Summary
本文提出了一种啮齿动物眼部显微解剖的方案。该过程涉及眼球与眼球膜（即第三眼睑）的剜除。然后是后眼杯和前眼杯的分离。
Abstract
啮齿动物眼的眼部显微解剖涉及将去核眼球与附着的眼膜或第三眼睑分割，以获得前眼罩和后眼罩。使用这种技术，可以获得眼睛的子部分，包括角膜组织、神经组织、视网膜色素上皮 （RPE） 组织和晶状体，用于特定眼组织的整片、冷冻切片和/或单细胞悬液。第三眼睑的存在具有独特而显着的优势，因为它有利于维持眼睛的方向，这对于在任何局部干预后了解眼睛生理学或涉及与眼睛空间地形相关的眼部分析的研究非常重要。
在这种方法中，我们通过小心而缓慢地切开眼外肌并切断视神经，将眼窝处的眼球与第三眼睑一起去掉。用微刀片刺穿眼球角膜缘。切口被用作切口，允许通过切口点插入微型剪刀来沿着角膜巩膜连接处切割。沿圆周进行小而连续的切割，直到杯子分离。这些可以通过使用Colibri缝合钳轻轻剥离神经视网膜的半透明层来进一步解剖，以获得神经视网膜和RPE层。此外，从外围垂直于视中心进行三/四个等距切口，直到到达视神经。这将半球形杯子打开成小花形状，使它们平坦并可以轻松安装。该技术已在我们的实验室中用于角膜整体安装和视网膜切片。第三眼睑的存在描绘了鼻颞方向，这允许研究移植后的各种细胞治疗干预措施，因此，对于此类研究中的可视化和准确表示至关重要的靶向生理验证。
Introduction
眼部解剖是眼科研究中的一项重要技术，它允许研究人员进入眼睛的节段进行有针对性的研究。以前，眼部研究人员依靠患病个体的眼组织进行研究。然而，多年来眼科啮齿动物模型1 的菌株数量逐渐增加，减少了对人类眼组织的需求。这些小鼠品系使人们对眼部疾病和干预措施有了更深入的了解。然而，它们也产生了对眼部显微解剖创新技术的需求。小尺寸和有限的操作区域严重限制了对眼亚部分的有效访问。此外，由于后眼罩和前眼杯的细胞组装均匀，因此很难在解剖后进行有针对性的干预。目前的激光2 和外科显微解剖3，4 的显微解剖技术不足以满足眼科研究的这种要求。激光显微解剖在单细胞分析中非常有效，但特定组织需要在激光手术前进行显微解剖2。该技术可以从预先解剖的组织中分离出感兴趣的小区域以进行分子分析。因此，该技术不适用于制备整体安装或分离轴向堆积的眼层以获得最佳可视化效果。
手术方法是使用最广泛的技术;该方法涉及通过视神经5固定眼睛，然后进行解剖。这种做法很艰巨，可能会损害任何脆弱的组织，因为球眼在解剖过程中继续移动。尽管该技术有利于分离视网膜层的各个部分，但该技术无法在解剖时划定组织的空间方向。
在解剖过程中，保持附着的萤火膜或第三眼睑的存在（图1）具有独特而显着的优势。在这种方法中，首先，用第三眼睑去眼球。然后，使用第三眼睑固定眼睛6（图2A）。随后通过角膜缘刺穿眼球并使用切口作为切入点（图2B，C）。然后，通过沿前后圆周切割来分离眼罩（图2D-G）。通过进一步解剖后眼罩，可以识别神经视网膜的半透明层并轻轻剥离。然后在获得的半球形前杯和后杯中进行三个或四个等距切割，这使得这些花形杯子平放在滑块上（图2H）。
第三个眼睑有助于在解剖过程中轻松有效地处理，从而确保在进入各个眼层和生产整体时对组织的损害最小。此外，第三眼睑的存在有助于在可视化过程中定位和检查局部干预。
在我们的实验室中，该程序已在任何性别的 P28 的 CBA/J 或 rd1 小鼠品系上进行。该程序可以对动物的任何品系，年龄或性别进行，并且根据这些特征没有偏差。
这些动物是从商业来源采购的（见 材料表），并在国家免疫学研究所（NII）的小动物设施（SAF）进行维护。他们被关在单独的通风笼子（IVC）中， 并随意获得 酸化的高压灭菌水和食物。它们保持在21-23°C，光照/黑暗循环为14小时/ 10小时。
