Summary
Dit artikel presenteert een fabricageprotocol voor een nieuw type kweeksubstraat met honderden microcontainers per mm2, waarin organoïden kunnen worden gekweekt en waargenomen met behulp van microscopie met hoge resolutie. De protocollen voor het zaaien en immunostainen van cellen zijn ook gedetailleerd.
Abstract
De karakterisering van een groot aantal driedimensionale (3D) organotypische culturen (organoïden) op verschillende resolutieschalen wordt momenteel beperkt door standaard beeldvormingsbenaderingen. Dit protocol beschrijft een manier om microgefabriceerde organoïde kweekchips te bereiden, die multiscale, 3D live imaging mogelijk maken op een gebruiksvriendelijk instrument dat minimale manipulaties vereist en in staat is tot 300 organoïden / h imaging-doorvoer. Deze kweekchips zijn compatibel met zowel lucht- als onderdompelingsdoelen (lucht, water, olie en siliconen) en een breed scala aan gangbare microscopen (bijv. Draaiende schijf, puntscanner confocal, breed veld en brightfield). Bovendien kunnen ze worden gebruikt met light-sheet modaliteiten zoals de single-objective, single-plane illumination microscopy (SPIM) technologie (soSPIM).
Het hier beschreven protocol geeft gedetailleerde stappen voor de bereiding van de microgefabriceerde kweekchips en de kweek en kleuring van organoïden. Er is slechts een korte tijd nodig om vertrouwd te raken en verbruiksartikelen en apparatuur zijn gemakkelijk te vinden in normale biolabs. Hier zullen de 3D-beeldvormingsmogelijkheden alleen worden gedemonstreerd met commerciële standaardmicroscopen (bijv. Draaiende schijf voor 3D-reconstructie en wide field microscopie voor routinematige monitoring).
Introduction
In organotypische 3D-celculturen, hierna organoïden genoemd, differentiëren stamcellen en organiseren ze zichzelf in ruimtelijke structuren die sterke morfologische en functionele overeenkomsten delen met echte organen. Organoïden bieden waardevolle modellen om de menselijke biologie en ontwikkeling buiten het lichaam te bestuderen 1,2,3. Er wordt een groeiend aantal modellen ontwikkeld die de lever, hersenen, nieren, longen en vele andere organen nabootsen 2,4,5. Differentiatie in organoïden wordt gestuurd door de toevoeging van oplosbare groeifactoren en een extracellulaire matrix in een precieze tijdsvolgorde. In schril contrast met organen is de ontwikkeling van organoïden echter vrij heterogeen.
Naast tal van biologische uitdagingen 6,7, vormen organoïde culturen ook technologische uitdagingen op het gebied van celkweekmethoden, karakterisering van transcriptomica en beeldvorming. In vivo orgaanontwikkeling vindt plaats in een biologische omgeving die resulteert in een zeer stereotiepe zelforganisatie van celarrangementen. Elke fenotypische verandering kan worden gebruikt als een proxy om een zieke toestand te diagnosticeren. Daarentegen ontwikkelen organoïden zich in vitro in minimaal gecontroleerde micro-omgevingen die compatibel zijn met celkweekomstandigheden, wat resulteert in grote variabiliteit in het ontwikkelingspad en de vormvorming voor elke individuele organoïde.
Een recente studie8 toonde aan dat kwantitatieve beeldvorming van organoïde vorm (fenotype descriptoren) gekoppeld aan de beoordeling van een paar genetische markers de definitie van fenotypische ontwikkelingslandschappen mogelijk maakt. Ongetwijfeld is het vermogen om de diversiteit van genomische expressie in organoïden te relateren aan hun fenotypische gedrag een belangrijke stap in de richting van het ontketenen van het volledige potentieel van organotypische culturen. Het smeekt dus om de ontwikkeling van speciale, high-content beeldvormingsbenaderingen die de karakterisering van organoïde kenmerken op subcellulaire, meercellige en geheel-organoïde schalen in 3D 9,10 mogelijk maken.
We ontwikkelden een veelzijdig high-content screening (HCS) platform dat gestroomlijnde organoïde cultuur mogelijk maakt (van geïsoleerde menselijke embryonale stamcellen [hESCs], door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen [hIPSC's], of primaire cellen naar 3D, meercellige, gedifferentieerde organoïden) en snelle, niet-invasieve 3D-beeldvorming. Het integreert een next-generation, geminiaturiseerd, 3D-celcultuurapparaat, de JeWells-chip (de chip hierna), dat duizenden goed gerangschikte microwells bevat, geflankeerd door 45 ° -spiegels die snelle, 3D-beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maken door single-objective light-sheet microscopie11. Dit systeem is compatibel met elke standaard, commerciële, omgekeerde microscoop en maakt de beeldvorming van 300 organoïden in 3D mogelijk met subcellulaire resolutie in <1 uur.
De microfabricage van het celkweekapparaat vertrekt vanuit een bestaande microgestructureerde mal, die honderden micropyramiden bevat (figuur 1A) met een vierkante basis en zijwanden op 45° ten opzichte van de basis. Figuur 1C toont elektronenmicroscoop (EM) beelden van dergelijke structuren. De mal zelf is gemaakt van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) en kan worden gemaakt als een replica gegoten van een primaire mal (hier niet weergegeven) met overeenkomstige kenmerken (als holtes) met behulp van standaard soft-lithografische procedures. De primaire mal kan door verschillende procedures worden geproduceerd. Degene die voor dit protocol werd gebruikt, werd gemaakt met behulp van silicium nat etsen zoals gerapporteerd in Galland et al. 11; de procedure voor de fabricage van de primaire mal is niet van cruciaal belang voor dit protocol. De piramides zijn gerangschikt in een vierkante array, met dezelfde toonhoogte voor de X- en Y-richting (in dit geval is de toonhoogte 350 μm).
