Summary
Et lysarkmikroskop ble utviklet for å avbilde og digitalisere hele sneglehuset.
Abstract
Døvhet er den vanligste sensoriske svekkelsen, som påvirker omtrent 5% eller 430 millioner mennesker over hele verden i henhold til Verdens helseorganisasjon1. Aldring eller presbycusis er en primær årsak til sensorineural hørselstap og er preget av skade på hårceller, spiral ganglion nevroner (SGN), og stria vaskularis. Disse strukturene ligger i cochlea, som har en kompleks, spiralformet anatomi av membranøse vev suspendert i væske og omgitt av bein. Disse egenskapene gjør det teknisk vanskelig å undersøke og kvantifisere histopatologiske endringer. For å imøtekomme dette behovet utviklet vi et lysarkmikroskop (TSLIM) som kan avbilde og digitalisere hele sneglehuset for å lette studiet av struktur-funksjonsforhold i det indre øret. Godt justerte serielle seksjoner av hele cochlea resulterer i en stabel med bilder for tredimensjonal (3D) volumgjengivelse og segmentering av individuelle strukturer for 3D-visualisering og kvantitativ analyse (dvs. lengde, bredde, overflate, volum og antall). Cochleae krever minimale behandlingstrinn (fiksering, avkalkning, dehydrering, farging og optisk clearing), som alle er kompatible med påfølgende høyoppløselig avbildning ved skanning og transmisjonselektronmikroskopi. Siden alle vevene er til stede i stablene, kan hver struktur vurderes individuelt eller i forhold til andre strukturer. I tillegg, siden bildebehandling bruker fluorescerende prober, kan immunhistokjemi og ligandbinding brukes til å identifisere spesifikke strukturer og deres 3D-volum eller distribusjon i cochlea. Her brukte vi TSLIM til å undersøke cochleae fra eldre mus for å kvantifisere tap av hårceller og spiral ganglionneuroner. I tillegg ble avanserte analyser (f.eks. klyngeanalyse) brukt til å visualisere lokale reduksjoner av spiralganglionnevroner i Rosenthals kanal langs 3D-volumet. Disse tilnærmingene demonstrerer TSLIM-mikroskopiens evne til å kvantifisere struktur-funksjonsforhold i og mellom cochleae.
Introduction
Sneglehuset er det perifere sanseorganet for hørsel hos pattedyr. Den har en kompleks spiralanatomi av repeterende sensoriske og støttende celler som er anatomisk spesialisert for å oppdage lydvibrasjoner og overføre dem til hjernen for oppfatning av hørsel. De viktigste sensoriske elementene er de indre og ytre hårcellene og deres innerverende nervefibre hvis cellelegemer utgjør spiralganglionen, som ligger innenfor Rosenthals kanal (figur 1). Disse sensoriske og nevrale strukturene er tonotopisk arrangert slik at høyfrekvente lyder transduseres i cochleabasen og lavfrekvente lyder transduseres i cochlea apex2. Et anatomisk kart over denne sensoriske cellefordelingen langs spirallengden til den støttende basilære membranen kalles et cytokochleogram3 og kan sammenlignes med hørselstap som en funksjon av frekvensen som vist i et audiogram.
