Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En plattform med hög kapacitet för odling och 3D-avbildning av organoider

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64405
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3,4, 1,5
1Mechanobiology Institute (MBI), National University of Singapore, 2Biomedical Engineering Department, National University of Singapore, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4IRL 3639 CNRS, 5Department of Microbiology & Immunology, Immunology Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Summary

Detta dokument presenterar ett tillverkningsprotokoll för en ny typ av odlingssubstrat med hundratals mikrobehållare per mm2, där organoider kan odlas och observeras med hjälp av högupplöst mikroskopi. Cellsådd- och immunfärgningsprotokollen är också detaljerade.

Abstract

Karakteriseringen av ett stort antal tredimensionella (3D) organotypiska kulturer (organoider) vid olika upplösningsskalor begränsas för närvarande av standardavbildningsmetoder. Detta protokoll beskriver ett sätt att förbereda mikrofabricerade organoidodlingschips, som möjliggör multiskalig, 3D-liveavbildning på ett användarvänligt instrument som kräver minimala manipulationer och kan upp till 300 organoider / h-bildgenomströmning. Dessa odlingschips är kompatibla med både luft- och nedsänkningsmål (luft, vatten, olja och silikon) och ett brett spektrum av vanliga mikroskop (t.ex. spinnskiva, punktskannerkonfokal, brett fält och ljusfält). Dessutom kan de användas med ljusarkmodaliteter som SPIM-tekniken (single-objective, single-plane illumination microscopy) (soSPIM).

Protokollet som beskrivs här ger detaljerade steg för framställning av mikrofabricerade odlingschips och odling och färgning av organoider. Endast en kort tid krävs för att bli bekant med, och förbrukningsvaror och utrustning kan lätt hittas i vanliga biolaboratorier. Här kommer 3D-avbildningsfunktionerna endast att demonstreras med kommersiella standardmikroskop (t.ex. spinnskiva för 3D-rekonstruktion och bredfältsmikroskopi för rutinövervakning).

Introduction

I organotypiska 3D-cellkulturer, nedan kallade organoider, differentierar stamceller och självorganiserar sig i rumsliga strukturer som delar starka morfologiska och funktionella likheter med verkliga organ. Organoider erbjuder värdefulla modeller för att studera mänsklig biologi och utveckling utanför kroppen 1,2,3. Ett växande antal modeller utvecklas som efterliknar lever, hjärna, njure, lunga och många andra organ 2,4,5. Differentiering i organoider styrs genom tillsats av lösliga tillväxtfaktorer och en extracellulär matris i en exakt tidssekvens. Men i markant kontrast till organ är utvecklingen av organoider ganska heterogen.

Utöver många biologiska utmaningar 6,7 utgör organoidkulturer också tekniska utmaningar när det gäller cellodlingsmetoder, karakterisering av transkriptomik och avbildning. In vivo organutveckling sker i en biologisk miljö som resulterar i en mycket stereotyp självorganisation av cellarrangemang. Varje fenotypisk förändring kan användas som en proxy för att diagnostisera ett sjukt tillstånd. Däremot utvecklas organoider in vitro i minimalt kontrollerade mikromiljöer som är kompatibla med cellodlingsförhållanden, vilket resulterar i stor variation i utvecklingsvägen och formbildningen för varje enskild organoid.

En nyligen genomförd studie8 visade att kvantitativ avbildning av organoidform (fenotypdeskriptorer) i kombination med bedömningen av några genetiska markörer möjliggör definition av fenotypiska utvecklingslandskap. Förmodligen är förmågan att relatera mångfalden av genomiskt uttryck i organoider med deras fenotypiska beteende ett stort steg mot att frigöra den fulla potentialen hos organotypiska kulturer. Således ber det om utveckling av dedikerade, höginnehållsavbildningsmetoder som möjliggör karakterisering av organoida egenskaper på subcellulära, flercelliga och helorganoidskalor i 3D 9,10.

Vi utvecklade en mångsidig plattform för screening med högt innehåll (HCS) som möjliggör strömlinjeformad organoidodling (från isolerade mänskliga embryonala stamceller [hESC], humant inducerade pluripotenta stamceller [hIPSC] eller primära celler till 3D, flercelliga, differentierade organoider) och snabb, icke-invasiv 3D-avbildning. Den integrerar en nästa generation, miniatyriserad, 3D-cellodlingsenhet, kallad JeWells-chipet ( chipet nedan), som innehåller tusentals välordnade mikrobrunnar flankerade med 45 ° speglar som möjliggör snabb, 3D, högupplöst avbildning med enkelobjektiv ljusarkmikroskopi11. Detta system är kompatibelt med alla vanliga, kommersiella, inverterade mikroskop och möjliggör avbildning av 300 organoider i 3D med subcellulär upplösning på <1 timmar.

Mikrofabrikationen av cellodlingsanordningen utgår från en befintlig mikrostrukturerad form, som innehåller hundratals mikropyramider (figur 1A) med en kvadratisk bas och sidoväggar vid 45° i förhållande till basen. Figur 1C visar elektronmikroskopbilder (EM) av sådana strukturer. Formen i sig är gjord av poly (dimetylsiloxan) (PDMS) och kan tillverkas som en replikavgjutning av en primär form (visas inte här) med motsvarande egenskaper (som hålrum) med hjälp av standard mjuklitografiska procedurer. Den primära formen kan framställas genom olika förfaranden. Den som användes för detta protokoll gjordes med användning av kiselvåtetsning som rapporterats i Galland et al. 11; Förfarandet för tillverkning av den primära formen är inte kritisk för detta protokoll. Pyramiderna är ordnade i en kvadratisk matris, med samma tonhöjd för X- och Y-riktningarna (i detta fall är tonhöjden 350 μm).

