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Biology

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64405
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3,4, 1,5
1Mechanobiology Institute (MBI), National University of Singapore, 2Biomedical Engineering Department, National University of Singapore, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4IRL 3639 CNRS, 5Department of Microbiology & Immunology, Immunology Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

Este artículo presenta un protocolo de fabricación para un nuevo tipo de sustrato de cultivo con cientos de microcontenedores por mm2, en el que los organoides pueden ser cultivados y observados utilizando microscopía de alta resolución. También se detallan los protocolos de siembra celular e inmunotinción.

Abstract

La caracterización de un gran número de cultivos organotípicos tridimensionales (3D) (organoides) a diferentes escalas de resolución está actualmente limitada por los enfoques de imagen estándar. Este protocolo describe una forma de preparar chips de cultivo de organoides microfabricados, que permiten imágenes en vivo 3D multiescala en un instrumento fácil de usar que requiere manipulaciones mínimas y es capaz de un rendimiento de imágenes de hasta 300 organoides / h. Estos chips de cultivo son compatibles con objetivos de aire e inmersión (aire, agua, aceite y silicona) y una amplia gama de microscopios comunes (por ejemplo, disco giratorio, escáner de punto confocal, campo amplio y campo claro). Además, se pueden utilizar con modalidades de hoja de luz como la tecnología de microscopía de iluminación de un solo objetivo y plano único (SPIM) (soSPIM).

El protocolo descrito aquí da pasos detallados para la preparación de los chips de cultivo microfabricados y el cultivo y tinción de organoides. Solo se requiere un corto período de tiempo para familiarizarse, y los consumibles y equipos se pueden encontrar fácilmente en biolaboratorios normales. Aquí, las capacidades de imágenes 3D se demostrarán solo con microscopios estándar comerciales (por ejemplo, disco giratorio para reconstrucción 3D y microscopía de campo amplio para monitoreo de rutina).

Introduction

En los cultivos celulares 3D organotípicos, en lo sucesivo denominados organoides, las células madre se diferencian y se autoorganizan en estructuras espaciales que comparten fuertes similitudes morfológicas y funcionales con órganos reales. Los organoides ofrecen modelos valiosos para estudiar la biología humana y el desarrollo fuera del cuerpo 1,2,3. Se está desarrollando un número creciente de modelos que imitan el hígado, el cerebro, el riñón, el pulmón y muchos otros órganos 2,4,5. La diferenciación en organoides está dirigida por la adición de factores de crecimiento solubles y una matriz extracelular en una secuencia de tiempo precisa. Sin embargo, en marcado contraste con los órganos, el desarrollo de los organoides es bastante heterogéneo.

Más allá de numerosos desafíos biológicos6,7, los cultivos de organoides también plantean desafíos tecnológicos en términos de métodos de cultivo celular, caracterización de la transcriptómica e imágenes. El desarrollo de órganos in vivo ocurre en un entorno biológico que resulta en una autoorganización altamente estereotipada de los arreglos celulares. Cualquier alteración fenotípica puede ser utilizada como un proxy para diagnosticar un estado enfermo. En contraste, los organoides se desarrollan in vitro en microambientes mínimamente controlados compatibles con las condiciones de cultivo celular, lo que resulta en una gran variabilidad en la ruta de desarrollo y la formación de formas para cada organoide individual.

Un estudio reciente8 demostró que la imagen cuantitativa de la forma de organoides (descriptores fenotípicos) junto con la evaluación de unos pocos marcadores genéticos permite la definición de paisajes de desarrollo fenotípico. Podría decirse que la capacidad de relacionar la diversidad de la expresión genómica en organoides con su comportamiento fenotípico es un paso importante hacia la liberación de todo el potencial de los cultivos organotípicos. Por lo tanto, pide el desarrollo de enfoques de imagen dedicados y de alto contenido que permitan la caracterización de características organoides a escalas subcelulares, multicelulares y organoides completas en 3D 9,10.

Desarrollamos una plataforma versátil de detección de alto contenido (HCS) que permite el cultivo de organoides optimizados (desde células madre embrionarias humanas aisladas [hESCs], células madre pluripotentes inducidas humanas [hIPSC] o células primarias hasta organoides diferenciados, multicelulares y 3D) e imágenes 3D rápidas y no invasivas. Integra un dispositivo de cultivo celular 3D miniaturizado de próxima generación, llamado chip JeWells (el chip en adelante), que contiene miles de micropozos bien dispuestos flanqueados por espejos de 45 ° que permiten obtener imágenes rápidas, 3D y de alta resolución mediante microscopía de hoja de luz de un solo objetivo11. Compatible con cualquier microscopio estándar, comercial e invertido, este sistema permite obtener imágenes de 300 organoides en 3D con resolución subcelular en <1 h.

La microfabricación del dispositivo de cultivo celular parte de un molde microestructurado existente, que contiene cientos de micropirámides (Figura 1A) con una base cuadrada y paredes laterales a 45 ° con respecto a la base. La Figura 1C muestra imágenes de microscopio electrónico (EM) de tales estructuras. El molde en sí está hecho de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) y se puede hacer como una réplica de un molde primario (no se muestra aquí) con las características correspondientes (como cavidades) utilizando procedimientos litográficos blandos estándar. El molde primario puede ser producido por diferentes procedimientos. El utilizado para este protocolo se realizó utilizando grabado húmedo de silicio como se informó en Galland et al. 11; El procedimiento para la fabricación del molde primario no es crítico para este protocolo. Las pirámides están dispuestas en una matriz cuadrada, con el mismo paso para las direcciones X e Y (en este caso el paso es de 350 μm).