Den membranøse labyrinten i sneglehuset, som er omgitt av tett bein, gjør det teknisk vanskelig å undersøke mer enn én cochleastruktur om gangen. Derfor er begrunnelsen for å utvikle et lysarkmikroskop å produsere godt justerte serielle seksjoner av hele sneglehuset, slik at alle cochleastrukturer kan undersøkes i forhold til hverandre i 3D-rekonstruksjoner. Voie et al.4 og Voie og Spelman5 designet det første lysarkmikroskopet, kalt ortogonalt plan fluorescens optisk seksjoneringsmikroskop (OPFOS), for å optisk seksjonere hele cochlea. Dette mikroskopet ble imidlertid aldri kommersielt utviklet; så vårt mål var å konstruere et lysarkmikroskop kalt et tynt arklaserbildemikroskop (TSLIM; Figur 2). Design- og konstruksjonsdetaljene for TSLIM er tidligere publisert8. TSLIM gjorde flere forbedringer i forhold til OPFOS, inkludert bruk av et digitalkamera med lite lys kontra et CCD-kamera for bildeinnsamling, optisk kodede mikroposisjoner for nøyaktig og reproduserbar bevegelse av prøven gjennom lysarket, bruk av et kommersielt tilgjengelig, optisk klart prøvekammer og rhodaminfarging i etanol i stedet for i ryddeløsningen for å forhindre flekkutfelling i vevet. Kommersiell utvikling av lysarkmikroskoper som SPIM6 har fokusert på høyoppløselig avbildning av levende, små gjennomsiktige prøver, men er uegnet for hel cochlea-avbildning da de mangler tilstrekkelig arbeidsavstand. En gjennomgang av utviklingen av andre lysarkmikroskoper ble publisert av Santi7. TSLIMs primære fordel i forhold til andre histologiske metoder for å undersøke cochlea er å optisk seksjonere vev for 3D-rekonstruksjon samtidig som prøvens integritet bevares slik at den kan brukes av andre histologiske metoder. En annen fordel med TSLIM-avbildning er at bare et tynt lysark produsert av en laser blir utsatt for vevet, sammenlignet med eksponering for hele vevets tykkelse for laseren som i konfokalmikroskopi. Vevsrydding for å minimere lysspredning og det faktum at bare en liten del av vevet blir utsatt for laseren, resulterer i minimal fluorokromfading (fotobleking) med lysarklaseravbildning. Imidlertid endrer prosessen med fiksering, dehydrering og rydding morfologien til cochleære strukturer og resulterer i vevskrymping sammenlignet med levende vev. Den faktiske mengden vevskrymping som oppstår ble ikke bestemt.
TSLIM ble utviklet av Shane Johnson og åtte tyske optikerstudenter (se Acknowledgements). TSLIM konstruksjonsdetaljer ble levert av Santi et al.8 og en skanningsversjon (sTSLIM) av Schröter et al.9. TSLIM fungerer som en ikke-destruktiv mikrotome til optisk seksjonsprøver og som et mikroskop for å samle 2D-serielle seksjoner gjennom hele bredden og tykkelsen av cochlea. TSLIM kan avbilde både små (mm) og store (cm), tykke prøver. Brilleglassene er luftmontert for å tillate lange arbeidsavstander med innsamlingsmål på 1x og 2x på et disseksjonsmikroskop. Disseksjonsmikroskopet har også zoomoptikk som gjør at TSLIM kan løse subcellulære og synaptiske strukturer på celler. TSLIM er utstyrt med både en blå (473 nm) og grønn (532 nm) laser for belysning som gjør det mulig å bruke en rekke fluorescerende sonder til avbildning. Målet med TSLIM er å produsere godt justerte optiske 2D-seksjoner gjennom et helt sneglehus for en komplett digital rekonstruksjon av cochleavev. Siden det er en fluorescerende metode, kan ligander og immunhistokjemi også brukes til å identifisere spesifikke cochleære strukturer.
I utgangspunktet ble en sylindrisk linse brukt til å produsere to motsatte gaussiske lysark, men det produserte absorpsjonsbildeartefakter. På grunn av arbeidet til Keller et al.10 ble den faste sylindriske linsen erstattet av et skanningsgalvanometerspeil for å produsere lysarket9. I tillegg, siden midten av lysarket er det tynneste ved strålemidjen, produseres sTSLIM 2D-bilder ved å samle en sammensetning av X-aksekolonner med data over prøvens bredde (figur 3). Denne metoden ble først beskrevet av Buytaert og Dircks11. TSLIM tilpasset programvare for å kjøre og samle bilder ble utviklet ved hjelp av et grafisk program for instrumentkontroll. Lysarket beveger seg gjennom prøven og belyser et fluorescerende plan i vevet. Dette fluorescerende planet projiseres ortogonalt gjennom det gjennomsiktige prøven og samles av et disseksjonsmikroskop. Optisk kodede micropositioners tillater skanning gjennom strålemidjen i X-aksen for å samle et enkelt sammensatt 2D-bilde, og deretter flytter Z-aksen micropositioner prøven til et dypere plan i vevet for å oppnå en stabel med serielle, seksjonerte 2D-bilder (Video 1, figur 4). En stabel med translasjonsbilder samles gjennom hele bredden, tykkelsen og lengden på sneglehuset, og det er ikke nødvendig å sy sammen bilder (Video 2). Bildestakken overføres til en annen datamaskin og lastes inn i et 3D-gjengivelsesprogram for 3D-rekonstruksjon og kvantifisering. Bildestablene inneholder all digital informasjon om morfologien til et sneglehus ved mikroskopets oppløsning. Imidlertid, hvis en høyere oppløsning er nødvendig, kan den intakte cochlea behandles videre ved destruktive histologiske metoder som mikrotomsnitting, skanning og transmisjonselektronmikroskopi.
