Summary
Um microscópio fotográfico foi desenvolvido para obter imagens e digitalizar a cóclea inteira.
Abstract
A surdez é a deficiência sensorial mais comum, afetando aproximadamente 5% ou 430 milhões de pessoas no mundo, de acordo com a Organização Mundial da Saúde1. O envelhecimento ou presbiacusia é uma causa primária de perda auditiva neurossensorial e é caracterizada por danos às células ciliadas, neurônios do gânglio espiral (GNG) e estria vascular. Essas estruturas residem dentro da cóclea, que tem uma anatomia complexa em forma de espiral de tecidos membranosos suspensos em fluido e circundados por osso. Essas propriedades dificultam tecnicamente a investigação e quantificação das alterações histopatológicas. Para suprir essa necessidade, desenvolvemos um microscópio fotográfico (TSLIM) que pode obter imagens e digitalizar toda a cóclea para facilitar o estudo das relações estrutura-função na orelha interna. Seções seriais bem alinhadas de toda a cóclea resultam em uma pilha de imagens para renderização de volume tridimensional (3D) e segmentação de estruturas individuais para visualização 3D e análise quantitativa (ou seja, comprimento, largura, superfície, volume e número). As cócleas requerem etapas mínimas de processamento (fixação, descalcificação, desidratação, coloração e clareamento óptico), todas compatíveis com imagens subsequentes de alta resolução por microscopia eletrônica de varredura e transmissão. Uma vez que todos os tecidos estão presentes nas pilhas, cada estrutura pode ser avaliada individualmente ou em relação a outras estruturas. Além disso, como a imagem utiliza sondas fluorescentes, a imunohistoquímica e a ligação de ligantes podem ser usadas para identificar estruturas específicas e seu volume ou distribuição 3D dentro da cóclea. Aqui usamos TSLIM para examinar cócleas de camundongos idosos para quantificar a perda de células ciliadas e neurônios do gânglio espiral. Além disso, análises avançadas (por exemplo, análise de agrupamento) foram usadas para visualizar reduções locais de neurônios do gânglio espiral no canal de Rosenthal ao longo de seu volume 3D. Essas abordagens demonstram a capacidade da microscopia TSLIM de quantificar as relações estrutura-função dentro e entre as cócleas.
Introduction
A cóclea é o órgão sensorial periférico para a audição em mamíferos. Tem uma anatomia espiral complexa de células sensoriais e de suporte repetidas que são anatomicamente especializadas para detectar vibrações sonoras e transmiti-las ao cérebro para a percepção da audição. Os principais elementos sensoriais são as células ciliadas internas e externas e suas fibras nervosas inervantes, cujos corpos celulares compõem o gânglio espiral, que reside dentro do canal de Rosenthal (Figura 1). Essas estruturas sensoriais e neurais são dispostas tonotopicamente de tal forma que sons de alta frequência são transduzidos na base da cóclea e sons de baixa frequência são transduzidos no ápice da cóclea2. Um mapa anatômico da distribuição dessas células sensoriais ao longo do comprimento espiral da membrana basilar de suporte é chamado de citococleograma3 e pode ser comparado com a perda auditiva em função da frequência retratada em um audiograma.
