Summary
Ein Lichtblattmikroskop wurde entwickelt, um die gesamte Cochlea abzubilden und zu digitalisieren.
Abstract
Taubheit ist die häufigste sensorische Beeinträchtigung und betrifft laut Weltgesundheitsorganisation weltweit etwa 5 % oder 430 Millionen Menschen1. Alterung oder Presbyakusis ist eine Hauptursache für Schallempfindungsschwerhörigkeit und ist gekennzeichnet durch eine Schädigung der Haarzellen, der spiralförmigen Ganglienneuronen (SGNs) und der Stria vascularis. Diese Strukturen befinden sich in der Cochlea, die eine komplexe, spiralförmige Anatomie aus membranösem Gewebe aufweist, das in Flüssigkeit suspendiert und von Knochen umgeben ist. Diese Eigenschaften machen es technisch schwierig, histopathologische Veränderungen zu untersuchen und zu quantifizieren. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir ein Lichtblattmikroskop (TSLIM) entwickelt, das die gesamte Cochlea abbilden und digitalisieren kann, um die Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen im Innenohr zu erleichtern. Gut ausgerichtete serielle Schnitte der gesamten Cochlea führen zu einem Stapel von Bildern für die dreidimensionale (3D) Volumendarstellung und Segmentierung einzelner Strukturen für die 3D-Visualisierung und quantitative Analyse (d. h. Länge, Breite, Oberfläche, Volumen und Anzahl). Cochleae erfordern minimale Verarbeitungsschritte (Fixierung, Entkalkung, Dehydratisierung, Färbung und optische Reinigung), die alle mit der anschließenden hochauflösenden Bildgebung durch Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie kompatibel sind. Da alle Gewebe in den Stapeln vorhanden sind, kann jede Struktur einzeln oder relativ zu anderen Strukturen beurteilt werden. Da bei der Bildgebung fluoreszierende Sonden verwendet werden, können Immunhistochemie und Ligandenbindung verwendet werden, um spezifische Strukturen und deren 3D-Volumen oder -Verteilung innerhalb der Cochlea zu identifizieren. Hier haben wir TSLIM verwendet, um Cochleae von gealterten Mäusen zu untersuchen, um den Verlust von Haarzellen und spiralförmigen Ganglienneuronen zu quantifizieren. Darüber hinaus wurden fortgeschrittene Analysen (z. B. Clusteranalyse) verwendet, um lokale Reduktionen von Spiralganglienneuronen im Rosenthal-Kanal entlang seines 3D-Volumens zu visualisieren. Diese Ansätze demonstrieren die Fähigkeit der TSLIM-Mikroskopie, Struktur-Funktions-Beziehungen innerhalb und zwischen Cochleae zu quantifizieren.
Introduction
Die Cochlea ist das periphere Sinnesorgan für das Gehör bei Säugetieren. Es hat eine komplexe spiralförmige Anatomie aus sich wiederholenden Sinnes- und Stützzellen, die anatomisch darauf spezialisiert sind, Schallschwingungen zu erkennen und sie zur Wahrnehmung des Gehörs an das Gehirn weiterzuleiten. Die wichtigsten sensorischen Elemente sind die inneren und äußeren Haarzellen und ihre innervierten Nervenfasern, deren Zellkörper das Spiralganglion bilden, das sich im Rosenthal-Kanal befindet (Abbildung 1). Diese sensorischen und neuronalen Strukturen sind tonotopisch so angeordnet, dass hochfrequente Töne in der Cochlea-Basis und niederfrequente Töne in der Cochlea-Spitze2 transduziert werden. Eine anatomische Karte dieser sensorischen Zellverteilung entlang der Spirallänge der tragenden Basilarmembran wird als Zytocochleogramm3 bezeichnet und kann mit einem Hörverlust in Abhängigkeit von der Frequenz verglichen werden, wie in einem Audiogramm dargestellt.