3D-gjengivelsesprogrammet brukes til å segmentere forskjellige cochleastrukturer for 3D-gjengivelse og kvantitativ analyse. For segmentering spores hver struktur i hvert 2D-bilde av stakken ved hjelp av en annen farge av et grafikkbrett og en penn (figur 5). Til nå er 20 forskjellige cochleastrukturer segmentert (figur 6). Etter segmentering kan en rekke 3D-analyser utføres. For eksempel kan 3D-gjengivelsesprogramvare praktisk talt reseksjonere cochlea i et hvilket som helst plan langs strukturens sentroid. Video 3 viser snitt tangentiell til organet til Corti, som avslører hårcellene langs lengden av basilarmembranen. Denne prosessen krever først manuell segmentering av strukturen av interesse. Deretter beregnes strukturens sentroid basert på minste kvadraters passform av splinepunkter plassert langs midten av strukturen fra basen til toppunktet, og tillater dermed en tilnærming av strukturens lengde (Video 4). En lignende prosess kalt skjelettisering kan brukes til å visualisere strukturens radiale bredde langs lengden ved hjelp av et fargekart (Video 4). Det totale volumet av hver struktur beregnes av programmet etter segmentering, men relative avstander kan også kvantifiseres og visualiseres med fargekart i en 3D-gjengivelsesprogramvare (figur 7). Segmenterte strukturer kan også eksporteres for å produsere forstørrede, helplastiske modellgjengivelser (figur 8). I tillegg kan halvautomatisk celletelling også utføres ved hjelp av 3D-gjengivelsesprogramvare (figur 9). Immunhistokjemi og ligandbinding kan brukes til å farge spesifikke cochleære strukturer, og disse strukturene kan isoleres fra andre cochleære strukturer for morfometrisk vurdering, for eksempel å produsere et cytokokleogram (figur 10). Lengde, bredde, overflate, volum og antall av alle cochleastrukturer kan bestemmes fra 3D-modellene, noe som gjør denne tilnærmingen ideell for å kartlegge cochleaskader på funksjonsnedsettelser. Spesielt kan cochleaskader på grunn av aldring, støyinduserte traumer eller andre fornærmelser vises og kvantifiseres i 3D-cochlea-rekonstruksjoner fra optiske 2D-seksjoner. Når en cochlea har blitt digitalisert, er det mange bildealgoritmer som kan brukes til å vurdere cochleaskader av vev i cochlea i det anatomiske registeret til andre cochleære vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer og bruk av levende dyr har blitt gjennomgått og godkjent (protokoll-ID # 2010-38573A) av University of Minnesota Institutional Care and Use Committee (IACUC) og etterforskere som bruker disse dyrene har blitt grundig trent og testet av Research Animal Resources (RAR) veterinærer før de har tilgang til dyreavdelingene. Både hann- og hunnmus ble brukt i denne studien.
1. Cochlea fjerning for fiksering og vevsbehandling for avbildning
- Avlive en mus ved hjelp av CO2 -innånding. Decapitate musen med saks og lage en dorsal-ventral snitt gjennom hjernen for å hemisect skallen. Fjern hjernen, identifiser den runde bulla i den baso-ventrale delen av skallen, åpne bulla med rongeurs, og visualiser og fjern cochlea.
- Fiksering: Utfør denne prosedyren under en avtrekkshette og bruk et disseksjonsmikroskop ved 5x forstørrelse. Bruk hansker og verneutstyr. Punkter det ovale vinduet og fjern stiftene med et skarpt hakke. Sett inn en hakke i det runde vinduet for å punktere membranen.