Ter illustratie werden proof-of-concept experimenten12 gepubliceerd om aan te tonen dat de chip langdurige kweek (maanden) en differentiatieprotocollen mogelijk maakt, terwijl het aantal initiële cellen in de putten nauwkeurig wordt gedefinieerd. De individuele ontwikkeling van een groot aantal organoïden kan automatisch live worden gevolgd met behulp van standaard brightfield- en 3D-lichtplaatfluorescentiemicroscopen. Bovendien kunnen organoïden worden opgehaald om verder biologisch onderzoek uit te voeren (bijv. transcriptomische analyse). Dit artikel schetst gedetailleerde protocollen voor de fabricage van de celkweek coverslips, de zaai- en kleuringsprocedure voor fluorescentiemicroscopie, evenals het ophalen van de organoïden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het eerste deel van dit protocol beschrijft de microfabricage van het celkweekapparaat. Een originele primaire mal met piramidale holtes kan in eigen huis worden geproduceerd - als microfabricagefaciliteiten beschikbaar zijn - of worden uitbesteed aan externe bedrijven. De primaire mal die in dit werk wordt gebruikt, wordt in eigen huis geproduceerd, met elders beschreven fabricageprocesstappen11,13. Een basisprotocol voor de microfabricage van de matrijs is beschikbaar in aanvullend dossier 1. KRITIEK: De bewerkingen in stap 1 tot en met 6 moeten in een stofvrije omgeving worden uitgevoerd. Een laminaire stromingskap of een cleanroom, indien beschikbaar, hebben de voorkeur. Tijdens deze stappen moeten persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) worden gebruikt, zoals handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril.
1. In blokjes snijden van PDMS-mal
- Snijd kleine delen van de PDMS-mal tot de afmeting die nodig is voor het uiteindelijke apparaat (bijv. 1 cm x 1 cm [figuur 1B]). Knip ze parallel aan de XY-richtingen van de array.
KRITISCH: Bij het snijden van de PDMS-mal in dobbelstenen van 1 cm x 1 cm, voert u de sneden in enkele stappen uit; gebruik een eenzijdig scheermesje, oefen druk uit en snijd in één stap door het PDMS. Dit is om de vorming van kleine deeltjes PDMS te voorkomen, die zich op het oppervlak van de mal kunnen afzetten en de kwaliteit van de replicastappen kunnen beïnvloeden (stap 3).
2. Bereiding van vlakke PDMS-substraten
- Weeg ~ 15-20 g PDMS-basishars en 1,5-2 g van het reticulatiemiddel (d.w.z. een verhouding van 10: 1), meng ze zorgvuldig en ontgas in een vacuümpot gedurende ~ 20 minuten.
- Giet het ontgaste PDMS langzaam op een plastic petrischaaltje van 15 cm breed (diameter).
- Hard het PDMS uit door de petrischaal 2 uur in een oven op 65° C te bewaren. Na het wachten op de uitharding is een platte PDMS-folie van ~1,5 mm dikte (in de petrischaal) klaar voor gebruik (figuur 2A).
- Snijd met een scherp mes stukken van 2 cm x 2 cm uit het PDMS (figuur 2B-D).
OPMERKING: De exacte dikte van deze PDMS-plaat is niet kritisch; ~1-2 mm is een geschikt bereik. De afmeting voor de snede moet groter zijn dan de getextureerde mal, maar niet veel groter, wat zou resulteren in verspilling van materiaal.
3. Productie van de getextureerde laag gemaakt van UV-uithardende lijm
- Plaats één PDMS-maldobbelsteen (zoals voorbereid in stap 1) met de voorkant naar beneden bovenop de platte PDMS-snede (zoals voorbereid in stap 2) (figuur 3A, B).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de piramidale uitsteeksels in de mal zijn gericht op het platte PDMS-substraat en dat alleen het bovenste oppervlak van de afgeknotte piramides in contact is. Beoordeel de juiste plaatsing met een optische microscoop (figuur 3C,D). - Laat aan de ene kant van de mal, met behulp van een pipet, een kleine hoeveelheid (twee druppels, ongeveer 0,1-0,2 ml) UV-uithardende lijm vallen (figuur 4A).
OPMERKING: Naarmate de vloeistof in contact komt met de rand van de mal, zal capillariteit de vloeistof ertoe aanzetten om de holte tussen de mal zelf en de platte snede van PDMS die als substraat wordt gebruikt, te vullen.- Volg de progressie van de vloeistof in de holte, bijvoorbeeld met behulp van een omgekeerde optische microscoop met een vergrotingsobjectief van 10x (figuur 4B,C).
- Stel de UV-uithardende lijm bloot aan UV-licht om het uit te harden. Pas de blootstellingstijd aan afhankelijk van de vermogensdichtheid van de gebruikte UV-bron (bijvoorbeeld een UV-LED-box met een vermogensdichtheid van 35 mW/cm2; 2 min bij 50% vermogen in dit protocol om de lijm volledig uit te harden).
- Gebruik de overtollige hoeveelheid lijm aan één rand en houd de uitgeharde lijm op het platte PDMS-substraat door voorzichtig met een vinger te drukken (figuur 5A, B). Gebruik ondertussen een pincet om een hoek van de mal naast dezelfde rand te knijpen die wordt vastgehouden en pel deze langzaam af terwijl u ervoor zorgt dat de getextureerde film ook niet wordt opgetild.