下面给出的是用于小鼠眼睛微解剖的改良手术方法。
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Protocol
该程序得到了新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会的批准。批准的序列号为IAEC#480/18。这些实验是根据印度政府渔业、畜牧业和乳制品部动物实验控制和监督委员会的监管准则，在SAF专业兽医NII的监督下进行的。
1. 准备
- 在每只眼睛中使用0.8%托吡卡胺和5%去氧肾上腺素眼用溶液来扩张啮齿动物的眼睛。手术前将动物放在黑暗区域30分钟。
注意：不需要镇痛药，因为动物在完成 30 分钟后立即被安乐死。动物眼睛的黑暗适应和散大使观察者能够在手术前检查眼部撕裂和损伤。此外，在处理色素眼球组织时，扩张是有利的。 - 通过腹膜内施用 5 倍剂量的麻醉对动物实施安乐死。典型剂量是 200 μL PBS，含有 10 mg 氯胺酮和 1 mg 甲苯噻嗪。
注意：对动物实施安乐死的剂量是400-500mg / kg体重的氯胺酮和50mg / kg体重的甲苯噻嗪腹膜内给药。对于称量 20 g 的典型小鼠，剂量为 200 μL PBS，含有 10 mg 氯胺酮（100 μL 100 mg/mL 氯胺酮储备溶液）和 1 mg 甲苯噻嗪（100 μL 10 mg/mL 甲苯噻嗪储备溶液）。 - 通过检查踏板反射来确认对刺激完全缺乏反应。没有心跳和呼吸也是重要的指标。
- 将鼠标放在侧面卧位以允许完全进入眼睛。
- 准备 Colibri 缝合钳、弯曲镊子、微刀片（15°，3 毫米大小）、弹簧微型剪刀和倾斜弹簧微型剪刀，准备进行手术。
2. 小鼠眼与第三眼睑一起去核
- 将鼠标放在侧面卧位，以便完全进入眼睛。用镊子打开外眼睑，以最佳地观察第三眼睑。
注意：第三眼睑，也称为鼻膜，位于鼻切线的上角（图1A）。 - 将第三眼睑识别为具有色素边界的轻微半透明突起（图1B）。
- 将弯曲的镊子放在眼球周围，捏住以使眼睛摆脱无关的附着物。这将最大限度地减少从周围组织出血到眼睛。
- 用弹簧微型剪刀代替弯曲的镊子，并在眼球周围切开第三个眼睑。使用连续的小切口将眼球从周围的组织附件中释放出来。
- 将弯曲的弹簧微型剪刀放在眼球下方，通过切割视神经来解放眼睛。确保眼球从眼窝中完全释放。
3. 清除外来组织
- 将安乐死小鼠的眼球置于pH 7.4的带有磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液的培养皿中，填充培养皿，使眼球浸没在PBS中。
- 用一只手用镊子固定鼠标的去核眼球，附有第三眼睑。
- 将眼球悬浮在液体介质中，以便更有效地处理。一些眼外肌肉或组织将开始从眼球上漂浮。使用弹簧微型剪刀将它们从眼球上剪下来，将其取下。
- 使用微型剪刀从眼球底部切割并去除视神经，以便更好地分离视网膜以进行整体安装准备。
注意：组织切片不需要切除视神经。 - 用PBS清洗眼球，并将其转移到含有1mL4%多聚甲醛（PFA）的1.5mL管中，在4°C下至少2小时以进行组织固定。
注意：通过将组织在PFA中在4°C下放置长达12小时，可以在此步骤中暂停该过程。 但是，对于活细胞的分离，不应执行固定步骤，整个过程需要不间断地进行。
4.解剖眼摘除，得到前后眼罩
- PFA固定后（如果收集活细胞，则无需固定眼球即可进行），将眼球转移到含有PBS的培养皿中，并将其置于解剖显微镜下以执行后续程序。
- 用 Colibri 缝合镊子牢牢按住第三眼睑来固定眼球。