Como ilustración, se publicaron experimentos de prueba de concepto12 para demostrar que el chip permite protocolos de cultivo y diferenciación a largo plazo (meses) al tiempo que define con precisión el número de células iniciales en los pozos. El desarrollo individual de un gran número de organoides se puede monitorear automáticamente en vivo utilizando microscopios de fluorescencia estándar de campo claro y de hoja de luz 3D. Además, los organoides se pueden recuperar para realizar más investigaciones biológicas (por ejemplo, análisis transcriptómico). Este documento describe protocolos detallados para la fabricación de los cubreobjetos de cultivo celular, el procedimiento de siembra y tinción para microscopía de fluorescencia, así como la recuperación de los organoides.

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Protocol

NOTA: La primera parte de este protocolo detalla la microfabricación del dispositivo de cultivo celular. Un molde primario original con cavidades piramidales puede producirse internamente, si hay instalaciones de microfabricación disponibles, o subcontratado a empresas externas. El molde primario utilizado en este trabajo se produce internamente, con pasos del proceso de fabricación descritos en otra parte11,13. Un protocolo básico para la microfabricación del molde está disponible en el Archivo Suplementario 1. CRÍTICO: Las operaciones en los pasos 1 a 6 deben llevarse a cabo en un ambiente libre de polvo. Se prefiere una campana de flujo laminar o una sala limpia, si está disponible. A lo largo de estos pasos, se debe usar equipo de protección personal (EPP), como guantes, una bata de laboratorio y gafas de seguridad.

1. Dados de molde PDMS

  1. Corte pequeñas porciones del molde PDMS a la dimensión requerida para el dispositivo final (por ejemplo, 1 cm x 1 cm [Figura 1B]). Córtelos paralelos a las direcciones XY de la matriz.
    CRÍTICO: Al cortar el molde PDMS en dados de 1 cm x 1 cm, ejecute los cortes en pasos individuales; usando una cuchilla de afeitar de un solo lado, aplique presión y corte a través del PDMS en un solo paso. Esto es para evitar la formación de pequeñas partículas de PDMS, que pueden depositarse en la superficie del molde y afectar la calidad de los pasos de réplica (paso 3).

2. Preparación de sustratos planos de PDMS

  1. Pesar ~ 15-20 g de resina base PDMS y 1.5-2 g de su agente de reticulación (es decir, una proporción de 10: 1), mezclarlos cuidadosamente y desgasificar en un frasco de vacío durante ~ 20 min.
  2. Vierta lentamente el PDMS desgasificado sobre una placa de Petri de plástico de 15 cm de ancho (diámetro).
  3. Curar el PDMS manteniendo la placa de Petri en un horno a 65 ° C durante 2 h. Después de esperar a que se complete el curado, una película PDMS plana de ~ 1.5 mm de espesor (contenida en la placa de Petri) está lista para su uso (Figura 2A).
  4. Con una cuchilla afilada, corte piezas de 2 cm x 2 cm del PDMS (Figura 2B-D).
    NOTA: El grosor exacto de esta hoja PDMS no es crítico; ~1-2 mm es un rango adecuado. La dimensión para el corte debe ser más grande que el molde texturizado pero no mucho más grande, lo que resultaría en desperdicio de material.

3. Producción de la capa texturizada hecha de adhesivo curable UV

  1. Coloque un dado de molde PDMS (como se preparó en el paso 1) boca abajo sobre el corte plano de PDMS (como se preparó en el paso 2) (Figura 3A, B).
    NOTA: Asegúrese de que las protuberancias piramidales en el molde estén orientadas hacia el sustrato PDMS plano y que solo la superficie superior de las pirámides truncadas esté en contacto. Evalúe la colocación correcta con un microscopio óptico (Figura 3C, D).
  2. A un lado del molde, usando una pipeta, deje caer una pequeña cantidad (dos gotas, aproximadamente 0.1-0.2 ml) de adhesivo curable por UV (Figura 4A).
    NOTA: A medida que el líquido entra en contacto con el borde del molde, la capilaridad impulsará el líquido a llenar la cavidad entre el molde y el corte plano de PDMS utilizado como sustrato.
    1. Siga la progresión del líquido dentro de la cavidad, por ejemplo, utilizando un microscopio óptico invertido con un objetivo de aumento de 10x (Figura 4B, C).
  3. Exponga el adhesivo curable UV a la luz UV para curarlo. Ajuste el tiempo de exposición dependiendo de la densidad de potencia de la fuente UV utilizada (por ejemplo, una caja UV-LED con una densidad de potencia de 35 mW / cm 2;2 min al 50% de potencia en este protocolo para curar el adhesivo por completo).
  4. Usando la cantidad excesiva de adhesivo en un borde, sostenga el adhesivo curado sobre el sustrato plano de PDMS presionando suavemente con un dedo (Figura 5A, B). Mientras tanto, use pinzas para pellizcar una esquina del molde junto al mismo borde que se mantiene presionado y despéguelo lentamente mientras se asegura de que la película texturizada no se levante también.
    NOTA: La Figura 5C muestra el resultado de un procedimiento adecuado de eliminación de moho; La figura 5E-G muestra el procedimiento incorrecto.
  5. Recorte el exceso de adhesivo y el exceso de sustrato de PDMS con una cuchilla de afeitar para dejar la capa adhesiva curada y texturizada plana sobre el PDMS con exceso de PDMS en un solo borde (Figura 5D), que será necesario en el paso 5.