OPMERKING: Figuur 5C toont het resultaat van een goede schimmelverwijderingsprocedure; Figuur 5E-G toont de verkeerde procedure. - Snijd de overtollige lijm en het overtollige PDMS-substraat bij met behulp van een scheermesje om de uitgeharde, getextureerde, kleeflaag plat op het PDMS te laten met overtollig PDMS op slechts één rand (figuur 5D), die nodig is in stap 5.
4. Coverslip substraat voorbereiding
OPMERKING: Als substraat voor het uiteindelijke apparaat worden standaard afgeronde 1,5H-coverslips met een diameter van 25 mm gebruikt. Voordat ze kunnen worden gebruikt, moeten ze worden gereinigd om stof en / of organische resten van hun oppervlak te verwijderen.
- Coverslip reiniging
- Dompel de coverslips gedurende 5 minuten onder in een sopje terwijl de echografie wordt toegepast (40 kHz, 110 W sonische kracht).
- Was de coverslips in schoon gedeïoniseerd (DI) water, eerst door onderdompeling en ten slotte met stromend DI-water uit een kraan. Droog de coverslips af met een N2 gasblaaspistool.
- Dompel de coverslips gedurende 5 minuten onder in een acetonbad; ga onmiddellijk naar een 2-propanol (IPA) bad voor een extra 5 min.
- Spoel de coverslips af met schone IPA met behulp van een knijpfles. Droog de coverslips met het N2 gasblukker.
OPMERKING: Coverslips die volgens deze procedure worden gereinigd, kunnen in een gesloten container worden bewaard totdat ze nodig zijn. Bewaar ze in een droge kast om te voorkomen dat vocht zich op hun oppervlak afzet.
- Wanneer klaar voor gebruik, behandel een schone coverslip met een kort O2 plasmaproces om de hydrofilie te verbeteren: O2 20 sccm, 3 mbar druk, 60 W bij de RF-stroomgenerator en 60 s duur.
- Ga onmiddellijk na de plasmaactivering verder met het spincoaten van de dunne laag UV-uithardende lijm door de coverslip op de vacuümhouder van een standaard spincoater te plaatsen en een kleine druppel lijm in het midden van de coverslip te gieten (figuur 6). Voer het spin-coatingproces uit: strooien gedurende 5 s bij 500 tpm, coaten bij 3.000 tpm gedurende 45 s (met de acceleratie en vertraging ingesteld op 100 tpm / s).
- Als spin-coating niet beschikbaar is, gebruik dan de volgende alternatieve manier om een dunne film uv-lijm op de coverslips te produceren:
- Laat op een schone coverslip ~0,1 ml UV-uithardende lijm vallen met behulp van een pipet (figuur 7A).
- Neem een tweede coverslip en plaats deze bovenop de eerste om de vloeibare lijm gelijkmatig tussen de twee coverslips te verspreiden (figuur 7B-D).
- Zodra de strooilijm de randen van de coverslips heeft bereikt, scheidt u ze voorzichtig door ze over elkaar te schuiven. Eenmaal gescheiden, zijn beide coverslips volledig bedekt met een dunne laag vloeibare lijm (figuur 7E).
OPMERKING: De coating is mogelijk niet uniform en glad als de scheiding niet wordt uitgevoerd met een soepele en continue beweging.
- Als spin-coating niet beschikbaar is, gebruik dan de volgende alternatieve manier om een dunne film uv-lijm op de coverslips te produceren:
- Voorbewerking van UV-uithardende lijm
- Na het spin-coaten, precureer de lijm door blootstelling aan UV. Pas de blootstellingstijd aan afhankelijk van de vermogensdichtheid van de gebruikte UV-bron (hier werd een UV-LED-box met een vermogensdichtheid van 35 mW/cm2 gedurende 1 minuut bij 50% vermogen gebruikt).
KRITIEK: De lijm die hier wordt gebruikt, is een optische lijm. Zie de discussie voor belangrijke punten met betrekking tot de energiedoses voor de uitharding ervan.
- Na het spin-coaten, precureer de lijm door blootstelling aan UV. Pas de blootstellingstijd aan afhankelijk van de vermogensdichtheid van de gebruikte UV-bron (hier werd een UV-LED-box met een vermogensdichtheid van 35 mW/cm2 gedurende 1 minuut bij 50% vermogen gebruikt).
5. Overdracht van de getextureerde film naar het uiteindelijke substraat
- Neem een van de getextureerde films (voorbereid in stap 3) en plaats deze in contact met de zelfklevende coverslip (voorbereid in stap 4). Zorg ervoor dat het contact tussen de gedeeltelijk uitgeharde lijm op de coverslip en de getextureerde film zo uniform mogelijk is (figuur 8A-C).
KRITIEK: In dit stadium moet de lijm op de coverslip stevig genoeg zijn om opnieuw te laten stromen, wat de piramidale holtes van de getextureerde film zou vullen wanneer deze in contact wordt gebracht, maar ook plastic en klevend genoeg is dat contact kan worden geoptimaliseerd door zachtjes op de getextureerde film te drukken. - Stel de coverslips bloot aan UV-licht totdat de kleeflaag die op de coverslip is gecoat volledig is uitgehard. Dit verzegelt de getextureerde film op de coverslip en zorgt voor een lekvrije isolatie tussen de piramidale holtes.