Das membranöse Labyrinth der Cochlea, das von dichtem Knochen umgeben ist, macht es technisch schwierig, mehr als eine Cochlea-Struktur gleichzeitig zu untersuchen. Der Grundgedanke für die Entwicklung eines Lichtblattmikroskops besteht daher darin, gut ausgerichtete Serienschnitte der gesamten Cochlea herzustellen, so dass alle Cochlea-Strukturen in 3D-Rekonstruktionen relativ zueinander untersucht werden können. Voie et al.4 und Voie und Spelman5 entwarfen das erste Lichtblattmikroskop, das sogenannte OPFOS-Mikroskop (Orthogonal Plane Fluorescence Optical Sectioning), um die gesamte Cochlea optisch zu schneiden. Dieses Mikroskop wurde jedoch nie kommerziell entwickelt; Unser Ziel war es daher, ein Lichtblattmikroskop zu konstruieren, das als Dünnschicht-Laserbildgebungsmikroskop (TSLIM; Abbildung 2). Die Design- und Konstruktionsdetails für TSLIM wurden bereits veröffentlicht8. TSLIM hat gegenüber dem OPFOS mehrere Verbesserungen vorgenommen, darunter die Verwendung einer Low-Light-Digitalkamera im Vergleich zu einer CCD-Kamera für die Bilderfassung, optisch codierte Mikropositionierer für eine genaue und reproduzierbare Bewegung der Probe durch das Lichtblatt, die Verwendung einer kommerziell erhältlichen, optisch klaren Probenkammer und die Rhodaminfärbung in Ethanol statt in der Klärlösung, um Fleckenausfällungen im Gewebe zu verhindern. Die kommerzielle Entwicklung von Lichtblattmikroskopen wie SPIM6 konzentrierte sich auf die hochauflösende Bildgebung von lebenden, kleinen, transparenten Proben, die jedoch für die Bildgebung der gesamten Cochlea ungeeignet sind, da sie keinen ausreichenden Arbeitsabstand haben. Ein Überblick über die Entwicklung anderer Lichtblattmikroskope wurde von Santi7 veröffentlicht. Der Hauptvorteil von TSLIM gegenüber anderen histologischen Methoden zur Untersuchung der Cochlea besteht darin, Gewebe für die 3D-Rekonstruktion optisch zu schneiden und gleichzeitig die Integrität der Probe zu erhalten, so dass sie mit anderen histologischen Methoden verwendet werden kann. Ein weiterer Vorteil der TSLIM-Bildgebung besteht darin, dass nur eine dünne Lichtschicht, die von einem Laser erzeugt wird, dem Gewebe ausgesetzt wird, verglichen mit der Belichtung des gesamten Gewebes mit dem Laser wie bei der konfokalen Mikroskopie. Die Gewebereinigung zur Minimierung der Lichtstreuung und die Tatsache, dass nur ein kleiner Teil des Gewebes dem Laser ausgesetzt ist, führt zu einem minimalen Fluorochrom-Fading (Photobleichen) bei der Lichtblatt-Laserbildgebung. Der Prozess der Fixierung, Dehydrierung und Klärung verändert jedoch die Morphologie der Cochlea-Strukturen und führt zu einer Gewebeschrumpfung im Vergleich zu lebendem Gewebe. Das tatsächliche Ausmaß der auftretenden Gewebeschrumpfung wurde nicht bestimmt.
TSLIM wurde von Shane Johnson und acht deutschen Studenten der Optischen Technik entwickelt (siehe Danksagung). Details zur TSLIM-Konstruktion wurden von Santi et al.8 und eine Scan-Version (sTSLIM) von Schröter et al.9 zur Verfügung gestellt. TSLIM fungiert als zerstörungsfreies Mikrotom zum optischen Schneiden von Proben und als Mikroskop zum Sammeln von 2D-Serienschnitten über die gesamte Breite und Dicke der Cochlea. TSLIM kann sowohl kleine (mm) als auch große (cm) dicke Proben abbilden. Die Linsen sind luftmontiert, um große Arbeitsabstände mit Sammelobjektiven von 1x und 2x auf einem Dissektionsmikroskop zu ermöglichen. Das Dissektionsmikroskop verfügt außerdem über eine Zoomoptik, die es TSLIM ermöglicht, subzelluläre und synaptische Strukturen auf Zellen aufzulösen. TSLIM ist sowohl mit einem blauen (473 nm) als auch mit einem grünen (532 nm) Laser für die Beleuchtung ausgestattet, der es ermöglicht, eine Vielzahl von Fluoreszenzsonden für die Bildgebung zu verwenden. Das Ziel von TSLIM ist es, gut ausgerichtete optische 2D-Schnitte durch eine ganze Cochlea für eine vollständige digitale Rekonstruktion von Cochlea-Geweben zu erzeugen. Da es sich um eine Fluoreszenzmethode handelt, können auch Liganden und Immunhistochemie verwendet werden, um spezifische Cochlea-Strukturen zu identifizieren.
