-кратном или 20-кратном увеличении) отсутствие воздуха в этих полостях (рисунок 10).
    2. Замените PBS стерильной питательной средой и стерилизуйте пластину ультрафиолетовым светом в течение 30 минут под вытяжкой клеточной культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, блюдо следует рассматривать как стерильное и манипулировать с использованием стерильных методов. Альтернативным способом удаления захваченного воздуха из устройства культивирования клеток является использование вакуумной банки с вакуумным насосом.
  2. Приготовление клеточной суспензии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки могут быть засеяны как одно- или мелкоклеточные агрегаты и входить в пробные колодцы через верхнюю апертуру. Со временем вставленные клетки агрегируются и вырастают внутри пробных колодцев в сфероиды размером, превышающим размер отверстия. В качестве проверенных моделей клеточных линий используйте раковые клетки HCT116 (CCL-247 ATCC) или MCF7 (HTB-22 ATCC), хранящиеся в рекомендуемой культуральной среде (руководящие принципы ATCC).
    1. Приготовьте клеточную суспензию (например, используя процесс трипсинизации в соответствии с рекомендациями ATCC). Следуйте рекомендациям по трипсинизации/приготовлению клеточной суспензии для интересующих клеток.
    2. Подсчитайте и отрегулируйте концентрацию клеток до 0,5 × 106 клеток/мл в рекомендуемой питательной среде.
  3. Дозирование клеток
    1. Извлеките буфер PBS из чашки для культивирования клеток толщиной 35 мм, а затем дозируйте 1 мл скорректированной клеточной суспензии. См. рисунок 11А для изображения в оптический микроскоп процедуры посева клеток с адекватной плотностью и однородностью клеток.
    2. Поместите чашку для культивирования клеток обратно в клеточный инкубатор (37 °C, 5% CO2 и 100% влажность) на 10 мин. Примерно 80-100 клеток войдут в каждую пирамидальную полость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно увеличить количество клеток на чашку для клеточной культуры, увеличив либо концентрацию клеток, либо время, затраченное на удаление клеточной суспензии. Как правило, формирование сфероидов занимает несколько часов (в зависимости от типа клеток) после посева клеток и может сопровождаться ярким микроскопом (от 4x до 40x объективов; Рисунок 11). Отсюда культуральная среда, внеклеточные матрицы и факторы роста дифференцировки могут быть изменены или добавлены в чашку клеточной культуры, содержащую сфероиды, в соответствии с типичными протоколами дифференцировки, которые могут длиться несколько дней, недель или месяцев.
    3. После 10-минутной инкубации извлеките чашку для культивирования клеток из инкубатора и осторожно аспирируйте клеточную суспензию, чтобы удалить непопадающие клетки. Добавьте 1 мл питательной среды в посуду диаметром 35 мм и поместите обратно в клеточный инкубатор.
      КРИТИЧЕСКИЙ: На этом этапе, поскольку сфероиды еще не сформировались, очень важно избегать сильной аспирации или дозирования, которые приведут к потере клеток. Визуальный контроль с помощью настольного микроскопа Brightfield настоятельно рекомендуется на этом этапе.