- Verwijder ten slotte het PDMS-vlakke substraat (figuur 8D-F). Knijp met een pincet het PDMS op een hoek aan de rand waar overtollig materiaal achterbleef na het trimmen (stap 3.5). Op deze manier blijft de getextureerde filmlaag kleefbaar aan de coverslip met open toegang aan de bovenkant voor celzaaien. KRITISCH: Bij het afpellen van het platte PDMS moet de getextureerde film goed vast blijven zitten aan de coverslip. Adhesiefouten zijn gemakkelijk te bevestigen als de getextureerde film na uiteindelijke blootstelling aan UV zonder enige moeite van de coverslip kan worden afgepeld.
6. Langdurige passivering van de celkweekdeksel voor celkweek
OPMERKING: Passivering wordt bereikt door het genereren van een conformale en continue coating van een biomimetisch copolymeer met een structuur die vergelijkbaar is met de polaire groep fosfolipiden in het celmembraan. Deze hoekgetrouwe coating voorkomt dat cellen hechten aan het celkweekapparaat
- Bereid een oplossing met 0,5% (g/v) van het biomimetische copolymeer opgelost in zuivere ethanol. Bewaar de oplossing bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
- Plaats de celkweekdeksel in een petrischaaltje van 35 mm en bedek deze volledig met de biomimetische copolymeeroplossing.
- Verwijder na 5 minuten de celkweekdeksel uit de container met de biomimetische copolymeeroplossing en laat deze drogen bij kamertemperatuur in de laatste schotel in een bioveiligheidskap (>1 uur).
OPMERKING: Een dikkere coating kan worden geproduceerd door de concentratie van het biomimetische copolymeer in de coatingoplossing te verhogen; de resultaten van een dikkere coating zijn zichtbaar onder een brightfield microscoop (figuur 9A).
7. Celzaaien
- Ontgassen en steriliseren
- Geef vlak voor het zaaien van de cel steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) af in de celkweekschalen (meestal 1 ml voor een petrischaaltje van 35 mm). Ontgas de schotel met de steriele PBS met behulp van een ultrasoon apparaat gedurende ~ 10 minuten, gevolgd door verschillende pipetteerrondes om alle bubbels te verwijderen.
KRITIEK: Als lucht gevangen zit in de piramidale holtes, voorkomt dit dat de cellen ze binnendringen. Om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de piramide gevangen zit voordat de cel wordt gezaaid, wordt aanbevolen om visueel te zorgen (onder een benchtop brightfield microscoop bij 10x of 20x vergroting) de afwezigheid van lucht in deze holtes (figuur 10). - Vervang de PBS door steriel kweekmedium en steriliseer de plaat met UV-licht gedurende 30 minuten onder een celkweekkap.
OPMERKING: Vanaf deze stap moet het gerecht als steriel worden beschouwd en gemanipuleerd met behulp van steriele technieken. Een alternatieve manier om opgesloten lucht uit het celkweekapparaat te verwijderen, is door een vacuümpot met een vacuümpomp te gebruiken.
- Geef vlak voor het zaaien van de cel steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) af in de celkweekschalen (meestal 1 ml voor een petrischaaltje van 35 mm). Ontgas de schotel met de steriele PBS met behulp van een ultrasoon apparaat gedurende ~ 10 minuten, gevolgd door verschillende pipetteerrondes om alle bubbels te verwijderen.
- Celsuspensievoorbereiding
OPMERKING: Cellen kunnen worden gezaaid als aggregaten van één of kleine cellen en de monsterputten binnenkomen via de bovenste opening. Na verloop van tijd aggregeren en groeien de ingebrachte cellen in de monsterputten tot sferoïden van een grootte groter dan de grootte van het diafragma. Gebruik als gevalideerde cellijnmodellen HCT116 (CCL-247 ATCC) of MCF7 (HTB-22 ATCC) kankercellen die worden onderhouden in het aanbevolen kweekmedium (ATCC-richtlijnen).- Bereid een celsuspensie voor (bijvoorbeeld met behulp van een trypsinisatieproces volgens ATCC-richtlijnen). Volg trypsinisatie / celsuspensievoorbereidingsaanbevelingen voor de cellen van belang.
- Tel en pas de celconcentratie aan op 0,5 × 106 cellen/ml in het aanbevolen kweekmedium.
- Celdosering
- Verwijder de PBS-buffer uit de celkweekschaal van 35 mm en doseer vervolgens 1 ml van de aangepaste celsuspensie. Zie figuur 11A voor een optische microscoopafbeelding van een celzaaiprocedure met voldoende celdichtheid en homogeniteit.
- Plaats de celkweekschaal terug in de celincubator (37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid) gedurende 10 minuten. Ongeveer 80-100 cellen zullen elke piramidale holte binnendringen.
OPMERKING: Het is mogelijk om het aantal cellen per celkweekschaal te verhogen door de celconcentratie of de tijd die wordt besteed aan het verwijderen van de celsuspensie te verhogen. Meestal duurt de vorming van sferoïden enkele uren (afhankelijk van het celtype) na het zaaien van cellen en kan worden gevolgd met een brightfield-microscoop (4x tot 40x doelstellingen; Figuur 11). Vanaf hier kunnen kweekmedium, extracellulaire matrices en differentiatiegroeifactoren worden gewijzigd of toegevoegd aan de celkweekschaal die de sferoïden bevat in overeenstemming met typische differentiatieprotocollen die een paar dagen, weken of maanden kunnen duren. - Na de incubatie van 10 minuten, herstel de celkweekschaal uit de incubator en aspirateer voorzichtig de cellulaire suspensie om niet-gevangen cellen te verwijderen. Voeg 1 ml kweekmedium toe aan een schaal van 35 mm en plaats het terug in de celincubator.