Ursprünglich wurde eine zylindrische Linse verwendet, um zwei gegenüberliegende Gaußsche Lichtblätter zu erzeugen, aber sie erzeugte Absorptionsbildgebungsartefakte. Aufgrund der Arbeit von Keller et al.10 wurde die feste zylindrische Linse durch einen scannenden Galvanometerspiegel ersetzt, um das Lichtblatt9 herzustellen. Da die Mitte des Lichtblatts an der Strahltaille am dünnsten ist, werden sTSLIM 2D-Bilder erzeugt, indem eine Zusammenstellung von Datenspalten der X-Achse über die Breite der Probe gesammelt wird (Abbildung 3). Diese Methode wurde erstmals von Buytaert und Dircks11 beschrieben. Die kundenspezifische TSLIM-Software zum Steuern und Sammeln von Bildern wurde unter Verwendung eines grafischen Programms zur Instrumentensteuerung entwickelt. Das Lichtblatt wandert durch die Probe und beleuchtet eine fluoreszierende Ebene innerhalb des Gewebes. Diese fluoreszierende Ebene wird orthogonal durch die transparente Probe projiziert und von einem Dissektionsmikroskop gesammelt. Optisch kodierte Mikropositionierer ermöglichen das Scannen durch die Strahltaille in der X-Achse, um ein einzelnes zusammengesetztes 2D-Bild zu erfassen, und anschließend bewegt der Mikropositionierer der Z-Achse die Probe in eine tiefere Ebene innerhalb des Gewebes, um einen Stapel serieller, geschnittener 2D-Bilder zu erhalten (Video 1, Abbildung 4). Ein Stapel von Translationsbildern wird über die gesamte Breite, Dicke und Länge der Cochlea gesammelt, und das Zusammenfügen von Bildern ist nicht erforderlich (Video 2). Der Bildstapel wird auf einen anderen Computer übertragen und zur 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung in ein 3D-Rendering-Programm geladen. Die Bildstapel enthalten alle digitalen Informationen über die Morphologie einer Cochlea bei der Auflösung des Mikroskops. Wenn jedoch eine höhere Auflösung erforderlich ist, kann die intakte Cochlea durch destruktive histologische Methoden wie Mikrotomschnitt, Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie weiterverarbeitet werden.
Das 3D-Rendering-Programm wird verwendet, um verschiedene Cochlea-Strukturen für das 3D-Rendering und die quantitative Analyse zu segmentieren. Für die Segmentierung wird jede Struktur in jedem 2D-Bild des Stapels mit einem Grafiktablett und einem Stift in einer anderen Farbe nachgezeichnet (Abbildung 5). Bis heute wurden 20 verschiedene Cochlea-Strukturen segmentiert (Abbildung 6). Nach der Segmentierung können verschiedene 3D-Analysen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine 3D-Rendering-Software die Cochlea in jeder Ebene entlang des Schwerpunkts der Struktur virtuell resektionieren. Video 3 zeigt den Schnitt tangential zum Corti-Organ, der die Haarzellen entlang der Länge der Basilarmembran freilegt. Dieser Prozess erfordert zunächst eine manuelle Segmentierung der interessierenden Struktur. Als nächstes wird der Schwerpunkt der Struktur basierend auf der Anpassung der kleinsten Quadrate von Spline-Punkten berechnet, die entlang der Mitte der Struktur von ihrer Basis bis zu ihrem Scheitelpunkt platziert sind, wodurch eine Annäherung an die Länge der Struktur ermöglicht wird (Video 4). Ein ähnlicher Prozess, der als Skelettierung bezeichnet wird, kann verwendet werden, um die radiale Breite der Struktur entlang ihrer Länge mithilfe einer Farbkarte zu visualisieren (Video 4). Das Gesamtvolumen jeder Struktur wird vom Programm nach der Segmentierung berechnet, aber relative Abstände können auch quantifiziert und mit Farbkarten in einer 3D-Rendering-Software visualisiert werden (Abbildung 7). Segmentierte Strukturen können auch exportiert werden, um vergrößerte Renderings von Volumenkunststoffmodellen zu erzeugen (Abbildung 8). Darüber hinaus kann die halbautomatische Zellzählung auch mit einer 3D-Rendering-Software durchgeführt werden (Abbildung 9). Immunhistochemie und Ligandenbindung können verwendet werden, um spezifische Cochlea-Strukturen zu färben, und diese Strukturen können von anderen Cochlea-Strukturen für morphometrische Beurteilungen, wie z. B. die Erstellung eines Zytocochleogramms, isoliert werden (Abbildung 10). Länge, Breite, Oberfläche, Volumen und Anzahl aller Cochlea-Strukturen können aus den 3D-Modellen bestimmt werden, wodurch sich dieser Ansatz ideal für die Kartierung von Cochlea-Schäden auf funktionelle Beeinträchtigungen eignet. Konkret können Cochlea-Schäden durch Alterung, lärmbedingte Traumata oder andere Beleidigungen in 3D-Cochlea-Rekonstruktionen aus optischen 2D-Schnitten dargestellt und quantifiziert werden. Sobald eine Cochlea digitalisiert wurde, gibt es zahlreiche bildgebende Algorithmen, mit denen die Cochlea-Schädigung von Geweben innerhalb der Cochlea im anatomischen Register zu anderen Cochlea-Geweben beurteilt werden kann.