- 使用微型刀片刺穿角膜缘，在角膜缘处做一个小切口。角膜缘是角膜-巩膜连接处。使切口最好与第三眼睑相对，从而为弹簧微型剪刀做一个接入点。
注意：使用15°和3毫米大小的微刀片可以更好地控制该切口的深度。 - 接下来，以这个切口为起点，用一把微型剪刀，沿着角膜巩膜缘的圆周进行小而连续的切口。首先，完成从切口点到第三眼睑的半圆切口。然后，在另一侧完成剩余的半圆切割。最后，在第三眼睑周围切开，将后杯和前杯分开。
注意：根据感兴趣的眼罩，眼膜可以留在前眼罩或后眼罩上。 - 使用镊子从后杯上取下晶状体，以获得包含神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）层的后杯。因此，眼睛的晶状体、后杯和前杯是分开的。
注意：如果使用未固定的组织，现在可以酶消化前杯和后杯以获得角膜或视网膜单细胞悬浮液。 - 为了固定组织，将这些杯子转移到含有1mL 4%PFA的1.5mL管中，在4°C下12小时。
注意：固定后，可以将组织嵌入适当的培养基中，并且可以进行冷冻切片或石蜡切片以获得角膜或视网膜切片。
5. 神经视网膜和 RPE 层的分离
- 将后杯重新引入含有PBS缓冲液的培养皿中以浸没组织。
- 检查神经视网膜是否存在。这可以可视化为色素沉着RPE层上的不透明层，该层附着在杯子的圆周处。
- 用镊子握住第三眼睑以固定后杯，并使用第二对镊子从外围开始剥离神经视网膜。
注意：强烈建议非常轻柔和轻微的手部运动，以免损坏组织。在视神经出口处，可以将弯曲的弹簧剪刀插入神经视网膜下方，如果神经视网膜保持连接，则可以进行切割以完全释放层，如图 3所示。或者，使用软刷轻轻抚摸或分离视网膜。但是，如果收集视网膜进行组织学检查，则不宜这样做。
注意：因此，获得了具有第三眼睑的神经视网膜和色素沉着的RPE层。
6. 视网膜和 RPE 层的分割以进行整体安装
- 将前杯和后杯重新引入含有PBS缓冲液的培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下。
- 按住第三眼睑固定前杯。
- 使用倾斜的弹簧微型剪刀在第三眼睑旁边切开眼罩直径的约3/4，从外围垂直于光学中心切割。
- 保持抓紧第三眼睑，并在第一眼睑旁边切开。
- 在第二个切口和第三个眼睑之间做一个类似的切口。
注意：三个或四个这样的等距切口将半球形杯子打开成花形，平坦且易于安装。 - 按住第三眼睑固定后杯。
- 按照与在前杯上进行切口相同的步骤（步骤6.3-6.5），在后杯上进行三到四个等距切口。
注意：对于在步骤5中分离的神经视网膜的组织学，请进行类似的切割以确保其平坦地落在表面上。不要在杯子的中心切得很深，因为这会使叶子部分容易散开或分离。 - 进行染色，并整体安装组织以进行有效的可视化7，8。
注意：眼罩的存在是整个眼罩鼻侧的恒定物理指标。它有助于划分眼杯的背侧/腹侧，因为眼罩的第三个眼睑指示鼻/腹侧方向。
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Representative Results
准备了整个rd1小鼠眼睛/角膜组织，以研究患病状态下前/角膜组织中潜在的淋巴血管生成。来自第三眼睑的附着结膜组织作为阳性对照，因为角膜缺乏淋巴管。在这项研究中，角膜组织用结膜解剖并用4%PFA固定，然后透化和阻塞。然后用针对淋巴内皮标志物（LYVE1）的一抗对组织进行染色9。随后用标记有Alexa Fluor 488（绿色）的二抗孵育。使用荧光显微镜在4x和10x下捕获代表性图像（图4）。