Som en illustration publicerades proof-of-concept-experiment12 för att visa att chipet möjliggör långsiktig odling (månader) och differentieringsprotokoll samtidigt som antalet initiala celler i brunnarna exakt definieras. Individuell utveckling av ett stort antal organoider kan automatiskt övervakas live med hjälp av standard ljusfält och 3D-ljusarkfluorescensmikroskop. Dessutom kan organoider hämtas för att utföra ytterligare biologiska undersökningar (t.ex. transkriptomisk analys). Detta dokument beskriver detaljerade protokoll för tillverkning av cellkulturens täckglas, sådd- och färgningsproceduren för fluorescensmikroskopi samt hämtning av organoiderna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Den första delen av detta protokoll beskriver mikrofabrikationen av cellodlingsanordningen. En original primär form med pyramidala håligheter kan produceras internt - om mikrotillverkningsanläggningar är tillgängliga - eller outsourcas till externa företag. Den primära formen som används i detta arbete produceras internt, med tillverkningsprocesssteg som beskrivs någon annanstans11,13. Ett grundläggande protokoll för mikrofabrikation av formen finns i kompletterande fil 1. KRITISK: Verksamheten i steg 1 till 6 måste utföras i en dammfri miljö. En laminär flödeshuv eller ett rent rum, om tillgängligt, föredras. Under alla dessa steg måste personlig skyddsutrustning (PPE) användas, såsom handskar, en labbrock och skyddsglasögon.

1. Tärning av PDMS-form

  1. Skär små delar av PDMS-formen till den dimension som krävs för den slutliga enheten (t.ex. 1 cm x 1 cm [figur 1B]). Klipp dem parallellt med matrisens XY-riktningar.
    KRITISK: När du skär PDMS-formen i 1 cm x 1 cm tärningar, utför skärningarna i enkla steg; Använd ett ensidigt rakblad, tryck och skär igenom PDMS i ett enda steg. Detta för att förhindra bildandet av små partiklar av PDMS, som kan deponeras på formens yta och påverka kvaliteten på replikstegen (steg 3).

2. Beredning av platta PDMS-substrat

  1. Väg ~ 15-20 g PDMS-basharts och 1,5-2 g av dess retikuleringsmedel (dvs ett förhållande på 10: 1), blanda dem försiktigt och avgasa i en vakuumburk i ~ 20 minuter.
  2. Häll långsamt det avgasade PDMS på en plast, 15 cm bred (diameter) petriskål.
  3. Bota PDMS genom att förvara petriskålen i en ugn inställd på 65 ° C i 2 timmar. Efter att ha väntat på att härdningen ska slutföras är en platt PDMS-film med ~ 1,5 mm tjocklek (som finns i petriskålen) klar för användning (figur 2A).
  4. Skär med ett vasst blad ut 2 cm x 2 cm bitar ur PDMS (figur 2B-D).
    OBS: Den exakta tjockleken på detta PDMS-ark är inte kritisk; ~1-2 mm är ett lämpligt intervall. Dimensionen för snittet bör vara större än den texturerade formen men inte mycket större, vilket skulle resultera i slöseri med material.

3. Produktion av det texturerade skiktet av UV-härdbart lim

  1. Placera en PDMS-formtärning (enligt beredningen i steg 1) med framsidan nedåt ovanpå det plana PDMS-snittet (enligt beredningen i steg 2) (figur 3A, B).
    OBS: Se till att de pyramidala utsprången i formen är orienterade mot det plana PDMS-substratet och att endast den övre ytan av de stympade pyramiderna är i kontakt. Bedöm rätt placering med ett optiskt mikroskop (figur 3C, D).
  2. Till ena sidan av formen, med en pipett, släpp en liten mängd (två droppar, cirka 0,1-0,2 ml) UV-härdbart lim (figur 4A).
    OBS: När vätskan kommer i kontakt med formens kant kommer kapillariteten att driva vätskan för att fylla hålrummet mellan själva formen och det platta snittet av PDMS som används som substrat.
    1. Följ vätskans progression inuti kaviteten, till exempel med hjälp av ett inverterat optiskt mikroskop med ett 10x förstoringsmål (figur 4B, C).
  3. Utsätt det UV-härdbara limet för UV-ljus för att härda det. Justera exponeringstiden beroende på effekttätheten hos den UV-källa som används (t.ex. en UV-LED-låda med en effekttäthet på 35 mW/cm 2;2 min med 50 % effekt i detta protokoll för att härda limmet helt).
  4. Använd överskottet av lim vid ena kanten och håll det härdade limet på det plana PDMS-substratet genom att försiktigt trycka med ett finger (figur 5A, B). Använd under tiden pincett för att nypa ett hörn av formen bredvid samma kant som hålls nere och dra långsamt av den samtidigt som du ser till att den texturerade filmen inte lyfts upp också.
    OBS: Figur 5C visar resultatet av ett korrekt förfarande för borttagning av mögel; Figur 5E-G visar fel procedur.
  5. Trimma överflödigt lim och överskott av PDMS-substrat med ett rakblad för att lämna det härdade, texturerade, självhäftande skiktet platt på PDMS med överskott av PDMS endast på ena kanten (figur 5D), vilket kommer att behövas i steg 5.

