Summary
यह पेपर कृन्तकों में ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रक्रिया में नेत्रगोलक के न्यूक्लियेशन के साथ-साथ निकोटिटेटिंग झिल्ली (यानी, तीसरी पलक) शामिल है। इसके बाद पीछे और पूर्ववर्ती आंखों के कप को अलग किया जाता है।
Abstract
कृंतक आंख के ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन में पूर्ववर्ती और पीछे के आंख के कप प्राप्त करने के लिए संलग्न छिद्रित झिल्ली, या तीसरी पलक के साथ एन्यूक्लिएटेड नेत्रगोलक का विभाजन शामिल है। इस तकनीक के साथ, कॉर्नियल ऊतक, तंत्रिका ऊतक, रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) ऊतक और लेंस सहित आंख के उप-भागों को एक विशिष्ट ओकुलर ऊतक के पूरे भरण, क्रायो-सेक्शनिंग और / या एकल-कोशिका निलंबन के लिए प्राप्त किया जा सकता है। तीसरी पलक की उपस्थिति अद्वितीय और महत्वपूर्ण फायदे प्रस्तुत करती है, क्योंकि यह आंख के अभिविन्यास के रखरखाव को लाभ पहुंचाती है, जो किसी भी स्थानीय हस्तक्षेप के बाद आंखों के शरीर विज्ञान को समझने या आंख की स्थानिक स्थलाकृति से संबंधित ओकुलर विश्लेषण से जुड़े अध्ययनों में महत्वपूर्ण है।
इस विधि में, हमने ध्यान से और धीरे-धीरे एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियों को काटकर और ऑप्टिक तंत्रिका को अलग करके तीसरी पलक के साथ सॉकेट पर नेत्रगोलक को अलग किया। एक माइक्रोब्लेड का उपयोग करके कॉर्नियल लिम्बस के माध्यम से नेत्रगोलक को छेद दिया गया था। चीरा का उपयोग प्रवेश बिंदु के रूप में किया गया था, जिससे चीरा बिंदु के माध्यम से माइक्रो-कैंची डालकर कॉर्नियल-स्क्लेरल जंक्शन के साथ काटने की अनुमति मिलती थी। परिधि के साथ छोटे और निरंतर कटौती की गई जब तक कि कप अलग नहीं हो गए। तंत्रिका रेटिना और आरपीई परतों को प्राप्त करने के लिए कोलिब्री ट्यूरिंग फोर्सप्स का उपयोग करके तंत्रिका रेटिना की पारभासी परत को धीरे से छीलकर इन्हें और विच्छेदित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑप्टिक तंत्रिका तक पहुंचने तक ऑप्टिक केंद्र के लंबवत परिधि से तीन/चार समान दूरी के कट किए गए थे। इसने अर्धगोलाकार कपों को एक फूलों के आकार में खोल दिया ताकि वे सपाट गिर जाएं और आसानी से चढ़ सकें। इस तकनीक का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में कॉर्नियल होलमाउंट और रेटिना सेक्शन के लिए किया गया है। तीसरी पलक की उपस्थिति नाक-अस्थायी अभिविन्यास को चित्रित करती है, जो प्रत्यारोपण के बाद विभिन्न सेल थेरेपी हस्तक्षेपों के अध्ययन की अनुमति देती है और इस प्रकार, ऐसे अध्ययनों में विज़ुअलाइज़ेशन और सटीक प्रतिनिधित्व के लिए महत्वपूर्ण लक्षित शारीरिक सत्यापन।
Introduction
नेत्र विच्छेदन नेत्र अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण तकनीक है और जांचकर्ताओं को लक्षित अध्ययन के लिए आंख के खंडों तक पहुंचने की अनुमति दी है। इससे पहले, ओकुलर शोधकर्ताअपने अध्ययन के लिए रोगग्रस्त व्यक्तियों से ओकुलर ऊतक पर भरोसा करते थे। हालांकि, वर्षों से नेत्र कृंतक मॉडल1 के उपभेदों की उत्तरोत्तर बढ़ती संख्या ने मानव ओकुलर ऊतक की आवश्यकता को कम कर दिया है। इन माउस उपभेदों ने ओकुलर रोग और हस्तक्षेप की गहरी समझ की अनुमति दी है। फिर भी, उन्होंने ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन की नवीन तकनीकों की आवश्यकता भी उत्पन्न की है। ऑपरेशन का छोटा आकार और सीमित क्षेत्र ओकुलर उप-भागों तक प्रभावी पहुंच को गंभीर रूप से बाधित करता है। इसके अलावा, पीछे और पूर्ववर्ती आंखों के कप की समरूप सेलुलर असेंबली के कारण, विच्छेदन के बाद लक्षित हस्तक्षेप करना मुश्किल है। लेजर2 और सर्जिकल माइक्रोडिसेक्शन 3,4 की वर्तमान सूक्ष्म विच्छेदन तकनीक ओकुलर अनुसंधान की ऐसी आवश्यकताओं को पूरा करने में अपर्याप्त हैं। लेजर माइक्रो-विच्छेदन एकल-कोशिका विश्लेषण में बहुत प्रभावी है, लेकिन लेजर प्रक्रिया2 से पहले विशिष्ट ऊतक को सूक्ष्म-विच्छेदित करने की आवश्यकता होती है। तकनीक आणविक विश्लेषण के लिए पूर्व-विच्छेदित ऊतक से रुचि के छोटे क्षेत्रों को अलग कर सकती है। इस प्रकार, तकनीक संपूर्ण तैयार करने या इष्टतम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अक्षीय रूप से पैक ओकुलर परतों के अलगाव के लिए उपयुक्त नहीं है।
सर्जिकल विधि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है; इस विधि में ऑप्टिक तंत्रिका5 के माध्यम से आंख को स्थिर करना और फिर विच्छेदन करना शामिल है। यह अभ्यास कठिन है और किसी भी नाजुक ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, क्योंकि गोलाकार आंख विच्छेदन के दौरान चलती रहती है। रेटिना परतों के विभिन्न वर्गों को अलग करने के लिए फायदेमंद होने के बावजूद, तकनीक विच्छेदन पर ऊतक के स्थानिक अभिविन्यास को सीमांकित नहीं कर सकती है।
विच्छेदन के दौरान, संलग्न निकोटिटिंग झिल्ली या तीसरी पलक (चित्रा 1) की उपस्थिति को बनाए रखना अद्वितीय और महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है। इस विधि में, सबसे पहले, नेत्रगोलक को तीसरी पलक के साथ एन्यूक्लिएटेड किया जाता है। फिर, तीसरी पलक का उपयोग आंख6 (चित्रा 2 ए) को गतिहीन करने के लिए किया जाता है। इसके बाद कॉर्नियल लिम्बस के माध्यम से नेत्रगोलक को छेदना और प्रवेश के बिंदु के रूप में चीरा का उपयोग करना (चित्रा 2 बी, सी)। फिर, आंखों के कप को परिधि के साथ पूर्वकाल और पीछे की ओर काटकर अलग किया जाता है (चित्रा 2 डी-जी)। पीछे के आईकप को आगे विच्छेदित करके, तंत्रिका रेटिना की पारभासी परत की पहचान की जा सकती है और धीरे से छील दिया जा सकता है। तीन या चार समान दूरी के कट तब प्राप्त अर्धगोलाकार पूर्ववर्ती और पीछे के कप में किए जाते हैं, जो इन फूलों के आकार के कपों को स्लाइड पर सपाट गिरने की अनुमति देते हैं (चित्रा 2 एच)।
तीसरी पलक विच्छेदन के दौरान आसान और कुशल हैंडलिंग में सहायता करती है, इस प्रकार विभिन्न ओकुलर परतों तक पहुंचने के दौरान और पूरे अंडे का उत्पादन करते समय ऊतक को न्यूनतम नुकसान सुनिश्चित करती है। इसके अलावा, तीसरी पलक की उपस्थिति विज़ुअलाइज़ेशन के दौरान स्थानीय हस्तक्षेप का पता लगाने और जांच करने में मदद करती है।
हमारी प्रयोगशाला में, प्रक्रिया, किसी भी लिंग के पी 28 पर सीबीए / जे या आरडी 1 माउस स्ट्रेन पर की गई है। प्रक्रिया जानवर के किसी भी तनाव, उम्र या लिंग पर की जा सकती है और इन विशेषताओं के अनुसार कोई पूर्वाग्रह नहीं है।
जानवरों को वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा गया था ( सामग्री की तालिका देखें) और राष्ट्रीय प्रतिरक्षा विज्ञान संस्थान (एनआईआई) में लघु पशु सुविधा (एसएएफ) में बनाए रखा गया था। उन्हें अलग-अलग हवादार पिंजरों (आईवीसी) में रखा गया था और एसिडयुक्त ऑटोक्लेव पानी और भोजन तक पहुंच प्राप्त हुई थी। उन्हें 21-23 डिग्री सेल्सियस पर और 14 घंटे / 10 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ बनाए रखा गया था।
नीचे दिए गए माउस आंख के सूक्ष्म विच्छेदन के लिए एक संशोधित शल्य चिकित्सा विधि है।
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Protocol
इस प्रक्रिया को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ इम्यूनोलॉजी, नई दिल्ली की संस्थागत पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। अनुमोदन की क्रम संदर्भ संख्या IAEC # 480/18 है। एसएएफ, एनआईआई में एक पेशेवर पशु चिकित्सक की देखरेख में भारत सरकार के मत्स्य पालन, पशुपालन और डेयरी मंत्रालय के पशुओं पर प्रयोगों के नियंत्रण और पर्यवेक्षण के लिए समिति के विनियमन दिशानिर्देशों के अनुसार प्रयोग किए गए थे।
1. तैयारी
- प्रत्येक आंख में 0.8% ट्रॉपिकामाइड और 5% फेनिलफ्राइन नेत्र समाधान की एक बूंद का उपयोग करके कृंतक आंखों को पतला करें। प्रक्रिया से पहले जानवर को 30 मिनट के लिए एक अंधेरे क्षेत्र में रखें।
नोट: एक एनाल्जेसिक की आवश्यकता नहीं है क्योंकि जानवर को 30 मिनट पूरा करने के तुरंत बाद इच्छामृत्यु दी जाती है। अंधेरे अनुकूलन और जानवर की आंखों को पतला करने से पर्यवेक्षक को प्रक्रिया से पहले ओकुलर आँसू और क्षति की जांच करने की अनुमति मिलती है। इसके अतिरिक्त, रंजित नेत्रगोलक ऊतक के साथ काम करते समय फैलाव फायदेमंद होता है। - एनेस्थीसिया की 5x खुराक को इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करके जानवर को यूथेनाइज़ करें। एक विशिष्ट खुराक पीबीएस की 200 μL है जिसमें 10 मिलीग्राम केटामाइन और 1 मिलीग्राम ज़ाइलाज़िन होता है।
नोट: जानवर को यूथेनाइज़ करने के लिए खुराक 400-500 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन पर केटामाइन और 50 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन पर ज़ाइलाज़िन है। 20 ग्राम वजन वाले एक विशिष्ट माउस के लिए, खुराक पीबीएस के 200 μL होगी जिसमें 10 मिलीग्राम केटामाइन (100 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन के स्टॉक समाधान का 100 μL) और 1 मिलीग्राम ज़ाइलज़िन (10 मिलीग्राम / एमएल ज़ाइलज़िन के स्टॉक समाधान का 100 μL) होगा। - पेडल रिफ्लेक्स की जांच करके उत्तेजना की प्रतिक्रिया की पूरी कमी की पुष्टि करें। दिल की धड़कन और श्वसन की अनुपस्थिति भी महत्वपूर्ण संकेतक हैं।
- आंख तक पूर्ण पहुंच की अनुमति देने के लिए माउस को पार्श्व रिकंबेंसी में रखें।
- प्रक्रिया के लिए कोलिब्री ट्यूरिंग फोर्स, घुमावदार फोर्सप्स, एक माइक्रो-ब्लेड (15 डिग्री, आकार में 3 मिमी), स्प्रिंग माइक्रो-कैंची और एंगल्ड स्प्रिंग माइक्रो-कैंची तैयार करें।
2. तीसरी पलक के साथ माउस आंख का न्यूक्लियेशन
- आंख तक पूर्ण पहुंच की अनुमति देने के लिए माउस को पार्श्व रिकंबेंसी में रखें। तीसरी पलक को बेहतर ढंग से देखने के लिए बाहरी पलकों को बल के साथ खोलें।
नोट: तीसरी पलक, जिसे निकोटिटिंग झिल्ली के रूप में भी जाना जाता है, नाक स्पर्शरेखा के ऊपरी कोने की ओर स्थित है (चित्रा 1 ए)। - तीसरी पलक को एक पिगमेंटेड सीमा के साथ एक मामूली पारभासी प्रोट्यूबरेंस के रूप में पहचानें (चित्रा 1 बी)।
- नेत्रगोलक के चारों ओर घुमावदार बल रखें, और आंख को बाहरी संलग्नकों से मुक्त करने के लिए चुटकी लें। यह आसपास के ऊतकों से आंख में रक्तस्राव को कम करेगा।
- घुमावदार बल को स्प्रिंग माइक्रो-कैंची से बदलें, और आंख की पुतली के चारों ओर तीसरी पलक से काटें। आसपास के ऊतक अनुलग्नकों से नेत्रगोलक को छोड़ने के लिए छोटे निरंतर कट का उपयोग करें।
- ऑप्टिक तंत्रिका को काटकर आंख को मुक्त करने के लिए नेत्रगोलक के नीचे घुमावदार स्प्रिंग माइक्रो-कैंची रखें। सुनिश्चित करें कि नेत्रगोलक पूरी तरह से आंख सॉकेट से मुक्त हो गया है।
3. बाहरी ऊतक को साफ करना
- पीएच 7.4 पर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) बफर के साथ पेट्री डिश में इच्छामृत्यु माउस से एन्यूक्लिएटेड आंख रखें, जिसमें पेट्री डिश इस तरह से भरी हुई है कि नेत्रगोलक पीबीएस में डूबा हुआ है।
- माउस की न्यूक्लियेटेड नेत्रगोलक को एक हाथ से संलग्न तीसरी पलक के साथ बल का उपयोग करके स्थिर करें।
- अधिक कुशल हैंडलिंग की अनुमति देने के लिए तरल माध्यम में नेत्रगोलक को निलंबित करें। कुछ एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियां या ऊतक नेत्रगोलक से दूर तैरना शुरू कर देंगे। स्प्रिंग माइक्रो-कैंची का उपयोग करके नेत्रगोलक को काटकर उन्हें हटा दें।
- माइक्रो-कैंची का उपयोग करके नेत्रगोलक के आधार से ऑप्टिक तंत्रिका को काटें और हटा दें ताकि पूरे माउंट की तैयारी के लिए रेटिना को बेहतर ढंग से अलग किया जा सके।
नोट: ऊतक सेक्शनिंग के लिए ऑप्टिक तंत्रिका को हटाना आवश्यक नहीं है। - पीबीएस के साथ नेत्रगोलक को धोएं, और इसे ऊतक निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम 2 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 1 एमएल युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: प्रक्रिया को इस चरण में पीएफए में ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे तक छोड़कर रोका जा सकता है। हालांकि, जीवित कोशिकाओं के अलगाव के लिए, निर्धारण चरणों का प्रदर्शन नहीं किया जाना चाहिए, और पूरी प्रक्रिया को विराम के बिना किया जाना चाहिए।
4. पूर्ववर्ती और पीछे के आंखों के कप प्राप्त करने के लिए एन्यूक्लिएटेड आंख का विच्छेदन
- पीएफए निर्धारण के बाद (यदि जीवित कोशिकाओं को इकट्ठा किया जाता है, तो नेत्रगोलक के निर्धारण के बिना आगे बढ़ें), नेत्रगोलक को पीबीएस युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और बाद की प्रक्रिया करने के लिए इसे विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रखें।
- कोलिब्री ट्यूरिंग फोर्स के साथ तीसरी पलक को मजबूती से पकड़कर नेत्रगोलक को स्थिर करें।
- माइक्रो-ब्लेड का उपयोग करके इसे छेदकर लिम्बस पर एक छोटा सा चीरा लगाएं। लिम्बस कॉर्नियल-स्क्लेरल जंक्शन है। चीरा अधिमानतः तीसरी पलक के विपरीत करें, जिससे स्प्रिंग माइक्रो-कैंची के लिए एक पहुंच बिंदु बन जाए।
नोट: आकार में 15 ° और 3 मिमी के माइक्रोब्लेड का उपयोग करने से इस चीरा की गहराई पर बेहतर नियंत्रण मिल सकता है। - इसके बाद, इस चीरे को शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग करते हुए, माइक्रो-कैंची की एक जोड़ी के साथ, कॉर्नियल-स्क्लरल लिम्बस की परिधि के साथ छोटे और निरंतर कटौती करते हैं। सबसे पहले, चीरा बिंदु से तीसरी पलक तक शुरू होने वाले कटों का एक अर्धवृत्त पूरा करें। फिर, दूसरी तरफ कट के शेष अर्धवृत्त को पूरा करें। अंत में, पीछे के कप और पूर्ववर्ती कप को अलग करने के लिए तीसरी पलक के चारों ओर एक कट बनाएं।
नोट: रुचि के आंख के कप के आधार पर, निकोटिटिंग झिल्ली को पूर्वकाल या पीछे के आईकप से जुड़ा छोड़ा जा सकता है। - तंत्रिका रेटिना और रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) परतों वाले पश्चवर्ती कप को प्राप्त करने के लिए बल का उपयोग करके पीछे के कप से लेंस को हटा दें। लेंस, पश्चवर्ती कप, और आंख के पूर्ववर्ती कप, इस प्रकार, अलग हो जाते हैं।
नोट: यदि अनिर्धारित ऊतकों के साथ काम कर रहे हैं, तो पूर्ववर्ती और पीछे के कप को अब कॉर्नियल या रेटिना सिंगल-सेल सस्पेंशन प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से पचाया जा सकता है। - ऊतकों को ठीक करने के लिए, इन कपों को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए 4% पीएफए का 1 एमएल होता है।
नोट: निर्धारण के बाद, ऊतक को एक उपयुक्त माध्यम में एम्बेडेड किया जा सकता है, और कॉर्नियल या रेटिना अनुभाग प्राप्त करने के लिए क्रायो-सेक्शनिंग या पैराफिन सेक्शनिंग की जा सकती है।
5. तंत्रिका रेटिना और आरपीई परतों का अलगाव
- ऊतक को जलमग्न करने के लिए पीबीएस बफर युक्त पेट्री डिश में पीछे के कप को फिर से पेश करें।
- तंत्रिका रेटिना की उपस्थिति की जांच करें। इसे पिगमेंटेड आरपीई परत पर एक अपारदर्शी परत के रूप में देखा जा सकता है, जो कप की परिधीय परिधि में जुड़ा हुआ है।
- पीछे के कप को स्थिर करने के लिए तीसरी पलक को बल के साथ पकड़ें, और बल की दूसरी जोड़ी का उपयोग करके परिधि से शुरू होने वाले तंत्रिका रेटिना को छील दें।
नोट: ऊतक को नुकसान न पहुंचाने के लिए हाथ के बहुत कोमल और मामूली आंदोलनों की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। ऑप्टिक तंत्रिका निकास पर, घुमावदार स्प्रिंग कैंची को तंत्रिका रेटिना के नीचे डाला जा सकता है, और परतों को पूरी तरह से मुक्त करने के लिए एक कट बनाया जा सकता है यदि तंत्रिका रेटिना संलग्न रहता है जैसा कि चित्र 3 में दर्शाया गया है। वैकल्पिक रूप से, एक नरम ब्रश का उपयोग करके कोमल स्ट्रोक के साथ रेटिना को मुक्त या अलग करें। हालांकि, हिस्टोलॉजी के लिए रेटिना एकत्र करते समय ऐसा करना उचित नहीं होगा।
नोट: तीसरी पलक के साथ तंत्रिका रेटिना और रंजित आरपीई परत, इस प्रकार, प्राप्त की जाती है।
6. संपूर्ण राशियों के लिए रेटिना और आरपीई परतों का विभाजन
- पीबीएस बफर युक्त पेट्री डिश में पूर्ववर्ती और पीछे के कप को फिर से पेश करें, और डिश को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
- तीसरी पलक को पकड़कर पूर्ववर्ती कप को स्थिर करें।
- तीसरी पलक के बगल में आंख के कप के व्यास का लगभग 3/4 हिस्सा काटने के लिए कोण वाली स्प्रिंग माइक्रो-कैंची का उपयोग करें, परिधि से ऑप्टिक केंद्र की ओर लंबवत रूप से काटें।
- तीसरी पलक पर पकड़ बनाए रखें, और पहले कट के बगल में एक कट बनाएं।
- दूसरे कट और तीसरी पलक के बीच एक समान कट बनाएं।
नोट: तीन या चार ऐसे समान दूरी के कट अर्धगोलाकार कप को फूल के आकार में खोलते हैं, जो सपाट गिरता है और आसानी से लगाया जा सकता है। - तीसरी पलक को पकड़कर पीछे के कप को स्थिर करें।
- पूर्ववर्ती कप पर कटौती (चरण 6.3-6.5) करने के लिए दिए गए चरणों का पालन करें ताकि पीछे के कप पर तीन या चार समान दूरी के कट बनाए जा सकें।
नोट: चरण 5 में पृथक तंत्रिका रेटिना के हिस्टोलॉजी के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए समान कटौती करें कि यह सतह पर सपाट गिरता है। कप के केंद्र में बहुत गहरे कट न करें, क्योंकि इससे पत्ती के खंड अलग हो सकते हैं या आसानी से अलग हो सकते हैं। - धुंधलापन करें, और प्रभावी विज़ुअलाइज़ेशन 7,8 के लिए ऊतकों को पूरा करें।
नोट: निकोटिटिंग झिल्ली की उपस्थिति पूरे टुकड़ों में आंखों के नाक पक्ष के निरंतर भौतिक संकेतक के रूप में कार्य करती है। यह आईकप के पृष्ठीय / उदर पक्ष को सीमांकित करने में मदद करता है, क्योंकि आईकप की तीसरी पलक नाक / उदर अभिविन्यास को इंगित करती है।
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Representative Results
रोगग्रस्त अवस्था में पूर्ववर्ती/कॉर्नियल ऊतक में संभावित लिम्फ-एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए आरडी1 माउस आई/कॉर्नियल ऊतक की एक पूरी मात्रा तैयार की गई थी। तीसरी पलक से संलग्न नेत्रश्लेष्मला ऊतक ने एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम किया, क्योंकि कॉर्निया में लसीका वाहिकाओं की कमी होती है। अध्ययन के लिए, कॉर्नियल ऊतक को नेत्रश्लेष्मला के साथ विच्छेदित किया गया था और 4% पीएफए के साथ तय किया गया था, इसके बाद परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग थी। ऊतक को तब लसीका एंडोथेलियल मार्कर (एलवाईवीई 1)9 के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। इसके बाद एलेक्सा फ्लोर 488 (हरे) के साथ लेबल किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन किया गया था। प्रतिनिधि छवियों (चित्रा 4) को 4x और 10x पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था।
रेटिना रूपात्मक, संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययनों के लिए रेटिना वास्कुलचर की कल्पना करने के लिए पीछे के आईकप से तंत्रिका रेटिना की एक पूरी मात्रा तैयारकी गई थी। तंत्रिका रेटिना को कोरॉयड-आरपीई परत से सावधानीपूर्वक छील दिया गया था, और इसे एक फ्लोरेट संरचना में सपाट रखने के लिए कटौती की गई थी। रेटिना संवहनी संरचना की कल्पना करने के लिए, पत्रक को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए आइसोलेक्टिन आईबी 4-एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ धुंधला किया गया था और 2x और 20x आवर्धन (चित्रा 5) पर कल्पना की गई थी।
चित्र 1: माउस की तीसरी पलक या छिद्रित झिल्ली। (A) तीसरी पलक नाक स्पर्शरेखा के ऊपरी कोने की ओर स्थित होती है और (B) में अक्सर एक रंजित सीमा होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: एक न्यूक्लियेटेड नेत्रगोलक से पूर्ववर्ती और पीछे की आंखों के अलगाव में कदम। (A) तीसरी पलक का उपयोग आंख को गतिहीन करने के लिए किया जाता है, और (B) कॉर्नियल लिम्बस के माध्यम से एक चीरा लगाया जाता है। (ग) चीरा बनाने और परिधि के साथ काटने के बाद एक प्रविष्टि की जाती है, जैसा कि (डी-एफ) में दिखाया गया है। (जी) पूर्वकाल और पीछे के आंखों के कप, इस प्रकार, अलग हो जाते हैं। तंत्रिका रेटिना की एक पारभासी परत पीछे के आंख के कप पर मौजूद होती है, जिसे छील दिया जाता है। (H) फिर कप में तीन समान दूरी के कट किए जाते हैं ताकि वे सपाट हो जाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: योजनाबद्ध आरेख दिखाता है कि परतों को मुक्त करने के लिए तंत्रिका रेटिना के नीचे घुमावदार स्प्रिंग कैंची कैसे डाली जा सकती है। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: पूर्ववर्ती कप की पूरी मात्रा। लसीका वाहिकाओं को प्रकट करने के लिए वर्णित कॉर्नियल ऊतक को सूक्ष्मविच्छेदित किया गया था। ऊतक को लसीका एंडोथेलियल मार्कर (एलवाईवीई 1) और एलेक्सा फ्लूर 488 (हरा) लेबल वाले द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। (ए) 4x पर छवियां और 10x आवर्धन पर (B) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: तंत्रिका रेटिना की संपूर्ण राशि। आइसोलेक्टिन आईबी 4 रेटिना वाहिका को दाग देता है, जिसे आसानी से हरे रंग में देखा जा सकता है। (ए) पीछे के आईकप से प्राप्त रेटिना फ्लैट माउंट को एलेक्सा फ्लूर 488 (2 एक्स) के साथ टैग किए गए आइसोलेक्टिन आईबी 4 से दाग दिया गया था। (बी) रेटिना वास्कुलचर का 20 एक्स आवर्धन रेटिना में मध्यवर्ती संवहनी जाल को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कृंतक आंख के छोटे आकार और गोलाकार आकार के कारण ओकुलर माइक्रोडिसेक्शन एक मुश्किल काम पाया गया है, और कृंतक आंख को कुशल हैंडलिंग 8 के लिए नवीनतकनीकों की आवश्यकता होती है।
वर्तमान प्रदर्शित विधि में, प्रभावी और आसान हैंडलिंग के लिए तीसरी पलक के साथ एन्यूक्लिएटेड माउस आईबॉलिक प्राप्त किया जाता है। तीसरी पलक का उपयोग करके, नेत्रगोलक को पूरी तरह से स्थिर किया जा सकता है, जो विच्छेदन को आसानी से और न्यूनतम त्रुटियों के साथ आगे बढ़ने की अनुमति देता है। इसके अलावा, तीसरी पलक की उपस्थिति आंख के उप-भागों के अभिविन्यास को चित्रित करती है। इस प्रकार, नेत्रगोलक को पूर्वकाल और पीछे की आंखों को प्राप्त करने के लिए तीसरी पलक के साथ विच्छेदित किया जाता है। कैंची के प्रवेश के लिए एक स्लिट का उपयोग सम और साफ कट की अनुमति देने के लिए आंख की गोलाकार प्रकृति के साथ काम करना आसान बनाता है। इसके अलावा, तंत्रिका रेटिना की पारभासी परत को धीरे से छीलकर ऊतक-विशिष्ट अध्ययन के लिए तंत्रिका रेटिना और आरपीई परतों को प्राप्त करने के लिए पीछे के आईकप को आगे विच्छेदित किया जा सकता है।
इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में, ऑप्टिक तंत्रिका तक पहुंचने के लिए ऑप्टिक केंद्र तक लंबवत रूप से परिधि से तीन/चार समान दूरी के कट किए जाते हैं ताकि अर्धगोलाकार कप को एक फ्लोरेट आकार में खोला जा सके, जो सपाट गिरता है और आसानी से लगाया जा सकता है।
इसलिए, यह विधि ओकुलर ऊतक-विशिष्ट सेक्शनिंग, एकल-कोशिका विश्लेषण और होलमाउंट के लिए फायदेमंद है। हालांकि, दोहराए जाने वाले ऊतक निर्धारण की आवश्यकता ऊतक को सेल संस्कृति या प्रयोगों के लिए अव्यवहार्य बनाती है जिनके लिए जीवित कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इस तकनीक का उपयोग हमारी प्रयोगशालामें प्रभावी रूप से कॉर्नियल होलमाउंट, रेटिना सेक्शन और प्रत्यारोपण के बाद सेलुलर हस्तक्षेप के एकल-सेल अध्ययन के लिए किया गया है। तीसरी पलक की उपस्थिति अभिविन्यास की पहचान करने में मदद करती है, जो लक्षित दृष्टिकोण का समर्थन करती है और रेटिना विज़ुअलाइज़ेशन के दौरान एक गाइड के रूप में कार्य करती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
अलकनंदा मिश्रा, सेल बायोलॉजी एंड ह्यूमन एनाटॉमी विभाग, कैलिफोर्निया डेविस विश्वविद्यालय, यूएसए ने हमें नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ इम्यूनोलॉजी, नई दिल्ली में इस पद्धति में प्रशिक्षित किया। इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार से राष्ट्रीय प्रतिरक्षा विज्ञान संस्थान, नई दिल्ली को प्राप्त कोर अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। पीएस को जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा एक शोध फैलोशिप प्रदान की गई थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T.
- Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).