4. Preparación del sustrato de cubreobjetos

NOTA: Como sustrato para el dispositivo final, se utilizan cubreobjetos redondeados estándar de 1,5 H con 25 mm de diámetro. Antes de que puedan ser utilizados, necesitan ser limpiados para eliminar el polvo y/o residuos orgánicos de su superficie.

  1. Limpieza de cubreobjetos
    1. Sumerja los cubreobjetos en agua jabonosa durante 5 minutos mientras se aplica el ultrasonido (40 kHz, potencia sónica de 110 W).
    2. Lave los cubreobjetos en agua limpia desionizada (DI), primero por inmersión y finalmente con agua DI corriente de un grifo. Seque los cubreobjetos con una cerbatana de gas N2 .
    3. Sumerja los cubreobjetos en un baño de acetona durante 5 minutos; Cambie inmediatamente a un baño de 2-propanol (IPA) durante 5 minutos adicionales.
    4. Enjuague los cubreobjetos con IPA limpia usando una botella apretada. Seque los cubreobjetos con la cerbatana de gas N2 .
      NOTA: Los cubreobjetos limpiados con este procedimiento se pueden almacenar en un recipiente cerrado hasta que sea necesario. Manténgalos en un gabinete seco para evitar que la humedad se deposite en su superficie.
  2. Cuando esté listo para ser utilizado, trate un cubreobjetos limpios con un proceso corto de plasma deO2 para mejorar su hidrofilicidad: O2 20 sccm, presión de 3 mbar, 60 W en el generador de potencia de RF y 60 s de duración.
  3. Inmediatamente después de la activación por plasma, proceda con el recubrimiento por centrifugado de la capa delgada de adhesivo curable UV colocando el cubreobjetos en el mandril de vacío de un recubridor de centrifugado estándar y vertiendo una pequeña gota de adhesivo en el centro del cubreobjetos (Figura 6). Ejecute el proceso de centrifugado: extendiendo durante 5 s a 500 rpm, recubrimiento a 3.000 rpm durante 45 s (con la aceleración y desaceleración ajustadas a 100 rpm/s).
    1. Si el recubrimiento por centrifugado no está disponible, use la siguiente forma alternativa para producir una película delgada de adhesivo UV en los cubreobjetos:
      1. En un cubreobjetos limpio, deje caer ~0,1 ml de adhesivo curable UV con una pipeta (Figura 7A).
      2. Tome un segundo cubreobjetos y colóquelo encima del primero para que el adhesivo líquido se extienda uniformemente entre los dos cubreobjetos (Figura 7B-D).
      3. Una vez que el adhesivo extendido haya alcanzado los bordes de los cubreobjetos, sepárelos suavemente deslizando uno sobre el otro. Una vez separados, ambos cubreobjetos están completamente recubiertos con una fina capa de adhesivo líquido (Figura 7E).
        NOTA: El recubrimiento puede no ser uniforme y liso solo si la separación no se realiza con un movimiento suave y continuo.
  4. Precurado de adhesivo curable UV
    1. Después del recubrimiento por centrifugado, precure el adhesivo por exposición a los rayos UV. Ajuste el tiempo de exposición en función de la densidad de potencia de la fuente UV utilizada (aquí, se utilizó una caja UV-LED con una densidad de potencia de 35 mW / cm2 durante 1 min al 50% de potencia).
      CRÍTICO: El adhesivo utilizado aquí es un pegamento óptico. Vea la discusión para puntos clave relacionados con las dosis de energía para su curado.

5. Transferencia de la película texturizada al sustrato final

  1. Tome una de las películas texturizadas (preparada en el paso 3) y colóquela en contacto con el cubreobjetos recubierto de adhesivo (preparado en el paso 4). Asegúrese de que el contacto entre el adhesivo parcialmente curado en el cubreobjetos y la película texturizada sea lo más uniforme posible (Figura 8A-C).
    CRÍTICO: En esta etapa, el adhesivo en el cubreobjetos debe ser lo suficientemente sólido como para evitar el reflujo, lo que llenaría las cavidades piramidales de la película texturizada cuando se coloca en contacto, pero también sería lo suficientemente plástico y adhesivo como para que el contacto se pueda optimizar presionando suavemente la película texturizada.
  2. Exponga los cubreobjetos a la luz UV hasta que la capa adhesiva recubierta en el cubreobjetos esté completamente curada. Esto sellará la película texturizada en el cubreobjetos y proporcionará un aislamiento a prueba de fugas entre las cavidades piramidales.
  3. Finalmente, retire el sustrato plano PDMS (Figura 8D-F). Con unas pinzas, pellizque el PDMS en una esquina del borde donde quedó el exceso de material después del recorte (paso 3.5). De esta manera, la capa de película texturizada se deja adhesiva al cubreobjetos con acceso abierto en la parte superior para la siembra celular. CRÍTICO: Al despegar el PDMS plano, la película texturizada debe permanecer bien adherida al cubreobjetos. Los fallos de adhesión se confirman fácilmente si la película texturizada se puede despegar del cubreobjetos después de la exposición final a los rayos UV sin ningún esfuerzo.