4. Förberedelse av täckglassubstrat

OBS: Som underlag för den slutliga anordningen används standardrundade 1,5H-täckglas med 25 mm diameter. Innan de kan användas måste de rengöras för att avlägsna damm och/eller organiska rester från ytan.

  1. Rengöring av täckglas
    1. Sänk ner täckglasen i tvålvatten i 5 minuter medan ultraljudet appliceras (40 kHz, 110 W sonisk effekt).
    2. Tvätta täckglasen i rent avjoniserat (DI) vatten, först genom nedsänkning och slutligen med rinnande DI-vatten från en kran. Torka täckglasen med en N2 gasblåspistol.
    3. Sänk ner täckglasen i ett acetonbad i 5 minuter; omedelbart flytta till ett 2-propanol (IPA) bad i ytterligare 5 minuter.
    4. Skölj täckglasen med ren IPA med en pressflaska. Torka täckglasen med N2 gasblåspistolen.
      OBS: Täckglas som rengörs med denna procedur kan förvaras i en sluten behållare tills det behövs. Förvara dem i ett torrt skåp för att undvika fuktavsättning på ytan.
  2. När du är klar att användas, behandla ett rent täckglas med en kort O2-plasmaprocess för att förbättra dess hydrofilicitet:O2 20 sccm, 3 mbar tryck, 60 W vid RF-kraftgeneratorn och 60 s varaktighet.
  3. Omedelbart efter plasmaaktiveringen, fortsätt med att spinnbelägga det tunna lagret av UV-härdbart lim genom att placera täckglaset på vakuumchucken på en vanlig spin-coater och häll en liten droppe lim i mitten av täckglaset (figur 6). Kör centrifugeringsprocessen: sprid i 5 s vid 500 rpm, beläggning vid 3 000 rpm i 45 s (med acceleration och retardation inställd på 100 rpm/s).
    1. Om spinnbeläggning inte finns tillgänglig, använd följande alternativa sätt att producera en tunn film av UV-lim på täckglasen:
      1. På ett rent täckglas, släpp ~ 0,1 ml UV-härdbart lim med en pipett (figur 7A).
      2. Ta ett andra täckglas och placera det ovanpå det första för att få det flytande limet att spridas jämnt mellan de två täckglasen (figur 7B-D).
      3. När spridningslimmet har nått kanterna på täckglasen, separera dem försiktigt genom att skjuta över varandra. När de är separerade är båda täckglasen helt belagda med ett tunt lager flytande lim (figur 7E).
        OBS: Beläggningen kanske inte är enhetlig och slät endast om separationen inte görs med en jämn och kontinuerlig rörelse.
  4. Förhärdning av UV-härdbart lim
    1. Efter spin-beläggning, förhärda limet genom exponering för UV. Justera exponeringstiden beroende på effekttätheten för den UV-källa som används (här användes en UV-LED-låda med en effekttäthet på 35 mW / cm2 i 1 min vid 50% effekt).
      KRITISK: Limmet som används här är ett optiskt lim. Se diskussionen för viktiga punkter relaterade till energidoserna för dess härdning.

5. Överföring av den texturerade filmen till det slutliga substratet

  1. Ta en av de texturerade filmerna (beredd i steg 3) och placera den i kontakt med det självhäftande täckglaset (beredd i steg 4). Se till att kontakten mellan det delvis härdade häftämnet på täckglaset och den texturerade filmen är så enhetlig som möjligt (figur 8A-C).
    KRITISK: I detta skede bör limmet på täckglaset vara tillräckligt fast för att undvika återflöde, vilket skulle fylla pyramidhåligheterna i den texturerade filmen när den placeras i kontakt men också vara tillräckligt plastisk och lim för att kontakten kan optimeras genom att försiktigt trycka på den texturerade filmen.
  2. Utsätt täckglasen för UV-ljus tills det självhäftande skiktet som är belagt på täckglaset är helt härdat. Detta kommer att försegla den texturerade filmen på täckglaset och ge läckagesäker isolering mellan pyramidhåligheterna.
  3. Slutligen skala av det plana PDMS-substratet (figur 8D-F). Använd pincett och nyp PDMS i ett hörn vid kanten där överflödigt material lämnades efter trimning (steg 3.5). På så sätt lämnas det texturerade filmskiktet lim på täckglaset med öppen åtkomst upptill för cellsådd. KRITISK: Vid avskalning av det platta PDMS-systemet ska den texturerade filmen förbli väl fäst vid täckglaset. Vidhäftningsfel bekräftas lätt om den texturerade filmen kan skalas av från täckglaset efter slutlig exponering för UV utan ansträngning.