8. Иммуноокрашивание и визуализация

  1. Фиксация и окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные классические процедуры фиксации и иммуноокрашивания полностью совместимы с чашкой для клеточной культуры. Один типичный протокол описан здесь.
    1. Зафиксируйте органоиды/сфероиды в чашке для клеточной культуры в течение 20 мин в 4% параформальдегиде при комнатной температуре.
    2. Пермеабилизируют органоиды в течение 24 ч в 1% растворе поверхностно-активного вещества в стерильном PBS при 4 °C на орбитальном шейкере и инкубируют в течение 24 ч в блокирующем буфере (2% бычьего сывороточного альбумина [BSA] и 1% поверхностно-активного вещества в стерильном PBS) при 4 °C на орбитальном шейкере.
    3. Инкубировать образцы с первичными антителами, представляющими интерес, в разведении между 1/50 и 1/200 (или в соответствии с рекомендациями производителя) в буфере разбавления антител (2% BSA и 0,2% поверхностно-активного вещества в стерильном PBS) при 4 °C в течение 48 ч.
    4. Промыть образцы 3x с промывочным буфером на орбитальном шейкере (3% NaCl и 0,2% поверхностно-активного вещества в стерильном PBS) и инкубировать с соответствующими вторичными антителами в буфере разбавления антител (разбавление между 1/100 и 1/300 или в соответствии с рекомендациями производителя), 0,5 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и 0,2 мкг/мл Alexa Fluor 647 или 488 фаллоидин при 4 °C в течение 24 ч на орбитальном шейкере, затем следуют пять шагов полоскания с помощью PBS. Опционально монтируйте образцы с помощью водорастворимого очищающего агента, предварительно расплавленного до 37 °C.
  2. Отображение
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе органоиды в микролуночной пластине можно рассматривать как обычную культуральную чашку, содержащую фиксированные и окрашенные образцы для визуализации: любая стандартная процедура визуализации может быть использована без адаптации или модификации. Фиг.12 иллюстрирует репрезентативный результат изображений и 3D-реконструкции, полученных с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа, с 40-кратным воздушным объективом (числовая апертура 0,75).
    1. Используйте программное обеспечение конструктора для автоматического процесса получения изображения со следующими настройками: время экспозиции = 50 мс, с z моторизованной ступенью для получения z-стека (Z-шаг 1 мкм, для общей высоты 70 мкм).
    2. Выполняйте 3D-реконструкцию с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

9. Высвобождение и сбор органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Текстурированный адгезивный слой чашки для клеточной культуры может быть отделен от покровного листа для высвобождения живых сфероидов / органоидов (до фиксации), содержащихся внутри пирамидных полостей, для анализа клеток с помощью других процедур, таких как секвенирование РНК, -омические подходы, эксперименты in vitro и трансплантация in vivo .

  1. Когда образец все еще находится в чашке Петри и в вытяжке биобезопасности, используйте лезвие, такое как скальпель, чтобы срезать угол текстурированного слоя клея.
  2. Пинцетом зажмите текстурированный клейкий слой на срезанном крае и аккуратно отклейте его от стеклянной крышки, но держите его погруженным в среду (некоторые органоиды могут оставаться с клеевым слоем, рисунок 13).
  3. Промыть 3 раза питательной средой и собрать органоиды путем пипетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 8F показан типичный аспект покрова клеточной культуры после успешного изготовления. УФ-отверждаемый клейкий слой выглядит плоским и хорошо прилипает к крышке. Перенос клеевого слоя на крышке может завершиться, если слой на крышке затвердел или если удаление плоской подложки PDMS выполнено неправильно (как показано на рисунке 8G, H). В обоих случаях неисправность очевидна, так как текстурированная пленка не переносится на крышку.

Для работы микролунок текстурированная пленка, полученная (как описано в протокольном этапе 3), должна иметь как верхнюю, так и нижнюю стороны пирамид, чтобы гарантировать, что клетки во время посева на стадии 7 могут проникать в полости и оставаться содержащимися после того, как органоиды начнут формироваться. На фиг.9 показано увеличение толщины покрытия за счет увеличения концентрации биомиметического сополимера в растворе покрытия. На рисунке 10 показаны результаты дегазации чашек для клеточной культуры, чтобы гарантировать, что воздух не задерживается в пирамидальных полостях. На рисунке 10A,B показана полная дегазация, в то время как на рисунке 10C,D показаны пузырьки воздуха в пирамидальных полостях.

На рисунке 11 клетки попадают внутрь пирамид, а соответствующие органоиды образуются после 2 и 15 дней культивирования. Если верхнее отверстие микролунок вместо этого закрыто (как следствие неправильного шага 3), после промывки образца после посева клеток не останется никаких клеток. На рисунке 12 показаны репрезентативные изображения органоидов и 3D-реконструкция, полученная с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа с 40-кратным воздушным объективом (числовая диафрагма 0,75). После высвобождения и сбора органоиды могут храниться в небольшом флаконе и использоваться для дальнейшего анализа (например, секвенирования РНК). На рисунке 13B показан пример образца органоидов, собранных, как описано.