6. Pasivación a largo plazo del cubreobjetos de cultivo celular para cultivo celular

NOTA: La pasivación se logra generando un recubrimiento conforme y continuo de un copolímero biomimético con una estructura similar al grupo polar de fosfolípidos en la membrana celular. Este recubrimiento conformado evita la adhesión de las células al dispositivo de cultivo celular

  1. Preparar una solución con 0,5% (p/v) del copolímero biomimético disuelto en etanol puro. Conservar la solución a 4 °C para utilizarla en el futuro.
  2. Coloque el cubreobjetos de cultivo celular en una placa de Petri de 35 mm y cúbralo completamente con la solución de copolímero biomimético.
  3. Después de 5 min, retire el cubreobjetos de cultivo celular del recipiente con la solución de copolímero biomimético y déjelo secar a temperatura ambiente dentro del plato final en una campana de bioseguridad (>1 h).
    NOTA: Se puede producir un recubrimiento más grueso aumentando la concentración del copolímero biomimético en la solución de recubrimiento; los resultados de un recubrimiento más grueso son visibles bajo un microscopio de campo claro (Figura 9A).

7. Siembra celular

  1. Desgasificación y esterilización
    1. Justo antes de la siembra celular, dispense solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en las placas de cultivo celular (típicamente 1 ml para una placa de Petri de 35 mm). Desgasifique el plato con el PBS estéril usando un dispositivo ultrasónico durante ~ 10 minutos, seguido de varias rondas de pipeteo para eliminar todas las burbujas.
      CRÍTICO: Si el aire queda atrapado dentro de las cavidades piramidales, evitará que las células entren en ellas. Para asegurarse de que no haya aire atrapado en la pirámide antes de la siembra celular, se recomienda asegurar visualmente (bajo un microscopio de campo claro de sobremesa con un aumento de 10x o 20x) la ausencia de aire en estas cavidades (Figura 10).
    2. Reemplace el PBS con medio de cultivo estéril y esterilice la placa con luz UV durante 30 minutos bajo una campana de cultivo celular.
      NOTA: A partir de este paso, el plato debe considerarse estéril y manipularse utilizando técnicas estériles. Una forma alternativa de eliminar el aire atrapado del dispositivo de cultivo celular es usar un frasco de vacío con una bomba de vacío.
  2. Preparación de la suspensión celular
    NOTA: Las celdas se pueden sembrar como agregados de células simples o pequeñas e ingresar a los pocillos de muestra a través de la abertura superior. Con el tiempo, las células insertadas se agregan y crecen dentro de los pozos de muestra en esferoides de un tamaño mayor que el tamaño de la abertura. Como modelos de línea celular validados, utilice células cancerosas HCT116 (CCL-247 ATCC) o MCF7 (HTB-22 ATCC) mantenidas en el medio de cultivo recomendado (directrices ATCC).
    1. Preparar una suspensión celular (p. ej., utilizando un proceso de tripsinización siguiendo las pautas de ATCC). Siga las recomendaciones de preparación de tripsinización/suspensión celular para las células de interés.
    2. Contar y ajustar la concentración celular a 0,5 × 106 células/ml en el medio de cultivo recomendado.
  3. Dispensación celular
    1. Retire el tampón PBS de la placa de cultivo celular de 35 mm y luego dispense 1 ml de la suspensión celular ajustada. Consulte la Figura 11A para obtener una imagen de microscopio óptico de un procedimiento de siembra celular con densidad celular y homogeneidad adecuadas.
    2. Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en la incubadora celular (37 °C, 5% deCO2 y 100% de humedad) durante 10 min. Aproximadamente 80-100 células entrarán en cada cavidad piramidal.
      NOTA: Es posible aumentar el número de células por placa de cultivo celular aumentando la concentración celular o el tiempo empleado antes de la eliminación de la suspensión celular. Típicamente, la formación de esferoides toma varias horas (dependiendo del tipo de célula) después de la siembra celular y se puede seguir con un microscopio de campo claro (objetivos de 4x a 40x; Figura 11). A partir de aquí, el medio de cultivo, las matrices extracelulares y los factores de crecimiento de diferenciación se pueden cambiar o agregar a la placa de cultivo celular que contiene los esferoides de acuerdo con los protocolos de diferenciación típicos que podrían durar unos pocos días, semanas o meses.
    3. Después de la incubación de 10 minutos, recupere la placa de cultivo celular de la incubadora y aspire suavemente la suspensión celular para eliminar las células no atrapadas. Agregue 1 ml de medio de cultivo a un plato de 35 mm y colóquelo nuevamente en la incubadora celular.
      CRÍTICO: En esta etapa, debido a que los esferoides aún no se han formado, es muy importante evitar la aspiración fuerte o la dispensación que resultará en la pérdida de las células. El control visual con un microscopio de campo claro de sobremesa es muy recomendable en este paso.