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Protocol
Alle Verfahren und die Verwendung lebender Tiere wurden vom Institutional Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota überprüft und genehmigt (Protokoll-ID #2010-38573A), und die Ermittler, die diese Tiere verwenden, wurden von den Tierärzten der Research Animal Resources (RAR) gründlich geschult und getestet, bevor sie Zugang zu den Tiereinrichtungen haben. In dieser Studie wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet.
1. Cochlea-Entfernung zur Fixierung und Gewebeverarbeitung für die Bildgebung
- Euthanasieren Sie eine Maus durch CO2 -Inhalation. Enthaupten Sie die Maus mit einer Schere und machen Sie einen dorsal-ventralen Schnitt durch das Gehirn, um den Schädel zu halbieren. Entfernen Sie das Gehirn, identifizieren Sie die runde Bulla im baso-ventralen Teil des Schädels, öffnen Sie die Bulla mit Rongeurs und visualisieren und entfernen Sie die Cochlea.
- Fixierung: Führen Sie diesen Vorgang unter einem Abzug und mit einem Dissektionsmikroskop bei 5-facher Vergrößerung durch. Tragen Sie Handschuhe und Schutzkleidung. Durchstechen Sie das ovale Fenster und entfernen Sie den Steigbügel mit einer scharfen Spitzhacke. Führen Sie einen Pickel in das runde Fenster ein, um die Membran zu durchstechen.
- Decken Sie das geöffnete runde Fenster mit der Schnittspitze eines Infusionssets ab, das an einer 1-ml-Spritze befestigt ist, die mit 2 ml Formalin gefüllt ist. Ziehen Sie Formalin langsam über einen Zeitraum von 2 Minuten durch die perilymphatischen Räume der Cochlea und stellen Sie fest, dass Formalin über das geöffnete ovale Fenster aus der Cochlea austritt. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe von der Cochlea ab und tauchen Sie es in eine Flasche mit 10% Formalin und legen Sie es über Nacht auf einen Rotator.
- Entkalkung: Spülen Sie die Cochlea in PBS 3x für jeweils 5 Minuten und tauchen Sie sie 4 Tage lang in eine Flasche mit 10% iger Lösung von Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit Rotation ein, wobei Sie die Lösung täglich wechseln.
- Dehydration: Durchbluten Sie die Cochlea mit PBS 3x und tauchen Sie zwischen den Wechseln 15 Minuten lang ein. Dehydrieren Sie die Cochlea mit aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; für 30 min in jeder Konzentration.
HINWEIS: Es ist wichtig, das gesamte EDTA vor der Dehydratisierung zu entfernen, da EDTA in Ethanol ausfällt. Außerdem können Cochleae über Nacht in jeder Ethanolkonzentration von mehr als 70% belassen werden. - Färbung: Färben Sie die gesamte Cochlea durch Eintauchen in eine Lösung von Rhodamin-B-Isothiocynat (5 μg/ml in 100% Ethanol) über Nacht mit Rotation. Entfernen Sie überschüssigen Farbstoff von der Cochlea mit zwei Wechseln von 100% Ethanol, jeweils 5 Minuten Wechsel.
- Clearing: Die gefärbte Cochlea in zwei Wechsel der Spalteholz12-Lösung (5:3 Methylsalicylat:Benzylbenzoat) mit jeweils 30 min Wechsel überführen und über Nacht in der Clearing-Lösung mit Rotation belassen. Cochleae können auf unbestimmte Zeit in Spalteholz-Lösung belassen werden.