6. Långvarig passivering av cellkulturens täckglas för cellodling

OBS: Passivering uppnås genom att generera en konform och kontinuerlig beläggning av en biomimetisk sampolymer med en struktur som liknar den polära gruppen fosfolipider i cellmembranet. Denna konforma beläggning förhindrar cellers vidhäftning till cellodlingsanordningen

  1. Bered en lösning med 0,5 % (vikt/volym) av den biomimetiska sampolymeren upplöst i ren etanol. Förvara lösningen vid 4 °C för framtida användning.
  2. Placera cellkulturens täckglas i en 35 mm petriskål och täck den helt med den biomimetiska sampolymerlösningen.
  3. Efter 5 minuter avlägsnas cellkulturens täckglas från behållaren med den biomimetiska sampolymerlösningen och låt den torka vid rumstemperatur inuti den slutliga skålen i en biosäkerhetshuv (>1 timmar).
    OBS: En tjockare beläggning kan framställas genom att öka koncentrationen av den biomimetiska sampolymeren i beläggningslösningen; Resultaten av en tjockare beläggning är synliga under ett ljusfältmikroskop (figur 9A).

7. Cell sådd

  1. Avgasning och sterilisering
    1. Strax före cellsådd, fördela steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i cellodlingsskålarna (vanligtvis 1 ml för en 35 mm petriskål). Avgasa skålen med den sterila PBS med hjälp av en ultraljudsanordning i ~ 10 minuter, följt av flera omgångar pipettering för att ta bort alla bubblor.
      KRITISK: Om luft fångas inuti pyramidhåligheterna kommer det att förhindra att cellerna kommer in i dem. För att säkerställa att det inte finns någon luft fångad i pyramiden före cellsådd, rekommenderas att visuellt säkerställa (under ett bänkljusfältmikroskop vid 10x eller 20x förstoring) frånvaron av luft i dessa håligheter (figur 10).
    2. Byt ut PBS mot sterilt odlingsmedium och sterilisera plattan med UV-ljus i 30 minuter under en cellodlingshuv.
      OBS: Från och med detta steg bör skålen betraktas som steril och manipuleras med sterila tekniker. Ett alternativt sätt att avlägsna fångad luft från cellodlingsanordningen är att använda en vakuumburk med en vakuumpump.
  2. Beredning av cellsuspension
    OBS: Celler kan seedas som enstaka eller små cellaggregat och komma in i provbrunnarna genom den övre öppningen. Med tiden aggregerar de infogade cellerna och växer inuti provbrunnarna till sfäroider av en storlek som är större än bländarens storlek. Som validerade cellinjemodeller, använd HCT116 (CCL-247 ATCC) eller MCF7 (HTB-22 ATCC) cancerceller som hålls i rekommenderat odlingsmedium (ATCC-riktlinjer).
    1. Bered en cellsuspension (t.ex. med hjälp av en trypsiniseringsprocess enligt ATCC-riktlinjerna). Följ rekommendationer för trypsinisering / cellsuspensionsberedning för cellerna av intresse.
    2. Räkna och justera cellkoncentrationen till 0,5 × 106 celler/ml i det rekommenderade odlingsmediet.
  3. Dosering av celler
    1. Ta bort PBS-bufferten från 35 mm cellodlingsskålen och fördela sedan 1 ml av den justerade cellsuspensionen. Se figur 11A för en optisk mikroskopbild av en cellsåddprocedur med adekvat celldensitet och homogenitet.
    2. Sätt tillbaka cellodlingsskålen i cellinkubatorn (37 °C, 5 %CO2 och 100 % luftfuktighet) i 10 minuter. Cirka 80-100 celler kommer in i varje pyramidhålighet.
      OBS: Det är möjligt att öka antalet celler per cellodlingsskål genom att öka antingen cellkoncentrationen eller tiden innan cellsuspensionen avlägsnas. Vanligtvis tar sfäroidbildning flera timmar (beroende på celltyp) efter cellsådd och kan följas med ett ljusfältmikroskop (4x till 40x mål; Figur 11). Härifrån kan odlingsmedium, extracellulära matriser och differentieringstillväxtfaktorer ändras eller läggas till cellodlingsskålen som innehåller sfäroiderna i enlighet med typiska differentieringsprotokoll som kan pågå i några dagar, veckor eller månader.
    3. Efter 10 minuters inkubation, återställ cellodlingsskålen från inkubatorn och aspirera försiktigt den cellulära suspensionen för att avlägsna ofångade celler. Tillsätt 1 ml odlingsmedium till en 35 mm skål och sätt tillbaka den i cellinkubatorn.
      KRITISK: I detta skede, eftersom sfäroider inte har bildats ännu, är det mycket viktigt att undvika stark aspiration eller dispensering som kommer att leda till förlust av cellerna. Visuell kontroll med hjälp av ett ljusfältmikroskop på bänken rekommenderas starkt i detta steg.

