Summary
Et lysarkmikroskop blev udviklet til at afbilde og digitalisere hele cochlea.
Abstract
Døvhed er den mest almindelige sensoriske svækkelse, der påvirker ca. 5% eller 430 millioner mennesker verden over ifølge Verdenssundhedsorganisationen1. Aldring eller presbycusis er en primær årsag til sensorineuralt høretab og er karakteriseret ved skader på hårceller, spiralganglionneuroner (SGN'er) og stria vascularis. Disse strukturer befinder sig i cochlea, som har en kompleks, spiralformet anatomi af membranøst væv suspenderet i væske og omgivet af knogler. Disse egenskaber gør det teknisk vanskeligt at undersøge og kvantificere histopatologiske ændringer. For at imødekomme dette behov udviklede vi et lysarkmikroskop (TSLIM), der kan afbilde og digitalisere hele cochlea for at lette studiet af struktur-funktionsforhold i det indre øre. Veljusterede serielle sektioner af hele cochlea resulterer i en stak billeder til tredimensionel (3D) volumengengivelse og segmentering af individuelle strukturer til 3D-visualisering og kvantitativ analyse (dvs. længde, bredde, overflade, volumen og tal). Cochleae kræver minimale behandlingstrin (fiksering, afkalkning, dehydrering, farvning og optisk clearing), som alle er kompatible med efterfølgende billeddannelse i høj opløsning ved scanning og transmissionselektronmikroskopi. Da alle væv er til stede i stakkene, kan hver struktur vurderes individuelt eller i forhold til andre strukturer. Da billeddannelse desuden bruger fluorescerende sonder, kan immunhistokemi og ligandbinding bruges til at identificere specifikke strukturer og deres 3D-volumen eller fordeling inden for cochlea. Her brugte vi TSLIM til at undersøge cochleae fra ældre mus for at kvantificere tabet af hårceller og spiralganglionneuroner. Derudover blev avancerede analyser (f.eks. Klyngeanalyse) brugt til at visualisere lokale reduktioner af spiralganglionneuroner i Rosenthals kanal langs dens 3D-volumen. Disse tilgange demonstrerer TSLIM-mikroskopiens evne til at kvantificere struktur-funktionsforhold inden for og mellem cochleae.
Introduction
Cochlea er det perifere sensoriske organ til hørelse hos pattedyr. Det har en kompleks spiralanatomi af gentagne sensoriske og understøttende celler, der er anatomisk specialiserede til at detektere lydvibrationer og overføre dem til hjernen for opfattelsen af hørelse. De vigtigste sensoriske elementer er de indre og ydre hårceller og deres inderverende nervefibre, hvis cellekroppe udgør spiralganglionen, som ligger inden for Rosenthals kanal (figur 1). Disse sensoriske og neurale strukturer er tonotopisk arrangeret således, at højfrekvente lyde transduceres i cochlear basen og lavfrekvente lyde transduceres i cochlea apex2. Et anatomisk kort over denne sensoriske cellefordeling langs spirallængden af den understøttende basilarmembran kaldes et cytocochleogram3 og kan sammenlignes med høretab som funktion af frekvens som afbildet i et audiogram.