2. Bildgebung von Cochleae
- Befestigen Sie die Cochleae an einem Probenstab am ovalen und runden Fenstermembranende, so dass die Klärlösung in der Cochlea verbleibt und sich keine Blasen bilden (Abbildung 2). Es muss darauf geachtet werden, dass sich keine Blasen in der Cochlea bilden, da diese schwer zu entfernen sind und wenn sie im Gewebe verbleiben, bildgebende Artefakte verursachen.
- Verwenden Sie einen UV-aktivierenden Kleber, um die feuchte Cochlea am trockenen Probenstab zu befestigen (Abbildung 2). Befestigen Sie die Cochlea an den ovalen und runden Fensterenden. Härten Sie den UV-Kleber 10 s lang aus, indem Sie sich mit dem UV-Licht um die Cochlea bewegen.
HINWEIS: Eine lose Befestigung der Cochlea am Probenstab führt zu Abbildungsfehlern. Dieser Stab wurde speziell für dieses Protokoll hergestellt (siehe Santi et al.8 für Details) und ist spezifisch für unser Lichtblattmikroskop. - Hängen Sie die Cochlea in die Bildgebungskammer, die mit Spalteholz-Lösung für die Bildgebung gefüllt ist. Bei der Probenkammer handelt es sich um eine optisch klare Quarzfluorometerzelle (Video 1).
- Befestigen Sie den Probenstab an einem drehbaren Halter, der auch am XZ-Translationstisch befestigt ist. Die meisten Stapel werden durch Verschieben der Probe in den XZ-Ebenen erhalten, aber es können auch Rotationsstapel erhalten werden.
- Optischer TSLIM-Schnitt: Verwenden Sie je nach Art der Fluorochromfärbung einen blauen oder grünen Laser zur Anregung. Positionieren Sie das Lichtblatt zur Fokussierung in der Mitte des Gewebes und bestimmen Sie die Vergrößerung, mit der die gesamte Breite der Cochlea beleuchtet wird. Verwenden Sie dann ein speziell entwickeltes Programm, um die Probe durch das Lichtblatt über die Probe in der X-Achse (Zusammenfügen des Bildes) und in Z-Schritten zu bewegen, um einen Stapel von 2D-Bildern in der gesamten Cochlea zu erstellen.
- Für das erste Bild wird die Strahltaille des Lichtblatts am Rand der Probe positioniert und das Programm scannt die gesamte Breite der Probe und sammelt Datenspalten (siehe Bildzusammenfügung; Santi et al.8), die die Breite des konfokalen Parameters (Abbildung 3) darstellen, um ein zusammengesetztes 2D-Bild mit maximaler Auflösung über die Breite der Probe zu erzeugen. Das Programm automatisiert das Zusammenfügen von Bildern für jeden Z-Schritt, bis die Probe vollständig abgebildet ist.
- Bildverarbeitung: Übertragen Sie den Bildstapel auf einen anderen Computer und laden Sie ihn zur 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung in ein 3D-Rendering-Programm.
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Representative Results
Da das Thema dieser Sonderausgabe die Darstellung der Auswirkungen des Alterns in der Cochlea ist, werden eine junge (3 Monate alt, HS2479, CBA-Stammmaus) und gealterte (23 Monate alt, HS2521, C57-Stammmaus) Cochleae als Beispiele verwendet. Es sollte beachtet werden, dass TSLIM in der Lage ist, eine Vielzahl von Proben abzubilden, einschließlich Cochleae von Menschen, Säugetieren, anderen Nagetieren und Fischen sowie anderen Organen wie dem Gehirn.
Johnson et al. 13 veröffentlichten einen Artikel über SGNs bei jungen (3 Wochen alten) CBA-Mäusen mit TSLIM. Alle SGNs wurden in fünf Mäusen gezählt und es gab einen Bereich von 8.408-8.912 SGNs mit einer durchschnittlichen Rosenthal-Länge von 2,0 mm. In der vorliegenden Studie haben wir die SGNs in einer 3 Monate alten CBA-Maus gezählt, die 7.913 SGNs in einer Rosenthal-Kanallänge von 2,0 mm enthielt. Die 23 Monate alte C57BL6-Maus enthielt 6.521 SGN bei einer Rosenthal-Länge von 2,11 mm. Ein Volumen-Rendering zeigt alle SGNs in beiden Cochleae, aber der SGN-Verlust wurde bei der älteren Maus nicht aufgedeckt. Die Anzahl der SGN-Zellen in Abhängigkeit von der Rosenthal-Kanalabstand, die in einem linearen Diagramm dargestellt ist, zeigte jedoch beim jüngeren Tier am mittleren und apikalen Ende der Cochlea im Vergleich zum älteren Tier größere SGNs (Abbildung 11). Dieser scheinbare Verlust von SGNs wurde durch die Verwendung von Clusteranalysen in 3D-Rendering-Software weiter visualisiert. Hier wurden die SGN-Dichteunterschiede auf einer Farbskala dargestellt, bei der Cluster mit hoher Dichte gelb sind und Blau Bereiche mit geringerer Dichte darstellt (Abbildung 12). Obwohl es nicht möglich ist, spezifische Zellen zu identifizieren, die verloren gegangen sind, zeigt die Clusteranalyse deutlich Regionen mit geringerer Zelldichte entlang der Länge des Rosenthal-Kanals (Abbildung 12).