KRITISCH: In dit stadium, omdat sferoïden zich nog niet hebben gevormd, is het erg belangrijk om sterke aspiratie of afgifte te voorkomen die zal resulteren in verlies van de cellen. Visuele controle met behulp van een benchtop brightfield microscoop wordt ten zeerste aanbevolen bij deze stap.
8. Immunostaining en beeldvorming
- Fixatie en vlekken
OPMERKING: Verschillende klassieke procedures van fixatie en immunostaining zijn volledig compatibel met de celkweekschaal. Een typisch protocol wordt hier beschreven.- Bevestig de organoïden/sferoïden in de celkweekschaal gedurende 20 minuten in 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur.
- Permeabiliseer de organoïden gedurende 24 uur in 1% oppervlakteactieve oplossing in steriele PBS bij 4 °C op een orbitale shaker en incubeer gedurende 24 uur in blokkerende buffer (2% runderserumalbumine [BSA] en 1% oppervlakteactieve stof in steriele PBS) bij 4 °C op een orbitale shaker.
- Incubeer de monsters met primaire antilichamen van belang bij een verdunning tussen 1/50 en 1/200 (of volgens de aanbevelingen van de fabrikant) in antilichaamverdunningsbuffer (2% BSA en 0,2% oppervlakteactieve stof in steriele PBS) bij 4 °C gedurende 48 uur.
- Spoel de monsters 3x met wasbuffer op een orbitale shaker (3% NaCl en 0,2% oppervlakteactieve stof in steriel PBS) en incubeer met overeenkomstige secundaire antilichamen in antilichaamverdunningsbuffer (verdunning tussen 1/100 en 1/300 of volgens de aanbevelingen van de fabrikant), 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylalandool (DAPI) en 0,2 μg/ml Alexa Fluor 647 of 488 falloïdine bij 4 °C gedurende 24 uur op een orbitale shaker, gevolgd door vijf spoelstappen met PBS. Monteer de monsters optioneel met een in water oplosbaar opruimmiddel dat is voorgewarmd tot 37 °C.
- Beeldvorming
OPMERKING: In dit stadium kunnen de organoïden in de microwellplaat worden beschouwd als een normale kweekschaal met vaste en gekleurde monsters voor beeldvorming: elke standaard beeldvormingsprocedure kan worden gebruikt zonder dat aanpassing of wijziging vereist is. Figuur 12 illustreert een representatief resultaat van beelden en 3D-reconstructie verkregen met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop, met een 40x lucht objectief (numeriek diafragma 0,75).- Gebruik constructorsoftware voor een automatisch beeldacquisitieproces met de volgende instellingen: belichtingstijd = 50 ms, met een z gemotoriseerde trap om een z-stack te verkrijgen (1 μm Z-stap, voor een totale hoogte van 70 μm).
- Voer 3D-reconstructie uit met behulp van beeldanalysesoftware.
9. Vrijgeven en verzamelen van de organoïden
OPMERKING: De getextureerde kleeflaag van de celkweekschaal kan worden losgemaakt van de coverslip om de levende sferoïden / organoïden (vóór fixatie) in de piramidale holtes vrij te geven voor analyse van de cellen met andere procedures zoals RNA-sequencing, -omic-benaderingen, in vitro experimenten en in vivo transplantatie.
- Met het monster nog in de petrischaal en in een bioveiligheidskap, gebruik je een mes zoals een scalpel om een hoek van de getextureerde kleeflaag te snijden.
- Knijp met een pincet de getextureerde kleeflaag op de snijrand en pel deze voorzichtig af van de glazen afdekplaat, maar houd deze ondergedompeld in het medium (sommige organoïden kunnen bij de kleeflaag achterblijven, figuur 13).
- Spoel 3x af met kweekmedium en verzamel de organoïden door te pipetteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 8F toont het typische aspect van een celkweekdeksel na succesvolle fabricage. De UV-uithardende lijmlaag ziet er plat uit en hecht goed aan de coverslip. De overdracht van de kleeflaag op de coverslip kan mislukken als de laag op de coverslip overstroomt of als de verwijdering van het platte PDMS-substraat verkeerd gebeurt (zoals weergegeven in figuur 8G, H). In beide gevallen is de storing duidelijk omdat er geen getextureerde film wordt overgebracht naar de coverslip.
Om de microwells te laten werken, moet de geproduceerde getextureerde film (zoals beschreven in protocol stap 3) zowel de boven- als de onderkant van de piramides open hebben om ervoor te zorgen dat cellen tijdens het zaaien in stap 7 de holtes kunnen binnendringen en ingesloten blijven zodra de organoïden zich beginnen te vormen. Figuur 9 toont de toename in dikte van de coating door de concentratie van het biomimetische copolymeer in de coatingoplossing te verhogen. Figuur 10 toont de resultaten van het ontgassen van de celkweekschalen om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de piramidale holtes wordt opgesloten. Figuur 10A,B toont volledige ontgassing, terwijl Figuur 10C,D luchtbellen in de piramidale holtes toont.
In figuur 11 zitten cellen gevangen in de piramides en de bijbehorende organoïden worden gevormd na dag 2 en 15 van het kweken. Als de bovenste opening van de microwells in plaats daarvan gesloten is (als gevolg van onjuiste stap 3), blijven er geen cellen over na het spoelen van het monster na het zaaien van de cel. Figuur 12 toont representatieve beelden van de organoïden en een 3D-reconstructie verkregen met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop met een 40x lucht objectief (numeriek diafragma 0,75). Na afgifte en verzameling kunnen de organoïden worden opgeslagen in een kleine injectieflacon en worden gebruikt voor verdere analyse (bijv. RNA-sequencing). Figuur 13B toont een voorbeeld van een monster van organoïden verzameld zoals beschreven.
Figuur 1: Poly(dimethylsiloxaan) mal. (A) De beginnende PDMS-mal verkregen als gegoten replica van een 4"-getextureerde wafer (zie aanvullend bestand 1). (B) 1 cm x 1 cm brede snede van de beginnende PDMS-mal. (C) Scanning elektronenmicroscoop beelden van de trapeziumvormige pilaren gerangschikt in een vierkante array, die het oppervlak van de mal bevolken. Schaalstaven = 1 cm (A), 100 μm en 200 μm (respectievelijk C boven en onder). Afkorting: PDMS = poly(dimethysiloxaan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plat PDMS-substraat. (A) Een laag PDMS, ~1 mm dik, wordt bereid in een standaard petrischaal van 15 cm breed. (B) Pellen van een vers stuk PDMS. (C) De resterende PDMS op de petrischaal kan in meer stukken worden gesneden voor verder gebruik. (D) Platte PDMS-snede en PDMS-mal naast elkaar; de platte PDMS is groter dan de mal. Afkorting: PDMS = poly(dimethysiloxaan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het plaatsen van de mal op het substraat. (A) De mal wordt op het vlakke substraat geplaatst met de piramides naar beneden gericht. (B) Verschillend uiterlijk van slecht contact (boven) en goed contact (onder) tussen de mal en PDMS-substraat. (C) Optische microscoopafbeelding van een gebied met slecht contact; de rode cirkels markeren de pilaren die niet in contact komen met het substraat - ze lijken van een helderdere kleur dan degenen die in contact komen in dezelfde afbeelding. (D) Optisch beeld van een gebied met alle pilaren in goed contact. Schaalstaven = 200 μm (C,D). Afkorting: PDMS = poly(dimethysiloxaan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Capillaire vulling van UV-uithardende lijm. (A) Deze reeks afbeeldingen toont (van links naar rechts) het gieten van een kleine hoeveelheid lijm op één rand en de progressie van de vloeibare lijm in de holte tussen de mal en het substraat. De gele pijlen wijzen in de richting van de vloeistofstroom. (B) Volgorde van optische beelden (40x vergroting) van het vloeibare front dat beweegt; bij goed contact beweegt de voorkant van de vloeistof rond de randen van de piramides zonder lekken. De gele pijlen wijzen naar de stroomrichting en de rode pijlen wijzen naar de voorrand van het vloeistoffront dat rond de contactranden beweegt. (C) Volgorde van optische beelden (40x) van het vloeibare front dat beweegt wanneer het contact slecht is; de rode pijlen wijzen naar de voorrand van de vloeistof die infiltreert tussen de mal en het substraat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Verwijdering van de mal na het uitharden van de lijm. (A-C) Juiste procedure voor het afpellen van de mal: terwijl zachtjes met een pincet op het teveel aan lijm aan de linkerranden wordt gedrukt, wordt de mal in dezelfde rand geknepen en langzaam gebogen om af te pellen. (D) Het resultaat van de juiste procedure; het overschot wordt aan drie randen uitgesneden, terwijl aan de vierde kant een klein overschot aan PDMS wordt achtergelaten (gele pijl). (E-G) Voorbeeld van een onjuiste procedure voor het verwijderen van de mal: de mal wordt samengeknepen met een pincet vanaf de tegenovergestelde rand, wat resulteert in het afbladderen van het platte substraat van de kleeffilm samen met de mal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Coating van de glazen coverslip. (A,B) Voorbeeld van een goede coatingprocedure: de glazen coverslip wordt op de vacuümhouder van een spin-coater geplaatst en in het midden wordt voldoende lijm verstrekt, waardoor een homogene coating van de coverslip ontstaat. (C,D) Voorbeeld van een slechte coatingprocedure: er wordt niet genoeg lijm verstrekt, wat resulteert in een niet-uniforme coating van de coverslip. (E) Van links naar rechts, voorbeelden van goede, acceptabele en slechte coating. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Alternatief coatingproces. (A) Een kleine druppel vloeibare lijm wordt in het midden van de coverslip geplaatst. (B) Een tweede coverslip wordt voorzichtig bovenop de eerste geplaatst. (C,D) De vloeistof verspreidt zich tussen de twee coverslips en gelijkmatig verdeeld. (E) Voorbeelden van resultaten na correcte scheiding van de coverslips (links) of onjuiste scheiding (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Breng over op de coverslip. (A) De uitgeharde en getrimde zelfklevende film (figuur 5D) wordt met gedeeltelijk uitgeharde lijm op de coverslip geplaatst. (B) Voorbeeld van goed contact tussen de getextureerde film en de coverslip. De inzet is een optisch beeld dat uniform contact toont van de gebieden tussen de trapeziumholten (donkere uniforme kleur). (C) Voorbeeld van slecht contact tussen de getextureerde film en de coverslip. De helderdere gebieden zijn niet in contact, de rode pijlen wijzen naar die gebieden. De inzet is een optisch beeld dat het verschillende uiterlijk van goed contact (twee aan de linkerkant) en slecht contact (twee aan de rechterkant) laat zien. Schaalbalken (geel, B,C) = 200 μm. (D,E) Juiste procedure voor het verwijderen van het PDMS-vlakke substraat: pincetten worden gebruikt om het PDMS aan de rand te knijpen met overtollig PDMS en te buigen om voorzichtig af te pellen. (F) Het resultaat met de UV-kleefstructuurfilm is met succes overgebracht naar de coverslip. (G,H) Voorbeeld van onjuiste peelingprocedure: pincet wordt gebruikt om het platte PDMS op een van de randen te knijpen waar het overtollige materiaal is afgesneden; zo wordt de film samen met het platte PDMS verwijderd. Afkorting: PDMS = poly(dimethysiloxaan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Coating met biomimetisch copolymeer. (A) Celkweekapparaat bedekt met biomimetisch copolymeer met behulp van een oplossing van 0,5% (links) of (B) 1% (rechts) (w/v) in zuivere ethanol. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10: Ontgassing van celkweekapparaat. (A) Celkweekapparaat vóór volledige ontgassing. B) celkweekinrichting na volledige ontgassing; (C,D) celkweekapparaat met slechts gedeeltelijke ontgassing waar luchtbellen in de piramides gevangen zitten. Schaalstaven = 200 μm (A-D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Representatieve brightfieldbeelden van celzaaien en groei van organoïden. (A) Cellen zijn zichtbaar zwevend op de bovenkant. (B) Cellen die gevangen zitten in de piramidale holtes na het wegspoelen van de celsuspensie. Alleen gevangen cellen worden behouden zoals aangegeven. (C) Cellen aggregeren om sferoïden te vormen in elke holte (dag 2 na het zaaien van cellen). (D) Afbeelding op dag 15 na het zaaien van cellen van een organoïde die in een piramidale holte is gegroeid. Schaalstaven = 200 μm (A B), 120 μm (C) en 150 μm (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: 3D-beeldvorming van organoïden. (A) Drie verschillende Z-plannen verkregen met behulp van een draaiende schijf confocal (lens 40x, lucht, numeriek diafragma: 0,75) van een organoïde onder neuro-ectoderm differentiatie (dag 7 na celzaaien). Actinekleuring met behulp van falloïdine (Alexa Fluor 647) in oranje en N-cadherine immunostaining (Alexa Fluor 561) in blauw. (B) Een 3D-reconstructie met behulp van beeldanalysesoftware van de overeenkomstige organoïden (80 Z-plannen, totale hoogte van 100 μm). Witte pijlen: clusters van cellen rond een streep met een hoog niveau van actine-expressie. Blauwe pijlen: celclusters die positief zijn voor N-cadherine-eiwitexpressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13: Afgifte van organoïden. (A) Het verwijderen van de getextureerde kleeflaag met een pincet; B) brightfield-afbeelding van een organoïde suspensie die na de verwijdering is verkregen. Schaalbalk = 200 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Een stapsgewijs protocol voor de microfabricage van een Si-mal met piramidale microcavaniteiten wordt gepresenteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De procedure voor de fabricage van de microwellcultuurschaal, die organoïde cultuur en differentiatie met hoge dichtheid mogelijk maakt, is in dit artikel beschreven. Dankzij de geometrie en rangschikking van de microcaviteiten kunnen duizenden sferoïden gedurende lange tijd (enkele weken of langer) in een enkele plaat worden gekweekt en gekleurd met bijna geen verlies van materiaal. Ter vergelijking: een gebied van 4 mm x 2 mm op de celkweekplaat kan evenveel sferoïden bevatten als een enkele 384-well plaat met een oppervlakte van 12 cm x 8 cm.
De regelmatige verdeling van de microcaviteiten en de platte standaard coverslip die als substraat wordt gebruikt, maken de monitoring van duizenden levende of vaste organoïden in 3D mogelijk, zonder de noodzaak van complexe en tijdrovende monstermanipulatie tussen kweekvaten en beeldvormingsondersteuning. Vanwege de piramidevorm met een kleinere bovenkant dan de basis, is er geen verlies van organoïden als gevolg van pipetteerstappen tijdens de mediumuitwisseling, afgifte van extracellulaire matrices of kleuringsprocedures. Al deze stappen kunnen direct worden uitgevoerd, zoals voor een 2D-cel monolaag zonder extra voorzorgsmaatregelen, in tegenstelling tot klassieke organoïde generatietechnieken (bijv. Hangende druppels, lage bevestigingsplaten, Aggrewell).
Bovendien zijn de microwells in vergelijking met deze bestaande technieken ontworpen voor 3D-beeldvorming met hoge resolutie die compatibel is met alle soorten immersielenzen (lucht, water, olie en silicium). Langdurig onderhoud van organoïden gesloten voor een platte glazen coverslip maakt de celkweek coverslip compatibel met hoge resolutie lichtmicroscopen, wat onmogelijk is met de bestaande methoden zonder complexe hantering en kieskeurige organoïde overdracht. Verder vermijdt een geoptimaliseerde passiveringsprocedure elke hechting van cellen / organoïden voor langdurige cultuur, waardoor de differentiatie van de 3D-cultuur wordt gecontroleerd Ten slotte, omdat de getextureerde kleeflaag verwijderbaar is, kunnen levende organoïden worden opgehaald om andere soorten experimenten uit te voeren, zoals -omics-assays of in vivo transplantatie.
Opgemerkt moet worden dat de piramidale vorm en array-rangschikking van de microcaviteiten die voor dit protocol worden gebruikt, zijn afgeleid van de primaire mal, die is vervaardigd door middel van silicium nat-etsen om oppervlakken te voorzien van spiegelachtige afwerking en 45 ° helling om single-objective light-sheet microscopie mogelijk te maken (soSPIM11). Hoewel een bespreking van deze vereisten en een volledige beschrijving van het produceren van dergelijke mallen elders te vinden is 12,13, wordt ook een eenvoudig protocol gegeven in aanvullend dossier 1. Er zijn verschillende manieren beschikbaar om een primaire mal te produceren, die volledig compatibel zijn met de fabricage van de chips in dit protocol. Laseretsen van glas en 3D-printen met hoge resolutie kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om een primaire mal te produceren met geschikte holtes voor het insluiten van de organoïden, maar zijn niet geschikt voor soSPIM-beeldvorming.