Cochleas membranlabyrint, som er omgivet af tætte knogler, gør det teknisk vanskeligt at undersøge mere end én cochlear struktur ad gangen. Derfor er begrundelsen for at udvikle et lysarkmikroskop at producere veljusterede serielle sektioner af den komplette cochlea, så alle cochlearstrukturer kan undersøges i forhold til hinanden i 3D-rekonstruktioner. Voie et al.4 og Voie og Spelman5 designede det første lysarkmikroskop, kaldet ortogonalt plan fluorescens optisk sektionering (OPFOS) mikroskop, til optisk at sektionere hele cochlea. Dette mikroskop blev imidlertid aldrig kommercielt udviklet; så vores mål var at konstruere et lysarkmikroskop kaldet et tyndt ark laserbilleddannelsesmikroskop (TSLIM; Figur 2). Design- og konstruktionsdetaljerne for TSLIM er tidligere blevet offentliggjort8. TSLIM foretog flere forbedringer i forhold til OPFOS, herunder brug af et digitalt kamera i svagt lys versus et CCD-kamera til billedindsamling, optisk kodede mikropositionere til nøjagtig og reproducerbar bevægelse af prøven gennem lysarket, brug af et kommercielt tilgængeligt, optisk klart prøvekammer og Rhodaminfarvning i ethanol snarere end i clearingopløsningen for at forhindre pletudfældning i vævet. Kommerciel udvikling af lysarkmikroskoper som SPIM6 har fokuseret på højopløsningsbilleddannelse af levende, små gennemsigtige prøver, men er uegnede til hele cochlear-billeddannelse, da de mangler tilstrækkelig arbejdsafstand. En gennemgang af udviklingen af andre lysarkmikroskoper blev offentliggjort af Santi7. TSLIMs primære fordel i forhold til andre histologiske metoder til undersøgelse af cochlea er optisk at sektionere væv til 3D-rekonstruktion, samtidig med at prøvens integritet bevares, så den kan bruges ved andre histologiske metoder. En anden fordel ved TSLIM-billeddannelse er, at kun et tyndt lysark produceret af en laser udsættes for vævet sammenlignet med eksponering for hele vævstykkelsen for laseren som ved konfokal mikroskopi. Vævsrydning for at minimere lysspredning og det faktum, at kun en lille del af vævet udsættes for laseren, resulterer i minimal fluorkromfading (fotoblegning) med lyspladelaserbilleddannelse. Imidlertid ændrer processen med fiksering, dehydrering og rydning morfologien af cochlear strukturer og resulterer i vævskrympning sammenlignet med levende væv. Den faktiske mængde vævskrympning, der opstår, blev ikke bestemt.
TSLIM blev udviklet af Shane Johnson og otte tyske optiske ingeniørstuderende (se anerkendelser). TSLIM konstruktionsdetaljer blev leveret af Santi et al.8 og en scanningsversion (sTSLIM) af Schröter et al.9. TSLIM fungerer som et ikke-destruktivt mikrotomt til optisk sektionsprøver og som et mikroskop til at indsamle 2D-serielle sektioner gennem cochleas fulde bredde og tykkelse. TSLIM kan afbilde både små (mm) og store (cm), tykke prøver. Linser er luftmonteret for at give mulighed for lange arbejdsafstande med opsamlingsmål på 1x og 2x på et dissektionsmikroskop. Dissektionsmikroskopet har også zoomoptik, der gør det muligt for TSLIM at løse subcellulære og synaptiske strukturer på celler. TSLIM er udstyret med både en blå (473 nm) og grøn (532 nm) laser til belysning, der gør det muligt at bruge en række fluorescerende sonder til billeddannelse. Målet med TSLIM er at producere veljusterede optiske 2D-sektioner gennem en hel cochlea for en komplet digital rekonstruktion af cochlear væv. Da det er en fluorescerende metode, kan ligander og immunhistokemi også bruges til at identificere specifikke cochleære strukturer.
Oprindeligt blev en cylindrisk linse brugt til at producere to modsatte gaussiske lysark, men det producerede absorptionsbilleddannelsesartefakter. På grund af Keller et al.10's arbejde blev den faste cylindriske linse erstattet af et scanningsgalvanometerspejl for at producere lysarket9. Da midten af lysarket desuden er tyndest ved stråletaljen, produceres sTSLIM 2D-billeder ved at indsamle en sammensætning af X-aksekolonner med data over prøvens bredde (figur 3). Denne metode blev først beskrevet af Buytaert og Dircks11. TSLIM brugerdefineret software til at drive og indsamle billeder blev udviklet ved hjælp af et grafisk program til instrumentstyring. Lysarket bevæger sig gennem prøven og belyser et fluorescerende plan i vævet. Dette fluorescerende plan projiceres ortogonalt gennem den gennemsigtige prøve og opsamles af et dissektionsmikroskop. Optisk kodede mikropositionere tillader scanning gennem stråletaljen i X-aksen for at indsamle et enkelt sammensat 2D-billede, og derefter flytter Z-aksemikropositionen prøven til et dybere plan i vævet for at opnå en stak seriale, snittede 2D-billeder (Video 1, figur 4). Der indsamles en stak translationelle billeder gennem hele bredden, tykkelsen og længden af cochlea, og syning af billeder er ikke påkrævet (video 2). Billedstakken overføres til en anden computer og indlæses i et 3D-gengivelsesprogram til 3D-rekonstruktion og kvantificering. Billedstablerne indeholder alle de digitale oplysninger om en cochleas morfologi ved mikroskopets opløsning. Men hvis der kræves en højere opløsning, kan den intakte cochlea behandles yderligere ved destruktive histologiske metoder såsom mikrotomsektionering, scanning og transmissionselektronmikroskopi.