Abbildung 1: Direktes Volumen-Rendering einer Cochlea. Eine zusammengesetzte Figur aus einer Volumendarstellung einer Maus-Cochlea, die die ovalen (O) und runden (R) Fenster, das Corti-Organ mit Haarzellen (blaue Linie, OC) und den Rosenthal-Kanal zeigt, der segmentiert und gerendert wurde und Volumen enthält, das spiralförmige Ganglienneuronen (SGNs) enthält. Balken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Probenhalter. Ein Holzprototyp eines kundenspezifischen Probenhalters zur Befestigung der Cochlea (Pfeilspitze) an einem Probenstab (Pfeil) unter Verwendung von UV-aktiviertem Kleber, während die Reinigungslösung in der Cochlea verbleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Lichtblechquerschnitt. Ein Querschnitt durch ein auf der X-Achse gescanntes Lichtblatt, das die Strahltaille in der Mitte des Lichtblatts und den konfokalen Parameter (CP) zeigt, bei dem es sich um einen Bereich handelt, in dem die Strahldicke relativ konstant ist. Das obere Volumenkörper-Rendering zeigt die Breite des Strahls ohne Scannen und das untere Volumenkörper-Rendering zeigt die Breite des gescannten Strahls, der über die gesamte Breite der Cochlea dünn bleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Ein 2D-Querschnitt durch eine Cochlea der Maus. Vier Cochlea-Windungen sind geschnitten. Die basale Windung des Rosenthal-Kanals ist zu sehen, die kugelförmige spiralförmige Ganglienneuronen enthält. Balken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Zwei Querschnitte der Cochlea. Auf der linken Seite befindet sich ein 2D-Querschnitt und auf der rechten Seite derselbe Schnitt mit mehreren Strukturen, die mit verschiedenfarbigen Zeichnungszeichnungen segmentiert wurden. Balken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Cochlea-Strukturen segmentiert. (A) Diese Abbildung zeigt eine segmentierte Cochlea mit der umgebenden Otikkapsel. (B-K) Diese zeigen mehrere verschiedene Cochlea-Strukturen, die segmentiert wurden, und die Schwerpunkte (weiße Linie) sind für die meisten Strukturen bestimmt. Cochlea-Strukturen wurden zu ihrer Identifizierung mit verschiedenen Farben segmentiert: (A) zusammengesetzte Figur mit Knochen (weiß), (B) türkis (Spiralband), (C) kastanienbraun (Stria vascularis), (D) gelb (basilares Membran), (E) rot (Corti-Organ), (F) gelb-grün (Rosenthal-Kanal), (G) blau (scala tympani), gold (Steigbügelfußplatte), (H) weiß (scala media), grün (Ductus reuniens), (I) rot (scala vestibuli), lila (runde Fenstermembran), Gold (Cochlea-Aquädukt), (J) grün (Tektorialmembran), (K) lila (spiralförmiger Limbus). Balken = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Vergleich der gleichen Cochlea-Struktur in zwei verschiedenen Cochleae. Mit der Procrustus-Methode in einer 3D-Rendering-Software wurden die Scala-Medien von zwei verschiedenen Mäusen verglichen. Das linke Feld zeigt die Anpassung einer Anpassung der kleinsten Quadrate zweier Strukturen und das rechte Feld zeigt ihre quantitativen Unterschiede anhand einer Farbkarte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Solides 3D-Kunststoffmodell der Cochlea. Das linke Bild zeigt die Scala tympani einer Maus-Cochlea mit der Basilarmembran, dem Corti-Organ und der Helicotrema. Die rechte Tafel zeigt ein massives Kunststoffmodell der Strukturen auf der linken Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Zählung von Ganglienneuronen in Spiralen. SGNs wurden von der 3D-Rendering-Software auf einem Querschnitt der Scala-Medien der Maus-Cochlea identifiziert und markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Immunhistochemische Markierung äußerer Haarzellen. Anti-Prestin-Antikörper und fluoreszierende Sekundärantikörper, die durch die