Figure 1
Рисунок 1: Поли(диметилсилоксановая) форма. (А) Исходная форма PDMS, полученная в виде литой копии 4"текстурированной пластины (см. Дополнительный файл 1). (B) Разрез начальной формы PDMS шириной 1 см х 1 см. (C) Сканирующий электронный микроскоп изображения трапециевидных столбов, расположенных в квадратном массиве, которые заполняют поверхность формы. Шкала стержней = 1 см (A), 100 мкм и 200 мкм (C сверху и снизу соответственно). Аббревиатура: PDMS = поли(диметисилоксан). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Плоская подложка PDMS. (A) Слой PDMS, толщиной ~1 мм, готовится в стандартной чашке Петри шириной 15 см. (B) Отслаивание свежего среза PDMS. (C) Оставшуюся PDMS на чашке Петри можно разрезать на большее количество частей для дальнейшего использования. (D) Плоский разрез PDMS и форма PDMS бок о бок; плоская PDMS больше, чем пресс-форма. Аббревиатура: PDMS = поли(диметисилоксан). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Размещение формы на подложке. (A) Форма помещается на плоскую подложку пирамидами, обращенными вниз. (B) Различный внешний вид плохого контакта (сверху) и хорошего контакта (снизу) между пресс-формой и подложкой PDMS. (C) Изображение оптическим микроскопом области с плохим контактом; красные круги выделяют столбы, не соприкасающиеся с подложкой — они выглядят более яркого цвета, чем те, которые соприкасаются на том же изображении. (D) Оптическое изображение области, где все столбы находятся в хорошем контакте. Шкала стержней = 200 мкм (C,D). Аббревиатура: PDMS = поли(диметисилоксан). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Капиллярное заполнение УФ-отверждаемого клея. (А) Эта последовательность изображений показывает (слева направо) заливку небольшого количества клея на один край и прогрессирование жидкого клея в полости между формой и подложкой. Желтые стрелки указывают на направление потока жидкости. (B) Последовательность оптических изображений (40-кратное увеличение) движущихся вперед жидкостей; при хорошем контакте передняя часть жидкости перемещается по краям пирамид без утечек. Желтые стрелки указывают на направление потока, а красные стрелки указывают на передний край фронта жидкости, движущегося вокруг контактных краев. C) последовательность оптических изображений (40x) жидкости, движущейся впереди при плохом контакте; красные стрелки указывают на передний край жидкости, проникающей между формой и подложкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Удаление формы после адгезивного отверждения. (A-C) Правильная процедура отслаивания формы: при осторожном надавливании на избыток клея по левым краям пинцетом, форма защемляется возле того же края и медленно сгибается, чтобы отслаиваться. (D) Результат правильной процедуры; избыток обрезается по трем краям, в то время как небольшой избыток PDMS остается на четвертой стороне (желтая стрелка). (Е-Г) Пример неправильной процедуры удаления формы: пресс-форма защемляется пинцетом с противоположного края, в результате чего с плоской подложки отслаивается клейкая пленка вместе с формой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Покрытие стеклянной крышки. (A,B) Пример хорошей процедуры нанесения покрытия: стеклянная крышка помещается на вакуумный патрон спин-коатера, и в центре дозируется достаточное количество клея, что дает однородное покрытие крышки. (С,Г) Пример плохой процедуры нанесения покрытия: не выделяется достаточное количество клея, в результате чего образуется неравномерное покрытие покровного листа. (E) Слева направо, примеры хорошего, приемлемого и плохого покрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Альтернативный процесс нанесения покрытия. (A) Небольшая капля жидкого клея помещается в центр крышки. (B) Вторая крышка аккуратно помещается поверх первой. (С,Г) Жидкость распределяется между двумя крышками и равномерно распределяется. (E) Примеры результатов после правильного разделения облицовок (слева) или неправильного разделения (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Перенос на крышку. (A) Отвержденная и обрезанная