3D-gengivelsesprogrammet bruges til at segmentere forskellige cochlear-strukturer til 3D-gengivelse og kvantitativ analyse. Til segmentering spores hver struktur i hvert 2D-billede af stakken ved hjælp af en anden farve af en grafiktablet og pen (figur 5). Til dato er 20 forskellige cochlear strukturer blevet segmenteret (figur 6). Efter segmentering kan der udføres en række 3D-analyser. For eksempel kan 3D-gengivelsessoftware praktisk talt resektionere cochlea i ethvert plan langs strukturens centroid. Video 3 viser sektionering, der tangerer Corti-organet, som afslører hårcellerne langs basilarmembranens længde. Denne proces kræver først manuel segmentering af strukturen af interesse. Dernæst beregnes strukturens centroid baseret på de mindste kvadraters pasform af splinepunkter placeret langs midten af strukturen fra dens base til dens top, hvilket muliggør en tilnærmelse af strukturens længde (Video 4). En lignende proces kaldet skeletonisering kan bruges til at visualisere strukturens radiale bredde langs dens længde ved hjælp af et farvekort (Video 4). Det samlede volumen af hver struktur beregnes af programmet efter segmentering, men relative afstande kan også kvantificeres og visualiseres med farvekort i en 3D-gengivelsessoftware (figur 7). Segmenterede strukturer kan også eksporteres for at producere forstørrede, solid-plast modelgengivelser (figur 8). Derudover kan halvautomatisk celletælling også udføres ved hjælp af 3D-gengivelsessoftware (figur 9). Immunhistokemi og ligandbinding kan bruges til at plette specifikke cochleære strukturer, og disse strukturer kan isoleres fra andre cochleære strukturer til morfometrisk vurdering, såsom fremstilling af et cytocochleogram (figur 10). Længde, bredde, overflade, volumen og antal af alle cochlear strukturer kan bestemmes ud fra 3D-modellerne, hvilket gør denne tilgang ideel til kortlægning af cochlear skader på funktionsnedsættelser. Specifikt kan cochlearskader på grund af aldring, støjinduceret traume eller andre fornærmelser vises og kvantificeres i 3D-cochlea-rekonstruktioner fra optiske 2D-sektioner. Når en cochlea er blevet digitaliseret, er der adskillige billeddannelsesalgoritmer, der kan bruges til at vurdere cochlear skader på ethvert væv i cochlea i det anatomiske register til andre cochlear væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer og brugen af levende dyr er blevet gennemgået og godkendt (Protocol ID # 2010-38573A) af University of Minnesota Institutional Care and Use Committee (IACUC), og efterforskere, der bruger disse dyr, er blevet grundigt uddannet og testet af Research Animal Resources (RAR) dyrlæger, før de har adgang til dyrefaciliteterne. Både han- og hunmus blev brugt i denne undersøgelse.
1. Cochlea fjernelse til fiksering og vævsbehandling til billeddannelse
- Aflive en mus ved hjælp af CO2 indånding. Halshug musen med en saks og lav et dorsal-ventralt snit gennem hjernen for at halvskære kraniet. Fjern hjernen, identificer den runde bulla i den baso-ventrale del af kraniet, åbn bullaen med rongeurs og visualiser og fjern cochlea.
- Fastgørelse: Udfør denne procedure under en stinkhætte og ved hjælp af et dissektionsmikroskop ved 5x forstørrelse. Brug handsker og beskyttelsesbeklædning. Punktering det ovale vindue og fjern båndene med et skarpt valg. Indsæt et valg i det runde vindue for at punktere membranen.