perilymphatische Scala einer Maus-Cochlea perfundiert wurden, haben alle äußeren Haarzellen markiert, die mit einer 3D-Rendering-Software volumengerendert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 11: Dichte von SGNs entlang der Länge des Rosenthal-Kanals. Der größte Verlust an SGNs scheint bei der 23 Monate alten Maus in den mittleren und apikalen Enden des Rosenthal-Kanals zu liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 12: Clusteranalyse der SGN-Zelldichte. Das linke Bild zeigt eine Clusteranalyse von SGNs in einer 3 Monate alten, normal hörenden Maus. Eine Farbkarte zeigt, dass die größte Dichte von Zellen innerhalb eines Clusters einer bestimmten Größe im mittleren Rosenthal-Kanal liegt, wo die Hörschwellen der Maus am niedrigsten sind. Die rechte Tafel zeigt den Verlust von SGNs im gesamten Rosenthal-Kanal mit dem größten Verlust an SGNs in der Mitte des Rosenthal-Kanals. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: X-Achsen-Scan-Video der Cochlea. X-Achsen-Abtastung der Probe durch das Lichtblatt, das die Cochlea zeigt, die am Probenstab in der Reinigungslösung aufgehängt ist, die in einer Glaskammer enthalten ist. Ein orthogonaler 2D-Fluoreszenzquerschnitt der Cochlea ist aufgrund der Beleuchtung durch das Lichtblatt dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Stapel von seriellen Abschnitten der Cochlea. Ein kurzer Stapel von 2D-Querschnitten wird durch Scannen der X-Achse und 10 μm Z-Schritte durch die Cochlea erhalten. Beachten Sie das Vorhandensein horizontaler Linien im gesamten Stapel, bei denen es sich um Absorptionsartefakte handelt, die auf die Verwendung einer zylindrischen Linse zur Herstellung des Lichtblatts zurückzuführen sind. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Resektion einer Cochlea in einer anderen Ebene. Ein Stapel, der in das 3D-Rendering-Softwareprogramm geladen wird, und eine virtuelle Resektion in einer Ebene, die tangential zum Corti-Organ führt, zeigt die Haarzellen entlang der Länge der Basilarmembran. Dieses Video wurde von8 geändert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 4: Skelettierung der Scala-Medien. Das linke Feld zeigt die Berechnung des Schwerpunkts innerhalb des Skala-Mediums einer Maus-Cochlea. Das rechte Feld zeigt eine Farbkarte der radialen Abmessungen des Scala-Mediums entlang seiner Länge. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Der optische Schnitt durch Lichtblattmikroskopie zur Untersuchung von Cochlea-Strukturen ist nicht mechanisch zerstörerisch wie andere traditionellere histologische Methoden und bietet eine vollständige digitale Ansicht der Cochlea-Strukturen relativ zueinander. Frühere Methoden wie Oberflächenpräparationen des Corti-14-Organs lieferten eine Karte des Haarzellverlusts entlang der Länge der Basilarmembran, aber der SGN-Verlust konnte nicht beurteilt werden, da das Gewebe wegseziert worden war, um das Corti-Organ freizulegen. Alternativ liefern Mid-Modoilar-Mikrotomschnitte der Cochlea nur eine sehr kleine Probe des Zustands der SGNs über die gesamte Länge des Rosenthal-Kanals. Mit TSLIM werden alle Cochlea-Strukturen auf der Ebene der Auflösung des Instruments (d.h. subzellulär) digitalisiert. Vollständige Bildstapel der Cochlea ermöglichen die Quantifizierung und Visualisierung mehrerer Cochlea-Strukturen, die hier gezeigt werden und die mit herkömmlichen histologischen Methoden nicht erhalten werden konnten. Zum Beispiel zeigte die vorliegende Untersuchung unter Verwendung eines Clustering-Algorithmus eine völlig neue Möglichkeit, die SGN-Zelldichte innerhalb des Rosenthal-Kanals zu betrachten und zu quantifizieren und den alterungsbedingten Zellverlust zu charakterisieren (Abbildung 12).