- Dekk det åpnede, runde vinduet med kuttspissen på et infusjonssett festet til en 1 ml sprøyte fylt med 2 ml formalin. Tilfør formalin langsomt gjennom perilymfatiske rom i sneglehuset over en periode på 2 minutter, og merk at formalin forlater sneglehuset via det åpne, ovale vinduet. Trim overflødig vev av cochlea og senk i en flaske som inneholder 10% formalin, og sett på en rotator over natten.
- Avkalkning: Skyll cochlea i PBS 3x i 5 minutter hver og senk den i en flaske som inneholder 10 % oppløsning av dinatriumetylendiamintetraeddiksyre (EDTA) med rotasjon i 4 dager, og skift oppløsningen daglig.
- Dehydrering: Perfuser cochlea med PBS 3x og senk i 15 minutter mellom endringene. Dehydrer cochlea med stigende konsentrasjoner av etanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; i 30 minutter i hver konsentrasjon.
MERK: Det er viktig å fjerne all EDTA før dehydrering da EDTA felles ut i etanol. Cochleae kan også etterlates i en hvilken som helst konsentrasjon av etanol større enn 70% over natten. - Farging: Beis hele sneglehuset ved nedsenkning i en løsning av Rhodamine B-isotiocynat (5 μg/ml i 100 % etanol) over natten med rotasjon. Fjern overflødig fargestoff fra cochlea med to endringer på 100% etanol, 5 min hver endring.
- Clearing: Overfør det fargede sneglehuset til to skift av Spalteholz12 oppløsning (5:3 metylsalisylat: benzylbenzoat), 30 minutter ved hver endring og la det stå over natten i clearingoppløsningen med rotasjon. Cochleae kan forbli i Spalteholz-løsningen på ubestemt tid.
2. Avbildning av cochleae
- Fest cochleae til en prøvestang ved den ovale og runde vindusmembranenden slik at ryddeløsningen forblir innenfor sneglehuset og bobler ikke dannes (figur 2). Pass på at bobler ikke dannes i sneglehuset, da de er vanskelige å fjerne, og hvis de blir liggende i vevet, vil de forårsake bildeartefakter.
- Bruk et UV-aktiverende lim for å feste det våte sneglehuset til den tørre prøvestangen (figur 2). Fest cochlea ved de ovale og runde vindusendene. Herd UV-limet i 10 s ved å bevege deg rundt i sneglehuset med UV-lyset.
MERK: Et løst feste av sneglehuset til prøvestangen vil resultere i avbildningsfeil. Denne staven er spesielt produsert for denne protokollen (se Santi et al.8 for detaljer) og er spesifikk for vårt lysarkmikroskop. - Heng cochlea inn i bildekammeret fylt med Spalteholz-oppløsning for avbildning. Prøvekammeret er en optisk klar kvartsfluorometercelle (Video 1).
- Fest prøvestangen til en roterende holder som også er festet til XZ oversettelsestrinn. De fleste stabler oppnås ved å oversette prøven i XZ-planene, men rotasjonsstabler kan også oppnås.
- TSLIM optisk seksjonering: Bruk en blå eller grønn laser for eksitasjon, avhengig av typen fluorokromfarging. Plasser lysarket i midten av vevet for fokusering og bestem forstørrelsen som skal brukes til å belyse cochleaens fulle bredde. Deretter bruker du et spesialdesignet program til å flytte prøven gjennom lysarket over prøven i X-aksen (sette sammen bildet) og i Z-trinn for å lage en stabel med 2D-bilder gjennom hele sneglehuset.
- For det første bildet er lysarkets strålemidje plassert på kanten av prøven, og programmet skanner hele bredden av prøven og samler kolonner med data (se bildesøm; Santi et al.8) som er bredden på konfokalparameteren (figur 3) for å produsere et sammensatt 2D-bilde med maksimal oppløsning over prøvens bredde. Programmet automatiserer bildesøm for hvert Z-trinn til prøven er fullstendig avbildet.
- Bildebehandling: Overfør bildestakken til en annen datamaskin og last den inn i et 3D-gjengivelsesprogram for 3D-rekonstruksjon og kvantifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siden temaet for dette spesialnummeret er å avbilde effekten av aldring i sneglehuset, vil en ung (3 måneder gammel, HS2479, CBA stammemus) og eldre (23 måneder gammel, HS2521, C57 stammemus) cochleae bli brukt som eksempler. Det skal bemerkes at TSLIM er i stand til å avbilde en rekke prøver, inkludert cochleae fra mennesker, pattedyr, andre gnagere og fisk, samt andre organer som hjernen.
Johnson et al. 13 publiserte en artikkel om SGNs hos unge (3 uker gamle) CBA-mus ved hjelp av TSLIM. Alle SGN-er ble talt i fem mus, og det var et område på 8,408-8,912 SGNs med en gjennomsnittlig Rosenthals lengde på 2,0 mm. I denne studien telte vi SGN-ene i en 3 måneder gammel CBA-mus som inneholdt 7,913 SGN i en Rosenthals kanallengde på 2,0 mm. Den 23 måneder gamle C57BL6-musen inneholdt 6,521 SGN med en Rosenthals lengde på 2,11 mm. En volumgjengivelse viser alle SGN-er i begge cochleae, men SGN-tap ble ikke avslørt i den eldre musen. Imidlertid viste SGN-celletall som en funksjon av Rosenthals kanalavstand, avbildet i et lineært plott, større SGN hos det yngre dyret i midten og apikale ender av sneglehuset sammenlignet med det eldre dyret (figur 11). Dette tilsynelatende tapet av SGN-er ble ytterligere visualisert ved hjelp av klyngeanalyse i 3D-gjengivelsesprogramvare. Her ble SGN-tetthetsforskjeller avbildet på en fargeskala der klynger med høy tetthet er gule, og blått representerer regioner med lavere tetthet (figur 12). Selv om det ikke er mulig å identifisere spesifikke celler som har gått tapt, visualiserer klyngeanalysen tydelig regioner med lavere celletetthet langs lengden av Rosenthals kanal (figur 12).
Figur 1: Direkte volumgjengivelse av et sneglehus. En sammensatt figur fra en volumgjengivelse av et musesneglehus som viser de ovale (O) og runde (R) vinduene, organet til Corti med hårceller (blå linje, OC) og Rosenthals kanal som har blitt segmentert og volumgjengitt som inneholder spiralganglionnevroner (SGN). Bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prøveholder. En treprototype av en tilpasset prøveholder for festing av sneglehuset (pilspissen) til en prøvestang (pil) ved hjelp av UV-aktivert lim samtidig som ryddeløsningen holdes inne i sneglehuset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tverrsnitt av lysark. Et tverrsnitt gjennom et X-akset skannet lysark som viser strålemidjen i midten av lysarket og konfokalparameteren (CP), som er et område der stråletykkelsen er relativt konstant. Den øvre, heldekkende gjengivelsen viser bredden på strålen uten skanning, og den nedre, heldekkende gjengivelsen viser bredden på den skannede strålen som forblir tynn over hele bredden av sneglehuset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Et midtmodiolært 2D-tverrsnitt gjennom et musesneglehus. Fire cochlea-svinger er seksjonert. Den basale svingen av Rosenthals kanal kan sees som inneholder sfæriskformede spiralganglionneuroner. Bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: To tverrsnitt av sneglehuset. Til venstre er et 2D-tverrsnitt og til høyre er den samme delen med flere strukturer som har blitt segmentert ved hjelp av forskjellige fargede sporinger. Bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Cochleastrukturer segmentert. (A) Denne figuren viser et segmentert sneglehus med den omkringliggende otiske kapselen. (VG Nett) Disse viser flere forskjellige cochleastrukturer som har blitt segmentert og sentroidene (hvit linje) er bestemt for de fleste strukturer. Cochleastrukturer har blitt segmentert med forskjellige farger for identifikasjon: (A) sammensatt figur med bein (hvit), (B) turkis (spiralligament), (C) rødbrun (stria vascularis), (D) gul (basilær membran), (E) rød (Corti-organ), (F) gulgrønn (Rosenthals kanal), (G) blå (scala tympani), gull (stifter fotplate), (H) hvit (scala media), grønn (ductus reuniens), (I) rød (scala vestibuli), lilla (rund vindusmembran), gull (cochlea-akvedukt), (J) grønn (tektorialmembran), (K) lilla (spiral limbus). Bar = 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Sammenligning av samme cochleastruktur i to ulike sneglehus. Ved hjelp av Prokrustus-metoden i 3D-renderingsprogramvare har Scala-mediet fra to forskjellige mus blitt sammenlignet. Det venstre panelet viser tilpasningen av en minste kvadraters tilpasning av to strukturer, og det høyre panelet viser deres kvantitative forskjeller ved hjelp av et fargekart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Solid 3D-plastmodell av sneglehuset. Det venstre panelet viser Scala tympani av en musecochlea med basilarmembranen, Corti-organet og helicotrema segmentert. Det høyre panelet viser en solid plastmodell av konstruksjonene til venstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Telling av spiralganglionnevroner. SGN-er er identifisert og merket av 3D-gjengivelsesprogrammet på et tverrsnitt av Scala-mediet i musesneglehuset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Immunhistokjemisk merking av ytre hårceller. Anti-prestin antistoffer og fluorescerende sekundære antistoffer som ble perfusert gjennom peri lymfatisk Scala av en mus cochlea har merket alle ytre hårceller som har blitt volum gjengitt ved hjelp av 3D-rendering programvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Tetthet av SGN langs lengden av Rosenthals kanal. Det største tapet av SGN ser ut til å være i midten og apikale ender av Rosenthals kanal i den 23 måneder gamle musen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Klyngeanalyse av SGN-celletetthet. Det venstre panelet viser en klyngeanalyse av SGN i en 3 måneder gammel, normal hørselsmus. Et fargekart viser at den største tettheten av celler i en klynge av en gitt størrelse er i midten av Rosenthals kanal, hvor musens hørselsterskler er lavest. Det høyre panelet viser tapet av SGN gjennom Rosenthals kanal med størst tap av SGN midt i Rosenthals kanal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: X-akse skanning video av cochlea. X-akseskanning av prøven gjennom lysarket som viser cochlea suspendert av prøvestangen i clearingløsningen som er inneholdt i et glasskammer. Et ortogonalt 2D fluorescerende tverrsnitt av cochlea vises på grunn av belysning av lysarket. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Stabel med serielle deler av sneglehuset. En kort stabel med 2D-tverrsnitt oppnås ved X-akseskanning og 10 μm Z-trinn gjennom sneglehuset. Legg merke til tilstedeværelsen av horisontale linjer i hele stabelen, som er absorpsjonsartefakter på grunn av bruk av en sylindrisk linse for å produsere lysarket. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Reseksjonering av et sneglehus i et annet plan. En stabel lastet inn i 3D-gjengivelsesprogrammet og virtuell reseksjonering i et plan tangentielt til organet til Corti, som viser hårcellene langs lengden av basilarmembranen. Denne videoen er endret fra8. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 4: Skjelettisering av Scala-mediet. Det venstre panelet viser beregningen av sentroiden i Scala-mediet til en musecochlea. Det høyre panelet viser et fargekart over de radiale dimensjonene til Scala-mediet langs lengden. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optisk snitting ved hjelp av lysplatemikroskopi for undersøkelse av cochleastrukturer er ikke mekanisk destruktiv som andre mer tradisjonelle histologiske metoder, og det gir en komplett digital oversikt over cochleastrukturer i forhold til hverandre. Tidligere metoder som overflatebehandlinger av organet til Corti14 ga et kart over hårcelletap langs lengden av basilarmembranen, men SGN-tap kunne ikke vurderes siden vevet hadde blitt dissekert bort for å avsløre Corti-organet. Alternativt gir mid-modoilære mikrotomseksjoner av cochlea bare en svært liten prøve av tilstanden til SGNene gjennom hele lengden av Rosenthals kanal. Med TSLIM digitaliseres alle cochleastrukturer på nivået for instrumentets oppløsning (dvs. subcellulært). Komplette bildestabler av sneglehuset tillater kvantifisering og visualisering av flere cochleastrukturer, som er vist her, som ikke kunne oppnås ved tradisjonelle histologiske metoder. For eksempel, ved hjelp av en klyngealgoritme, viste den nåværende undersøkelsen en helt ny måte å se og kvantifisere SGN-celletetthet i Rosenthals kanal og karakterisere celletap på grunn av aldring (figur 12).
TSLIM er en tidlig8 utvikling av et lysarkmikroskop som ble inspirert av arbeidet til Voie og kolleger 4,5. Spesifikasjoner for konstruksjon av TSLIM ble inkludert i papiret av Santi et al.8. Faktisk uttalte Brown et al.15 at de konstruerte et lignende lysarkmikroskop for avbildning av cochlea basert på TSLIMs design. Som nevnt i introduksjonen og gjennomgått av Santi7, var utviklingen av andre lysarkmikroskoper (f.eks. SPIM) rettet mot å undersøke levende celleutvikling og fikk bedre oppløsning ved nedsenking av høye N.A. mål i prøvekammeret, noe som krevde små arbeidsavstander og er uegnet for avbildning av hele cochleae. Kommersiell utvikling av lysarkmikroskoper fortsetter, og denne typen avbildning er ekstremt nyttig for å forberede veljusterte, serielle seksjoner av vev og dyr som er gjennomsiktige ved kjemiske ryddemetoder.
For enhver lysarkmikroskopapplikasjon er det avgjørende at prøven gjøres gjennomsiktig for å forhindre lysspredning og absorpsjon. Avkalkning er det første trinnet i prosessen for å fjerne kalsium fra cochlea for åpenhet. Hvis EDTA ikke skylles helt ut av vevet før dehydrering, vil det utfelle i vevet og god bildebehandling vil ikke være mulig. Dehydrering med etanol er nødvendig for infiltrasjon av Spalteholz-clearingløsningen. Hvis en prøve er sterkt pigmentert, kan bleking av pigmentet bidra til å gjøre prøven mer gjennomsiktig. Det er mange andre kjemikalier og metoder som kan brukes til å gjøre en prøve gjennomsiktig, og brukere kan ønske å prøve forskjellige metoder for å bestemme hvilken metode som passer best for prøven. Selv om lysarkmikroskopi produserer 2D-bilder av vev, er oppløsningen ikke så stor som det kan oppnås fra tynne mekaniske seksjoner av vev (spesielt plastseksjoner) og brightfield-mikroskopi. Dens primære fordel er å produsere godt justerte, serielle seksjoner av vev for 3D-rekonstruksjon av strukturer.
De to musene cochleae som vi viser som eksempler på SGN-tap på grunn av aldring, avslører tap av nevroner på grunn av aldring. Et uventet funn var tap av SGN i midtre og apikale ender av sneglehuset i stedet for et basalt tap som ville tilsvare tap av hårceller i basen. Vi vurderte imidlertid ikke hårcelletap i disse cochleae, og de to prøvene er bare eksempler i stedet for en undersøkelse av aldringseffektene på SGN. I et papir av White et al.16 beskrev de SGN-tap i 18 måneder gamle C57-mus, men bestemte ikke fordelingen av tapet langs lengden av Rosenthals kanal. I en annen artikkel av Grierson et al.17, ved bruk av 24-28 måneder gamle mus, beskrev de massiv degenerasjon av OHC-efferenter, spesielt i den apikale halvdelen av cochlea, hvor det også var et betydelig tap av OHC. Faktisk har fremtiden mange muligheter for å trekke ut nye data og få en bedre forståelse av patologiske prosesser i cochlea på grunn av aldring og andre fornærmelser. Videre har cochlear bildestakker blitt gitt til mange andre etterforskere, og det vil være interessant å se hvordan disse etterforskerne gruver data for å svare på sine forskningsspørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen har blitt støttet av tilskudd fra National Institute on Deafness and Other Communication Disorders fra National Institutes of Health, Kellogg Foundation, og private donasjoner fra Bridget Sperl og John McCormick. TSLIM er utviklet med utmerket assistanse fra Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg og Julian Wuester fra Technical University of Illmenau, Tyskland, veiledning av deres mentorer (Stefan Sinzinger og Rene Theska) og James Leger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021).
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J.
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. On making human and animal preparations transparent. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