8. Inmunotinción e imagen

  1. Fijación y tinción
    NOTA: Los diferentes procedimientos clásicos de fijación e inmunotinción son completamente compatibles con la placa de cultivo celular. Aquí se describe un protocolo típico.
    1. Fijar los organoides/esferoides en la placa de cultivo celular durante 20 minutos en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente.
    2. Permeabilizar los organoides durante 24 h en una solución de tensioactivo al 1% en PBS estéril a 4 °C en un agitador orbital e incubar durante 24 h en tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina [BSA] al 2% y surfactante al 1% en PBS estéril) a 4 °C en un agitador orbital.
    3. Incubar las muestras con anticuerpos primarios de interés en una dilución entre 1/50 y 1/200 (o según las recomendaciones del fabricante) en tampón de dilución de anticuerpos (2% BSA y 0,2% surfactante en PBS estéril) a 4 °C durante 48 h.
    4. Enjuagar las muestras 3 veces con tampón de lavado en un agitador orbital (3% de NaCl y 0,2% de surfactante en PBS estéril) e incubar con los anticuerpos secundarios correspondientes en el tampón de dilución de anticuerpos (dilución entre 1/100 y 1/300 o según las recomendaciones del fabricante), 0,5 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y 0,2 μg/ml de Alexa Fluor 647 o 488 Faloidina a 4 °C durante 24 h en un agitador orbital, seguido de cinco pasos de enjuague con PBS. Opcionalmente, montar las muestras utilizando un agente de limpieza soluble en agua precalentado a 37 °C.
  2. Imagenológico
    NOTA: En esta etapa, los organoides en la placa de micropocillos pueden considerarse como una placa de cultivo normal que contiene muestras fijas y teñidas para imágenes: cualquier procedimiento de imagen estándar se puede utilizar sin necesidad de adaptación o modificación. La figura 12 ilustra un resultado representativo de imágenes y reconstrucción 3D obtenidas utilizando un microscopio confocal de disco giratorio, con un objetivo de aire de 40x (apertura numérica 0,75).
    1. Utilice software constructor para el proceso automático de adquisición de imágenes con los siguientes ajustes: tiempo de exposición = 50 ms, con una platina motorizada z para adquirir una pila z (paso z de 1 μm, para una altura total de 70 μm).
    2. Realice la reconstrucción 3D utilizando software de análisis de imágenes.

9. Liberación y recolección de los organoides

NOTA: La capa adhesiva texturizada de la placa de cultivo celular se puede separar del cubreobjetos para liberar los esferoides / organoides vivos (antes de la fijación) contenidos dentro de las cavidades piramidales para el análisis de las células con otros procedimientos como secuenciación de ARN, enfoques ómicos, experimentos in vitro y trasplante in vivo .

  1. Con la muestra todavía en la placa de Petri y en una campana de bioseguridad, use una cuchilla como un bisturí para cortar una esquina de la capa adhesiva texturizada.
  2. Con pinzas, pellizque la capa adhesiva texturizada en el borde cortado y despéguela suavemente del cubreobjetos de vidrio, pero manténgala sumergida en el medio (algunos organoides podrían permanecer con la capa adhesiva, Figura 13).
  3. Enjuagar 3x con medio de cultivo y recoger los organoides por pipeteo.

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Representative Results

La Figura 8F muestra el aspecto típico de un cubreobjetos de cultivo celular después de una fabricación exitosa. La capa adhesiva curable UV aparece plana y se adhiere bien al cubreobjetos. La transferencia de la capa adhesiva en el cubreobjetos puede fallar si la capa del cubreobjetos se cura en exceso, o si la eliminación del sustrato PDMS plano se realiza incorrectamente (como se muestra en la Figura 8G, H). En ambos casos, la falla es evidente ya que no se transfiere ninguna película texturizada al cubreobjetos.

Para que los micropocillos funcionen, la película texturizada producida (como se describe en el paso 3 del protocolo) debe tener abiertos los lados superior e inferior de las pirámides para garantizar que las células durante la siembra en el paso 7 puedan ingresar a las cavidades y permanecer contenidas una vez que los organoides comiencen a formarse. La Figura 9 muestra el aumento del espesor del recubrimiento al aumentar la concentración del copolímero biomimético en la solución de recubrimiento. La Figura 10 muestra los resultados de la desgasificación de las placas de cultivo celular para garantizar que no quede aire atrapado en las cavidades piramidales. La Figura 10A,B muestra la desgasificación completa, mientras que la Figura 10C,D muestra burbujas de aire en las cavidades piramidales.

En la Figura 11, las células quedan atrapadas dentro de las pirámides, y los organoides correspondientes se forman después de los días 2 y 15 de cultivo. Si la abertura superior de los micropocillos se cierra (como consecuencia del paso 3 incorrecto), no quedarán células después de enjuagar la muestra después de la siembra celular. La Figura 12 muestra imágenes representativas de los organoides y una reconstrucción 3D obtenida utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo de aire de 40x (apertura numérica 0,75). Después de la liberación y recolección, los organoides pueden almacenarse en un pequeño vial y usarse para análisis adicionales (por ejemplo, secuenciación de ARN). La Figura 13B muestra un ejemplo de una muestra de organoides recolectados como se describe.