8. Immunfärgning och avbildning

  1. Fixering och färgning
    OBS: Olika klassiska procedurer för fixering och immunfärgning är helt kompatibla med cellodlingsskålen. Ett typiskt protokoll beskrivs här.
    1. Fixera organoiderna / sfäroiderna i cellodlingsskålen i 20 minuter i 4% paraformaldehyd vid rumstemperatur.
    2. Permeabilisera organoiderna i 24 timmar i 1 % ytaktiv lösning i sterilt PBS vid 4 °C i orbitalskakare och inkubera i 24 timmar i blockerande buffert (2 % bovint serumalbumin [BSA] och 1 % ytaktivt ämne i sterilt PBS) vid 4 °C i orbitalskak.
    3. Inkubera proverna med primära antikroppar av intresse vid en spädning mellan 1:50 och 1:200 (eller enligt tillverkarens rekommendationer) i antikroppsspädningsbuffert (2 % BSA och 0,2 % ytaktivt ämne i sterilt PBS) vid 4 °C i 48 timmar.
    4. Skölj proverna 3 gånger med diskbuffert på en orbitalskakare (3 % NaCl och 0,2 % ytaktivt ämne i sterilt PBS) och inkubera med motsvarande sekundära antikroppar i antikroppsutspädningsbuffert (spädning mellan 1/100 och 1/300 eller enligt tillverkarens rekommendationer), 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och 0,2 μg/ml Alexa Fluor 647 eller 488 Phalloidin vid 4 °C i 24 timmar i orbitalskak. följt av fem sköljsteg med PBS. Alternativt kan proverna monteras med ett vattenlösligt clearingmedel som förvärmts till 37 °C.
  2. Imaging
    OBS: I detta skede kan organoiderna i mikrobrunnsplattan betraktas som en normal odlingsskål som innehåller fasta och färgade prover för avbildning: alla standardavbildningsprocedurer kan användas utan anpassning eller modifiering krävs. Figur 12 illustrerar ett representativt resultat av bilder och 3D-rekonstruktion som erhållits med hjälp av ett konfokalmikroskop med en 40x luftmål (numerisk bländare 0,75).
    1. Använd konstrukteringsprogramvara för automatisk bildinsamlingsprocess med följande inställningar: exponeringstid = 50 ms, med ett z-motoriserat steg för att förvärva en z-stack (1 μm Z-steg, för en total höjd av 70 μm).
    2. Utför 3D-rekonstruktion med hjälp av bildanalysprogram.

9. Frisättning och insamling av organoiderna

OBS: Det texturerade självhäftande skiktet i cellodlingsskålen kan lossas från täckglaset för att frigöra de levande sfäroiderna / organoiderna (före fixering) som finns inuti pyramidhåligheterna för analys av cellerna med andra procedurer såsom RNA-sekvensering, -omiska metoder, in vitro-experiment och in vivo-transplantation .

  1. Med provet fortfarande i petriskålen och i en biosäkerhetshuva, använd ett blad som en skalpell för att skära ett hörn av det texturerade limskiktet.
  2. Med pincett klämmer du fast det texturerade självhäftande skiktet på skärkanten och drar försiktigt bort det från glastäcket men håller det nedsänkt i mediet (vissa organoider kan finnas kvar med limskiktet, figur 13).
  3. Skölj 3x med odlingsmedium och samla organoiderna genom pipettering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 8F visar den typiska aspekten av en cellodlingstäckslip efter framgångsrik tillverkning. Det UV-härdbara självhäftande skiktet verkar platt och fäster väl på täckglaset. Överföringen av det självhäftande skiktet på täckglaset kan misslyckas om skiktet på täckglaset är överhärdat eller om avlägsnandet av det plana PDMS-substratet görs felaktigt (som visas i figur 8G,H). I båda fallen är felet uppenbart eftersom ingen texturerad film överförs till täckglaset.

För att mikrobrunnarna ska fungera måste den texturerade filmen som produceras (som beskrivs i protokollsteg 3) ha både pyramidernas övre och nedre sidor öppna för att säkerställa att celler under sådden i steg 7 kan komma in i hålrummen och förbli inneslutna när organoiderna börjar bildas. Figur 9 visar ökningen av beläggningens tjocklek genom att öka koncentrationen av den biomimetiska sampolymeren i beläggningslösningen. Figur 10 visar resultaten av avgasning av cellodlingsskålarna för att säkerställa att ingen luft fångas i pyramidhåligheterna. Figur 10A,B visar fullständig avgasning, medan figur 10C,D visar luftbubblor i pyramidhålorna.

I figur 11 fångas celler inuti pyramiderna, och motsvarande organoider bildas efter dag 2 och 15 av odling. Om mikrobrunnarnas övre öppning istället stängs (som en följd av felaktigt steg 3) kommer inga celler att finnas kvar efter sköljning av provet efter cellsådd. Figur 12 visar representativa bilder av organoiderna och en 3D-rekonstruktion erhållen med hjälp av ett spinnskivkonfokalmikroskop med ett 40x luftmål (numerisk bländare 0,75). Efter frisättning och insamling kan organoiderna förvaras i en liten injektionsflaska och användas för vidare analys (t.ex. RNA-sekvensering). Figur 13B visar ett exempel på ett prov av organoider som samlats in enligt beskrivningen.