TSLIM ist eine frühe8-Entwicklung eines Lichtblattmikroskops, das von der Arbeit von Voie und Kollegen 4,5 inspiriert wurde. Spezifikationen für die Konstruktion von TSLIM wurden in das Papier von Santi et al.8 aufgenommen. Tatsächlich gaben Brown et al.15 an, dass sie ein ähnliches Lichtblattmikroskop für die Abbildung der Cochlea auf der Grundlage des TSLIM-Designs konstruiert haben. Wie in der Einleitung erwähnt und von Santi7 besprochen, war die Entwicklung anderer Lichtblattmikroskope (z. B. SPIM) auf die Untersuchung der Entwicklung lebender Zellen ausgerichtet und erzielte eine bessere Auflösung durch Eintauchen von Objektiven mit hohem N.A. in die Probenkammer, was kleine Arbeitsabstände erforderte und für die Abbildung ganzer Cochleae ungeeignet ist. Die kommerzielle Entwicklung von Lichtblattmikroskopen geht weiter, und diese Art der Bildgebung ist äußerst nützlich für die Herstellung gut ausgerichteter, serieller Schnitte von Geweben und Tieren, die durch chemische Reinigungsmethoden transparent gemacht werden.
Für jede Lichtblattmikroskop-Anwendung ist es wichtig, dass die Probe transparent gemacht wird, um Lichtstreuung und -absorption zu verhindern. Die Entkalkung ist der erste Schritt im Prozess, um Kalzium aus der Cochlea zu entfernen, um Transparenz zu schaffen. Wenn EDTA vor der Dehydratisierung nicht vollständig aus dem Gewebe gespült wird, fällt es im Gewebe aus und eine gute Bildgebung ist nicht möglich. Die Dehydratisierung durch Ethanol ist für die Infiltration der Spalteholz-Clearinglösung notwendig. Wenn eine Probe stark pigmentiert ist, kann das Bleichen des Pigments dazu beitragen, die Probe transparenter zu machen. Es gibt viele andere Chemikalien und Methoden, die verwendet werden können, um eine Probe transparent zu machen, und Benutzer möchten möglicherweise verschiedene Methoden ausprobieren, um festzustellen, welche Methode für ihre Probe am besten geeignet ist. Obwohl die Lichtblattmikroskopie 2D-Bilder von Gewebe erzeugt, ist ihre Auflösung nicht so groß wie bei dünnen mechanischen Schnitten von Gewebe (insbesondere Kunststoffschnitten) und Hellfeldmikroskopie. Sein Hauptvorteil besteht darin, gut ausgerichtete, serielle Gewebeschnitte für die 3D-Rekonstruktion von Strukturen herzustellen.
Die beiden Mäuse Cochleae, die wir als Beispiele für den altersbedingten SGN-Verlust zeigen, zeigen den altersbedingten Verlust von Neuronen. Ein unerwarteter Befund war der Verlust von SGNs in den mittleren und apikalen Enden der Cochlea und nicht ein basaler Verlust, der einem Verlust von Haarzellen in der Basis entsprechen würde. Wir haben jedoch nicht den Verlust von Haarzellen in diesen Cochleae untersucht, und die beiden Proben sind nur Beispiele und keine Untersuchung der Alterungseffekte auf SGNs. In einer Arbeit von White et al.16 beschrieben sie den SGN-Verlust bei 18 Monate alten C57-Mäusen, bestimmten jedoch nicht die Verteilung des Verlustes entlang der Länge des Rosenthal-Kanals. In einer anderen Arbeit von Grierson et al.17 beschrieben sie anhand von Mäusen im Alter von 24 bis 28 Monaten eine massive Degeneration von OHC-Eferenzen, insbesondere in der apikalen Hälfte der Cochlea, wo es auch zu einem signifikanten Verlust von OHCs kam. In der Tat birgt die Zukunft viele Möglichkeiten, neue Daten zu extrahieren und ein besseres Verständnis der pathologischen Prozesse innerhalb der Cochlea aufgrund von Alterung und anderen Beleidigungen zu erlangen. Darüber hinaus wurden Cochlea-Bildstapel vielen anderen Forschern zur Verfügung gestellt, und es wird interessant sein zu sehen, wie diese Forscher Daten auswerten, um ihre Forschungsfragen zu beantworten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Taubheit und andere Kommunikationsstörungen der National Institutes of Health, der Kellogg Foundation und private Spenden von Bridget Sperl und John McCormick unterstützt. TSLIM wurde unter der hervorragenden Unterstützung von Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg und Julian Wuester von der Technischen Universität Illmenau unter der Leitung ihrer Mentoren (Stefan Sinzinger und Rene Theska) und James Leger entwickelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
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