клейкая пленка (рисунок 5D) помещается на крышку с частично отвержденным клеем. (B) Пример хорошего контакта между текстурированной пленкой и крышкой. Вставка представляет собой оптическое изображение, показывающее равномерный контакт областей между трапециевидными полостями (темный равномерный цвет). (C) Пример плохого контакта между текстурированной пленкой и крышкой. Более яркие области не контактируют, красные стрелки указывают на эти области. Вставка представляет собой оптическое изображение, показывающее различное внешнее вид хорошего контакта (два слева) и плохого контакта (два справа). Шкала полос (желтый, B,C) = 200 мкм. (D,E) Правильная процедура удаления плоской подложки PDMS: пинцет используется для защемления PDMS по краю с избытком PDMS и изгиба для мягкого отслаивания. (F) Результат с УФ-клеевой текстурированной пленкой, успешно перенесенной на крышку. (Г,Ч) Пример неправильной процедуры пилинга: пинцет используется для защемления плоской PDMS по одному из краев, где был обрезан лишний материал; таким образом, пленка снимается вместе с плоским PDMS. Аббревиатура: PDMS = поли(диметисилоксан). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Покрытие биомиметическим сополимером. (А) Устройство клеточной культуры, покрытое биомиметическим сополимером, используют раствор 0,5% (слева) или (В) 1% (справа) (мас./об.) в чистом этаноле. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Устройство дегазации клеточной культуры. (A) Устройство для культивирования клеток перед полной дегазацией. (B) Устройство для культивирования клеток после полной дегазации; (C,D) устройство для культивирования клеток с лишь частичной дегазацией, когда пузырьки воздуха задерживаются в пирамидах. Шкала стержней = 200 мкм (A-D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 11
Рисунок 11: Репрезентативные яркие изображения посева клеток и роста органоидов. (А) Клетки видны плавающими сверху. (B) Клетки, захваченные в пирамидальных полостях после смывания клеточной суспензии. Только захваченные клетки будут сохранены, как показано на рисунке. (C) Клетки объединяются с образованием сфероидов в каждой полости (день 2 после посева клеток). (D) Изображение на 15-й день после посева клеток органоида, выросшего в пирамидальной полости. Шкала стержней = 200 мкм (A B), 120 мкм (C) и 150 мкм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 12
Рисунок 12: 3D-визуализация органоидов. (A) Три различных Z-плана, полученных с помощью конфокального вращающегося диска (линза 40x, воздух, числовая диафрагма: 0,75) органоида при дифференцировке нейроэктодермы (день 7 после посева клеток). Окрашивание актином с использованием фаллоидина (Alexa Fluor 647) в оранжевом цвете и иммуноокрашивания N-кадгерина (Alexa Fluor 561) в синем цвете. (B) 3D-реконструкция с использованием программного обеспечения для анализа изображений соответствующих органоидов (планы 80 Z, общая высота 100 мкм). Белые стрелки: скопления клеток вокруг полосы с высоким уровнем экспрессии актина. Синие стрелки: кластеры клеток, положительные для экспрессии белка N-кадгерина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 13
Рисунок 13: Высвобождение органоидов. (А) Удаление текстурированного адгезивного слоя пинцетом; (B) яркое полевое изображение органоидной суспензии, полученное после удаления. Шкала бара = 200 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Представлен пошаговый протокол для микрофабрикации формы Si с пирамидальными микрополостями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной работе описана процедура изготовления чашки для микроскважинной культуры, которая позволяет культивировать и дифференцировать органоиды высокой плотности. Благодаря геометрии и расположению микрополот, тысячи сфероидов могут быть культивированы и окрашены в одну пластину в течение длительных периодов времени (несколько недель или более) почти без потери материала. Для сравнения, площадь 4 мм х 2 мм на пластине клеточной культуры может содержать столько же сфероидов, сколько одна 384-луночная пластина с площадью 12 см х 8 см.