准备从后眼罩整片神经视网膜，以可视化视网膜脉管系统，以进行视网膜形态、结构和功能研究7.小心地从脉络膜RPE层剥离神经视网膜，并切开以将其平放在小花结构中。为了可视化视网膜血管结构，在室温下用异凝集素IB4-Alexa Fluor 488对小叶进行染色1小时，并在2倍和20倍放大倍率下可视化（图5）。
图1：小鼠的第三眼睑或 眼膜。 （A）第三眼睑位于鼻切线的上角，并且（B）通常具有色素边界。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：将前眼罩和后眼罩与去核眼球隔离的步骤。 （A）第三眼睑用于固定眼睛，以及 （B）通过角膜缘切开一个切口。（C）在形成切口并沿圆周切割后进入，如（D-F）所示。（G）因此，前眼罩和后眼罩是分开的。神经视网膜的半透明层存在于后眼杯上，该罩杯被剥离。 （H）然后在杯子上做三个等距切口，使它们平坦。请点击此处查看此图的大图。
图 3：示意图显示了如何将弯曲的弹簧剪刀插入神经视网膜下方以释放层。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：前杯的整体安装。 如描述的那样对角膜组织进行显微解剖以显示淋巴管。用淋巴内皮标志物（LYVE1）和Alexa Fluor 488（绿色）标记的二抗对组织进行染色。（A） 4 倍和 （B） 10 倍放大倍率的图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：神经视网膜的整体安装。 异凝集素IB4染色视网膜脉管系统，可以很容易地用绿色查看。（A）从后眼罩获得的视网膜平面支架用标记有Alexa Fluor 488（2x）的异凝集素IB4染色。（B）视网膜脉管系统的20倍放大倍数，显示视网膜中的中间血管丛。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
由于啮齿动物眼睛的体积小和球形，已经发现眼部显微解剖是一项艰巨的任务，并且啮齿动物眼睛需要创新技术才能有效处理8。
在目前演示的方法中，通过附有第三眼睑获得去核小鼠眼球，以便有效且易于处理。使用第三眼睑，眼球可以完全固定，这使得解剖可以轻松进行，误差最小。此外，第三眼睑的存在描绘了眼睛子部分的方向。因此，用第三眼睑解剖眼球以获得前眼罩和后眼罩。使用狭缝进入剪刀以允许均匀和干净的切割，使眼睛的球形性质更容易工作。此外，通过轻轻剥离神经视网膜的半透明层，可以进一步解剖后眼罩以获得神经视网膜和RPE层以进行组织特异性研究。
此外，在该协议中，从垂直于视中心的外围进行三/四个等距切口以到达视神经，以便将半球形杯打开成小花形状，该小花形状平坦且易于安装。
因此，该方法有利于眼组织特异性切片、单细胞分析和整体安装。然而，对重复组织固定的需求使得组织无法用于细胞培养或需要活细胞的实验。该技术已在我们的实验室中有效地用于角膜整体，视网膜切片和移植后细胞干预的单细胞研究10。第三眼睑的存在有助于识别方向，支持有针对性的方法，并在视网膜可视化期间充当指导。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
美国加州大学戴维斯分校细胞生物学和人体解剖学系的Alaknanda Mishra博士在新德里国家免疫学研究所培训了我们这种方法。这项工作得到了印度政府生物技术部向新德里国家免疫学研究所提供的核心赠款的支持。P.S.被生物技术系授予研究奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
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