Figure 1
Figura 1: Molde de poli(dimetilsiloxano). (A) El molde PDMS inicial obtenido como una réplica fundida de una oblea texturizada de 4" (ver Archivo Suplementario 1). (B) Corte de 1 cm x 1 cm de ancho del molde PDMS inicial. (C) Imágenes de microscopio electrónico de barrido de los pilares trapezoidales dispuestos en una matriz cuadrada, que pueblan la superficie del molde. Barras de escala = 1 cm (A), 100 μm y 200 μm (C superior e inferior, respectivamente). Abreviatura: PDMS = poli(dimetisiloxano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Sustrato PDMS plano. (A) Una capa de PDMS, ~1 mm de espesor, se prepara en una placa de Petri estándar de 15 cm de ancho. (B) Despegado de un corte fresco de PDMS. (C) El PDMS restante en la placa de Petri se puede cortar en más trozos para su uso posterior. (D) PDMS plano cortado y molde PDMS uno al lado del otro; el PDMS plano es más grande que el molde. Abreviatura: PDMS = poli(dimetisiloxano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Colocación del molde sobre el sustrato. (A) El molde se coloca sobre el sustrato plano con las pirámides hacia abajo. (B) Apariencia diferente de mal contacto (arriba) y buen contacto (abajo) entre el molde y el sustrato PDMS. (C) Imagen de microscopio óptico de un área con contacto deficiente; Los círculos rojos resaltan los pilares que no están en contacto con el sustrato, aparecen de un color más brillante que los que están en contacto en la misma imagen. (D) Imagen óptica de un área con todos los pilares en buen contacto. Barras de escala = 200 μm (C,D). Abreviatura: PDMS = poli(dimetisiloxano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Llenado capilar de adhesivo curable UV . (A) Esta secuencia de imágenes muestra (de izquierda a derecha) el vertido de una pequeña cantidad de adhesivo en un borde y la progresión del adhesivo líquido en la cavidad entre el molde y el sustrato. Las flechas amarillas apuntan a la dirección del flujo de líquido. (B) Secuencia de imágenes ópticas (aumento de 40x) del frente líquido en movimiento; Cuando está en buen contacto, el frente del líquido se mueve alrededor de los bordes de las pirámides sin fugas. Las flechas amarillas apuntan a la dirección del flujo y las flechas rojas apuntan al borde delantero del frente líquido que se mueve alrededor de los bordes de contacto. (C) Secuencia de imágenes ópticas (40x) del frente líquido moviéndose cuando el contacto es deficiente; Las flechas rojas apuntan al borde delantero del líquido que se infiltra entre el molde y el sustrato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Eliminación del molde después del curado adhesivo. (A-C) Procedimiento correcto para despegar el molde: mientras se presiona suavemente el exceso de adhesivo en los bordes izquierdos con pinzas, el molde se pellizca cerca del mismo borde y se dobla lentamente para despegarse. (D) El resultado del procedimiento correcto; el exceso se recorta en tres bordes, mientras que un pequeño exceso de PDMS se deja en el cuarto lado (flecha amarilla). (E-G) Ejemplo de un procedimiento incorrecto para quitar el molde: el molde se pellizca con pinzas desde el borde opuesto, lo que resulta en la despegación del sustrato plano de la película adhesiva junto con el molde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Recubrimiento del cubreobjetos de vidrio. (A,B) Ejemplo de un buen procedimiento de recubrimiento: el cubreobjetos de vidrio se coloca en el mandril al vacío de un centrifugador, y se dispensa suficiente adhesivo en el centro, dando un recubrimiento homogéneo del cubreobjetos. (C,D) Ejemplo de un mal procedimiento de recubrimiento: no se dispensa suficiente adhesivo, lo que resulta en un recubrimiento no uniforme del cubreobjetos. (E) De izquierda a derecha, ejemplos de recubrimiento bueno, aceptable y malo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Proceso de recubrimiento alternativo . (A) Se coloca una pequeña gota de adhesivo líquido en el centro del cubreobjetos. (B) Un segundo cubreobjetos se coloca suavemente encima del primero. (C,D) El líquido se extiende entre los dos cubreobjetos y se distribuye uniformemente. (E) Ejemplos de resultados después de la separación correcta de los cubreobjetos (izquierda) o la separación incorrecta (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Transferencia al cubreobjetos. (A) La película adhesiva curada y recortada (Figura 5D) se coloca en el cubreobjetos con adhesivo parcialmente curado. (B) Ejemplo de buen contacto entre la película texturizada y el cubreobjetos. El recuadro es una imagen óptica que muestra el contacto uniforme de las áreas entre las cavidades trapezoidales (color uniforme oscuro). (C) Ejemplo de mal contacto entre la película texturizada y el cubreobjetos. Las áreas más brillantes no están en contacto, las flechas rojas apuntan a esas áreas. El recuadro es una imagen óptica que muestra la apariencia diferente de buen contacto (dos a la izquierda) y mal contacto (dos a la derecha). Barras de escala (amarillas, B,C) = 200 μm. (D,E) Procedimiento correcto para eliminar el sustrato plano PDMS: se utilizan pinzas para pellizcar el PDMS en el borde con exceso de PDMS y doblar para despegar suavemente. (F) El resultado con la película con textura adhesiva UV se transfirió con éxito al cubreobjetos. (G,H) Ejemplo de procedimiento de peeling incorrecto: las pinzas se utilizan para pellizcar el PDMS plano en uno de los bordes donde se recortó el exceso de material; por lo tanto, la película se retira junto con el PDMS plano. Abreviatura: PDMS = poli(dimetisiloxano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Recubrimiento con copolímero biomimético. (A) Dispositivo de cultivo celular recubierto con copolímero biomimético utilizando una solución de 0,5% (izquierda) o (B) 1% (derecha) (p/v) en etanol puro. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Desgasificación del dispositivo de cultivo celular. (A) Dispositivo de cultivo celular antes de la desgasificación completa. (B) Dispositivo de cultivo celular después de la desgasificación completa; (C, D) dispositivo de cultivo celular con desgasificación parcial donde las burbujas de aire quedan atrapadas en las pirámides. Barras de escala = 200 μm (A-D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Imágenes representativas de campo claro de la siembra celular y el crecimiento de organoides . (A) Las células son visibles flotando en la parte superior. (B) Células atrapadas en las cavidades piramidales después de enjuagar la suspensión celular. Solo las celdas atrapadas se conservarán como se muestra. (C) Las células se agregan para formar esferoides en cada cavidad (día 2 después de la siembra celular). (D) Imagen en el día 15 después de la siembra celular de un organoide que ha crecido en una cavidad piramidal. Barras de escala = 200 μm (A B), 120 μm (C) y 150 μm (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12: Imágenes 3D de organoides. (A) Tres planos Z diferentes adquiridos utilizando un disco giratorio confocal (lente 40x, aire, apertura numérica: 0.75) de un organoide bajo diferenciación neuroectodermo (día 7 después de la siembra celular). Tinción de actina con faloidina (Alexa Fluor 647) en naranja e inmunotinción de N-cadherina (Alexa Fluor 561) en azul. (B) Una reconstrucción 3D utilizando software de análisis de imágenes de los organoides correspondientes (planos 80 Z, altura total de 100 μm). Flechas blancas: grupos de células alrededor de una raya con alto nivel de expresión de actina. Flechas azules: grupos celulares positivos para la expresión de la proteína N-cadherina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 13
Figura 13: Liberación de organoides. (A) Eliminación de la capa adhesiva texturizada con pinzas; (B) imagen de campo claro de una suspensión organoide obtenida después de la extracción. Barra de escala = 200 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Se presenta un protocolo paso a paso para la microfabricación de un molde de Si con microcavidades piramidales. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El procedimiento para la fabricación de la placa de cultivo de micropocillos, que permite el cultivo y diferenciación de organoides de alta densidad, se ha descrito en este documento. Debido a la geometría y disposición de las microcavidades, miles de esferoides pueden ser cultivados y teñidos en una sola placa durante largos períodos de tiempo (varias semanas o más) casi sin pérdida de material. A modo de comparación, un área de 4 mm x 2 mm en la placa de cultivo celular puede contener tantos esferoides como una sola placa de 384 pocillos con un área de 12 cm x 8 cm.