O labirinto membranoso da cóclea, que é circundado por osso denso, torna tecnicamente difícil examinar mais de uma estrutura coclear ao mesmo tempo. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz é produzir cortes seriados bem alinhados da cóclea completa para que todas as estruturas cocleares possam ser examinadas em relação umas às outras em reconstruções 3D. Voie et al.4 e Voie e Spelman5 projetaram o primeiro microscópio de folha de luz, chamado microscópio de corte óptico de fluorescência no plano ortogonal (OPFOS), para seccionar opticamente toda a cóclea. No entanto, este microscópio nunca foi desenvolvido comercialmente; assim, nosso objetivo foi construir um microscópio de folha de luz chamado microscópio de imagem a laser de folha fina (TSLIM; Gráfico 2). Os detalhes de projeto e construção do TSLIM foram publicados anteriormente8. TSLIM fez várias melhorias sobre o OPFOS, incluindo o uso de uma câmera digital de baixa luz versus uma câmera CCD para coleta de imagens, microposicionadores codificados opticamente para movimento preciso e reprodutível do espécime através da folha de luz, uso de uma câmara de amostra opticamente clara disponível comercialmente e coloração de rodamina em etanol em vez de na solução de limpeza para evitar a precipitação de manchas dentro do tecido. O desenvolvimento comercial de microscópios fotográficos, como o SPIM6, tem se concentrado em imagens de alta resolução de espécimes vivos e transparentes pequenos, mas não são adequados para imagens cocleares inteiras por não terem distância de trabalho adequada. Uma revisão do desenvolvimento de outros microscópios de folha de luz foi publicada por Santi7. A principal vantagem do TSLIM sobre outros métodos histológicos para examinar a cóclea é a secção óptica dos tecidos para reconstrução 3D, preservando a integridade do espécime para que possa ser usado por outros métodos histológicos. Outra vantagem da imagem TSLIM é que apenas uma fina folha de luz produzida por um laser é exposta ao tecido, em comparação com a exposição de toda a espessura do tecido ao laser como na microscopia confocal. A limpeza do tecido para minimizar a dispersão da luz e o fato de que apenas uma pequena porção do tecido é exposta ao laser resulta em mínimo desbotamento de fluorocromo (fotoclareamento) com imagens a laser de folha de luz. No entanto, o processo de fixação, desidratação e clareamento altera a morfologia das estruturas cocleares e resulta em encolhimento do tecido em comparação com o tecido vivo. A quantidade real de encolhimento tecidual que ocorre não foi determinada.
O TSLIM foi desenvolvido por Shane Johnson e oito estudantes alemães de engenharia óptica (ver Agradecimentos). Os detalhes de construção do TSLIM foram fornecidos por Santi et al.8 e uma versão de varredura (sTSLIM) por Schröter et al.9. O TSLIM funciona como um micrótomo não destrutivo para seccionar opticamente espécimes e como um microscópio para coletar cortes seriados 2D através de toda a largura e espessura da cóclea. O TSLIM pode obter imagens de espécimes pequenos (mm) e grandes (cm) espécimes espessos. As lentes são montadas a ar para permitir longas distâncias de trabalho com objetivas de coleta de 1x e 2x em um microscópio de dissecção. O microscópio de dissecção também possui zoom óptico que permite ao TSLIM resolver estruturas subcelulares e sinápticas nas células. O TSLIM é equipado com um laser azul (473 nm) e verde (532 nm) para iluminação que permite que uma variedade de sondas fluorescentes sejam usadas para geração de imagens. O objetivo do TSLIM é produzir cortes ópticos 2D bem alinhados através de toda a cóclea para uma reconstrução digital completa dos tecidos cocleares. Por ser um método fluorescente, ligantes e imunohistoquímica também podem ser utilizados para identificar estruturas cocleares específicas.
Inicialmente, uma lente cilíndrica foi usada para produzir duas folhas de luz Gaussiana opostas, mas produziu artefatos de imagem de absorção. Devido ao trabalho de Keller et al.10, a lente cilíndrica fixa foi substituída por um espelho galvanômetro de varredura para produzir a folha de luz9. Além disso, como o centro da folha de luz é o mais fino na cintura do feixe, as imagens sTSLIM 2D são produzidas coletando uma composição de colunas de dados do eixo X em toda a largura do espécime (Figura 3). Esse método foi descrito pela primeira vez por Buytaert e Dircks11. O software personalizado TSLIM para conduzir e coletar imagens foi desenvolvido usando um programa gráfico para controle de instrumentos. A folha de luz viaja através do espécime e ilumina um plano fluorescente dentro do tecido. Este plano fluorescente é projetado ortogonalmente através do espécime transparente e é coletado por um microscópio de dissecção. Microposicionadores codificados opticamente permitem varrer através da cintura do feixe no eixo X para coletar uma única imagem 2D composta e, posteriormente, o microposicionador do eixo Z move o espécime para um plano mais profundo dentro do tecido para obter uma pilha de imagens 2D seriais seccionadas (Vídeo 1, Figura 4). Uma pilha de imagens translacionais é coletada em toda a largura, espessura e comprimento da cóclea, não sendo necessária a costura das imagens (Vídeo 2). A pilha de imagens é transferida para outro computador e carregada em um programa de renderização 3D para reconstrução e quantificação 3D. As pilhas de imagens contêm todas as informações digitais sobre a morfologia de uma cóclea na resolução do microscópio. No entanto, se uma resolução maior for necessária, a cóclea intacta pode ser processada por métodos histológicos destrutivos, como secção em micrótomos, varredura e microscopia eletrônica de transmissão.
O programa de renderização 3D é usado para segmentar diferentes estruturas cocleares para renderização 3D e análise quantitativa. Para segmentação, cada estrutura em cada imagem 2D da pilha é rastreada usando uma cor diferente por uma mesa gráfica e caneta (Figura 5). Até o momento, 20 diferentes estruturas cocleares foram segmentadas (Figura 6). Após a segmentação, uma variedade de análises 3D pode ser realizada. Por exemplo, o software de renderização 3D pode ressecção virtualmente da cóclea em qualquer plano ao longo do centroide da estrutura. O vídeo 3 mostra a secção tangencial ao órgão de Corti, que revela as células ciliadas ao longo do comprimento da membrana basilar. Esse processo requer primeiramente a segmentação manual da estrutura de interesse. Em seguida, o centroide da estrutura é calculado com base no ajuste dos mínimos quadrados dos pontos spline colocados ao longo do centro da estrutura desde sua base até seu ápice, permitindo assim uma aproximação do comprimento da estrutura (Vídeo 4). Um processo semelhante chamado esqueletonização pode ser usado para visualizar a largura radial da estrutura ao longo de seu comprimento usando um mapa colorido (Vídeo 4). O volume total de cada estrutura é calculado pelo programa após a segmentação, mas as distâncias relativas também podem ser quantificadas e visualizadas com mapas coloridos em um software de renderização 3D (Figura 7). Estruturas segmentadas também podem ser exportadas para produzir renderizações ampliadas de modelos de plástico sólido (Figura 8). Além disso, a contagem semi-automatizada de células também pode ser realizada usando um software de renderização 3D (Figura 9). A imuno-histoquímica e a ligação ao ligante podem ser usadas para corar estruturas cocleares específicas e estas estruturas podem ser isoladas de outras estruturas cocleares para avaliação morfométrica, como a confecção de um citococleograma (Figura 10). O comprimento, a largura, a superfície, o volume e o número de todas as estruturas cocleares podem ser determinados a partir dos modelos 3D, tornando esta abordagem ideal para mapear os danos cocleares e os comprometimentos funcionais. Especificamente, danos cocleares devido ao envelhecimento, trauma induzido por ruído ou outros insultos podem ser mostrados e quantificados em reconstruções cocleares 3D a partir de cortes ópticos 2D. Uma vez que a cóclea foi digitalizada, existem inúmeros algoritmos de imagem que podem ser usados para avaliar o dano coclear de qualquer tecido dentro da cóclea no registro anatômico para outros tecidos cocleares.
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Protocol
Todos os procedimentos e o uso de animais vivos foram revisados e aprovados (ID do Protocolo #2010-38573A) pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Universidade de Minnesota (IACUC) e os pesquisadores que usam esses animais foram exaustivamente treinados e testados pelos Veterinários de Recursos Animais de Pesquisa (RAR) antes de terem acesso às instalações para animais. Camundongos machos e fêmeas foram utilizados neste estudo.
1. Remoção da cóclea para fixação e processamento tecidual para aquisição de imagens
- Eutanásia de camundongos usando inalação de CO2 . Decapitar o camundongo com tesoura e fazer uma incisão dorso-ventral através do cérebro para hemissectar o crânio. Remova o cérebro, identifique a bula redonda na parte baso-ventral do crânio, abra a bula com rongeurs e visualize e remova a cóclea.
- Fixação: Realizar este procedimento sob exaustor e com microscópio de dissecção em aumento de 5x. Use luvas e roupas de proteção. Punture a janela oval e remova o estribo com uma picareta afiada. Insira um palito na janela redonda para perfurar a membrana.
- Cubra a janela redonda aberta com a ponta cortada de um conjunto de perfusão ligado a uma seringa de 1 ml preenchida com 2 ml de formalina. Infundir lentamente formalina através dos espaços perilinfáticos da cóclea durante um período de 2 minutos, observando que a formalina está saindo da cóclea através da janela oval aberta. Corte o excesso de tecido da cóclea e mergulhe em um frasco contendo 10% de formalina e coloque em um rotador durante a noite.
- Descalcificação: Enxaguar a cóclea em PBS 3x por 5 min cada e imergir em frasco contendo solução a 10% de ácido etilenodiaminotetracético dissódico (EDTA) com rotação por 4 dias, trocando a solução diariamente.
- Desidratação: Perfundir a cóclea com PBS 3x e imergir por 15 min entre as trocas. Desidratar a cóclea com concentrações crescentes de etanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; por 30 min em cada concentração.
NOTA: É importante remover todo o EDTA antes da desidratação, pois o EDTA precipita em etanol. Além disso, as cócleas podem ser deixadas em qualquer concentração de etanol superior a 70% durante a noite. - Coloração: Manchar toda a cóclea por imersão em uma solução de isotiocinato de Rodamina B (5 μg/mL em etanol 100%) durante a noite com rotação. Retirar o excesso de corante da cóclea com duas trocas de etanol 100%, 5 min cada troca.
- Clearing: Transferir a cóclea corada para duas trocas de solução de Spalteholz12 (salicilato de metilo 5:3:3:benzoato de benzila), 30 min cada troca e deixar durante a noite na solução de limpeza com rotação. As cócleas podem ser deixadas em solução de Spalteholz indefinidamente.
2. Imagem das cócleas
- Fixar as cócleas a uma haste de espécime na extremidade da membrana da janela oval e redonda para que a solução de clareamento permaneça dentro da cóclea e não se formem bolhas (Figura 2). Deve-se tomar cuidado para não deixar bolhas se formarem dentro da cóclea, pois são difíceis de remover e, se deixadas no tecido, causarão artefatos de imagem.
- Utilizar cola ativadora de UV para fixar a cóclea úmida à haste seca da amostra (Figura 2). Fixe a cóclea nas extremidades oval e redonda da janela. Cure a cola UV por 10 s movendo-se ao redor da cóclea com a luz UV.
NOTA: Uma fixação solta da cóclea à haste da amostra resultará em defeitos de imagem. Esta haste é fabricada especificamente para este protocolo (ver Santi et al.8 para detalhes) e é específica para o nosso microscópio de folha de luz. - Suspender a cóclea na câmara de imagem preenchida com solução de Spalteholz para aquisição de imagens. A câmara do espécime é uma célula de fluorômetro de quartzo opticamente transparente (Vídeo 1).
- Fixe a haste da amostra a um suporte rotativo que também está ligado ao estágio de translação XZ. A maioria das pilhas é obtida traduzindo o espécime nos planos XZ, mas pilhas rotacionais também podem ser obtidas.
- Secção óptica TSLIM: Use um laser azul ou verde para excitação, dependendo do tipo de coloração de fluorocromo. Posicione a folha de luz no meio do tecido para focalização e determine a ampliação que será usada para iluminar toda a largura da cóclea. Em seguida, use um programa personalizado para mover o espécime através da folha de luz através do espécime no eixo X (costurando a imagem) e em passos Z para fazer uma pilha de imagens 2D em toda a cóclea.
- Para a primeira imagem, a cintura do feixe da folha de luz é posicionada na borda do espécime e o programa varre toda a largura do espécime coletando colunas de dados (ver costura da imagem; Santi et al.8) que são a largura do parâmetro confocal (Figura 3) para produzir uma imagem 2D composta de máxima resolução em toda a largura do espécime. O programa automatiza a costura de imagens para cada passo Z até que o espécime seja completamente fotografado.
- Processamento de imagem: Transfira a pilha de imagens para outro computador e carregue-a em um programa de renderização 3D para reconstrução e quantificação 3D.
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Representative Results
Como o tema deste número especial é a imagem dos efeitos do envelhecimento na cóclea, uma cóclea jovem (camundongo HS2479, cepa CBA) e envelhecida (camundongo HS2521, cepa C57 de 23 meses) será usada como exemplo. Deve-se notar que o TSLIM é capaz de obter imagens de uma variedade de espécimes, incluindo cócleas de humanos, mamíferos, outros roedores e peixes, bem como outros órgãos, como o cérebro.
Johnson e col. 13 publicaram um artigo sobre SGNs em camundongos CBA jovens (3 semanas de idade) usando TSLIM. Todos os NSGs foram contados em cinco camundongos e houve uma variação de 8.408-8.912 SGNs com um comprimento médio de Rosenthal de 2,0 mm. No presente estudo, contamos os NSGs em um camundongo CBA com 3 meses de idade que continha 7.913 SGNs em um comprimento de canal de Rosenthal de 2,0 mm. O rato C57BL6 de 23 meses continha 6.521 SGN com um comprimento de Rosenthal de 2,11 mm. Uma renderização de volume mostra todos os SGNs em ambas as cócleas, mas a perda de SGN não foi revelada no mouse mais velho. No entanto, a contagem de células SGN em função da distância do canal de Rosenthal, representada em um gráfico linear, mostrou maiores SGNs no animal mais jovem nas extremidades média e apical da cóclea em comparação com o animal mais velho (Figura 11). Essa aparente perda de SGNs foi posteriormente visualizada usando a análise de cluster em um software de renderização 3D. Aqui, as diferenças de densidade do SGN foram descritas em uma escala de cores onde os aglomerados de alta densidade são amarelos e o azul representa regiões de menor densidade (Figura 12). Embora não seja possível identificar células específicas que foram perdidas, a análise de agrupamento visualiza claramente regiões de menor densidade celular ao longo do comprimento do canal de Rosenthal (Figura 12).
Figura 1: Renderização direta do volume de uma cóclea. Figura composta a partir de uma renderização volumétrica de uma cóclea de camundongo mostrando as janelas oval (O) e redonda (R), órgão de Corti com células ciliadas (linha azul, OC) e canal de Rosenthal que foi segmentado e volume renderizado que contém neurônios do gânglio espiral (SGNs). Bar = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Suporte do espécime. Um protótipo de madeira de um porta-espécime personalizado para fixação da cóclea (ponta de seta) a uma haste de amostra (seta) usando cola ativada por UV, mantendo a solução de limpeza dentro da cóclea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Seção transversal da folha de luz. Uma seção transversal através de uma folha de luz escaneada no eixo X mostrando a cintura do feixe no meio da folha de luz e o parâmetro confocal (CP), que é uma região onde a espessura do feixe é relativamente constante. A renderização sólida superior mostra a largura do feixe sem varredura e a renderização sólida inferior mostra a largura do feixe escaneado que permanece fino em toda a largura da cóclea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Corte transversal 2D médio-modiolar através de uma cóclea de camundongo. Quatro espiros cocleares são seccionados. A volta basal do canal de Rosenthal pode ser vista contendo neurônios ganglionares espirais em forma esférica. Barra = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Duas seções transversais da cóclea. À esquerda está uma seção transversal 2D e à direita é a mesma seção com várias estruturas que foram segmentadas usando traçados de cores diferentes. Bar = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Estruturas cocleares segmentadas. (A) Esta figura mostra uma cóclea segmentada com a cápsula ótica circundante. (B-K) Estes mostram várias estruturas cocleares diferentes que foram segmentadas e os centroides (linha branca) são determinados para a maioria das estruturas. As estruturas cocleares foram segmentadas com diferentes cores para sua identificação: (A) figura composta com osso (branco), (B) turquesa (ligamento espiral), (C) marrom (estria vascular), (D) amarelo (membrana basilar), (E) vermelho (órgão de Corti), (F) amarelo-verde (canal de Rosenthal), (G) azul (escala timpânica), ouro (platina do estribo), (H) branco (escala média), verde (ductus reuniens), (I) vermelho (scala vestibuli), roxo (membrana da janela redonda), ouro (aqueduto coclear), (J) verde (membrana tectória), (K) roxo (limbo espiral). Barra = 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Comparação da mesma estrutura coclear em duas cócleas diferentes. Usando o método Procrustus em software de renderização 3D, os meios Scala de dois camundongos diferentes foram comparados. O painel esquerdo mostra o ajuste de um ajuste de mínimos quadrados de duas estruturas e o painel direito mostra suas diferenças quantitativas usando um mapa colorido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Modelo plástico 3D sólido da cóclea. O painel esquerdo mostra a escala timpânica de uma cóclea de camundongo com membrana basilar, órgão de Corti e helicotrema segmentada. O painel direito mostra um modelo plástico sólido das estruturas à esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Contagem de neurônios do gânglio espiral. Os GNGs foram identificados e marcados pelo software de renderização 3D em uma seção transversal da mídia Scala da cóclea do rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Marcação imunoistoquímica das células ciliadas externas. Anticorpos anti-prestin e anticorpos secundários fluorescentes que foram perfundidos através da escala perilinfática de uma cóclea de camundongo marcaram todas as células ciliadas externas que foram renderizadas em volume usando software de renderização 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Densidade dos SGNs ao longo do comprimento do canal de Rosenthal. A maior perda de SGNs parece estar nas extremidades média e apical do canal de Rosenthal no camundongo de 23 meses de idade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Análise de agrupamento da densidade celular SGN. O painel esquerdo mostra uma análise de cluster de SGNs em um camundongo com 3 meses de idade com audição normal. Um mapa colorido mostra que a maior densidade de células dentro de um aglomerado de um determinado tamanho está no canal de Rosenthal médio, onde os limiares auditivos de camundongos são mais baixos. O painel da direita mostra a perda de SGNs em todo o canal de Rosenthal, com a maior perda de SGNs no meio do canal de Rosenthal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Vídeo de varredura do eixo X da cóclea. Varredura do eixo X do espécime através da folha de luz mostrando a cóclea suspensa pela haste do espécime na solução de limpeza que está contida dentro de uma câmara de vidro. Uma seção transversal fluorescente 2D ortogonal da cóclea é mostrada devido à iluminação pela folha de luz. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Pilha de seções seriais da cóclea. Uma pequena pilha de seções transversais 2D é obtida por varredura no eixo X e passos Z de 10 μm através da cóclea. Observe a presença de linhas horizontais em toda a pilha, que são artefatos de absorção devido ao uso de uma lente cilíndrica para produzir a folha de luz. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 3: Ressecção de uma cóclea em um plano diferente. Uma pilha carregada no programa de renderização 3D e ressecção virtual em um plano tangencial ao órgão de Corti mostrando as células ciliadas ao longo do comprimento da membrana basilar. Este vídeo foi modificado de8. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 4: Esqueleto da mídia Scala. O painel esquerdo mostra o cálculo do centroide dentro da escala média de uma cóclea de camundongo. O painel direito mostra um mapa colorido das dimensões radiais da mídia Scala ao longo de seu comprimento. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O corte óptico por microscopia óptica para exame das estruturas cocleares não é mecanicamente destrutivo como outros métodos histológicos mais tradicionais, e fornece uma visão digital completa das estruturas cocleares em relação umas às outras. Métodos anteriores, como preparações superficiais do órgão deCorti14 , forneceram um mapa da perda de células ciliadas ao longo do comprimento da membrana basilar, mas a perda de SGN não pôde ser avaliada, uma vez que o tecido havia sido dissecado para revelar o órgão de Corti. Alternativamente, seções do micrótomo médio-modoilar da cóclea fornecem apenas uma amostra muito pequena da condição dos SGNs em toda a extensão do canal de Rosenthal. Com o TSLIM, todas as estruturas cocleares são digitalizadas no nível da resolução do instrumento (ou seja, subcelular). Pilhas completas de imagens da cóclea permitem a quantificação e visualização de múltiplas estruturas cocleares, que são mostradas aqui, que não puderam ser obtidas pelos métodos histológicos tradicionais. Por exemplo, usando um algoritmo de agrupamento, a presente investigação mostrou uma maneira completamente nova de visualizar e quantificar a densidade celular SGN dentro do canal de Rosenthal e caracterizar a perda celular devido ao envelhecimento (Figura 12).
TSLIM é um dos primeiros8 desenvolvimentos de um microscópio de folha de luz que foi inspirado no trabalho de Voie e colaboradores 4,5. As especificações para a construção do TSLIM foram incluídas no artigo de Santi et al.8. De fato, Brown et al.15 afirmaram que construíram um microscópio de folha de luz semelhante para obtenção de imagens da cóclea com base no design do TSLIM. Como mencionado na Introdução e revisado por Santi7, o desenvolvimento de outros microscópios de folha de luz (por exemplo, SPIM) foi direcionado para investigar o desenvolvimento de células vivas e ganhou melhor resolução pela imersão de objetivas de alta N.A. dentro da câmara do espécime, o que exigiu pequenas distâncias de trabalho e é inadequado para obtenção de imagens de cócleas inteiras. O desenvolvimento comercial de microscópios de folha de luz continua, e esse tipo de imagem é extremamente útil para preparar seções seriadas bem alinhadas de tecidos e animais tornados transparentes por métodos de limpeza química.
Para qualquer aplicação de microscópio de folha de luz, é fundamental que o espécime seja tornado transparente para evitar a dispersão e absorção de luz. A descalcificação é o primeiro passo no processo de remoção de cálcio da cóclea para transparência. Se o EDTA não for enxaguado completamente para fora do tecido antes da desidratação, ele se precipitará dentro do tecido e uma boa imagem não será possível. A desidratação por etanol é necessária para a infiltração da solução de limpeza de Spalteholz. Se um espécime é fortemente pigmentado, então o clareamento do pigmento pode ajudar a tornar o espécime mais transparente. Existem muitos outros produtos químicos e métodos que podem ser usados para tornar um espécime transparente e os usuários podem querer tentar diferentes métodos para determinar qual método é mais adequado para seu espécime. Embora a microscopia de folha de luz produza imagens 2D de tecido, sua resolução não é tão grande quanto pode ser obtida a partir de cortes mecânicos finos de tecido (especialmente cortes plásticos) e microscopia de campo claro. Sua principal vantagem é produzir cortes de tecido bem alinhados, seriados, para reconstrução 3D de estruturas.
As duas cócleas de camundongos que mostramos como exemplos de perda de SGN devido ao envelhecimento revelam perda de neurônios devido ao envelhecimento. Um achado inesperado foi a perda de NSG nas extremidades média e apical da cóclea, ao invés de uma perda basal que corresponderia a uma perda de células ciliadas na base. No entanto, não avaliamos a perda de células ciliadas nessas cócleas e as duas amostras são apenas exemplos e não uma investigação dos efeitos do envelhecimento sobre os NSG. Em um artigo de White et al.16, eles descreveram a perda de SGN em camundongos C57 de 18 meses de idade, mas não determinaram a distribuição da perda ao longo do comprimento do canal de Rosenthal. Em outro trabalho de Grierson et al.17, utilizando camundongos de 24-28 meses de idade, descreveram degeneração maciça das CCE eferentes, especialmente na metade apical da cóclea, onde também houve perda significativa das CCE. De fato, o futuro reserva muitas possibilidades para extrair novos dados e obter uma melhor compreensão dos processos patológicos dentro da cóclea devido ao envelhecimento e outros insultos. Além disso, pilhas de imagens cocleares foram fornecidas a muitos outros pesquisadores e será interessante ver como esses pesquisadores extraem dados para responder às suas perguntas de pesquisa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação dos Institutos Nacionais de Saúde, da Fundação Kellogg e doações privadas de Bridget Sperl e John McCormick. O TSLIM foi desenvolvido com a excelente assistência de Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg e Julian Wuester da Universidade Técnica de Illmenau, Alemanha, sob supervisão de seus mentores (Stefan Sinzinger e Rene Theska) e James Leger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
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