Регулярное распределение микрополот и плоский стандартный покров, используемый в качестве подложки, позволяют контролировать тысячи живых или фиксированных органоидов в 3D без необходимости сложных и трудоемких манипуляций с образцами между культивирующими сосудами и опорами визуализации. Благодаря форме пирамиды с меньшим верхом, чем основание, не происходит потери органоидов из-за этапов пипетирования во время среднего обмена, дозирования внеклеточных матриц или процедур окрашивания. Все эти шаги могут быть выполнены напрямую, как для монослоя 2D-клеток без каких-либо дополнительных мер предосторожности, в отличие от классических методов генерации органоидов (например, подвесные капли, пластины с низким креплением, Aggrewell).

Более того, по сравнению с этими существующими методами, микровеллы были разработаны для 3D-визуализации с высоким разрешением, совместимой со всеми типами иммерсионных линз (воздух, вода, масло и кремний). Длительное поддержание органоидов, закрытых плоскому стеклянному покрову, делает покров клеточной культуры совместимым со световыми микроскопами высокого разрешения, что невозможно существующими методами без сложного обращения и привередливого переноса органоидов. Кроме того, оптимизированная процедура пассивации позволяет избежать любой адгезии клеток / органоидов для долгосрочной культуры, тем самым контролируя дифференцировку 3D-культуры Наконец, поскольку текстурированный адгезивный слой является съемным, живые органоиды могут быть извлечены для выполнения других типов экспериментов, таких как анализы -omics или трансплантация in vivo .

Следует отметить, что пирамидальная форма и расположение массивов микрополошин, используемых для этого протокола, получены из первичной формы, которая была изготовлена с помощью кремниевого мокрого травления для обеспечения поверхностей с зеркальной отделкой и наклоном 45°, чтобы обеспечить однообъективную микроскопию светового листа (soSPIM11). В то время как обсуждение этих требований и полное описание того, как производить такие формы, можно найти в другом месте12,13, простой протокол также приведен в Дополнительном файле 1. Доступны различные способы изготовления первичной формы, которые полностью совместимы с изготовлением чипов в этом протоколе. Лазерное травление стекла и 3D-печать с высоким разрешением, например, могут быть использованы для получения первичной формы с подходящими полостями для удержания органоидов, но не подходят для визуализации soSPIM.

Протокол изготовления, описанный здесь, может быть адаптирован для использования в любой стандартной биологической лаборатории, поскольку не требуется никаких специальных, передовых инструментов микропроизводства. Некоторыми критическими этапами изготовления микролунок являются производство через капиллярное заполнение текстурированной клеевой пленки и ее перенос на стеклянную подложку. Однако, по нашему опыту, они могут быть освоены с высокой воспроизводимостью за короткий промежуток времени. Расстояние между пирамидами должно быть как можно меньше, чтобы увеличить плотность полостей для роста органоидов, но оно также должно быть достаточно большим, чтобы полости могли быть запечатаны на подложке без какой-либо утечки или отсутствия герметизации между ними. Мы обнаружили, что расстояние в 50 мкм является хорошим компромиссом для этого случая.

Во время посева клеток критическим аспектом является удаление любых пузырьков воздуха, захваченных внутри полостей, для обеспечения входа в клетку. Здесь мы описываем валидированное решение, в котором используется только классическое лабораторное оборудование (например, ультразвуковой гомогенизатор или вакуумная банка). Чтобы обеспечить лучшую гомогенизацию количества клеток на чашку для культивирования клеток, рекомендуется дозировать клеточную суспензию со стороны тарелки, а не непосредственно над крышкой. Мягкое ручное перемешивание также может помочь гомогенизировать клеточный раствор.

После посева клеток чашку для культивирования клеток с органоидами можно обрабатывать, как и любую другую классическую культуральную опору; никаких конкретных манипуляций или критических шагов не требуется. Все протоколы, которые использовались с устройствами microwell, практически такие же, как и те, которые используются в посуде с низким креплением, такой как U-образные нижние пластины. Следовательно, органоидная культура в этих микролунках не требует каких-либо изменений условий культивирования по сравнению с другими стандартами.

Другим критическим фактором является то, что клей, используемый здесь, является оптическим клеем. В предлагаемом наилучшем использовании (также см. примечания по применению от поставщика) два оптических элемента, подлежащих склеиванию, выравниваются, а на интерфейс наносится УФ-отверждаемый клей. Первое воздействие ультрафиолета энергии, недостаточной для полной полимеризации, используется для затвердевания клея при сохранении адгезионных свойств. Оптические компоненты могут быть перемещены для достижения оптимального выравнивания, а затем клей полностью отверждается до своего конечного состояния со вторым воздействием ультрафиолета для обеспечения постоянной адгезии. Первая и вторая дозы энергии воздействия (т.е. время воздействия, если используется источник известной и постоянной плотности энергии) должны быть оптимизированы в зависимости от плотности энергии используемого источника УФ-излучения, толщины слоя клея, пропускания УФ-излучения через оптические элементы и текстурирования поверхности (или ее отсутствия) поверхности, подлежащей склеиванию.