Figure 1
Figur 1: Poly(dimetylsiloxan) mögel. (A) Den ursprungliga PDMS-formen erhållen som en gjuten kopia av en 4 "texturerad skiva (se kompletterande fil 1). (B) 1 cm x 1 cm brett snitt av utgångs-PDMS-formen. (C) Svepelektronmikroskopbilder av de trapetsformade pelarna arrangerade i en kvadratisk matris, som fyller formens yta. Skalstänger = 1 cm (A), 100 μm och 200 μm (C topp respektive botten). Förkortning: PDMS = poly(dimetysiloxan). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Platt PDMS-substrat . (A) Ett lager PDMS, ~ 1 mm tjockt, bereds i en standard 15 cm bred petriskål. b) Skalning av ett nytt styckningsdel. (C) Återstående PDMS på petriskålen kan skäras i fler bitar för vidare användning. (D) Platt PDMS-skärning och PDMS-form sida vid sida; den platta PDMS är större än formen. Förkortning: PDMS = poly(dimetysiloxan). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Placera formen på underlaget . (A) Formen placeras på det plana underlaget med pyramiderna nedåt. (B) Olika utseende av dålig kontakt (överst) och god kontakt (botten) mellan formen och PDMS-substratet. c) Optisk mikroskopbild av ett område med dålig kontakt. De röda cirklarna markerar pelarna som inte är i kontakt med substratet - de verkar ha en ljusare färg än de som är i kontakt i samma bild. (D) Optisk bild av ett område med alla pelare i god kontakt. Skalstänger = 200 μm (C,D). Förkortning: PDMS = poly(dimetysiloxan). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Kapillärfyllning av UV-härdbart lim. (A) Denna bildsekvens visar (från vänster till höger) hällningen av en liten mängd lim på ena kanten och progressionen av det flytande limet i håligheten mellan formen och substratet. De gula pilarna pekar i riktning mot vätskeflödet. (B) Sekvens av optiska bilder (40x förstoring) av vätskefronten i rörelse; Vid god kontakt rör sig vätskans framsida runt pyramidernas kanter utan läckage. De gula pilarna pekar på flödesriktningen och de röda pilarna pekar på vätskefrontens framkant som rör sig runt kontaktkanterna. (C) Sekvens av optiska bilder (40x) av vätskefronten som rör sig när kontakten är dålig; De röda pilarna pekar på framkanten av vätskan som infiltrerar mellan formen och underlaget. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Avlägsnande av formen efter limhärdning. (A-C) Korrekt procedur för att skala av formen: medan du försiktigt trycker på överskottet av lim vid vänster kant med pincett, kläms formen nära samma kant och böjs långsamt för att avskalas. (D) Resultatet av det korrekta förfarandet; överskottet trimmas ut på tre kanter, medan ett litet överskott av PDMS lämnas på fjärde sidan (gul pil). (E-G) Exempel på ett felaktigt förfarande för att ta bort formen: formen kläms med pincett från motsatt kant, vilket resulterar i avskalning från det plana underlaget i limfilmen tillsammans med formen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Beläggning av glastäcket. (A,B) Exempel på en bra beläggningsprocedur: glastäckglaset placeras på vakuumchucken på en spin-coater, och tillräckligt med lim dispenseras i mitten, vilket ger en homogen beläggning av täckglaset. (C,D) Exempel på en dålig beläggningsprocedur: inte tillräckligt med lim dispenseras, vilket resulterar i ojämn beläggning av täckglaset. (E) Från vänster till höger, exempel på bra, acceptabel och dålig beläggning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Alternativ beläggningsprocess . (A) En liten droppe flytande lim placeras i mitten av täckglaset. (B) Ett andra täckglas placeras försiktigt ovanpå det första. (C,D) Vätskan spred sig mellan de två täckglasen och fördelades jämnt. (E) Exempel på resultat efter korrekt separering av täckglasen (vänster) eller felaktig separering (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Överför till täckglaset . (A) Den härdade och trimmade självhäftande filmen (figur 5D) placeras på täckglaset med delvis härdat lim. (B) Exempel på god kontakt mellan den texturerade filmen och täckglaset. Infällningen är en optisk bild som visar enhetlig kontakt mellan områdena mellan trapetsformade hålrum (mörk enhetlig färg). (C) Exempel på dålig kontakt mellan den texturerade filmen och täckglaset. De ljusare områdena är inte i kontakt, de röda pilarna pekar på dessa områden. Infällningen är en optisk bild som visar olika utseende av god kontakt (två till vänster) och dålig kontakt (två till höger). Skalstänger (gul, B,C) = 200 μm. (D,E) Korrekt procedur för att ta bort PDMS platt underlag: pincett används för att klämma fast PDMS vid kanten med överskott av PDMS och böja för att försiktigt skala av. (F) Resultatet med den UV-självhäftande texturerade filmen överfördes framgångsrikt till täckglaset. (G,H) Exempel på felaktig skalningsprocedur: pincett används för att klämma fast det platta PDMS på en av kanterna där överskottsmaterialet trimmades av; sålunda avlägsnas filmen tillsammans med det platta PDMS. Förkortning: PDMS = poly(dimetysiloxan). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Beläggning med biomimetisk sampolymer. (A) Cellodlingsanordning belagd med biomimetisk sampolymer med en lösning av 0,5% (vänster) eller (B) 1% (höger) (w/v) i ren etanol. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Avgasning av cellodlingsanordning. a) Cellodlingsanordning före fullständig avgasning. b) Cellodlingsanordning efter fullständig avgasning. (C,D) cellodlingsanordning med endast partiell avgasning där luftbubblor fångas i pyramiderna. Skalstänger = 200 μm (AD). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 11
Figur 11: Representativa ljusfältsbilder av cellsådd och tillväxt av organoider . (A) Cellerna är synliga flytande på toppen. b) Celler som fastnat i pyramidhålorna efter sköljning av cellsuspensionen. Endast svällda celler behålls enligt bilden. (C) Celler aggregeras för att bilda sfäroider i varje hålighet (dag 2 efter cellsådd). (D) Bild på dag 15 efter cellsådd av en organoid som har vuxit i en pyramidhålighet. Skalstänger = 200 μm (A B), 120 μm (C) och 150 μm (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 12
Figur 12: 3D-avbildning av organoider. (A) Tre olika Z-planer förvärvade med hjälp av en snurrande skivkonfokal (lins 40x, luft, numerisk bländare: 0,75) av en organoid under neuroektodermdifferentiering (dag 7efter cellsådd). Actinfärgning med falloidin (Alexa Fluor 647) i orange och N-cadherin immunfärgning (Alexa Fluor 561) i blått. (B) En 3D-rekonstruktion med hjälp av bildanalysprogramvara av motsvarande organoider (80 Z-planer, total höjd på 100 μm). Vita pilar: kluster av celler runt en strimma med hög nivå av aktinuttryck. Blå pilar: cellkluster positiva för N-cadherinproteinuttryck. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 13
Figur 13: Frisättning av organoider. (A) Ta bort det texturerade självhäftande skiktet med pincett; b) Ljusfältsbild av en organoidsuspension som erhållits efter avlägsnandet. Skalstapel = 200 μm (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Ett steg-för-steg-protokoll för mikrofabrikation av en Si-form med pyramidala mikrokaviteter presenteras. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förfarandet för tillverkning av mikrobrunnsodlingsskålen, som möjliggör organoidkultur och differentiering med hög densitet, har beskrivits i detta dokument. På grund av mikrokaviteternas geometri och arrangemang kan tusentals sfäroider odlas och färgas i en enda platta under långa perioder (flera veckor eller mer) med nästan ingen förlust av material. Som jämförelse kan ett område på 4 mm x 2 mm på cellodlingsplattan innehålla lika många sfäroider som en enda 384-brunnsplatta med en yta på 12 cm x 8 cm.