- Dæk det åbnede, runde vindue med den afskårne spids af et infusionssæt, der er fastgjort til en 1 ml sprøjte fyldt med 2 ml formalin. Tilfør langsomt formalin gennem cochleas perilymfatiske rum over en periode på 2 minutter, idet det bemærkes, at formalin forlader cochlea via det åbne ovale vindue. Trim overskydende væv af cochlea og nedsænk i en flaske, der indeholder 10% formalin, og læg på en rotator natten over.
- Afkalkning: Skyl cochlea i PBS 3x i 5 minutter hver og nedsænk i en flaske indeholdende 10% opløsning af dinatriumethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) med rotation i 4 dage, skift opløsningen dagligt.
- Dehydrering: Perfus cochlea med PBS 3x og nedsænk i 15 minutter mellem skift. Dehydrer cochlea med stigende koncentrationer af ethanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; i 30 minutter i hver koncentration.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne al EDTA før dehydrering, da EDTA udfældes i ethanol. Cochleae kan også efterlades i enhver koncentration af ethanol større end 70% natten over. - Farvning: Plet hele cochlea ved nedsænkning i en opløsning af Rhodamin B-isothiocynat (5 μg/ml i 100% ethanol) natten over med rotation. Fjern overskydende farvestof fra cochlea med to ændringer på 100% ethanol, 5 min hver ændring.
- Rydning: Overfør den farvede cochlea til to ændringer af Spalteholz12-opløsning (5: 3 methylsalicylat: benzylbenzoat), 30 minutter hver ændring og lad natten over i clearingopløsningen med rotation. Cochleae kan efterlades i Spalteholz-opløsning på ubestemt tid.
2. Billeddannelse af cochleae
- Cochleae fastgøres til en prøvestang i den ovale og runde vinduesmembranende, så rydningsopløsningen forbliver inden for cochlea, og der ikke dannes bobler (figur 2). Pas på ikke at lade bobler dannes i cochlea, da de er vanskelige at fjerne, og hvis de efterlades i vævet, vil de forårsage billeddannelsesartefakter.
- Brug en UV-aktiverende lim til at fastgøre den våde cochlea til den tørre prøvestang (figur 2). Fastgør cochlea i de ovale og runde vinduesender. Hærd UV-limen i 10 sekunder ved at bevæge dig rundt om cochlea med UV-lyset.
BEMÆRK: En løs fastgørelse af cochlea til prøvestangen vil resultere i billeddannelsesfejl. Denne stang er specielt fremstillet til denne protokol (se Santi et al.8 for detaljer) og er specifik for vores lysarkmikroskop. - Ophæng cochlea i billeddannelseskammeret fyldt med Spalteholz-opløsning til billeddannelse. Prøvekammeret er en optisk klar kvartsfluorometercelle (video 1).
- Fastgør prøvestangen til en roterende holder, der også er fastgjort til XZ-oversættelsestrinnet. De fleste stakke opnås ved at oversætte prøven i XZ-planerne, men rotationsstakke kan også opnås.
- TSLIM optisk sektionering: Brug en blå eller grøn laser til excitation afhængigt af typen af fluorkromfarvning. Placer lyspladen midt i vævet til fokusering, og bestem den forstørrelse, der skal bruges til at belyse cochleas fulde bredde. Brug derefter et specialdesignet program til at flytte prøven gennem lysarket hen over prøven på X-aksen (syning af billedet) og i Z-trin for at lave en stak 2D-billeder i hele cochlea.
- For det første billede er lysarkets stråletalje placeret i kanten af prøven, og programmet scanner hele bredden af prøven, der indsamler kolonner med data (se billedsyning; Santi et al.8), der er bredden af den konfokale parameter (figur 3) for at producere et sammensat 2D-billede med maksimal opløsning over prøvens bredde. Programmet automatiserer billedsømning for hvert Z-trin, indtil prøven er helt afbildet.