В то время как адгезия между текстурированной пленкой и крышкой с адгезионным покрытием должна быть достаточно прочной, чтобы обеспечить герметичное уплотнение, также должна быть возможность удалить текстурированную пленку для извлечения органоидов после визуализации, если требуется какой-либо дальнейший анализ, такой как генотипическое профилирование. Правильный компромисс между герметичным уплотнением и возможностью отслаивания текстурированной пленки был достигнут с помощью протокола, описанного здесь, но может потребоваться дальнейшая оптимизация времени предварительного отверждения и окончательного отверждения для тонкого слоя клея на крышке, поскольку это зависит от системы воздействия ультрафиолета и используемой толщины пленки.

Одним из ограничений в текущей версии микролунок является процедура посева; клетки должны быть засеяны перед компонентами ECM, чтобы они могли войти в окрестности пирамиды. Продолжаются улучшения, чтобы покрыть микровеллы компонентами внеклеточного матрикса в качестве первого шага. Мы еще не проводили никакой электронной микроскопии (ЭМ) на фиксированных органоидах в полостях. Потребуется некоторая модификация этих протоколов изготовления и клеточной культуры, прежде чем визуализация органоидов в микролунках с ЭМ станет жизнеспособным вариантом.

Естественным будущим расширением этого метода является обеспечение возможностей скрининга с высоким содержанием, позволяющих проводить многокондиционные испытания в рамках одного рабочего процесса (пластина с несколькими скважинами). Это устройство клеточной культуры обеспечивает уникальную альтернативу существующим органоидным методам, предлагая непревзойденную пропускную способность культивирования и визуализации и открывая новые перспективы в области исследований органоидов для биомедицинского применения и открытия лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Опубликована международная патентная заявка с номером публикации WO 2021/167535 A1.

Acknowledgments

Исследование поддерживается проектом CALIPSO, поддерживаемым Национальным исследовательским фондом, канцелярией премьер-министра Сингапура, в рамках его программы Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. признает поддержку исследователя NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, начального финансирования MBI и ANR ADGastrulo. A.B. и G.G. признают поддержку со стороны основного финансирования MBI. A.B. выражает признательность Andor Technologies за предоставление в аренду микроскопа BC43.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Thermofisher scientific AA19397K7
Acetone Thermofisher scientific AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope Andor Technology spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin  Thermofisher scientific 37525
Buffered oxide etching solution Merck 901621-1L
CEE Spin Coater Brewer Science 200X
DAPI Thermofisher scientific 62248
Developer AZ400K Merck 18441223164
DI Milliq water Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 10082147
Glass coverslips Marienfled 117650 1.5H, round 25 mm diameter
Hepes Invitrogen 15630080
Imaris software BitPlane image analysis software
Inverted Transmission optical microscope Nikon TSF100-F
Labsonic M Sartorius Stedium Biotech Ultrasonic homogenizer
Lipidure NOF America CM5206 bio-mimetic copolymer
NOA73 Norland Products 17-345 UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070063
Phalloidin Thermofisher scientific  A12379 Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution Thermofisher scientific 10010023
Photo Resist AZ5214E Merck 14744719710
Pico Plasma tool Diener Electronic GmbH + Co. KG Pico Plasma For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52 Sunjin lab RC 152001 water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool Samco Inc. (JPN) RIE-10NR
RPMI 1640 Invitrogen 11875093 culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich 448931-10G
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284 surfactant
Trypsin EDTA Thermofisher scientific 15400054
Ultrasonic Cleaner Bransonic CPX2800
UV-KUB 2 KLOE UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner SUSS Microtec Semiconductor (DE) MJB4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
  4. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  5. O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
  6. Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
  7. Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
  8. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  9. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  10. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  11. Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  12. Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
  13. Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).

Tags

Биология выпуск 188
Высокопроизводительная платформа для культуры и 3D-визуализации органоидов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad… More

Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad Raffi, S. B., Marchand, M., Suryana, M., Sahni, G., Viasnoff, V., Beghin, A. A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids. J. Vis. Exp. (188), e64405, doi:10.3791/64405 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter