Summary
Este trabalho apresenta um protocolo para microdissecção ocular em roedores. O processo envolve a enucleação do globo ocular junto com a membrana nictitante (ou seja, a terceira pálpebra). Isto é seguido pela separação dos copos oculares posterior e anterior.
Abstract
A microdissecção ocular do olho de roedor envolve a segmentação do globo ocular enucleado com a membrana nictitante anexada, ou terceira pálpebra, para obter os óculos anterior e posterior. Com esta técnica, as subpartes do olho, incluindo o tecido da córnea, tecido neural, tecido epitelial pigmentar da retina (PSE) e lente, podem ser obtidas para montagens inteiras, crio-seccionamento e / ou suspensões unicelulares de um tecido ocular específico. A presença da terceira pálpebra apresenta vantagens únicas e significativas, pois beneficia a manutenção da orientação do olho, o que é importante para a compreensão da fisiologia ocular após qualquer intervenção localizada ou em estudos envolvendo análise ocular relacionada à topografia espacial do olho.
Neste método, enucleamos o globo ocular na órbita juntamente com a terceira pálpebra, cortando cuidadosa e lentamente os músculos extraoculares e cortando o nervo óptico. O globo ocular foi perfurado através do limbo corneano usando uma microlâmina. A incisão foi utilizada como ponto de entrada, permitindo o corte ao longo da junção córnea-escleral por meio da inserção de microtesouras através do ponto de incisão. Pequenos e contínuos cortes ao longo da circunferência foram feitos até que os copos se separassem. Estes poderiam ser ainda mais dissecados descascando suavemente a camada translúcida da retina neural usando pinça de sutura de Colibri para obter as camadas de retina neural e RPE. Além disso, três/quatro cortes equidistantes foram feitos da periferia perpendicularmente ao centro óptico até que o nervo óptico fosse atingido. Isso abriu os copos hemisféricos em forma de flor para que eles caíssem e pudessem ser facilmente montados. Esta técnica tem sido usada em nosso laboratório para montagens inteiras da córnea e seções da retina. A presença da terceira pálpebra delineia a orientação nasal-temporal, o que permite o estudo de diversas intervenções de terapia celular pós-transplante e, assim, a validação fisiológica direcionada vital para visualização e representação precisa em tais estudos.
Introduction
A dissecção ocular é uma técnica importante na pesquisa oftálmica e tem permitido que os investigadores acessem os segmentos do olho para estudos direcionados. Anteriormente, os pesquisadores oculares confiavam no tecido ocular de indivíduos doentes para seus estudos. No entanto, o número progressivamente crescente de cepas de roedores oftálmicos modelos1 ao longo dos anos diminuiu a necessidade de tecido ocular humano. Essas cepas de camundongos permitiram uma compreensão mais profunda das doenças oculares e intervenções. No entanto, eles também geraram a necessidade de técnicas inovadoras de microdissecção ocular. O pequeno tamanho e a área limitada de operação restringem severamente o acesso efetivo às subpartes oculares. Além disso, devido à montagem celular homogênea dos copos oculares posterior e anterior, é difícil realizar intervenções direcionadas pós-dissecção. As técnicas atuais de microdissecção do laser2 e da microdissecção cirúrgica 3,4 são inadequadas para atender a tais exigências da pesquisa ocular. A microdissecção a laser é muito eficaz na análise de célula única, mas o tecido específico precisa ser microdissecado antes do procedimento a laser2. A técnica pode isolar pequenas regiões de interesse de um tecido pré-dissecado para análise molecular. Assim, a técnica não é adequada para a preparação de montagens inteiras ou para o isolamento de camadas oculares axialmente compactadas para uma visualização ideal.
O método cirúrgico é a técnica mais utilizada; este método envolve imobilizar o olho através do nervo óptico5 e, em seguida, realizar a dissecção. Esta prática é árdua e pode danificar qualquer tecido frágil, pois o olho esférico continua a se mover durante a dissecção. Apesar de ser benéfica para isolar as várias seções das camadas da retina, a técnica não pode demarcar a orientação espacial do tecido após a dissecção.
Durante a dissecção, a manutenção da presença da membrana nictitante aderida ou da terceira pálpebra (Figura 1) apresenta vantagens únicas e significativas. Neste método, primeiro, o globo ocular é enucleado com a terceira pálpebra. Em seguida, a terceira pálpebra é utilizada para imobilizar o olho6 (Figura 2A). Segue-se a perfuração do globo ocular através do limbo corneano e a incisão como ponto de entrada (Figura 2B,C). Em seguida, os óculos são separados por corte ao longo da circunferência anterior e posteriormente (Figura 2D-G). Ao dissecar ainda mais o óculo posterior, a camada translúcida da retina neural pode ser identificada e suavemente descascada. Em seguida, são feitos três ou quatro cortes equidistantes nos copos hemisféricos anterior e posterior obtidos, que permitem que esses copos em forma de flor caiam sobre uma lâmina (Figura 2H).
A terceira pálpebra auxilia no manuseio fácil e eficiente durante a dissecção, garantindo assim danos mínimos ao tecido ao acessar as várias camadas oculares e ao produzir montagens inteiras. Além disso, a presença da terceira pálpebra ajuda a localizar e examinar intervenções localizadas durante a visualização.
O procedimento, em nosso laboratório, foi realizado em uma cepa de camundongo CBA/J ou rd1 em P28 de qualquer sexo. O procedimento pode ser realizado em qualquer cepa, idade ou sexo do animal e não tem viés de acordo com essas características.
Os animais foram adquiridos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e mantidos no Small Animal Facility (SAF) do Instituto Nacional de Imunologia (NII). Eles foram mantidos em gaiolas ventiladas individuais (VCI) e receberam acesso ad libitum a água e alimentos autoclavados acidificados. Foram mantidos a 21-23 °C e com ciclo claro/escuro de 14 h/10 h.
Dado abaixo é um método cirúrgico modificado para a micro-dissecção de um olho de rato.
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Protocol
Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal Institucional do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Delhi. O número de referência de série da homologação é IAEC#480/18. Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes de regulamentação do Comitê de Controle e Supervisão de Experimentos em Animais, Ministério das Pescas, Pecuária e Laticínios, Governo da Índia, sob a supervisão de um Veterinário profissional no SAF, NII.
1. Preparação
- Dilate os olhos dos roedores usando uma gota de soluções oftálmicas de tropicamida a 0,8% e fenilefrina a 5% em cada olho. Coloque o animal em uma área escura por 30 minutos antes do procedimento.
NOTA: Um analgésico não é necessário, pois o animal é sacrificado imediatamente após completar os 30 min. A adaptação escura e a dilatação dos olhos do animal permitem que o observador verifique se há lágrimas oculares e danos antes do procedimento. Além disso, a dilatação é vantajosa ao trabalhar com o tecido pigmentado do globo ocular. - Eutanasiar o animal administrando por via intraperitoneal uma dose de 5x de anestesia. Uma dose típica é de 200 μL de PBS contendo 10 mg de cetamina e 1 mg de xilazina.
NOTA: A dose para a eutanásia do animal é cetamina a 400-500 mg/kg de peso corporal e xilazina a 50 mg/kg de peso corporal administrada por via intraperitoneal. Para um rato típico com peso de 20 g, a dose seria de 200 μL de PBS contendo 10 mg de cetamina (100 μL de uma solução-mãe de 100 mg/ml de cetamina) e 1 mg de xilazina (100 μL de uma solução-mãe de 10 mg/ml de xilazina). - Confirme a completa falta de resposta a um estímulo examinando o reflexo do pedal. A ausência de batimentos cardíacos e respiração também são indicadores importantes.
- Coloque o rato em decúbito lateral para permitir o acesso completo ao olho.
- Prepare pinças de sutura Colibri, pinças curvas, uma microlâmina (15°, 3 mm de tamanho), microtesouras de mola e microtesouras de mola angulares prontas para o procedimento.
2. Enucleação do olho do rato juntamente com a terceira pálpebra
- Coloque o rato em decúbito lateral para permitir o acesso completo ao olho. Abra as pálpebras externas com a pinça para visualizar de forma ideal a terceira pálpebra.
NOTA: A terceira pálpebra, também conhecida como membrana nictiforme, está localizada em direção ao canto superior da tangente nasal (Figura 1A). - Identificar a terceira pálpebra como uma protuberância translúcida menor com limite pigmentado (Figura 1B).
- Coloque pinças curvas ao redor do globo ocular e aperte para libertar o olho de anexos estranhos. Isso minimizará o sangramento no olho do tecido circundante.
- Substitua a pinça curva por microtesouras de mola e corte ao redor do globo ocular com a terceira pálpebra presa a ela. Use pequenos cortes contínuos para liberar o globo ocular dos anexos de tecido circundantes.
- Coloque microtesouras de mola curvas sob o globo ocular para liberar o olho cortando o nervo óptico. Certifique-se de que o globo ocular esteja completamente liberado da cavidade ocular.
3. Limpeza do tecido estranho
- Coloque o olho enucleado do rato eutanasiado numa placa de Petri com tampão salino tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,4, com a placa de Petri preenchida de tal forma que o globo ocular fique submerso em PBS.
- Imobilize o globo ocular enucleado do rato com a terceira pálpebra anexada com uma mão usando fórceps.
- Suspenda o globo ocular em meio líquido para permitir um manuseio mais eficiente. Alguns músculos ou tecidos extraoculares começarão a flutuar para longe do globo ocular. Removê-los, cortando-os do globo ocular usando micro-tesouras de mola.
- Corte e remova o nervo óptico da base do globo ocular usando microtesouras para permitir a melhor separação da retina para preparações de montagem completa.
NOTA: Não é necessário remover o nervo óptico para a secção do tecido. - Lave o globo ocular com PBS e transfira-o para um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% por um período mínimo de 2 h a 4 °C para fixação tecidual.
NOTA: O procedimento pode ser pausado nesta etapa, deixando o tecido em PFA por até 12 h a 4 °C. No entanto, para o isolamento de células vivas, as etapas de fixação não devem ser realizadas e todo o procedimento precisa ser realizado sem pausas.
4. Dissecção do olho enucleado para obtenção dos óculos anterior e posterior
- Após a fixação do PFA (se coletar células vivas, prossiga sem a fixação do globo ocular), transfira o globo ocular para uma placa de Petri contendo PBS e coloque-o sob um microscópio de dissecação para realizar o procedimento subsequente.
- Imobilize o globo ocular segurando a terceira pálpebra firmemente com pinça de sutura de Colibri.
- Faça uma pequena incisão no limbo, perfurando-o usando uma micro-lâmina. O limbo é a junção córnea-escleral. Faça a incisão de preferência oposta à terceira pálpebra, fazendo assim um ponto de acesso para a microtesoura da mola.
NOTA: O uso de uma microlâmina de 15° e 3 mm de tamanho pode proporcionar um melhor controle sobre a profundidade desta incisão. - Em seguida, usando esta incisão como ponto de partida, com um par de micro-tesouras, faça pequenos e contínuos cortes ao longo da circunferência do limbo córnea-escleral. Primeiro, complete um semicírculo de cortes a partir do ponto de incisão até a terceira pálpebra. Em seguida, complete o semicírculo restante de cortes do outro lado. Finalmente, faça um corte ao redor da terceira pálpebra para separar o copo posterior e o copo anterior.
NOTA: Dependendo do óculo de interesse, a membrana nictitante pode ser deixada ligada ao óculo anterior ou posterior. - Remova a lente do copo posterior usando fórceps para obter o copo posterior que compreende as camadas de retina neural e epitélio pigmentar da retina (PSE). O cristalino, o copo posterior e o copo anterior do olho são, portanto, separados.
NOTA: Se trabalhar com tecidos não fixos, os copos anterior e posterior podem agora ser digeridos enzimaticamente para obter uma suspensão unicelular da córnea ou da retina. - Para fixar os tecidos, transfira esses copos para um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PFA a 4% por 12 h a 4 °C.
NOTA: Após a fixação, o tecido pode ser incorporado em um meio apropriado, e a criosecção ou a secção de parafina podem ser feitas para obter seções da córnea ou da retina.
5. Isolamento das camadas neurais da retina e do EPR
- Reintroduza o copo posterior na placa de Petri contendo tampão PBS para submergir o tecido.
- Verifique a presença da retina neural. Isso pode ser visualizado como uma camada opaca na camada de PSE pigmentada, que é anexada na circunferência periférica do copo.
- Segure a terceira pálpebra com fórceps para imobilizar o copo posterior e retire a retina neural a partir da periferia usando um segundo par de fórceps.
NOTA: Movimentos muito suaves e leves da mão são altamente recomendados para não danificar o tecido. Na saída do nervo óptico, a tesoura de mola curva pode ser inserida sob a retina neural, e um corte pode ser feito para liberar completamente as camadas se a retina neural permanecer presa, conforme ilustrado na Figura 3. Opcionalmente, libere ou descole a retina com traços suaves usando uma escova macia. No entanto, não seria apropriado fazê-lo se coletasse a retina para histologia.
NOTA: A retina neural e a camada de EPR pigmentada com a terceira pálpebra são, assim, obtidas.
6. Segmentação das camadas retiniana e PSE para montagens inteiras
- Reintroduza os copos anterior e posterior na placa de Petri contendo tampão PBS e coloque o prato sob o microscópio de dissecação.
- Imobilize o copo anterior segurando a terceira pálpebra.
- Use microtesouras de mola angulada para fazer um corte de cerca de 3/4 do diâmetro do copo ao lado da terceira pálpebra, cortando da periferia perpendicularmente em direção ao centro óptico.
- Mantenha um aperto na terceira pálpebra e faça um corte ao lado do primeiro corte.
- Faça um corte semelhante entre o segundo corte e a terceira pálpebra.
NOTA: Três ou quatro desses cortes equidistantes abrem os copos hemisféricos em forma de flor, que cai plana e pode ser facilmente montada. - Imobilize o copo posterior segurando a terceira pálpebra.
- Siga os mesmos passos dados para fazer os cortes (passos 6,3-6,5) no copo anterior para fazer três ou quatro cortes equidistantes no copo posterior.
NOTA: Para a histologia da retina neural isolada na etapa 5, faça cortes semelhantes para garantir que ela caia plana em uma superfície. Não faça cortes muito profundos no centro do copo, pois isso pode fazer com que as seções das folhas se desintegrem ou se separem facilmente. - Realizar a coloração e montar os tecidos na íntegra para uma visualização eficaz 7,8.
NOTA: A presença da membrana nictitante atua como um indicador físico constante do lado nasal do óculo em todo o corpo. Ajuda a demarcar o lado dorsal/ventral do copo do olho, pois a terceira pálpebra do copo indica a orientação nasal/ventral.
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Representative Results
Uma montagem inteira de tecido olho/córnea de camundongo rd1 foi preparada para estudar a potencial linfangiogênese no tecido anterior/corneano em um estado doente. O tecido conjuntival aderido da terceira pálpebra atuou como um controle positivo, uma vez que a córnea carece de vasos linfáticos. Para o estudo, o tecido corneano foi dissecado com a conjuntiva e fixado com PFA a 4%, seguido de permeabilização e bloqueio. O tecido foi então corado com um anticorpo primário contra o marcador endotelial linfático (LYVE1)9. Isto foi seguido por incubação com um anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 (verde). As imagens representativas (Figura 4) foram capturadas em microscópio de fluorescência a 4x e 10x.
Uma montagem completa da retina neural a partir do oftalmologista posterior foi preparada para visualizar a vasculatura retiniana para estudos morfológicos, estruturais e funcionais da retina7. A retina neural foi cuidadosamente descascada da camada de EPR coroide, e cortes foram feitos para colocá-la plana em uma estrutura de florete. Para a visualização da estrutura vascular da retina, o folheto foi submetido à coloração com Isolectina IB4-Alexa Fluor 488 por 1 h à temperatura ambiente e visualizado em 2x e 20x de ampliação (Figura 5).
Figura 1: A terceira pálpebra ou membrana nictitante do rato. (A) A terceira pálpebra está localizada em direção ao canto superior da tangente nasal e (B) geralmente tem um limite pigmentado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Passos no isolamento dos copos anteriores e posteriores de um globo ocular enucleado. (A) A terceira pálpebra é usada para imobilizar o olho, e (B) uma incisão é feita através do limbo corneano. (C) Uma entrada é feita depois de formar a incisão e cortar ao longo da circunferência, como mostrado em (D-F). (G) Os óculos anterior e posterior são, assim, separados. Uma camada translúcida da retina neural está presente no copo posterior do olho, que é descascado. (H) Três cortes equidistantes são então feitos nos copos para fazê-los cair no chão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diagrama esquemático mostrando como a tesoura de mola curva pode ser inserida sob a retina neural para liberar as camadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Montagem integral do copo anterior. O tecido corneano foi microdissecado conforme descrito para revelar os vasos linfáticos. O tecido foi corado com o marcador endotelial linfático (LYVE1) e um anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 (verde). (A) Imagens a 4x e (B) a 10x de ampliação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Toda a montagem da retina neural. A isopectina IB4 mancha a vasculatura da retina, que pode ser facilmente visualizada em verde. (A) A montagem plana da retina obtida do oftalmologista posterior foi corada com Isolectina IB4 marcada com Alexa Fluor 488 (2x). (B) Ampliação de 20x da vasculatura retiniana mostrando o plexo vascular intermediário na retina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A microdissecção ocular tem sido considerada uma tarefa difícil devido ao pequeno tamanho e forma esférica do olho do roedor, e o olho do roedor requer técnicas inovadoras para o manuseio eficiente8.
No método demonstrado atualmente, o globo ocular de rato enucleado é obtido com a terceira pálpebra presa para um manuseio eficaz e fácil. Usando a terceira pálpebra, o globo ocular pode ser imobilizado completamente, o que permite que a dissecção prossiga com facilidade e com erros mínimos. Além disso, a presença da terceira pálpebra delineia a orientação das subpartes do olho. O globo ocular é, assim, dissecado com a terceira pálpebra para obter os óculos anterior e posterior. O uso de uma fenda para a entrada da tesoura para permitir cortes uniformes e limpos facilita o trabalho com a natureza esférica do olho. Além disso, o óculo posterior pode ser dissecado para obter as camadas de retina neural e PSE para estudos específicos de tecidos, descascando suavemente a camada translúcida da retina neural.
Além disso, neste protocolo, três / quatro cortes equidistantes são feitos da periferia perpendicularmente ao centro óptico para alcançar o nervo óptico, a fim de abrir os copos hemisféricos em forma de florete, que cai plano e pode ser facilmente montado.
Assim, este método é vantajoso para o corte específico do tecido ocular, análise de célula única e montagens inteiras. No entanto, a necessidade de fixação tecidual repetitiva torna o tecido inviável para cultura de células ou experimentos que requerem células vivas. Essa técnica tem sido efetivamente utilizada em nosso laboratório para todo o solo corneano, cortes de retina e estudos unicelulares de intervenções celulares pós-transplante10. A presença da terceira pálpebra ajuda a identificar a orientação, que suporta abordagens direcionadas e atua como um guia durante a visualização da retina.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A Dra. Alaknanda Mishra, Departamento de Biologia Celular e Anatomia Humana, Universidade da Califórnia em Davis, EUA, nos treinou neste método no Instituto Nacional de Imunologia, Nova Delhi. Este trabalho foi apoiado pela subvenção principal recebida do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. P.S. recebeu uma bolsa de pesquisa do Departamento de Biotecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
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