Den regelbundna fördelningen av mikrokaviteterna och det platta standardtäckglaset som används som substrat möjliggör övervakning av tusentals levande eller fasta organoider i 3D, utan behov av komplex och tidskrävande provmanipulation mellan odlingskärl och bildstöd. På grund av pyramidformen med en mindre topp än basen finns det ingen förlust av organoider på grund av pipettersteg under mediebytet, dispensering av extracellulära matriser eller färgningsprocedurer. Alla dessa steg kan utföras direkt, som för ett 2D-cellmonolager utan några extra försiktighetsåtgärder, till skillnad från klassiska organoidgenereringstekniker (t.ex. hängande droppar, låga fästplattor, Aggrewell).

Dessutom, jämfört med dessa befintliga tekniker, har mikrobrunnarna utformats för högupplöst 3D-avbildning kompatibel med alla typer av nedsänkningslinser (luft, vatten, olja och kisel). Långvarigt underhåll av organoider stängda till ett platt glastäckglas gör cellodlingstäcket kompatibelt med högupplösta ljusmikroskop, vilket är omöjligt med befintliga metoder utan komplex hantering och krävande organoidöverföring. Vidare undviker en optimerad passiveringsprocedur vidhäftning av celler / organoider för långvarig odling, vilket kontrollerar differentieringen av 3D-kulturen Slutligen, eftersom det texturerade limskiktet är avtagbart, kan levande organoider hämtas för att utföra andra typer av experiment såsom -omics-analyser eller in vivo-transplantation .

Det bör noteras att den pyramidala formen och matrisarrangemanget för mikrokaviteterna som används för detta protokoll härrör från den primära formen, som har tillverkats med hjälp av kiselwetetsning för att ge ytor spegelliknande ytbehandling och 45 ° lutning för att möjliggöra enobjektiv ljusarkmikroskopi (soSPIM11). Medan en diskussion om dessa krav och en fullständig beskrivning av hur man producerar sådana formar finns någon annanstans12,13, ges också ett enkelt protokoll i kompletterande fil 1. Olika sätt att producera en primär form finns tillgängliga, som är helt kompatibla med tillverkningen av chipsen i detta protokoll. Laseretsning av glas och högupplöst 3D-utskrift kan till exempel användas för att producera en primär form med lämpliga hålrum för inneslutning av organoiderna, men är inte lämpliga för soSPIM-avbildning.

Tillverkningsprotokollet som beskrivs här kan anpassas för användning i alla vanliga biologiska laboratorier, eftersom inga dedikerade, avancerade mikrofabrikationsverktyg krävs. Några kritiska steg i tillverkningen av mikrobrunnarna är produktionen genom kapillärfyllning av den texturerade limfilmen och dess överföring till glassubstratet. Men enligt vår erfarenhet kan de behärskas med hög reproducerbarhet på kort tid. Avståndet mellan pyramiderna ska vara så litet som möjligt för att öka tätheten av hålrum för tillväxt av organoider, men det måste också vara tillräckligt stort så att hålrummen kan förseglas på substratet utan läckage eller brist på tätning mellan dem. Vi fann att ett avstånd på 50 μm är en bra kompromiss för detta fall.

Under cellsådd är en kritisk aspekt avlägsnandet av eventuella luftbubblor som fångas inuti hålrummen för att säkerställa cellinmatning. Vi beskriver här en validerad lösning som endast använder klassisk laboratorieutrustning (t.ex. en ultraljudshomogenisator eller en vakuumburk). För att möjliggöra bättre homogenisering av antalet celler per cellodlingsskål rekommenderas att cellsuspensionen dispenseras från sidan av skålen och inte direkt ovanför täckglaset. Mild manuell omrörning kan också bidra till att homogenisera den cellulära lösningen.