La distribución regular de las microcavidades y el cubreobjetos estándar plano utilizado como sustrato permiten el monitoreo de miles de organoides vivos o fijos en 3D, sin la necesidad de una manipulación de muestras compleja y lenta entre los recipientes de cultivo y los soportes de imágenes. Debido a la forma de pirámide con una parte superior más pequeña que la base, no hay pérdida de organoides debido a los pasos de pipeteo durante el intercambio del medio, la dispensación de matrices extracelulares o los procedimientos de tinción. Todos estos pasos se pueden realizar directamente, como para una monocapa de células 2D sin precauciones adicionales, a diferencia de las técnicas clásicas de generación de organoides (por ejemplo, gotas colgantes, placas de unión baja, Aggrewell).

Además, en comparación con estas técnicas existentes, los micropocillos han sido diseñados para imágenes 3D de alta resolución compatibles con todo tipo de lentes de inmersión (aire, agua, aceite y silicio). El mantenimiento a largo plazo de organoides cerrados a un cubreobjetos de vidrio plano hace que el cubreobjetos de cultivo celular sea compatible con microscopios de luz de alta resolución, lo cual es imposible con los métodos existentes sin un manejo complejo y una transferencia de organoides fastidiosa. Además, un procedimiento de pasivación optimizado evita cualquier adhesión de células / organoides para el cultivo a largo plazo, controlando así la diferenciación del cultivo 3D Finalmente, dado que la capa adhesiva texturizada es extraíble, se pueden recuperar organoides vivos para realizar otros tipos de experimentos, como ensayos -ómicos o trasplante in vivo .

Cabe señalar que la forma piramidal y la disposición de la matriz de las microcavidades utilizadas para este protocolo se derivan del molde primario, que se ha fabricado mediante grabado húmedo de silicio para proporcionar superficies con acabado similar a un espejo e inclinación de 45 ° para permitir la microscopía de hoja de luz de un solo objetivo (soSPIM11). Si bien en otra parte se puede encontrar una discusión de estos requisitos y una descripción completa sobre cómo producir tales moldes12,13, también se da un protocolo simple en el Archivo Suplementario 1. Hay diferentes formas de producir un molde primario disponibles, que son totalmente compatibles con la fabricación de los chips en este protocolo. El grabado láser de vidrio y la impresión 3D de alta resolución, por ejemplo, podrían usarse para producir un molde primario con cavidades adecuadas para la contención de los organoides, pero no son adecuados para imágenes soSPIM.

El protocolo de fabricación descrito aquí se puede adaptar para su uso en cualquier laboratorio biológico estándar, ya que no se requieren herramientas de microfabricación avanzadas y dedicadas. Algunos pasos críticos de la fabricación de los micropocillos son la producción a través del llenado capilar de la película adhesiva texturizada y su transferencia al sustrato de vidrio. Sin embargo, en nuestra experiencia, se pueden dominar con alta reproducibilidad en un corto período de tiempo. La distancia entre las pirámides debe ser lo más pequeña posible para aumentar la densidad de cavidades para el crecimiento de organoides, pero también debe ser lo suficientemente grande como para que las cavidades puedan sellarse en el sustrato sin ninguna fuga o falta de sellado entre ellas. Encontramos que una distancia de 50 μm es un buen compromiso para este caso.

Durante la siembra celular, un aspecto crítico es la eliminación de cualquier burbuja de aire atrapada dentro de las cavidades para garantizar la entrada de la célula. Describimos aquí una solución validada, que utiliza solo equipos de laboratorio clásicos (por ejemplo, un homogeneizador ultrasónico o un frasco de vacío). Para permitir una mejor homogeneización del número de células por placa de cultivo celular, se recomienda dispensar la suspensión celular desde el lado de la placa y no directamente sobre el cubreobjetos. La agitación manual suave también podría ayudar a homogeneizar la solución celular.

Después de la siembra de células, la placa de cultivo celular con organoides se puede tratar como cualquier otro soporte de cultivo clásico; No se requiere manipulación específica ni pasos críticos. Todos los protocolos que se han utilizado con los dispositivos de micropocillos son prácticamente los mismos que se utilizan en platos de baja fijación, como las placas con fondo en U. Por lo tanto, el cultivo de organoides en estos micropocillos no requiere ningún cambio en las condiciones de cultivo en comparación con otros estándares.

Otro factor crítico es que el adhesivo utilizado aquí es un pegamento óptico. En su mejor uso sugerido (consulte también las notas de aplicación del proveedor), se alinean dos elementos ópticos que se pegan y se aplica adhesivo curable UV en la interfaz. Una primera exposición a los rayos UV de una energía insuficiente para causar la polimerización completa se utiliza para solidificar el pegamento manteniendo las propiedades adhesivas. Los componentes ópticos se pueden mover para lograr una alineación óptima, y luego el pegamento se cura completamente a su estado final con una segunda exposición a los rayos UV para proporcionar una adhesión permanente. La primera y segunda dosis de energía de exposición (es decir, los tiempos de exposición si se utiliza una fuente de densidad de energía conocida y constante) deben optimizarse en función de la densidad de energía de la fuente UV utilizada, el grosor de la capa de pegamento, la transmisión de UV a través de los elementos ópticos y la textura superficial (o la falta de ella) de la superficie a pegar.

Si bien se requiere que la adhesión entre la película texturizada y el cubrecubierto con adhesivo sea lo suficientemente fuerte como para proporcionar un sellado a prueba de fugas, también debe ser posible eliminar la película texturizada para recuperar los organoides después de la imagen, si se requiere algún análisis adicional, como el perfil genotípico. Se ha logrado un compromiso correcto entre el sellado a prueba de fugas y la capacidad de despegar la película texturizada con el protocolo descrito aquí, pero podría ser necesaria una mayor optimización de los tiempos de precurado y curado final para la capa delgada adhesiva en el cubreobjetos, ya que depende del sistema de exposición UV y el grosor de la película utilizado.

Una limitación en la versión actual de micropozos está en el procedimiento de siembra; Las células deben ser sembradas antes que los componentes de ECM para permitirles entrar en las proximidades de la pirámide. Se están realizando mejoras para recubrir los micropocillos con componentes de matriz extracelular, como primer paso. Todavía no hemos realizado ninguna microscopía electrónica (EM) en los organoides fijos dentro de las cavidades. Se requerirá alguna modificación a estos protocolos de fabricación y cultivo celular antes de que las imágenes de organoides en los micropocillos con EM se conviertan en una opción viable.

Una extensión futura natural de este método es proporcionar capacidades de detección de alto contenido para permitir pruebas multicondición en un solo flujo de trabajo (placa multipocil). Este dispositivo de cultivo celular proporciona una alternativa única a las técnicas organoides existentes, ofreciendo un rendimiento de cultivo e imagen insuperable y abriendo nuevas perspectivas en el campo de la investigación de organoides para aplicaciones biomédicas y descubrimiento de fármacos.

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Disclosures

Se ha publicado una solicitud internacional de patente con el número de publicación WO 2021/167535 A1.

Acknowledgments

La investigación cuenta con el apoyo del proyecto CALIPSO apoyado por la Fundación Nacional de Investigación, Oficina del Primer Ministro, Singapur, bajo su programa Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. reconoce el apoyo del investigador de NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding y ANR ADGastrulo. A.B. y G.G. reconocen el apoyo de la financiación básica de MBI. A.B. agradece a Andor Technologies por el préstamo del microscopio BC43.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Thermofisher scientific AA19397K7
Acetone Thermofisher scientific AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope Andor Technology spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin  Thermofisher scientific 37525
Buffered oxide etching solution Merck 901621-1L
CEE Spin Coater Brewer Science 200X
DAPI Thermofisher scientific 62248
Developer AZ400K Merck 18441223164
DI Milliq water Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 10082147
Glass coverslips Marienfled 117650 1.5H, round 25 mm diameter
Hepes Invitrogen 15630080
Imaris software BitPlane image analysis software
Inverted Transmission optical microscope Nikon TSF100-F
Labsonic M Sartorius Stedium Biotech Ultrasonic homogenizer
Lipidure NOF America CM5206 bio-mimetic copolymer
NOA73 Norland Products 17-345 UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070063
Phalloidin Thermofisher scientific  A12379 Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution Thermofisher scientific 10010023
Photo Resist AZ5214E Merck 14744719710
Pico Plasma tool Diener Electronic GmbH + Co. KG Pico Plasma For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52 Sunjin lab RC 152001 water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool Samco Inc. (JPN) RIE-10NR
RPMI 1640 Invitrogen 11875093 culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich 448931-10G
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284 surfactant
Trypsin EDTA Thermofisher scientific 15400054
Ultrasonic Cleaner Bransonic CPX2800
UV-KUB 2 KLOE UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner SUSS Microtec Semiconductor (DE) MJB4

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References

  1. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
  4. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  5. O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
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  12. Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
  13. Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).

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Biología Número 188
Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides
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Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad… More

Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad Raffi, S. B., Marchand, M., Suryana, M., Sahni, G., Viasnoff, V., Beghin, A. A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids. J. Vis. Exp. (188), e64405, doi:10.3791/64405 (2022).

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