Het hier beschreven fabricageprotocol kan worden aangepast voor gebruik in elk standaard biologisch laboratorium, omdat er geen speciale, geavanceerde microfabricagetools nodig zijn. Enkele kritieke stappen van de fabricage van de microwells zijn de productie door capillaire vulling van de getextureerde kleeffilm en de overdracht ervan naar het glazen substraat. Onze ervaring is echter dat ze in korte tijd met een hoge reproduceerbaarheid kunnen worden beheerst. De afstand tussen de piramides moet zo klein mogelijk zijn om de dichtheid van holtes voor de groei van organoïden te vergroten, maar het moet ook groot genoeg zijn zodat de holtes op het substraat kunnen worden afgedicht zonder lek of gebrek aan afdichting ertussen. We vonden dat een afstand van 50 μm een goed compromis is voor dit geval.
Tijdens het zaaien van cellen is een cruciaal aspect het verwijderen van luchtbellen die in de holtes zijn opgesloten om de toegang van de cel te garanderen. We beschrijven hier een gevalideerde oplossing, die alleen klassieke laboratoriumapparatuur gebruikt (bijvoorbeeld een ultrasone homogenisator of een vacuümpot). Om een betere homogenisatie van het aantal cellen per celkweekschaal mogelijk te maken, wordt aanbevolen om de celsuspensie vanaf de zijkant van de schaal te doseren en niet direct boven de coverslip. Zachte handmatige agitatie kan ook helpen om de cellulaire oplossing te homogeniseren.
Na het zaaien van cellen kan de celkweekschaal met organoïden worden behandeld als elke andere klassieke kweekondersteuning; er zijn geen specifieke manipulatie of kritieke stappen vereist. Alle protocollen die zijn gebruikt met de microwell-apparaten zijn praktisch hetzelfde als die worden gebruikt in schotels met een laag aanhechting, zoals U-bodemplaten. Vandaar dat organoïde cultuur in deze microwells geen verandering in kweekomstandigheden vereist in vergelijking met andere normen.
Een andere kritische factor is dat de lijm die hier wordt gebruikt een optische lijm is. In het voorgestelde beste gebruik (zie ook de toepassingsnotities van de leverancier), worden twee optische elementen die moeten worden gelijmd uitgelijnd en wordt UV-uithardende lijm op de interface aangebracht. Een eerste blootstelling aan UV van een energie die onvoldoende is om volledige polymerisatie te veroorzaken, wordt gebruikt om de lijm te stollen met behoud van kleefeigenschappen. De optische componenten kunnen worden verplaatst om een optimale uitlijning te bereiken, en vervolgens wordt de lijm volledig uitgehard tot zijn uiteindelijke toestand met een tweede blootstelling aan UV om permanente hechting te bieden. De eerste en tweede blootstellingsenergiedoses (d.w.z. blootstellingstijden als een bron van bekende en constante energiedichtheid wordt gebruikt) moeten worden geoptimaliseerd afhankelijk van de energiedichtheid van de gebruikte UV-bron, de dikte van de lijmlaag, de overdracht van UV door de optische elementen en de oppervlaktetexturering (of het ontbreken ervan) van het te lijmen oppervlak.
Hoewel de hechting tussen de getextureerde film en de met lijm beklede coverslip sterk genoeg moet zijn om lekvrije afdichting te bieden, moet het ook mogelijk zijn om de getextureerde film te verwijderen om de organoïden na beeldvorming op te halen, indien verdere analyse vereist is, zoals genotypische profilering. Een correct compromis tussen lekvrije afdichting en de mogelijkheid om de getextureerde film af te pellen is bereikt met het hier beschreven protocol, maar verdere optimalisatie van de voor- en einduithardingstijden voor de zelfklevende dunne laag op de coverslip kan nodig zijn omdat dit afhankelijk is van het UV-blootstellingssysteem en de gebruikte filmdikte.
Een beperking in de huidige microwells-versie is in de zaaiprocedure; cellen moeten vóór de ECM-componenten worden gezaaid om ze in de buurt van de piramide te laten komen. Er zijn verbeteringen aan de gang om de microwells te coaten met extracellulaire matrixcomponenten, als een eerste stap. We hebben nog geen elektronenmicroscopie (EM) uitgevoerd op de vaste organoïden in de holtes. Enige aanpassing aan deze fabricage- en celkweekprotocollen zal nodig zijn voordat beeldvorming van organoïden in de microwells met EM een haalbare optie wordt.
Een natuurlijke toekomstige uitbreiding van deze methode is het bieden van screeningcapaciteiten met een hoog gehalte om multiconditioneringstests in een enkele workflow (multiwell-plaat) mogelijk te maken. Dit celkweekapparaat biedt een uniek alternatief voor bestaande organoïde technieken, biedt onovertroffen kweek- en beeldvormingsdoorvoer en opent nieuwe perspectieven op het gebied van organoïdonderzoek voor biomedische toepassing en medicijnontdekking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is een internationale octrooiaanvraag gepubliceerd met publicatienummer WO 2021/167535 A1.
Acknowledgments
Het onderzoek wordt ondersteund door het CALIPSO-project dat wordt ondersteund door de National Research Foundation, Prime Minister's Office, Singapore, in het kader van het Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) -programma. V.V. erkent de steun van NRF-onderzoeker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding en ANR ADGastrulo. A.B. en G.G. erkennen de steun van de MBI-kernfinanciering. A.B. erkent Andor Technologies voor de bruikleen van de BC43 microscoop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