- Billedbehandling: Overfør billedstakken til en anden computer, og indlæs den i et 3D-gengivelsesprogram til 3D-rekonstruktion og kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da temaet for dette særnummer er billeddannelse af virkningerne af ældning i cochlea, vil en ung (3 måneder gammel, HS2479, CBA-stammemus) og alderen (23 måneder gammel, HS2521, C57 stammemus) cochleae blive brugt som eksempler. Det skal bemærkes, at TSLIM er i stand til at afbilde en række prøver, herunder cochleae fra mennesker, pattedyr, andre gnavere og fisk samt andre organer såsom hjernen.
Johnson et al. 13 offentliggjorde en artikel om SGN'er hos unge (3 uger gamle) CBA-mus, der bruger TSLIM. Alle SGN'er blev talt i fem mus, og der var en rækkevidde på 8.408-8.912 SGN'er med en gennemsnitlig Rosenthals længde på 2,0 mm. I denne undersøgelse tællede vi SGN'erne i en 3 måneder gammel CBA-mus, der indeholdt 7.913 SGN'er i en Rosenthals kanallængde på 2,0 mm. Den 23 måneder gamle C57BL6-mus indeholdt 6.521 SGN med en Rosenthals længde på 2,11 mm. En volumengengivelse viser alle SGN'er i begge cochleae, men SGN-tab blev ikke afsløret i den ældre mus. SGN-celletællinger som funktion af Rosenthals kanalafstand, afbildet i et lineært plot, viste imidlertid større SGN'er hos det yngre dyr i de midterste og apikale ender af cochlea sammenlignet med det ældre dyr (figur 11). Dette tilsyneladende tab af SGN'er blev yderligere visualiseret ved hjælp af klyngeanalyse i 3D-gengivelsessoftware. Her blev SGN-tæthedsforskelle afbildet på en farveskala, hvor klynger med høj densitet er gule, og blå repræsenterer regioner med lavere densitet (figur 12). Selvom det ikke er muligt at identificere specifikke celler, der er gået tabt, visualiserer klyngeanalysen tydeligt regioner med lavere celletæthed langs Rosenthals kanal (figur 12).
Figur 1: Direkte volumengengivelse af en cochlea. En sammensat figur fra en volumengengivelse af en musecochlea, der viser de ovale (O) og runde (R) vinduer, Cortis organ med hårceller (blå linje, OC) og Rosenthals kanal, der er blevet segmenteret og volumen gengivet, der indeholder spiralganglionneuroner (SGN'er). Bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Prøveholder. En træprototype af en brugerdefineret prøveholder til fastgørelse af cochlea (pilespids) til en prøvestang (pil) ved hjælp af UV-aktiveret lim, samtidig med at rydningsopløsningen holdes inde i cochlea. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tværsnit af lysark. Et tværsnit gennem et X-akse scannet lysark, der viser stråletaljen i midten af lysarket og den konfokale parameter (CP), som er et område, hvor stråletykkelsen er relativt konstant. Den øverste solide gengivelse viser strålens bredde uden scanning, og den nederste solide gengivelse viser bredden af den scannede stråle, der forbliver tynd over hele cochleas bredde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Et midtmodiolært 2D-tværsnit gennem en musecochlea. Fire cochlear drejninger er sektioneret. Den basale drejning af Rosenthals kanal kan ses indeholdende sfærisk formede spiralganglionneuroner. Bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: To tværsnit af cochlea. Til venstre er et 2D-tværsnit og til højre er det samme afsnit med flere strukturer, der er segmenteret ved hjælp af forskellige farvede tracings. Bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Cochlear strukturer segmenteret. (A) Denne figur viser en segmenteret cochlea med den omgivende otic kapsel. (B-K) Disse viser flere forskellige cochlear strukturer, der er blevet segmenteret, og centroider (hvid linje) bestemmes for de fleste strukturer. Cochlear strukturer er blevet segmenteret med forskellige farver til deres identifikation: (A) sammensat figur med knogle (hvid), (B) turkis (spiralbånd), (C) rødbrun (stria vascularis), (D) gul (basilar membran), (E) rød (organ af Corti), (F) gulgrøn (Rosenthals kanal), (G) blå (scala tympani), guld (stapes fodplade), (H) hvid (scala media), grøn (ductus reuniens), (I) rød (scala vestibuli), lilla (rund vinduesmembran), guld (cochlear akvædukt), (J) grøn (tektorial membran), (K) lilla (spirallimbus). Bar = 400 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Sammenligning af den samme cochlear struktur i to forskellige cochleae. Ved hjælp af Procrustus-metoden i 3D-gengivelsessoftware er Scala-medierne fra to forskellige mus blevet sammenlignet. Det venstre panel viser tilpasningen af en mindste kvadraters pasform af to strukturer, og det højre panel viser deres kvantitative forskelle ved hjælp af et farvekort. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Solid 3D-plastmodel af cochlea. Det venstre panel viser Scala tympani af en musecochlea med basilarmembranen, Corti-organet og helicotrema segmenteret. Det højre panel viser en solid plastmodel af strukturerne til venstre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Spiral ganglion neuron tæller. SGN'er er blevet identificeret og markeret af 3D-gengivelsessoftwareprogrammet på et tværsnit af Scala-mediet i musecochlea. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Immunohistokemisk mærkning af ydre hårceller. Anti-prestin-antistoffer og fluorescerende sekundære antistoffer, der blev perfuseret gennem peri lymfatisk Scala af en musecochlea, har mærket alle de ydre hårceller, der er blevet volumengengivet ved hjælp af 3D-gengivelsessoftware. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Tæthed af SGN'er langs Rosenthals kanal. Det største tab af SGN'er ser ud til at være i de midterste og apikale ender af Rosenthals kanal i den 23 måneder gamle mus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12: Klyngeanalyse af SGN-celletæthed. Det venstre panel viser en klyngeanalyse af SGN'er i en 3 måneder gammel, normalt hørende mus. Et farvekort viser, at den største tæthed af celler i en klynge af en given størrelse er i midten af Rosenthals kanal, hvor musens høretærskler er lavest. Det højre panel viser tabet af SGN'er i hele Rosenthals kanal med det største tab af SGN'er midt i Rosenthals kanal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: X-akse scanning video af cochlea. X-aksescanning af prøven gennem lysarket, der viser cochlea suspenderet af prøvestangen i clearingopløsningen, der er indeholdt i et glaskammer. Et ortogonalt 2D fluorescerende tværsnit af cochlea vises på grund af belysning af lysarket. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Stak af serielle sektioner af cochlea. En kort stak 2D-tværsnit opnås ved X-aksescanning og 10 μm Z-trin gennem cochlea. Bemærk tilstedeværelsen af vandrette linjer i hele stakken, som er absorptionsartefakter på grund af brugen af en cylindrisk linse til at producere lysarket. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Resektionering af en cochlea i et andet plan. En stak indlæst i 3D-gengivelsessoftwareprogrammet og virtuel resektion i et plan, der tangerer Corti-organet, der viser hårcellerne langs basilarmembranens længde. Denne video er blevet ændret fra8. Klik her for at downloade denne video.
Video 4: Skeletonisering af Scala-mediet. Det venstre panel viser beregningen af centroiden i Scala-mediet for en musecochlea. Det højre panel viser et farvekort over de radiale dimensioner af Scala-mediet langs dets længde. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optisk sektionering ved lysarkmikroskopi til undersøgelse af cochlear strukturer er ikke mekanisk destruktiv som andre mere traditionelle histologiske metoder, og det giver et komplet digitalt overblik over cochlear strukturer i forhold til hinanden. Tidligere metoder såsom overfladepræparater af Corti14-organet gav et kort over hårtab langs basilarmembranens længde, men SGN-tab kunne ikke vurderes, da vævet var blevet dissekeret væk for at afsløre Corti-organet. Alternativt giver midt-modoilar mikrotomsektioner af cochlea kun en meget lille prøve af SGN'ernes tilstand i hele Rosenthals kanals længde. Med TSLIM digitaliseres alle cochlear-strukturer på niveauet for instrumentets opløsning (dvs. subcellulære). Komplette billedstakke af cochlea giver mulighed for kvantificering og visualisering af flere cochlear strukturer, der er vist her, som ikke kunne opnås ved traditionelle histologiske metoder. For eksempel viste denne undersøgelse ved hjælp af en klyngealgoritme en helt ny måde at se og kvantificere SGN-celletæthed i Rosenthals kanal og karakterisere celletab på grund af aldring (figur 12).
TSLIM er en tidlig8 udvikling af et lysarkmikroskop, der blev inspireret af Voie og kollegerne 4,5's arbejde. Specifikationer for konstruktionen af TSLIM blev medtaget i dokumentet af Santi et al.8. Faktisk udtalte Brown et al.15, at de konstruerede et lignende lysarkmikroskop til billeddannelse af cochlea baseret på TSLIMs design. Som nævnt i indledningen og gennemgået af Santi7 var udviklingen af andre lysarkmikroskoper (f.eks. SPIM) rettet mod at undersøge levende celleudvikling og opnåede bedre opløsning ved nedsænkning af høje NA-mål i prøvekammeret, hvilket krævede små arbejdsafstande og er uegnet til billeddannelse af hele cochleae. Den kommercielle udvikling af lysarkmikroskoper fortsætter, og denne type billeddannelse er yderst nyttig til fremstilling af veljusterede, serielle sektioner af væv og dyr, der gøres gennemsigtige ved kemiske rydningsmetoder.
For enhver lysarkmikroskopapplikation er det afgørende, at prøven gøres gennemsigtig for at forhindre lysspredning og absorption. Afkalkning er det første skridt i processen med at fjerne calcium fra cochlea for gennemsigtighed. Hvis EDTA ikke skylles helt ud af vævet før dehydrering, vil det udfældes i vævet, og god billeddannelse vil ikke være mulig. Dehydrering med ethanol er nødvendig for infiltration af Spalteholz-clearingopløsningen. Hvis en prøve er stærkt pigmenteret, kan blegning af pigmentet hjælpe med at gøre prøven mere gennemsigtig. Der er mange andre kemikalier og metoder, der kan bruges til at gøre en prøve gennemsigtig, og brugerne ønsker måske at prøve forskellige metoder til at bestemme, hvilken metode der er bedst egnet til deres prøve. Selvom lysarkmikroskopi producerer 2D-billeder af væv, er dens opløsning ikke så stor, som den kan opnås fra tynde mekaniske sektioner af væv (især plastsektioner) og brightfieldmikroskopi. Dens primære fordel er at producere veljusterede, serielle sektioner af væv til 3D-rekonstruktion af strukturer.
De to mus cochleae, som vi viser som eksempler på SGN-tab på grund af aldring, afslører tab af neuroner på grund af aldring. Et uventet fund var tabet af SGN'er i de midterste og apikale ender af cochlea snarere end et basalt tab, der ville svare til et tab af hårceller i basen. Vi vurderede dog ikke hårtab i disse cochleae, og de to prøver er blot eksempler snarere end en undersøgelse af aldringseffekterne på SGN'er. I en artikel af White et al.16 beskrev de SGN-tab hos 18 måneder gamle C57-mus, men bestemte ikke fordelingen af tabet langs Rosenthals kanal. I en anden artikel af Grierson et al.17 beskrev de ved hjælp af 24-28 måneder gamle mus massiv degeneration af OHC-efferenter, især i den apikale halvdel af cochlea, hvor der også var et betydeligt tab af OHC'er. Faktisk rummer fremtiden mange muligheder for at udtrække nye data og opnå en bedre forståelse af patologiske processer i cochlea på grund af aldring og andre fornærmelser. Desuden er cochlear billedstakke blevet leveret til mange andre efterforskere, og det vil være interessant at se, hvordan disse efterforskere udvinder data for at besvare deres forskningsspørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning er blevet støttet af tilskud fra National Institute on Deafness and Other Communication Disorders fra National Institutes of Health, Kellogg Foundation og private donationer fra Bridget Sperl og John McCormick. TSLIM er udviklet med fremragende hjælp fra Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg og Julian Wuester fra Technical University of Illmenau, Tyskland, tilsyn af deres mentorer (Stefan Sinzinger og Rene Theska) og James Leger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021).
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J.
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. On making human and animal preparations transparent. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