Efter sådd av celler kan cellodlingsskålen med organoider behandlas som alla andra klassiska kulturstöd; Ingen specifik manipulation eller kritiska steg krävs. Alla protokoll som har använts med mikrobrunnsenheterna är praktiskt taget desamma som de som används i skålar med låg fastsättning, såsom U-bottenplattor. Därför kräver organoidodling i dessa mikrobrunnar ingen förändring av odlingsförhållandena jämfört med andra standarder.

En annan kritisk faktor är att limet som används här är ett optiskt lim. I den föreslagna bästa användningen (se även applikationsanteckningar från leverantören) är två optiska element som ska limmas inriktade och UV-härdbart lim appliceras vid gränssnittet. En första exponering för UV av en energi som är otillräcklig för att orsaka full polymerisation används för att stelna limet samtidigt som vidhäftningsegenskaperna bibehålls. De optiska komponenterna kan flyttas för att uppnå optimal inriktning, och sedan härdas limet helt till sitt slutliga tillstånd med en andra exponering för UV för att ge permanent vidhäftning. Den första och andra exponeringsenergidosen (dvs. exponeringstider om en källa med känd och konstant energitäthet används) måste optimeras beroende på energitätheten hos den UV-källa som används, tjockleken på limskiktet, överföringen av UV genom de optiska elementen och yttextureringen (eller bristen på den) på ytan som ska limmas.

Medan vidhäftningen mellan den texturerade filmen och det självhäftande täckglaset måste vara tillräckligt stark för att ge läckagesäker tätning, måste det också vara möjligt att avlägsna den texturerade filmen för att hämta organoiderna efter avbildning, om ytterligare analys krävs, såsom genotypisk profilering. En korrekt kompromiss mellan läckagesäker tätning och förmågan att skala bort den texturerade filmen har uppnåtts med det protokoll som beskrivs här, men ytterligare optimering av förhärdnings- och sluthärdningstiderna för det självhäftande tunna skiktet på täckglaset kan krävas eftersom det beror på UV-exponeringssystemet och filmtjockleken som används.

En begränsning i den nuvarande mikrobrunnsversionen är i såddproceduren; celler måste sås före ECM-komponenterna så att de kan komma in i närheten av pyramiden. Förbättringar pågår för att belägga mikrobrunnarna med extracellulära matriskomponenter, som ett första steg. Vi har ännu inte utfört någon elektronmikroskopi (EM) på de fasta organoiderna i hålrummen. Viss modifiering av dessa tillverknings- och cellodlingsprotokoll kommer att krävas innan avbildning av organoider i mikrobrunnarna med EM blir ett genomförbart alternativ.

En naturlig framtida utvidgning av denna metod är att tillhandahålla screeningkapacitet med högt innehåll för att möjliggöra multikonditionstestning i ett enda arbetsflöde (multiwellplatta). Denna cellodlingsanordning ger ett unikt alternativ till befintliga organoidtekniker, som erbjuder oöverträffad odlings- och bildgenomströmning och öppnar nya perspektiv inom organoidforskning för biomedicinsk tillämpning och läkemedelsupptäckt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

En internationell patentansökan har publicerats med publikationsnummer WO 2021/167535 A1.

Acknowledgments

Forskningen stöds av CALIPSO-projektet som stöds av National Research Foundation, premiärministerns kontor, Singapore, under sitt program Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. erkänner stödet från NRF-utredaren NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-såddfinansiering och ANR ADGastrulo. A.B. och G.G. erkänner stödet från MBI:s kärnfinansiering. A.B. erkänner Andor Technologies för lånet av BC43-mikroskopet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Thermofisher scientific AA19397K7
Acetone Thermofisher scientific AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope Andor Technology spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin  Thermofisher scientific 37525
Buffered oxide etching solution Merck 901621-1L
CEE Spin Coater Brewer Science 200X
DAPI Thermofisher scientific 62248
Developer AZ400K Merck 18441223164
DI Milliq water Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 10082147
Glass coverslips Marienfled 117650 1.5H, round 25 mm diameter
Hepes Invitrogen 15630080
Imaris software BitPlane image analysis software
Inverted Transmission optical microscope Nikon TSF100-F
Labsonic M Sartorius Stedium Biotech Ultrasonic homogenizer
Lipidure NOF America CM5206 bio-mimetic copolymer
NOA73 Norland Products 17-345 UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15070063
Phalloidin Thermofisher scientific  A12379 Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution Thermofisher scientific 10010023
Photo Resist AZ5214E Merck 14744719710
Pico Plasma tool Diener Electronic GmbH + Co. KG Pico Plasma For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52 Sunjin lab RC 152001 water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool Samco Inc. (JPN) RIE-10NR
RPMI 1640 Invitrogen 11875093 culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich 448931-10G
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284 surfactant
Trypsin EDTA Thermofisher scientific 15400054
Ultrasonic Cleaner Bransonic CPX2800
UV-KUB 2 KLOE UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner SUSS Microtec Semiconductor (DE) MJB4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
  4. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  5. O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
  6. Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
  7. Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
  8. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  9. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  10. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  11. Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  12. Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
  13. Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).

Tags

Biologi nummer 188
En plattform med hög kapacitet för odling och 3D-avbildning av organoider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad… More

Grenci, G., Dilasser, F., Mohamad Raffi, S. B., Marchand, M., Suryana, M., Sahni, G., Viasnoff, V., Beghin, A. A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids. J. Vis. Exp. (188), e64405, doi:10.3791/64405 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter